JP6339590B2 - 核酸配列分析に使用される標識オリゴヌクレオチドプローブ - Google Patents
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Description
本発明は、標的核酸を検出するためのPCR反応において使用するための蛍光ローダミン由来色素を含む標識オリゴヌクレオチドプローブの製造方法を対象とする。第一の態様において、本発明は、以下を含むPCR反応においてハイブリダイゼーションプローブとして使用するための標識オリゴヌクレオチドを作製する方法であって、以下のステップ:
ローダミン誘導体である蛍光色素を準備するステップ、ここで、前記蛍光色素には二機能性リンカー分子が取り付けられている;
前記ヌクレオチド内に前記蛍光色素を組み込むために、前記二機能性リンカー分子を介して前記蛍光色素に反応基を結合させるステップ;そして、
前記オリゴヌクレオチドの2つの内部ヌクレオチドの間に当該蛍光色素を組み込むステップ、但し、前記蛍光色素は、前記オリゴヌクレオチドの5’末端に組み込まれない、
を含む、方法に関する。
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野において当業者により共通に理解されるのと同じ意味を有する。以下の参考文献は、本願発明で使用する多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する:Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994);The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991);及びHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書中で使用され場合、次の用語は、別段の明記がない限り、それらに帰する意味を有する。
対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションは、突然変異配列の一方に特異的なオリゴヌクレオチドを、核酸試料を増幅することで得られた増幅産物とハイブリダイズさせることにより、少なくとも1つの塩基が異なっている2つのDNA分子間での識別に依拠している。対立遺伝子特異的アッセイは、2つの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド、例えば、一方の変異体と、他方の変異体に対し、別個にハイブリダイズする、最初の変異体用の対立遺伝子特異的プローブ及び第二の変異体用の対立遺伝子特異的プローブを含んで成ることがある。対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションは、典型的には、短いオリゴヌクレオチド、例えば15〜35個の長さのヌクレオチドを利用する。かかるプローブを設計するための原理及びガイダンスは当業界で入手可能なものである。ハイブリダイゼーション条件は、十分にストリンジェントであるべきであり、これは、対立遺伝子間でハイブリダイゼーション強度に有意な違いがあること、好ましくは本質的に二種類の応答に有意な違いがあって、プローブが当該対立遺伝子の一方にのみハイブリダイズする条件のことである。プローブによっては、標的DNAの1セグメントとハイブリダイズし、その結果、注目の部位が、前記プローブの中心部に整列するが、このデザインは必須ではない。
核酸試料の検出は、米国特許第5,210,015号;同第5,487,972号;及び同第5,804,375号;及びHolland et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280に記載の「TaqMan(登録商標)」又は「5’ヌクレアーゼアッセイ」を用いて実施され得る。TaqMan(登録商標)アッセイでは、増幅された領域内でハイブリダイズする標識済みの検出プローブが増幅反応中存在している。プローブは、当該プローブがDNA合成のためのプライマーとして働かないように修飾される。増幅は、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを用いて実施される。増幅の各合成ステップでは、伸張されるプライマーから下流の標的核酸にハイブリダイズする任意のプローブは、DNAポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性によって分解される。従って、新しい標的鎖の合成はプローブの分解をもたらし、この分解産物の蓄積は、標的配列の合成の指標となる。
