JP5717169B2 - オリゴヌクレオチド及びその利用 - Google Patents
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Description
、第2のユニット:
請求項1〜5のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドをプローブとして固相担体に固定化された固定化体が提供される。
本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、その長さは特に限定しないが、好ましくは10塩基以上100塩基以下程度である。また、本オリゴヌクレオチドは、100塩基を超える長さであってもよい。
第1のユニットは、式(1)で表される。第1のユニットは、ペリレン基を有している。ペリレン基は、光化学的に安定であり、量子効率が高いという利点がある。ペリレン基はR1基に連結される炭素原子以外の1又は2以上の炭素原子に結合する水素原子は適宜置換されていてもよい。置換基は、特に限定されないが、例えば、それぞれ独立に、水素原子;未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数1〜20のアルキル基もしくはアルコキシ基;未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数2〜20のアルケニル基もしくはアルキニル基;水酸基;ハロゲン原子;アミノ基;ニトロ基;またはカルボキシル基を表すことができる。
第2のユニットは式(2)で表される。第2のユニットは、第1のユニットと同様、ペリレン基を有している。第1のユニットと同様、ペリレン基は適宜置換されていてもよい。
本オリゴヌクレオチドに第1のユニット及び第2にユニット、第1のユニット及びクエンチャーユニット、並びに第2のユニット及びクエンチャーユニットをそれぞれ組み込むことで本オリゴヌクレオチドを得ることができる。第1のユニット及び第2のユニット並びに既に説明した他の組み合わせのオリゴヌクレオチドへの導入は、従来公知のDNA固相合成法において、ヌクレオチドに対応するアミダイト誘導体に代えてこの種のユニットを導入なアミダイド誘導体を用いることによって可能となる。アミダイト誘導体を取得する方法としては、例えば、以下のスキームが例示される。
本明細書の開示によれば、オリゴヌクレオチドプローブ固定化体であって、固相担体に本オリゴヌクレオチドがプローブとして固定化されている。本オリゴヌクレオチドはモレキュラービーコンを形成可能であってもよい。
本明細書の開示によれば、欠失変異又は挿入変異の検査方法であって、欠失変異又は挿入変異の存否をそれぞれの野生型との間で区別可能に構成した本オリゴヌクレオチドプローブと、被験DNA含有試料とを接触させる工程、を備える、検出方法が提供される。本検査方法によれば、1塩基又は2塩基以上の欠失や挿入に係る変異を通常のハイブリダイゼーション操作で簡易に検出することができる。本検査方法の用途は、プローブ固定化体と同様、各種疾病の診断、発症予測、予後予測等が挙げられる。
(1)検出しようとする変異型を野生型と識別可能に構成したオリゴヌクレオチドプローブを固定化したアレイを準備する。オリゴヌクレオチドプローブは、欠失を有しない野生型の塩基配列に相補的な塩基配列を有し、変異により欠失される1塩基又は2以上の塩基で離間して第1のユニット、第2にユニット及びクエンチャーユニットから選択される2種を含んでいる。
(2)アレイに対して、被験DNA含有試料(以下、単に被験試料という。)を供給し、所定のハイブリダイゼーション条件下、ハイブリダイゼーション反応を実施する。
(3)所定時間経過後、アレイを洗浄し、被験試料中のDNAとオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションを、ペリレンの発する蛍光シグナルを検出することによって行う。
(4)被験試料が、ターゲットDNAを含むとき、すなわち、変異型DNAを含むとき、変異型DNAは、オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーションする。しかし、変異型DNAの欠失箇所にプローブ側にバルジが形成される。この結果、このプローブにおいては、第1のユニットと第2にユニットとによるエキシプレックス発光による蛍光を観察することができる。エキシプレックス発光は、バルジを形成しない野生型とのハイブリダイゼーション時における蛍光よりも長波長側にシフトしており、両者を区別することができる。なお、蛍光シグナルの検出は、蛍光スキャナー等により行うことができる。
本明細書に開示される検査キットは、欠失変異又は挿入変異の検査キットであって、1塩基又は2塩基以上の前記欠失変異又は3塩基以上の前記挿入変異の存否をそれぞれの野生型との間で区別可能に構成した本オリゴヌクレオチドプローブを含むことができる。本キットは、オリゴヌクレオチドプローブとして固定化体を含んでいてもよい。
本実施例では、以下のスキームに従い、エチニルペリレン(以下、Fともいう。)をオリゴヌクレオチドに導入するためのアミダイトモノマーを合成した。
本実施例では、以下のスキームに従い、フェニルエチニルペリレン(以下,Lともいう。)を導入するためのアミダイトモノマーを合成した。
