KR20100104754A

KR20100104754A - Ｄｅｆａ4 유전자로부터 유래된 단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 마이크로어레이 및 진단키트, 이를 이용한 검출 방법

Info

Publication number: KR20100104754A
Application number: KR1020090023381A
Authority: KR
Inventors: 곽규범; 정주호; 남민; 원성식; 강현준; 김수강
Original assignee: 차의과학대학교 산학협력단
Priority date: 2009-03-19
Filing date: 2009-03-19
Publication date: 2010-09-29
Also published as: KR101071081B1

Abstract

본 발명은 8번 염색체상의 유전자, 특히, DEFA4 (defensin alpha 4, corticostatin) 유전자로부터 유래된 단일염기다형(Single-Nucleotide Polymorphism; SNP)을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드는 자폐증(Autism) 의 임상적 진단의 표지 인자로서, 사용될 수 있다.

자폐증, 단일염기다형, DEFA4

Description

ＤＥＦＡ4 유전자로부터 유래된 단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 마이크로어레이 및 진단키트, 이를 이용한 검출 방법{Polynucleotides comprising single nucleotide polymorphism derived from DEFA4 gene, microarrays and diagnostic kits comprising the same, and detection methods using the same}

본 발명은 8번 염색체상의 유전자, 특히, DEFA4 (defensin alpha 4, corticostatin) 유전자로부터 유래된 단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드로 이루어진 자폐증(Autism) 진단을 위한 증폭용 프라이머 또는 자폐증 진단용 프로브; 상기 프로브를 포함하는 마이크로어레이; 및 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 이용한 자폐증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 검출 방법에 관한 것이다.

인간의 게놈은 모두 22쌍의 상동 염색체와 두 개의 성염색체로 이루어져 있다. 그러나 모든 인간이 각기 다른 외모와 성격을 갖는다. 이는 개개인이 같은 수의 염색체를 가지고 있기는 하지만, 그 염색체로부터 발현되는 유전자들에 의한 표 현형이 모두 다르기 때문이다. 개개인의 이러한 유전자 발현의 다양성은 곧 유전자를 가지고 있는 게놈의 유전적 다양성 때문이다. 이러한 유전적 다양성은 많은 연구가 수행되어 왔으며, 최근 인간게놈프로젝트의 완성으로 그 구조가 모두 밝혀졌다.

게놈에서의 유전적 다양성을 대표하는 것으로는 Transposable element, STR (short tandem repeats), Microsatellites, STS (sequence tagged site), VNTR (variable number tandem repeat), SNP (single nucleotide polymorphism : 단일염기다형) 등이 알려져 있다. 이중 SNP는 단일염기다형으로서, 인간 게놈 상에서 약 1000개의 뉴클레오티드 중 1개의 빈도로 나타나며 동일한 종의 개체 사이의 단일뉴클레오티드 변이의 형태를 취한다. 이러한 단일염기다형이 나타내는 유전학에서의 의미는 그 위치에 따라 각 개체에 큰 차이를 가져온다. 예를 들면, 단일염기다형이 단백질을 암호화하고 있는 위치에 존재할 경우, 단백질의 구조에 영향을 미칠 수 있게 되어 단백질 기능이 달라질 수 있게 되며, 질병과도 연관될 수 있다. 다른 예로 단일염기다형이 단백질을 암호화하지 않는 다른 유전자상에서 존재할 경우, 즉 프로모터(promoter) 또는 인트론(intron)에 존재할 경우, 각각에 대하여 단백질의 발현 수준에 차이를 가져와 그 단백질의 전체적인 활성이 줄어들 수 있고, 변성적인 인트론 제거 과정(alternative splicing)을 통하여 단백질이 비정상적으로 발현될 수도 있다.

단일염기다형들은 질병과 같은 특정 표현형(phenotype)의 지표로 사용될 수 있고, 이를 위해서는 가장 우선적으로 인간 유전체에 존재하는 대량의 단일염기다 형을 발굴하고 발굴된 단일염기다형는 다수의 인간 유전체 시료에서 전체 인간집단의 1% 이상 존재하는 유전변이형 마커인지를 조사하는 검정작업을 거치게 된다. 검정된 SNP은 특정 질병 또는 약물반응과 같은 유전적 차이에 기인된 원인을 찾기 위한 연관성 연구에 사용되게 된다. 예를 들면, 특정 단일염기다형이 환자군과 대조군 간의 비교에서 유의적인 빈도의 차이가 관측된다면 아주 유용한 단일염기다형으로 선발되어 임상실험을 거치게 될 것이며 임상실험의 결과가 계속적으로 진행되어 그 결과가 좋을 때는 경제적으로 아주 유용한 가치를 지니는 유전지표로 실제 임상에 사용할 수 있게 될 것이다.

이러한 단일염기다형의 발견을 위한 종래 기술로는 제한효소를 이용한 제한 단편화 길이 다형성(Restriction Fragment Length Polymorphism; RFLP), 대립형질 특이적 혼성화(Allele-specific hybridization)를 이용한 TaqMan^TM 프로브 방법, 용융온도(melting temperature; Tm)을 이용한 역동적 대립형질 특이적 혼성화(Dynamic Allele-Specific Hybridization; DASH)방법, 중합반응을 이용한 pyrosequencing등이 있다. 최근, 마이크로어레이 기술은 단일 염기 신장(Single Base Extension)이라는 원리를 이용한 프로브들을 조그만 기판위에 집적화시켜 심은 후, 목적 DNA들과의 혼성화와 신장(Extension)을 시킴으로써 단일염기다형을 발견해 내고 있다.

