JP5709104B2 - オリゴヌクレオチドプローブ及びその利用 - Google Patents
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Description
(式中、Xはフルオロホアを表し、R1は、炭素数が2又は3であって置換されていてもよいアルキレン鎖を表し、R2は、炭素数が0以上2以下であって置換されていてもよいアルキレン鎖を表し、Zは、直接の結合又は連結基を表す。)
前記ステムの隣り合うヌクレオチド間の前記少なくとも1個のフルオロホアと対合可能な部位に配置される以下の式(2)で表されるユニットに連結される少なくとも1個のクエンチャーと、
(式中、Yはクエンチャーを表し、R1は、炭素数が2又は3であって置換されていてもよいアルキレン鎖を表し、R2は、炭素数が0以上2以下であって置換されていてもよいアルキレン鎖を表し、Zは、直接の結合又は連結基を表す。)
を備える、プローブが提供される。なお、上記式(1)及び(2)において、ホスホジエステル結合におけるリン酸基(PO3 -)は、非解離型(PO3H)であってもよい。
本明細書に開示のオリゴヌクレオチドプローブは、図1及び図2に示すように、ステム及びループを形成可能であり、そのステムにおいてフルオロホアとクエンチャーとを備えている。
本明細書に開示のプローブ固定化体は、固相担体と、前記標的核酸と特異的にハイブリダイゼーション可能な塩基配列を有し、本明細書に開示のオリゴヌクレオチドプローブと、を備えることができる。本明細書に開示のプローブ固定化体においては、モレキュラービーコンをプローブとして用いることが好ましい。
本明細書に開示の標的核酸の検出方法は、本明細書に開示のオリゴヌクレオチドプローブであって、標的核酸と特異的にハイブリダイゼーション可能な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いて、前記モレキュラービーコンの前記フルオロホアに基づくシグナルを検出する方法とすることができる。本明細書に開示の検出方法においては、オリゴヌクレオチドプローブはモレキュラービーコンであることが好ましく、より好ましくは、複数のオリゴヌクレオチドプローブ(典型的にはモレキュラービーコン)を固相担体に固定化した固定化体を用いることが好ましい。
本実施例では、フルオロホア又はクエンチャーを連結するユニット(炭素数3)のアミダイトモノマー(化合物A)を以下のスキームに従い合成した。300mlのナスフラスコにD−トレオニノール(0.99g,9.41mmol)をテトラヒドロフラン(THF)75mlに溶解させ、トリエチルアミン15mlを加え、攪拌した。次に、75mlのTHFに溶解させておいたクロロギ酸アリル(1.01ml,9.51mmol)を、氷浴中で上記のTHF溶液に滴下した。15分後に氷浴を除いて室温に戻し、そのまま攪拌を続け、THF溶液を滴下し終わってから1時間30分後に反応を停止した。この後、溶媒をエバポレーターで留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフ法(展開溶媒 クロロホルム:メタノール=3:1)で精製し、化合物1−1を得た。
本実施例では、フルオロホア又はクエンチャーを連結するユニット(炭素数2)のアミダイトモノマー(化合物B)を以下のスキームに従い合成した。
本実施例では、フルオロホアとしてのチアゾールオレンジ誘導体を以下のスキームに従い、合成した。
本実施例では、以下に示すクエンチャーが導入されたオリゴヌクレオチド及びフルオロホアが導入されたオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成した。ただし、PEはペリレンを表し、MRはメチルレッドを表し、Azoはアゾベンゼンを表す。
クエンチャーとしてのアゾベンゼン、メチルレッド、あるいはペリレンを導入したDNAの合成は、ABI394型DNA合成機を使用し、対応するホスホロアミダイトモノマー(化合物C,D,E)と4つの天然の塩基に対応する市販のホスホロアミダイトモノマーを用いてネイチャー・プロトコルズ(Nature Protocols)誌2007年第2巻203ページから212ページに記載の方法で合成・精製した。
チアゾールオレンジ(TO−1、TO−2)とFITCのオリゴヌクレオチドへの導入は、アリルオキシカルボニル基で保護したホスホロアミダイトモノマーを経由した以下のスキームに示す方法で行った。
各種のフルオロホアがクエンチャーとの“塩基対形成”によって消光することを確認するため、実施例4で合成したオリゴヌクレオチドを用いて蛍光および吸収スペクトルを測定した。吸収スペクトルおよび蛍光スペクトル測定のための溶液の条件は以下の通りである。
