JP4064717B2 - 核酸塩基配列の解析方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、医薬品や検査薬、診断薬等の分野において利用し得る、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸の配列情報を解析するための試薬及び解析方法に関する。より詳しくは、疾病や病変の原因を突き止め、その修復処置を講じるための、例えば、検体核酸の一塩基変異、一塩基挿入、一塩基欠損等の微少の核酸配列の違いを検出するための試薬及び方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ヒトゲノムプロジェクトを代表とする研究の遂行により、多数の遺伝子の塩基配列情報が明らかにされてきた。なかでも将来可能とされているテーラーメイド医療（患者の体質に応じて薬を使い分ける医療）と関連して、ゲノムレベルでの個体差の代表である一塩基多型（ＳＮＰｓ）の解読とその応用が注目されている。ヒトゲノムＤＮＡの一塩基変異配列を効率よく識別・検出する手法の開拓は、疾患の診断・予防・治療のみならず、望みのテーラーメイド医療の実現に向けて極めて重要な研究課題である。
蛍光性化合物をプローブとなる核酸鎖にラベルし、検体核酸鎖とのハイブリダイゼーション過程を利用して、検体核酸鎖とプローブ核酸鎖との核酸塩基配列の相同性を検出する手法は、従来から知られている。しかしながら、それらの手法は、何れも、検体核酸鎖と結合したプローブ核酸鎖と、結合していないプローブ核酸鎖を、蛍光測定前に分離するいわゆるＢ/Ｆ分離過程が必要とされ、そのため測定過程が複雑化されるか、或いは特殊な装置の利用が不可欠であった。一方、プローブ核酸及び検体核酸がいずれも単鎖核酸である場合には、一塩基変異、一塩基挿入、一塩基欠損などの微少な核酸配列の違いを充分に検出できない欠点があった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、検体核酸鎖と結合したプローブ核酸鎖と、結合していないプローブ核酸鎖を蛍光測定前に分離するいわゆるＢ/Ｆ分離過程を必要とせず、連続的にプローブ核酸・検体核酸間の反応をモニターして、プローブ核酸と検体核酸の反応速度の検出を容易にすることにより、相補性の違いをより厳密に検出する方法とそのための試薬を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、エキサイマー蛍光を発する蛍光物質でラベルしたプローブ核酸単鎖と、単鎖の検体核酸鎖との結合、又は該プローブ核酸単鎖と２重鎖の検体核酸との鎖の交換、に伴う蛍光物質の蛍光挙動の変化を測定することにより、検体核酸鎖とプローブ核酸鎖との相同性を検出する方法に関する。
【０００５】
また、本発明は、エキサイマー蛍光を発する蛍光物質でラベルしたプローブ核酸単鎖と任意の核酸単鎖とからなる２重鎖と、単鎖の検体核酸鎖との鎖の交換に伴う蛍光物質の蛍光挙動の変化を測定することにより、検体核酸鎖とプローブ核酸鎖との相同性を検出する方法に関する。
【０００６】
更に、本発明は、エキサイマー蛍光を発する蛍光物質でラベルしたプローブ核酸単鎖、又はエキサイマー蛍光を発する蛍光物質でラベルしたプローブ核酸単鎖と任意の核酸単鎖とからなる２重鎖と、カチオン性化合物とを含んでなる、検体核酸鎖とプローブ核酸鎖との相同性を検出するための試薬に関する。
【０００７】
更にまた、本発明は、下記一般式［１］
【化７】
（式中、ｎは自然数を表す。）
で示される化合物に関する。
【０００８】
本発明者らは、これまで蛍光性化合物と核酸との相互作用について種々研究を重ねてきたが、その過程において、核酸のハイブリダイゼーションに依存して蛍光挙動が変化するプローブ核酸の設計法について知見を得、プローブ核酸鎖と検体核酸鎖との結合に依存して蛍光発光効率が著しく変化する蛍光プローブ核酸の調製を行ない、先に文献発表している[Tetrahedron 53,4265-4270(1997).; Nucleic Acids Res., 27, 2387-2392(1999).; Angew. Chem. Int. Ed., 40, 1104-1106(2001)]。