한편, 자폐스펙트럼장애(Autism Spectrum Disorder; ASD)라고도 불리는 자폐증은 전반적인 발달장애(Pervasive Developmental Disorder; PDD)로서 사회적 상호 작용의 장애, 의사소통의 장애, 반복적이고 상동증적인 행동을 보이는 신경발달장애이다. 자폐증은 다양한 형태로 나타나고 개인에 따라 심각한 정도가 다르며, 자폐증(autistic disorder), 레트장애(Rett's disorder), 소아기 붕괴장애(childhood disintegrative disorder), 아스퍼거 증후군(Asperger's syndrome), 특정불능의 전반적 발달장애(Pervasive Developmental Disorder Not Otherwise Specified; PDD-NOS)를 포함한다.

자폐증의 대부분은 소아기 자폐로 10,000 명당 2∼5 명의 유병률을 보이고, 아스퍼거 증후군 등 전반적 발달장애를 포함하는 경우 10,000명당 20∼50 명까지 보이며, 남녀 성비는 약 4:1 로서 여자보다 남자에서 발생 빈도가 높게 나타난다. 자폐증은 여러 가지 병인에 의해서 나타날 수 있으며, 환경적인 병인과 유전적인 영향에 의해 나타날 수 있다. 자폐증은 강한 유전적 소인을 가지는 질병으로 알려져 있다. 따라서 기존에 보고된 연구들을 바탕으로 질병과 연관된 많은 유전학적 연구들이 보고되고 있다. 한국 내 소아자폐증의 비율은 2003년에서 2007년간 환자 수가 1.65배 증가하였다. 소아자폐증 환자가 증가하는 추세에 있다. 자폐증 발병의 원인 규명 및 조기진단, 조기 치료가 소아 건강 및 국민의료 재정에 주요하며, 자폐증의 조기 진단은 자폐증 치료를 위한 필수적인 요소이다. 또한, 자폐증에 특이적으로 나타날 수 있는 단일염기다형을 찾아내는 것은 자폐증을 조기에 진단할 수 있으며, 더 나아가 병태생리학적 경로를 밝히고 치료 방법을 개발하는데까지 이용될 수 있을 것이다.

본 발명자들은 자폐증에 특이적으로 나타나는 단일염기다형을 찾아내고자 연구를 거듭한 결과, 8번 염색체상의 유전자, 특히, DEFA4 (defensin alpha 4, corticostatin) 유전자로부터 자폐증 환자에 특이적으로 나타나는 단일염기다형 부위를 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 자폐증과 관련된 단일염기다형으로서 DEFA4 유전자로부터 유래된 단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어진 자폐증 진단을 위한 증폭용 프라이머 또는 자폐증 진단용 프로브를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 프로브를 포함하는 마이크로어레이를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 자폐증 진단에 필요한 정보를 제공하는데 유용한, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드를 이용한 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, 서열번호 1의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 251번째 염기(다형성 부위)가 C이고, 상기 251번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드 가 제공된다.

또한, 본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 자폐증 진단을 위한 증폭용 프라이머가 제공된다.

또한, 본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 자폐증 진단용 프로브 및 이를 포함한 마이크로어레이가 제공된다.

또한, 본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 자폐증 진단용 키트가 제공된다.

또한, 본 발명의 다른 태양에 따라, 자폐증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, (i) 검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계; 및 (ii) 상기 핵산 시료로부터, 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드의 다형성 부위의 염기 서열을 분석하는 단계 (단, 상기 다형성 부위는 251번째 염기를 의미한다)를 포함하는, 검체 중의 단일염기다형을 검출하는 방법이 제공된다.

본 발명에 따른 서열번호 1의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 251번째 염기(다형성 부위)가 C이고, 상기 251번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드는 자폐증의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어 진 프라이머 또는 프로브, 및 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 키트는 자폐증의 예측진단에 유용하게 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 검출방법은 자폐증 진단에 필요한 정보를 제공하는데 유용하게 사용될 수 있다.

본 명세서에서 "자폐증(autism)" 이라 함은, 자폐 스펙트럼 장애(Autism Spectrum Disorder; ASD)라고도 칭해지며, 전반적인 발달장애(Pervasive Developmental Disorder; PDD)로서 사회적 상호작용의 장애, 의사소통의 장애, 반복적이고 상동증적인 행동을 보이는 신경발달장애를 총칭한다. 자폐증은 다양한 형태로 나타나고 개인에 따라 심각한 정도가 다르며, 자폐증(autistic disorder), 레트 장애(Rett's disorder), 소아기 붕괴장애(childhood disintegrative disorder), 아스퍼거 증후군(Asperger's syndrome), 특정불능의 전반적 발달장애(Pervasive Developmental Disorder Not Otherwise Specified; PDD-NOS)를 포함한다. 상기 PDD-NOS 란 자폐증에 가깝지만 미국정신의학회 진단기준인 정신장애 진단 및 통계편람(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorder-IV; DSM-IV)의 진단기준에는 적합하지 않는 장애로서, 자폐증이 가지는 세가지 주된 증상이 모두 나타나지 않고 일부가 나타나는 경우를 말하는 것으로 WHO가 작성한 국제질병분류(International Classification of Disease; ICD)에서는 비정형 자폐증(Atypical Autism disorder)으로 정의된다. 본 명세서에서 "자폐증"이라 함은 상기 PDD-NOS도 포함한다.