Qb配列あるいはNbのオリゴヌクレオチド:5μmol/l
塩化ナトリウム:0.1mol/l
リン酸バッファー:10mmol/l(pH7.0)
標的核酸Nbの濃度:0.4μmol/l
塩化ナトリウム:0.1mol/l
リン酸バッファー:10mmol/l(pH7.0)
MB1−C2−TO1−MRにMB−tを加える前後での520nmでの励起における531nmのチアゾールオレンジからの蛍光強度を以下の表に示す。
MB2−C2−TO1−MRにMBtを加える前と後での、510nmでの励起における531nmのチアゾールオレンジからの蛍光強度を以下に示す。
比較例として、MB−contにMBtを加える前後での494nmでの励起における520nmのFITCからの蛍光強度を以下に示す。
MB1−C3−PE−AzoにMBtを加える前後での425nmでの励起における460nmのペリレンからの蛍光強度を以下の表に示す。
MB2−C3−PE−AzoにMBtを加える前後での425nmでの励起における460nmのペリレンからの蛍光強度を以下の表に示す。
以下のスキームに従い、4-[4-メチルチオフェニルアゾ]安息香酸を含むアミダイトモノマーを合成した。まず、パラ-ニトロソ安息香酸エチル(4-1)を、ジャーナル・オブ・ジ・オーガニック・ケミストリー(Journal of the Organic Chemistry)誌1970年第35巻505−508頁に記載の方法で合成した。このニトロソ化合物4−1を二口ナスフラスコに入れ窒素置換し、p−メチルチオアニリン4−2を加え、更に酢酸を溶媒として加えて、遮光しながら終夜反応させた。この反応溶液に蒸留水を加えた後に、酢酸エチルを加えて分液漏斗で十分に振とうした。続いて酢酸エチル層を蒸留水、飽和重炭酸ナトリウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液で順に洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた後、溶媒の酢酸エチルを留去した。得られたものを更にシリカゲルクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=15:1)で精製し、化合物4−3を得た(収率50%)。
以下のスキームに従い、Cy3を含むアミダイトモノマーを合成した。まず、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー(Journal of the American Chemical Society)誌2001年第125巻361−362ページ記載の方法で、Cy3(5−1)を得た。次に、アゾベンゼンの代わりにCy3(5-1)を用いる以外はネイチャー・プロトコルズ(Nature Protocols)誌2007年第2巻203ページから212ページに記載の方法に従って、アミダイトモノマー5−2を得た。
ビーコンの濃度:0.2μmol/l
標的核酸Nbの濃度:0.4μmol/l
塩化ナトリウム:0.1mol/l
リン酸バッファー:10mmol/l(pH7.0)
<MB1−C3−PE−S>
MB1−C3−PE−SにMBtを加える前後での425nmでの励起における460nmのペリレンからの蛍光強度を以下の表に示す。
MB2−C3−PE−SにMBtを加える前後での425nmでの励起における460nmのペリレンからの蛍光強度を以下の表に示す。
<MB1−C3−PE−Q>
MB1−C3−PE−QにMBtを加える前後での425nmでの励起における460nmのペリレンからの蛍光強度を以下の表に示す。
MB2−C3−PE−QにMBtを加える前後での425nmでの励起における460nmのペリレンからの蛍光強度を以下の表に示す。
MB3−C3−PE−QにMBtを加える前後での425nmでの励起における460nmのペリレンからの蛍光強度を以下の表に示す。
<MB1−C3−Cy3−MR>
MB1−C3−Cy3−MRにMBtを加える前後での546nmでの励起における563nmのCy3からの蛍光強度を以下の表に示す。
MB2−C3−Cy3−MRにMBtを加える前後での546nmでの励起における563nmのCy3からの蛍光強度を以下の表に示す。
以下のスキームに従い、MRNO2を含むアミダイトモノマーを合成した。4−アミノ−3−ニトロ安息香酸を酢酸と水の混合溶媒に溶解し、これに亜硝酸ナトリウムの塩酸酸性溶液を加え15−20℃で15分間攪拌し、さらに氷水を加えることでジアゾニウム塩の水溶液を得た。次にN,N−ジメチルアニリンの塩酸酸性溶液を氷浴上で0-5℃に保ちつつ、上記ジアゾニウム塩の水溶液を滴下することで、4’−ジメチルアミノ―2−ニトロアゾベンゼン―4−カルボン酸(6−1)を得た。次に、アゾベンゼンの代わりに4’−ジメチルアミノ―2−ニトロアゾベンゼン―4−カルボン酸(6−1)を用いる以外はネイチャー・プロトコルズ(Nature Protocols)誌2007年第2巻203ページから212ページに記載の方法に従って、アミダイトモノマー(6−2)を得た。