収量:0.22 g(0.280 mmol) 収率:58.3 %
F1a : 5’-GGTATCFGCAATC-3’
L1a : 5’-GGTATCLGCAATC-3’
So (native) : 5’-GATTGCGATACC-3’
FAF : 5’-GGTATCFAFGCAATC-3
LAL : 5’-GGTATCLALGCAATC-3
FAL : 5’-GGTATCFALGCAATC-3
Target DNA
So : 5’-GATTGCGATACC-3’
T1 : 5’-GATTGCTGATACC-3’
FCTTL : 5’-AATATCATFCTTLTGGTGTTT-3
FCTTF : 5’-AATATCATFCTTFTGGTGTTT-3
LCTTL : 5’-AATATCATLCTTLTGGTGTTT-3
Target DNA
WT(野生型) : 5’-CATAGGAAACACCAAAGATGATATTTTCTTT-3’
MU(三塩基欠失型) : 5’-CATAGGAAACACCAATGATATTTTCTTT-3’
Claims (13)
- オリゴヌクレオチドであって、
1塩基以上6塩基以下のヌクレオチドで離間されて、第1のユニット;
、第2のユニット;
クエンチャーユニットから選択される2種を備える、オリゴヌクレオチド。 - 前記第1のユニットは、以下の式で表される、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記第2のユニットは、以下の式で表される、請求項1又は2に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドは、3塩基以上の欠失変異又は挿入変異の検出用プローブである、請求項1〜3のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
- モレキュラービーコンを形成可能であって、モレキュラービーコン形成時におけるステムの一方の鎖に前記第1のユニット及び前記第2のユニットを備えるとともに、前記第1のユニット及び前記第2のユニットに対するクエンチャーを前記ステムの他方の鎖に備える、請求項1〜4のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
- オリゴヌクレオチドプローブ固定化体であって、
請求項1〜5のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドをプローブとして固相担体に固定化された固定化体。 - 欠失変異又は挿入変異の検査方法であって、
前記欠失変異又は前記挿入変異の存否をそれぞれの野生型との間で区別可能に構成した請求項1〜5のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドと、被験DNA含有試料とを接触させる工程、
を備える、検出方法。 - 前記被験DNA含有試料は、ヒト又は動物から採取したDNAを含む、請求項7に記載の検出方法。
- 疾病の発症可能性の有無の検査方法である、請求項7又は8に記載の検査方法。
- 欠失変異又は挿入変異の検査キットであって、
前記欠失変異又は前記挿入変異の存否をそれぞれの野生型との間で区別可能に構成した請求項1〜5のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブを含む、キット。 - 以下の式(3)で表される化合物。
- 以下の式(4)で表される化合物。
- オリゴヌクレオチドであって、
第1のユニット;
及び
第2のユニット;
のいずれか一方又は双方を備える、オリゴヌクレオチド。
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JP2010206043A JP5717169B2 (ja) | 2010-09-14 | 2010-09-14 | オリゴヌクレオチド及びその利用 |
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JP2010206043A JP5717169B2 (ja) | 2010-09-14 | 2010-09-14 | オリゴヌクレオチド及びその利用 |
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JP2012060901A JP2012060901A (ja) | 2012-03-29 |
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NZ571966A (en) * | 2006-03-16 | 2011-09-30 | Pentabase Aps | Oligonucleotides comprising signalling pairs and hydrophobic nucleotides, stemless beacons, for detection of nucleic acids, methylation status and mutants of nucleic acids |
-
2010
- 2010-09-14 JP JP2010206043A patent/JP5717169B2/ja active Active
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