본 발명은 자폐증과 관련된 것으로 새롭게 밝혀진 서열번호 1의 서열로부터 유래하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 즉, 본 발명은 서열번호 1의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 251번째 염기(다형성 부위)가 C이고, 상기 251번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

상기 서열번호 1의 DNA 서열은 자폐증 환자군과 정상군에서 통계학적으로 유의성 있는 차이(유의수준 p value < 0.05)를 보이는 단일염기다형으로서, 이들은 8번 염색체 상의 DEFA4 유전자에 존재한다. DEFA4 (defensin, alpha 4, corticostatin) 유전자는 defensin alpha 단백질을 표지한다. 이는 내재면역관련 유전자로 살균과 cytotoxic pepetide의 역할을 수행하는 것으로 알려져 있으며, 호중성 백혈구(neutrophils)의 과립에 다량 존재하고, 십이지장, 호흡기, 요로, 그리고 질과 같은 점막 표면의 상피에서 발견된다.

본 발명은 상기 서열번호 1의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 251번째 염기(다형성 부위)가 C이고, 상기 251번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드의 길이는 10 내지 100 뉴클레오티드, 바람직하게는 20 내지 60 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 40 내지 60 뉴클레오티드이다.

본 발명에 따른 상기 서열번호 1의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 251번째 염기(다형성 부위)가 C이고, 상기 251번째 염기를 포함하는 10개 이상 의 연속 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드는 다형성 서열이다. 다형성 서열 (polymorphic sequence)이란 뉴클레오티드 서열 중에 단일염기다형을 나타내는 다형성 부위 (polymorphic site)를 포함하는 서열을 말한다. 다형성 부위 (polymorphic site)란 다형성 서열 중 단일염기다형이 일어나는 부위를 말한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA가 될 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 서열번호 1의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 251번째 염기(다형성 부위)가 C이고, 상기 251번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 자폐증 진단을 위한 증폭용 대립형질 특이적 프라이머를 포함한다. 여기서 "프라이머(primer)"란 적절한 버퍼 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트(ATP,GTP,CTP,TTP) 및 DNA 폴리머라제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 10 내지 100, 바람직하게는 10 내지 80 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 3'-말단이 서열번호 1의 단일염기다형과 정렬하는 것이 바람직하다. 상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 표적 DNA에 혼성화하고, 상기 프라이머가 완전한 상동성을 보이는 대립형질 형태의 DNA에서 증폭을 개시한다. 이 프라이머는 반대편에 혼성화하는 제 2 프라이머와 쌍을 이루어 사용된다. 증폭에 의하여 두 개의 프라이머로부터 산물이 증폭되고, 증폭된 산물만을 특이적으로 염색하여 시각화한다. 이는 특정 대립형질 형태가 존재한다는 것을 의미한다. 여기서 사용되는 대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드들이 다른 변성화 과정을 거치게 되면, Infinium^TM Assay I 뿐만 아니라 다른 방법들에 의해서도 사용될 수 있다.

본 발명은 서열번호 1의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 251번째 염기(다형성 부위)가 C이고, 상기 251번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 자폐증 진단용 프로브 및 이를 포함하는 자폐증 진단용 마이크로어레이를 포함한다. 또한, 본 발명은 서열번호 1의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 251번째 염기(다형성 부위)가 C이고, 상기 251번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 자폐증 진단용 키트를 포함한다.

본 발명은 자폐증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 자폐증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, (i) 검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계; 및 (ii) 상기 핵산 시료로부터, 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드의 다형성 부위의 염기 서열을 분석하는 단계 (단, 상기 다형성 부위는 251번째 염기를 의미한다)를 포함하는, 검체 중의 단일염기다형을 검출하는 방법을 포함한다.

상기 검체는 혈액, 조직, 세포 등을 포함하며, 핵산 시료는 통상의 방법에 따라 얻을 수 있다. 예를 들어 혈액에 경우 다음과 같이 핵산 시료를 얻을 수 있다. 혈액을 원심분리 시험관으로 옮기고 낮은 농도의 염 성분 완충용액(low-salt buffer solution(10mM Tris-HCl [pH 7.6], 10mM KCl, 10mM MgCl₂, 및 2mM EDTA))을 첨가한다. 그리고 Nonidet P-40을 첨가한 다음, 얻어진 용액을 잘 섞어준 후, 상온에서 10분간 약 2,200 rpm으로 원심분리한다. 이때 얻어진 덩어리는 고농도의 염 성분 완충용액(high-salt buffer solution(10mM Tris-HCl [pH 7.6], 10mM KCl, 10mM MgCl₂, 0.4M NaCl, 및 2mM EDTA))으로 재현탁한다. 게놈 DNA는 50ul의 10% SDS와 섞은 후, 약 55℃에서 밤새 반응시킨다. 반응 후에, 각 게놈 DNA들은 1.5ml 용량의 원심분리 시험관으로 옮겨, 6M NaCl을 0.3ml 첨가한다. 게놈 DNA들을 잘 섞어준 후, 약 12,000rpm에서 10분간 원심분리한다. 원심분리 후, 게놈 DNA가 들어있는 상층을 모아서 새로운 시험관으로 옮기고, 상온에서 동량의 100% 에탄올을 첨가한다. 게놈 DNA들이 침전될 때까지 잘 섞어 주고, 침전이 되면 70% 에탄올로 게놈 DNA들을 세척한다. 이 과정이 끝나면 시험관 뚜껑을 열어, 용액성분이 마르도록 놓아둔다. 그리고 TE 완충용액(pH 8.0)을 넣어 게놈 DNA를 재현탁함으로써, 핵산 시료를 얻을 수 있다.