ビーコンの濃度:0.2μmol/l
標的核酸Nbの濃度:0.4μmol/l
塩化ナトリウム:0.1mol/l
リン酸バッファー:10mmol/l(pH7.0)
MB1−C3−Cy3−MRNO2にMB−tを加える前後での546nmでの励起における566nmのCy3からの蛍光強度を以下の表に示す。
分光蛍光光度計 日本分光製FP-6500
励起バンド幅 3 nm
蛍光バンド幅 3 nm
レスポンス 0.1 sec
感度 middle
走査速度 200 nm/min
MB2−C3−Cy3−MRNO2にMB−tを加える前後での546nmでの励起における566nmのCy3からの蛍光強度を以下の表に示す。
さらに、表17と表19のように標的核酸がビーコンの蛍光色素側の鎖と二重鎖を形成しても、表18と表20のようにビーコンのクエンチャー側の鎖と二重鎖を形成しても、消光−発光現象を確認できた。
(配列表フリーテキスト)
配列番号1〜8:合成オリゴヌクレオチド
Claims (13)
- ステム及びループを形成可能なオリゴヌクレオチドプローブであって、
前記ステムの隣り合うヌクレオチド間に配置される以下の式(1)で表されるユニットに連結される少なくとも1個のフルオロホアと、
前記ステムの隣り合うヌクレオチド間の前記少なくとも1個のフルオロホアに対合可能な部位に配置される以下の式(2)で表されるユニットに連結される少なくとも1個のクエンチャーと、
を備え、
前記少なくとも1個のフルオロホアと前記少なくとも1個のクエンチャーとはスタッキングされている、プローブ。 - 前記フルオロホアは、標的核酸と特異的にハイブリダイゼーションする塩基配列を構成するヌクレオチド鎖の内部に配置される、請求項1に記載のプローブ。
- 前記フルオロホアは、シアニン系色素、メロシアニン系色素、縮合芳香環系色素、キサンテン系色素、クマリン系色素及びアクリジン系色素からなる群から選択されるいずれかであり、前記クエンチャーは、アゾ系色素からなる群から選択されるいずれかである、請求項1又は2のいずれかに記載のプローブ。
- 前記フルオロホアは、Cy3、Cy5、チアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー、ペリレン、フルオレッセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、テキサスレッド、クマリン及びアクリジンから選択されるいずれかであり、前記クエンチャーは、メチルレッド、アゾベンゼン及びメチルチオアゾベンゼンから選択されるいずれかである、請求項3に記載のプローブ。
- 前記フルオロホアは、縮合芳香環系色素であり、前記クエンチャーは、アントラキノン又はその誘導体である、請求項1〜4のいずれかに記載のプローブ。
- 前記フルオロホアはペリレンであり、前記クエンチャーはアントラキノンである、請求項5に記載のプローブ。
- 一つの前記ステムと一つの前記ループを形成可能である、請求項1〜6のいずれかに記載のプローブ。
- 標的核酸を検出するためのプローブ固定化体であって、
固相担体と、
前記標的核酸の少なくとも一部と特異的にハイブリダイゼーション可能な塩基配列を有し、前記固相担体に保持された請求項1〜7のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブと、
を備える、固定化体。 - 前記固相担体は、プレート状体である、請求項8に記載の固定化体。
- 複数の前記標的核酸をそれぞれ検出可能な複数のオリゴヌクレオチドプローブを備える、請求項8又は9に記載の固定化体。
- SNP又は遺伝子変異の検出用である、請求項8〜10のいずれかに記載の固定化体。
- 標的核酸の検出方法であって、
請求項1〜7のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブであって、前記標的核酸の少なくとも一部と特異的にハイブリダイゼーション可能な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いて、前記オリゴヌクレオチドプローブの前記フルオロホアに基づくシグナルを検出する、方法。 - 複数の標的核酸に対応してハイブリダイゼーション可能な複数の前記オリゴヌクレオチドプローブを固相担体上に保持した固定化体を用いる、請求項12に記載の方法。
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