ローダミンは、図1Aに示されているコア構造を含む蛍光色素である。例えばカルボキシテトラメチルローダミン(TAMRA)やスルホローダミン101酸クロリド(Texas Red)等のローダミンのいくつかの誘導体もまた、造影目的で一般的に使用される蛍光色素である。その蛍光放出最大値が600nmの範囲内にある新規ローダミン誘導体が米国特許第6,184,379号(‘379)に開示されている。これらの誘導体は、次の式:
R1及びR2は、同一であるか又は異なっており、且つ、水素及び1〜20個のC原子を有するアルキルから成る群から選択され、ここで、前記アルキル残基は、少なくとも1つのヒドロキシル、ハロゲン、スルホン酸、アミノ、カルボキシ又はアルコキシカルボニル基によって任意に置換され、且つ、少なくともR1は、活性化可能な基を含んでおり;A1、A2、A3、B1は、塩素又はフッ素のいずれかであり、そして、B2は、塩素、フッ素又は水素のいずれかである。}で表される構造を有する。2種類の特定の化合物、JA270及びJF9もまた、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)システムの形で使用され得るフルオロフォアとして特に好適であることが示されたJA270のカルボン酸類似体(図2)を含めて、‘379特許に記載されている。
ApoEは、様々なリポタンパク質種の主な成分であり、血漿コレステロールレベルの制御において中心的役割を担っている。apoEをコードする遺伝子は、不均一型で存在し、それらの一部では、転写活性に特異的に影響すること、又は構造的若しくは機能的に異なったタンパク質アイソフォームをコードすることが知られている。apoE2、apoE3及びapoE4というapoEの三大アイソフォームは、低密度リポタンパク質(LDL)受容体に対して異なった結合親和力を有しているので、異なった血漿脂質レベル及びリポタンパク質レベルに関係している。その三大アイソフォームは、apoEポリペプチド鎖の112位におけるapoE2及びapoE3型のシスチン(Cys)とapoE4型のアルギニン(Arg)、そして、158位におけるapoE2型のCysとapoE3及びapoE4型のArgの存在を特徴としている。第112及び158アミノ酸の変異性は、それぞれapoE遺伝子のヌクレオチド配列334位及び472位に存在している一塩基多型(SNP)に基づいている。それぞれの位置において、CysはコドンTGCによって決定され、そして、ArgはコドンCGCによって決定される。これらの対立遺伝子は、本明細書中では334T/C対立遺伝子及び472T/C対立遺伝子と呼ばれる。組み合わせ、334T/472T、334T/472C、及び334C/472Cは、それぞれ既知のアイソフォーム特異的apoE対立遺伝子、ε2、ε3、及びε4を形成する。
蛍光検出の較正に使用するための基準試薬溶液を製造し、そして、それは、5種類の異なった蛍光色素を使用して5’末端ヌクレオチドですべて標識した、10merのデオキシチミジン(dT)オリゴヌクレオチドを2μMの濃度で含んでいた。その5種類の蛍光色素とは、FAM、HEX、JA270、Coumarin−343、及びCy5.5であった。この基準溶液の純度及び安定性を、Photodiode Array(PDA)を備えたWaters Acquity UPLC System及び蛍光検出によって分析した。クロマトグラフィーを、Acquity OST C8の1.7μmの粒子カラムで実施した。移動相はバッファーAとしての0.1Mの酢酸ヘキシルアンモニウム(HAA)pH7.0とバッファーBとしての100%のアセトニトリルから成り、そして、当該オリゴヌクレオチドを、1mL/分の流速にて、最初の0.6分間の30−60%のバッファーBと、それに続く1.4分間の60−95%のバッファーBのグラジエントにわたって分離した。同じ日の朝(上)と晩(下)に実施した実験におけるオリゴヌクレオチドの溶出プロフィールを図3に示す。興味深いことに、JA270ピークは、晩の実施においてサイズが大きく減少しており、他ならぬこのオリゴヌクレオチドの安定性に問題がある可能性を示唆している。JA270色素のサイズと疎水性のため、他ならぬこのオリゴヌクレオチドが溶液中に析出する(fall out of solution)であろうことが推測された。JA270標識オリゴヌクレオチドの疎水性を低下させるために、JA270を5’末端の代わりに内部の位置に配置したJA270で標識した10merのdTを合成することを決めた。JA270色素の内側への配置を、当該色素のカルボン酸部分にL−トレオニノールリンカー結合させ、そして、オリゴヌクレオチド内の内側のホスファートと連結可能な反応性ホスホラミダイト基を追加することによって可能にした。UPLC分析を再び実施し、そして、その結果を、図4に描かれた表及び棒グラフに示す。JA270色素をオリゴヌクレオチドの内部部位に配置することによって、1カ月の保管後であってもJA270で標識した10merのdTの安定性を維持できた。