여기에서, 상기 다형성 부위의 염기 서열을 분석하는 단계는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열로부터 유래된 서열로서 다형성 부위를 포함하는 서열(단, 상기 다형성 부위는 251번째 염기를 의미한다)을 주형으로 하는 프라이머 또는 프로브를 이용하여 수행될 수 있다. 상기 프라이머 또는 프로브는 상기에서 설명한 바와 같다.

또한, 상기 다형성 부위의 염기 서열을 분석하는 단계는 서열번호 1의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 251번째 염기(다형성 부위)가 C이고, 상기 251번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드가 고정된 마이크로어레이에 상기 핵산 시료를 혼성화시키는 단계; 및 얻어진 혼성화 결과를 분석하는 단계를 포함하여 수행될 수 있으며, 상기 마이크로어레이에 고정되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드의 DNA 서열의 길이는 각각 10 내지 100 뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명의 검체 중의 단일염기다형을 검출하는 방법에 따라 얻어진 결과는 자폐증 진단에 필요한 정보를 제공할 수 있으며 예를 들어, 서열번호 1의 다형성 부위의 염기가 C (위험 대립인자)인 경우, 자폐증에 걸릴 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 판정할 수 있다.

또한, 상기 다형성 부위의 염기 서열을 분석하는 단계는 서열번호 1의 DNA 서열의 다형성 부위(즉, 251번째 염기)의 유전자형(genotype) 분석에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는, 상기 다형성 부위의 염기 서열을 분석하는 단계는 서열번호 1의 DNA 서열의 다형성부위의 공우성 유전자형(co-dominant genotype), 우성 유전자형(dominant genotype), 및 열성 유전자형 (recessive genotype) 분석에 의해 수행될 수 있다. 즉, 서열번호 1의 다형성 부위가 각각 유전자형이 T/C와 C/C 가 하나 이상 존재하는 경우 자폐증에 걸릴 위험도가 높은 것으로 판단할 수 있다. 상 기 위험 유전자형을 갖는 핵산 서열이 하나의 검체에서 많이 검출되면 될수록 위험군에서 속하는 확률은 더 높은 것으로 판단할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

1. 피검자 선정

자폐증 환자 (평균 나이: 15.55±4.77)로 2004년에서 2006년까지 3개의 특수학교의 외래환자 및 학생을 대상으로 178명을 선정하였으며, 이들 모두 DSM-IV(American Psychiatric Association, 1994), 임상 면접시험, 증후 등급(symptom rating)을 시행하였으며, Childhood Autism Rating Scale, Korean version (K-CARS) 점수 30 이상의 환자를 선정하였다. 모든 진단은 독립된 2명의 경험 있는 정신과 의사 및 심리학자에 의해 수행되었다. 정상군은 유전학적, 신경학적 병인이 없는 건강한 147명을 대상으로 선정하였다. 사용된 군집의 크기는 다음 표 1과 같다.

그룹	정상군	자폐증 환자군	총합계
조사인원	147	178	325

2. 게놈 DNA의 준비

게놈 DNA(genomic DNA; gDNA)를 준비하기 위하여 자폐증 환자와 정상군으로부터 정맥 혈액을 채취하였다. 전체 정맥혈(약 0.3 ml)은 각 지원자들의 전주정맥으로부터 얻었고 15% EDTA가 들어있는 Vacutainer tube로 옮겼다. 게놈 DNA를 추출하기 위하여, 혈액을 원심분리 실험관으로 옮기고 낮은 농도의 염 성분 완충용액(low-salt buffer solution(10mM Tris-HCl [pH 7.6], 10mM KCl, 10mM MgCl₂, and 2mM EDTA)을 5ml 첨가 하였다. 그리고 Nonidet P-40을 첨가하였다. 얻어진 용액을 잘 섞어준 후, 상온에서 10분간 2,200 rpm으로 원심분리하였다. 이 때 얻어진 덩어리는 고농도의 염 성분 완충용액(high-salt buffer solution(10mM Tris-HCl [pH 7.6], 10mM KCl, 10mM MgCl₂, 0.4M NaCl, and 2mM EDTA))으로 재현탁 하였다. 이 게놈 DNA는 50ul의 10% SDS와 섞은 후, 55℃에서 밤새 반응시켰다.

반응 후에, 각 게놈 DNA들은 1.5ml 용량의 원심분리 실험관으로 옮겨, 6M NaCl을 0.3ml 첨가하였다. 게놈 DNA들을 잘 섞어준 후, 12,000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리 후, 게놈 DNA가 들어있는 상층을 모아서 새로운 시험관으로 옮기고, 상온에서 동량의 100% 에탄올을 첨가하였다. 게놈 DNA들이 침전될 때까지 잘 섞어 주고, 침전이 되면 70% 에탄올로 게놈 DNA들을 세척하였다. 이 과정이 끝나면 실험관 뚜껑을 열어, 용액성분이 마르도록 놓아둔다. 그리고 TE 완충용액(pH 8.0)을 넣어 게놈 DNA를 재현탁하였다.

준비된 게놈 DNA는 GoldenGate Assay를를 위해 Quant-iT^TM PicoGreen dsDNA reagent (Molecular Probes, Invitrogen)을 사용하여 750ng/15uL의 농도로 조정하였다.

3. 전체 게놈의 유전자형 분석 - GoldenGate Assay

Goldengate assay 방법에 따라, Sentrix array matrix chip을 사용하여 유전자형을 분석하였다. 일루미나사(Illumina Inc.)로부터 GoldenGate assay를 위한 모든 시약과 Sentrix array matrix chip을 구입하여 사용하였다. 모든 과정은 일루미나사의 GoldenGate assay 방법에 따라 시행하였다.

게놈 DNA 시료(250 ng/5 ㎕)는 96 well-plate에서 5 ul의 GS#-MS1 시약과 혼합하였다. plate를 밀봉하고 250×g에서 1 분 동안 원심분리하고, 95 ℃ heat block에서 30 분간 반응시켰다. 여기에 5 ul GS#-SUD를 넣고 혼합한 후 5 ul 2-프로판올(2-propanol)을 넣고, 다시 혼합한 후에 3,000×g에서 20분 동안 원심분리한 후 상등액을 제거하고 pellet을 건조시켰다. 건조된 DNA는 10 ul의 GS#-RS1 시약을 넣고 잘 풀어주었다. 여기에 10 ul의 GS#-OPA와 30 ul의 GS#-OB1를 넣고, 잘 혼합한 후 70℃ heat block에 넣고 30℃가 될 때까지 천천히 식혔다. GS#-ASE plate를 마그네틱 플레이트 위에 올리고 2분간 방치하였다. 상등액을 제거하고, 50 ul GS#-AM1을 넣어주고 잘 혼합하였다. 마그네틱 플레이트 위에 올리고 2분간 방치한 후 상등액을 제거하고, 50 ul GS#-AM1을 넣어주고 잘 혼합하였다. 위와 동일한 방법으로 50 ul GS#-UB1로 세척 후, 상등액을 제거하고, 37 ul GS#-MEL을 넣어주고 잘 혼합한 후에 45℃에서 15분간 배양(incubation)하였다. 위 플레이트를 다시 마그네틱 플레이트 위에 올리고 2분간 방치한 후 상등액을 제거하고, 50 ul GS#-UB1을 넣어주었다. 다시 위 과정을 반복하고, 35 ul GS#-IP1을 넣어주고 잘 혼합한 후 95℃ heat block에서 1분간 배양(incubation)하였다. 플레이트를 마그네틱 플레이트 위에 올리고 2분간 방치하였다. 상등액 30 ul를 GS#-PCR 플레이트에 옮긴 후 64 ul의 illumina-recommended DNA polymerase와 100 ul UDG를 GS#-MMP tube에 넣어준 후 잘 섞어주고, 표 2에 나타낸 조건으로 증폭시켰다.

	온도	각 온도에서의 시간
1 사이클	37℃	10 min
1 사이클	95℃	3 min
34 사이클	95℃	35 sec
	56℃	35 sec
	72℃	2 min
1 사이클	72℃	10 min
1 사이클	4℃	5 min

반응 후에 20 ul의 GS#MPB를 넣고 잘 혼합한 후, 96 well-plate 에 옮기고, 암실에서 60분 동안 방치하였다. 필터 플레이트 어댑터를 96 well plate(V-bottom)에 놓고, 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 다시 필터 플레이트에 50 ul GS#-UB2를 넣고 1000 x g에서 5 분간 원심분리하였다. 30 ul의 GS#_MH1가 들어있는 GS#-INT 플레이트를 필터 플레이트 위에 놓고, 30 ul의 0.1N NaOH를 필터 플레이트에 넣었다. 1000 xg에서 5 분간 원심분리하여 PCR 생산물을 수거하였다.

칩을 GS#-UB2와 NaOH에서 전 처리하고, 수거한 PCR 산물을 384웰에 옮기고 여기에 전처리한 칩을 올렸다. 60 ℃에서 30 분 동한 혼성화시키고 다시 온도를 45℃로 바꾸고 14시간 이상 혼성화시켰다. GS#UB2, GS#IS1에서 세척한 후에 상온에서 건조시킨 후, 분석을 위해서 이미지 스캐닝(image scanning)을 실시하였다.

유전자형 분석 이미지 파일로부터의 유전자형의 분석은 Illumina사의 Bead Studio Version 3.2 를 사용하여 각 다형성에 대한 유전자형를 정하였다.