apoE遺伝子のε2、ε3、及びε4対立遺伝子を遺伝子型決定するためのアッセイを、TaqMan(登録商標)技術及び対立遺伝子特異的TaqMan(登録商標)プローブオリゴヌクレオチドを使用して開発した。「マスターミックス」オリゴヌクレオチド溶液を調製し、それには、次のプローブ:
334T対立遺伝子選択性の5’末端FAM標識22merプローブ
334C対立遺伝子選択性の5’末端HEX標識22merプローブ
472C対立遺伝子選択性の5’末端JA270標識22merプローブ
472T対立遺伝子選択性の5’末端Cy5.5標識22merプローブ、
が含まれていた。
Claims (10)
- PCR反応においてハイブリダイゼーションプローブとして使用される標識オリゴヌクレオチドの製造方法であって、以下のステップ:
(a)ローダミン誘導体である蛍光色素を準備するステップ、ここで、前記蛍光色素には二機能性リンカー分子が取り付けられており、ここで前記二機能性リンカー分子は、L−トレオニノールである;
(b)前記オリゴヌクレオチド内に前記蛍光色素を組み込むために、前記二機能性リンカー分子を介して、前記蛍光色素に反応基を結合させるステップ;
(c)前記オリゴヌクレオチドの2つの内部ヌクレオチドの間に前記蛍光色素を組み込むステップ、但し、前記蛍光色素は、前記オリゴヌクレオチドの5’末端に組み込まれることはない
を含む、方法。 - 前記蛍光色素が、次の一般式:
Ca、Cb、Cc及びCdは、それぞれC原子を意味し、CaとCbは、単結合又は二重結合のいずれかによって一緒に連結され、そして、CcとCdは、単結合又は二重結合のいずれかによって一緒に連結され;
X1、X2、X3、X4、X7及びX10は、水素であり、且つ、X5、X6、X8、X9、X11及びX12は、メチルであり;
R1及びR2は、同一であるか又は異なっており、且つ、水素及び1〜20個のC原子を有するアルキルから成る群から選択され、ここで、前記アルキル残基は、少なくとも1つのヒドロキシル、ハロゲン、スルホン酸、アミノ、カルボキシ又はアルコキシカルボニル基によって任意に置換され、且つ、少なくともR1は、活性化可能な基を含んでおり;
A1、A2、A3、B1は、塩素又はフッ素のいずれかであり、そして、B2は、塩素、フッ素又は水素のいずれかである}
の化合物である、請求項1に記載の方法。 - 前記蛍光色素が:
- 前記標識オリゴヌクレオチドが、前記標識オリゴヌクレオチドの5’末端に取り付けられたクエンチャー分子をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 試験サンプル中の標的核酸又は核酸の標的対立遺伝子の存在又は不存在を検出する方法であって、以下のステップ:
前記標的核酸にハイブリダイズする標識プローブオリゴヌクレオチドの使用を伴ったPCR反応を実施するステップ、ここで、前記標識プローブオリゴヌクレオチドは:
二機能性リンカー分子が取り付けられたローダミン誘導体である蛍光色素、ここで前記二機能性リンカー分子は、L−トレオニノールである;及び
前記オリゴヌクレオチドの2つの内部ヌクレオチドの間に蛍光色素を組み込むための、前記二機能性リンカー分子に結合された反応基
を有することを特徴とし、但し、前記蛍光色素はオリゴヌクレオチドの5’末端には組み込まれない;
前記蛍光色素からのシグナルを検出するステップ、ここで、前記シグナルの強さは前記標的核酸の存在又は不存在を示す、
を含む、方法。 - 前記蛍光色素が、以下の一般式:
Ca、Cb、Cc及びCdは、それぞれC原子を意味し、CaとCbは、単結合又は二重結合のいずれかによって一緒に連結され、そして、CcとCdは、単結合又は二重結合のいずれかによって一緒に連結され;
X1、X2、X3、X4、X7及びX10は、水素であり、且つ、X5、X6、X8、X9、X11及びX12は、メチルであり;
R1及びR2は、同一であるか又は異なっており、且つ、水素及び1〜20個のC原子を有するアルキルから成る群から選択され、ここで、前記アルキル残基は、少なくとも1つのヒドロキシル、ハロゲン、スルホン酸、アミノ、カルボキシ又はアルコキシカルボニル基によって任意に置換され、且つ、少なくともR1は、活性化可能な基を含んでおり;
A1、A2、A3、B1は、塩素又はフッ素のいずれかであり、そして、B2は、塩素、フッ素又は水素のいずれかである}
の化合物である、請求項5に記載の方法。 - 前記蛍光色素が:
- 前記標識オリゴヌクレオチドが、前記標識オリゴヌクレオチドの5’末端に取り付けられたクエンチャー分子をさらに含む、請求項5に記載の方法。
- 前記標的核酸が、アポリポタンパク質E遺伝子である、請求項5に記載の方法。
- 核酸の前記標的対立遺伝子が、アポリポタンパク質E遺伝子の334T/C対立遺伝子又は472T/C対立遺伝子である、請求項5に記載の方法。
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