4. 통계학적 분석

단일염기다형들을 구성하는 대립인자들에 대한 집단내의 유전학적 분포여부에 대하여 하아디-와인버그 평형 검정을 하였다. 여기에서 단일염기다형의 기준이 되는 HWE p value > 0.05와 작은 대립인자 빈도(Minor Allele Frequency; MAF) > 0.1의 기준을 적용하였다. 자폐증 환자군과 정상군 간의 출현빈도를 이용하여 질병에 대한 각 단일염기다형들의 연관성분석은 유의수준을 < 0.05로 정하였으며, SAS software version 9.1.3를 사용하여 분석하였다. 연관성분석은 대립인자들 간의 자폐증 환자군과 정상군에서의 출현빈도로 나누어 유의성 있는 차이를 비교하였으며, 유의수준을 < 0.05로 하였다. 오즈 비(Odds Ratio)는 로지스틱 회귀모형을 통하여 산출하였으며 우성 (Dominant), 열성 (Recessive) 및 공우성(Co-Dominant) 모형을 적용하였다. 각 모형에 따른 질병과의 유의성을 분석함에 있어 다수 대립인자를 A1이라 하고 소수 대립인자를 A2라 하면 우성 (Dominant) 모형은 A1A1의 빈도와 A1A2와 A2A2의 빈도에 대한 합을 비교하는 것이고, 열성 (Recessive) 형질 모형은 A1A1과 A1A2의 합과 A2A2의 빈도를 비교하는 것이고, 공우성 (Co-Dominant) 형질 모형은 A1A1, A1A2 및 A2A2에 대한 각각의 빈도를 비교하는 것이다.

5. 결과

(1) DEFA4 유전자에 존재하는 유의성을 나타내는 단일염기다형

하기 표 3는 상기 자폐증 환자군과 정상군이 참여하여 자폐증과의 연관성을 분석한 결과 통계학적으로 유의성을 나타낸 서열번호 1의 다형성 서열의 특성을 나타낸 것이다.

서열번호	Reference SNP ID	대립인자	위치	SNP역할	아미노산 변화
1	rs10089687	T>C	6783261	5' UTR	변화없음

ㆍ서열번호는 각 단일염기다형을 나타내는 서열번호이다.

ㆍReference SNP ID는 표준단일염기다형의 명칭 (Reference SNP ID; rs)을 의미하며, 이는 인간게놈프로젝트 후, 미국 국립보건원 산하 생물공학정보연구소 (NCBI)의 데이터베이스에서 각 단일염기다형을 구분하기 위하여 붙인 이름이다.

ㆍ대립인자는 각 단일염기다형에서의 Major allele과 Minor allele을 나타낸다.

ㆍ위치는 염색체상에서 표준염기서열의 위치를 의미한다(NCBI Genome build 36.3).

ㆍSNP 역할은 상기 단일염기다형들이 유전자상에서 어디에 위치하고 있는지를 나타내주고 있다. 따라서 각각의 단일염기다형들이 유전자의 발현과 기능에 있어서 어떻게 작용하는지를 알 수 있다.

ㆍ아미노산의 변화는 상기 단일염기다형들이 유전자가 발현되어 단백질을 생성할 때, 그 단백질을 이루는 아미노산에 변화를 주고 있는지에 대한 설명이다.

(2) 유전자형(genotype) 및 위험대립인자 분석

하기 표 4은 자폐증 연관 단일염기다형에 속하는 단일염기다형(서열번호 1)의 DNA 서열의 대립인자 빈도와 각 유전자형에 대한 자폐증 환자군과 정상군 각각의 빈도를 나타내며, 표 5는 표 4의 대립인자형 빈도 및 유전자형 빈도를 토대로 진행한 하아디-와인버그 평형 검정(Hardy-Weinberg Equilibrium Test) 결과와 자폐증 연관성 분석[즉, 케이스-컨트롤 연관 분석(Case-control association study)] 결과로서, 하기 연관성 분석에 의해 자폐증에 영향을 미칠 수 있는 단일염기다형들과 이들의 유전자형을 확인할 수 있다.

대립인자형 빈도 및 유전자형 빈도

서열번호	Reference SNP ID	대립인자형 빈도		유전 자형	유전자형 빈도(%)
		Major allele	Minor allele		정상군	자폐증군
1	rs10089687	0.689 (T)	0.311 (C)	TT	103 (70.06)	56 (31.46)
				TC	40 (27.21)	90 (50.56)
				CC	4 (2.72)	32 (17.98)

ㆍ서열번호는 각 단일염기다형을 나타내는 서열번호이다.

ㆍ 대립인자형 빈도(allele frequency) 란에서는 각각의 단일염기다형을 구성하는 두 개의 뉴클레오티드 염기를 표시하며, 집단 내에서 관찰되는 각각의 대립인자들의 빈도를 나타내고 있다. 여기서 대립인자란 단일염기다형 부위에 실제로 존재하고 있는 뉴클레오티드의 염기서열을 뜻하며, 하나의 단일염기다형은 그 특성상 두 개의 대립인자를 가질 수 있다. 이들 대립인자 빈도의 고저에 따라 큰 대립인자(Major allele)와 작은 대립인자(Minor allele)로 나뉜다. 특히 작은 대립인자의 빈도(Minor allele frequency; MAF)는 0.1을 기준으로 하여 단일염기다형과 단일염기변이(point mutation)을 나누는 유전학적 기준으로 사용된다. 이러한 기준은 다형성 자체의 안정성을 뜻하기 때문에(즉, 단일염기다형이 일어나는 부위는 ‘일정하다’ 라는 뜻), 유전적 표지인자로써의 사용 가능성을 대변해 준다.

ㆍ 유전자형은 각 단일염기다형을 형성하는 각각의 대립인자들로 이루어지며, 단일염기다형 부위가 존재하는 유전자좌(locus)에 어떠한 대립인자들이 있는지를 나타내 주고 있다.

ㆍ 유전자형 빈도(genotype frequency) 란은 단일염기다형을 형성하는 각각의 대립인자들로 이루어지며, 단일염기다형 부위가 존재하는 유전자좌(locus)에 어떠한 대립인자들이 있는지를 나타내 주고 있다. 여기서 큰 대립인자들로만 구성되어 있는 유전자형을 큰 동형유전자형(Major homotype), 큰 대립인자와 작은 대립인자로 이루어진 유전자형을 이형유전자형(Heterotype), 그리고 작은 대립인자들로만 이루어진 유전자형을 작은 동형유전자형(Minor homotype)이라고 한다. 숫자들은 각각의 유전자형에 해당하는 사람들의 수를 정상군과 자폐증 환자군으로 나누어 나타낸다. 이를 관측치라고 할 수 있다.

케이스-컨트롤 연관 분석

서열번호	Reference SNP ID	HWE	분석모델	OR (95% CI)	Logit p value	위험대립인자
1	rs10089687	0.244	대립인자	3.907 (2.689-5.677)	1.53 X 10^-13	C
			공우성	4.006 (2.673-6.002)	1.75 X 10^-11
			우성	5.010 (3.175-8.193)	1.62 X 10^-11
			열성	7.836 (2.702-22.723)	0.000151

표 5는 하나의 단일염기다형을 이루는 두 개의 대립인자와 이로 인하여 형성되는 3가지 형태의 유전자형에 대한 자폐증 환자군과 대조군 간의 빈도차이를 비교하여 어떠한 대립인자가 또는 어떠한 유전자형이 질병과 연관되어 있는지를 분석한 결과이다. 이러한 연관성 분석은 대립인자형(allele model), 공동-우성 유전자형(Co-dominant model), 우성 유전자형(Dominant model), 그리고 열성 유전자형(Recessive model)이라는 네 가지 항목에서 실시하였다. 표 5에 있어서 각 칼럼이 의미하는 바는 다음과 같다.

ㆍ서열번호는 각각의 단일염기다형을 나타내는 번호이다.

ㆍHWE는 하아디-와인버그 평형 (Hardy-Weinberg Equilibrium)의 상태를 나타내는 것이다. 카이제곱 (df=1) 검정에서 chi-value = 3.84(p-value=0.05, df=1)을 기준으로, 3.84보다 큰 경우에는 하아디-와인버크 평형 HWE (Hardy-Weinberg Equilibrium)으로 판단하고, 3.84보다 작은 경우에는 하아디-와인버그 비평형 (Hardy-Weinberg Disequilibrium)으로 판단하였다. 이는 자폐증 환자군과 대조군 모두에서 관찰된 각 단일염기다형들의 유전적 표지인자로서의 기능과 이들로 이루어지는 유전자형의 분포가 일반적인 것들인지를 나타낸다.

ㆍ오즈 비율 (odds ratio, OR)은 자폐증 환자 중에서 위험 대립인자를 가질 오즈에 대한 대조군 중에서 위험 대립인자를 가질 오즈의 비율을 나타낸다. 95% CI는 오즈 비율의 95% 신뢰구간을 나타내는 것으로, (하한 신뢰구간, 상한 신뢰구간)을 나타낸다. 신뢰구간은 1을 포함하는 경우에는 질병과의 연관성을 유의하다고 판단할 수 없다. 오즈비율이 1보다 크고 95%신뢰구간에 1이 포함되어 있지 않은 경우 소수 대립인자가 질환군에서 더 높은 빈도를 가지며, 오즈비율이 1보다 작은 경우에는 다수 대립인자가 질환군에서 더 높은 빈도를 가진다.

ㆍ대립인자형에 대한 연관성 분석에서 Logit_p value는 오즈비에 대한 통계적 유의성을 나타낸다. 이는 오즈비 만큼 자폐증 환자군과 대조군간에 차이에 대한 유의성을 뜻한다. 여기서 유의성있는 차이가 있다고 판단하는 기준은 Logit_p value가 0.05 이하의 값을 나타낼 경우이다. 이러한 값은 로지스틱 회귀(logistic regression) 분석을 통하여 얻었다.

ㆍ위험 대립 인자 (risk allele)는 p-value에 유의성이 있는 경우 오즈비가 1 보가 크면 소수 대립인자, 오즈비가 1 보다 작으면 다수 대립인자로 하였다.

ㆍ각 네 가지 분석모델에 따른 질병과의 유의성을 분석함에 있어 다수 대립인자를 A1이라 하고 소수 대립인자를 A2라 하면 우성 (Dominant) 모형은 A1A1의 빈도와 A1A2와 A2A2의 빈도에 대한 합을 비교하는 것이고, 열성 (Recessive) 형질 모형은 A1A1과 A1A2의 합과 A2A2의 빈도를 비교하는 것이고, 공우성 (Co-Dominant) 형질 모형은 A1A1, A1A2 및 A2A2에 대한 각각의 빈도를 비교하는 것이다.

대립인자 (Allele)에 대한 연관성 분석은 대립형질들이 자폐증 환자군과 정상군 사이에서 출현되는 빈도수의 비율을 통하여 위험 대립인자가 자폐증에 어느 정도의 연관성 (위험도)를 가지고 있는지 확인할 수 있다. 95% 신뢰구간에 1을 포함하고 있을 경우 유의성이 없기 때문에, 상기 표 5로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 서열번호 1의 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열이 C (위험 대립인자)인 경우, 자폐증에 걸릴 가능성이 높은 것으로 판단할 수 있다.

또한, 서열번호 1은 대립인자와 공우성과 우성 모델에서 유의성을 보이며, 서열번호 1은 오즈비가 > 1로 유전자형(genotype)이 소수대립인자(Minor Allele)를 가지고 있는 사람이 다수대립인자(Major Allele)를 가지고 있는 사람보다 자폐증에 걸릴 위험이 더 높은 것으로 나타났고 또한 유전자형이 소수 대립인자를 하나라도 가지고 있는 사람이 다수대립인자 둘로 구성된 사람보다 자폐증에 걸릴 위험이 높은 것으로 나타났다.

상기 결과로부터, 서열번호 1의 다형성 부위가 각각 유전자형이 T/C와 C/C가 존재하는 경우 자폐증에 걸릴 위험도가 높은 것으로 판단할 수 있다. 또한 서열번호 1의 경우는 C가 정상군에 비해 자폐증군에서 유의적으로 높은 출현빈도로 나타났으므로, 이는 각각의 대립인자들이 자폐증에 감수성(susceptibility)을 가진다고 예측할 수 있다. 상기 위험 대립 인자를 갖는 핵산 서열이 하나의 검체에서 많이 검출되면 될수록 위험군에 속하는 확률은 더 높은 것으로 판단할 수 있다. 반대로, 서열번호 1의 경우는 T가 자폐증군에 비해 정상군에서 유의적으로 높은 출현빈도로 나타났으므로, 이는 각각의 대립인자를 가진 사람들은 자폐증에 저항성을 가지고 있다고 예측할 수 있다.

상기와 같은 분석의 결과를 볼 때, 각 대립인자는 각 개체에 있어서 동형접합자 (homozygote) 또는 이형접합자 (heterozygote)의 형태로 존재할 수 있다. 멘델의 유전법칙과 하디-와인버그 (Hardy-Weinberg) 법칙에 의하면, 집단을 구성하는 대립인자의 조성은 일정한 빈도로 유지되며, 통계적으로 유의한 경우 생물학적 기능상의 의미를 부여할 수 있다. 본 발명의 단일염기다형은 자폐증 환자와 정상군사이에서 통계적으로 유의한 수준으로 차이를 나타내며 출현되어, 이들 단일염기다형들은 자폐증의 진단에 사용될 수 있음을 알 수 있다.

<110> College of Medicine Pochon CHA University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Polynucleotides comprising single nucleotide polymorphism derived from DEFA4 gene, microarrays and diagnostic kits comprising the same, and detection methods using the same <130> PN0257 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 501 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cagccgccag acacccagat agaagttcac agcaggggct tcacccgctg ggtccctctg 60 gggtggcccc acagtgagag gtcagactgg ggacacagct tcaatattga aacctcaatg 120 tgaaagttta agttttgtgt tacttacaga tcctcaagct aggcagggcg agcagagagg 180 gcagacagca gtcctgtgtt ccaggtctta tgtagcaaga gcagccatgc acacagagga 240 gaggacttcc ytatttaagg gtcttttggt atcaggtgtc ctaatttttc agggttactt 300 tctattgggt actttaaata actgttaaca agggcagttg agaaatttgg cagaaagctg 360 gagttcaagc aggagtccac ggaggtaccg acccctcgtc tactttggtc agccctggcc 420 aggcccaggc agcaatcaac tatggattcc tcatgactcc taagacaatt gaccccatga 480 tacctatgct ggtggctgag g 501

Claims

서열번호 1의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 251번째 염기(다형성 부위)가 C이고, 상기 251번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 길이가 10 내지 100 뉴클레오티드인 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드.
제1항 또는 제2항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 자폐증 진단을 위한 증폭용 프라이머.
제1항 또는 제2항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 자폐증 진단용 프로브.
제4항에 따른 자폐증 진단용 프로브를 포함하는 마이크로어레이.
제1항 또는 제2항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 자폐증 진단용 키트.
자폐증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, (i) 검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계; 및 (ii) 상기 핵산 시료로부터, 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드의 다형성 부위의 염기 서열을 분석하는 단계 (단, 상기 다형성 부위는 251번째 염기를 의미한다)를 포함하는, 검체 중의 단일염기다형을 검출하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 다형성 부위의 염기 서열을 분석하는 단계가 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열로부터 유래된 서열로서 다형성 부위를 포함하는 서열(단, 상기 다형성 부위는 251번째 염기를 의미한다)을 주형으로 하는 프라이머 또는 프로브를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 검체 중의 단일염기다형을 검출하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 다형성 부위의 염기 서열을 분석하는 단계가 서열번호 1의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 251번째 염기(다형성 부위)가 C이고, 상기 251번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드가 고정된 마이크로어레이에 상기 핵산 시료를 혼성화시키는 단계; 및 얻어진 혼성화 결과를 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 검체 중의 단일염기다형을 검출하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 마이크로어레이에 고정되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 의 상보적 폴리뉴클레오티드의 DNA 서열의 길이가 각각 10 내지 100 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는, 검체 중의 단일염기다형을 검출하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 다형성 부위의 염기 서열을 분석하는 단계가 서열번호 1의 DNA 서열의 251번째 염기의 유전자형(genotype) 분석에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 검체 중의 단일염기다형을 검출하는 방법.