今回、本発明者らは、更に研究を重ねた結果、プローブ核酸鎖と検体核酸鎖との結合に依存して蛍光化合物のエキサイマー発光が著しく変化する新規な蛍光核酸プローブの調製に成功した。また、一方で、核酸間の結合及び鎖交換を促進する化合物について研究を行った結果、カチオン性イオンを生成する化合物（以下、カチオン性化合物と呼ぶ。）とりわけ親水性基を持つポリカチオン誘導体が極めて有用であることを見出し、更に、カチオン性化合物存在下での２重鎖核酸と単鎖核酸間の鎖交換過程がプローブ核酸と検体核酸間の相同性を厳密に検出する上で有用であることを見出し、本発明を完成するに到った。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明において、エキサイマー蛍光を発する蛍光物質でラベルしたプローブ核酸単鎖と、単鎖の検体核酸鎖との結合、又は該プローブ核酸単鎖と、２重鎖の検体核酸との鎖の交換、に伴う蛍光物質の蛍光挙動の変化を測定する場合、或いはエキサイマー蛍光を発する蛍光物質でラベルしたプローブ核酸単鎖と任意の核酸単鎖とからなる２重鎖と、単鎖の検体核酸鎖との鎖交換過程に伴う蛍光物質の蛍光挙動の変化を測定する場合の蛍光物質の蛍光挙動の変化としては、蛍光物質間のエキサイマー形成に原理を置くものであることが望ましい。
【００１０】
本発明において用いられるエキサイマー蛍光を発する蛍光物質としては、エキサイマー蛍光を発する化合物であればどのような化合物でもよいが、好ましくはピレン等の多環芳香族化合物に由来するエキサイマー、例えばビスピレン誘導体等が代表的なものとして挙げられる。
【００１１】
本発明において、エキサイマー蛍光を発する蛍光物質として用いられるビスピレン誘導体としては、例えば下記一般式［１］
【化８】
（式中、ｎは自然数を表す。）で示される化合物が挙げられる。
【００１２】
上記一般式［１］で示されるビスピレン誘導体の中で代表的なものとしては、例えば下式［２］
【化９】
で示される２，２−ビス［（４−ピレニルブチルアミド）メチル］−１，３−プロパンジオールが挙げられる。
【００１３】
本発明で用いられるエキサイマー蛍光を発する蛍光物質でラベルしたプローブ核酸、例えば上記式［２］で示されるビスピレン誘導体でラベルしたプローブ核酸を調製するために用いられるビスピレン修飾ホスホロアミダイトは、例えば下記の合成スキームに従って合成される。
【化１０】
上記スキーム中の(1)〜(7)はそれぞれ以下の通りである。
(1)ｐ−トルエンスルホン酸一水和物，アセトン中
(2)フタルイミドＫ塩，ＤＭＦ中
(3)ヒドラジン一水和物，ＥｔＯＨ中
(4)１−ピレン酪酸、Ｎ,Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド，１−ヒドロキシ ベンゾトリアゾール，ＤＭＦ中
(5)０.１Ｎ ＨＣｌ，ＴＨＦ中
(6)４,４'−ジメトキシトリチルクロライド，４−ジメチルアミノピリジン，ピリ ジン中
(7)２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトライソプロピルホスホロジアミダイト，テトラゾール，ＣＨ２Ｃｌ２中
【００１４】
即ち、２，２−ビス（ブロモメチル）−１，３−プロパンジオールを出発原料として、水酸基をイソプロピリデン化により保護して化合物Ｉを得る。次いで、Ｇａｂｒｉｅｌ合成法により化合物IIを得、二段階目の加水分解反応においてジアミン体IIIを得る。このジアミン体IIIと１−ピレン酪酸とをＤＣＣ脱水縮合させることにより化合物IVが得られる。次に、縮合体IVのイソプロピリデン基を酸により脱保護すれば上記式［２］で示される本発明のビスピレン誘導体Ｖを得る。ＤＭＴｒ（ジメトキシトリチル）化は、反応部位である一級の水酸基が２個所あるので、常法とは違いジメチルアミノピリジンを触媒として用いて１時間程度で反応を停止させ、できるだけ二置換体の生成を押さえる。これにより得られた化合物VIのもう一方の水酸基をリン酸化することにより、ＤＮＡ自動合成機に適用可能なビスピレン修飾ホスホロアミダイトユニットを得ることが出来る。
各段階の生成物は１Ｈ ＮＭＲにより構造確認を行えばよい。
【００１５】
本発明で用いられる、エキサイマー蛍光を発する蛍光物質でラベルしたプローブ核酸単鎖、例えばビスピレン修飾ＤＮＡは、オリゴヌクレオチドの５'−末端にビスピレンアミダイトユニットを導入したものであるが、その合成法としては、例えば、上で得られたビスピレン修飾ホスホロアミダイトユニットを使用し、市販のＤＮＡ自動合成機を用いて常法に従って合成を行う方法等が挙げられる。合成後はアンモニア水によって塩基部の脱保護を行い、次いで、逆相高速液体クロマトグラフィー等により精製を行えばよい。
【００１６】
本発明の検出方法は、核酸鎖と核酸鎖の結合又は核酸鎖と核酸鎖の交換に伴う蛍光物質の蛍光挙動の変化を測定することにより行うものであるが、該結合反応及び交換反応に際しては、カチオン性化合物の共存下にこれを行うことが好ましい。カチオン性化合物を共存させることにより、該結合反応及び交換反応が促進されるからである。
【００１７】
本発明において用いられるカチオン性化合物としては、例えば金属イオンやアンモニウムイオン等のカチオン性イオンを生成し得る化合物が挙げられる。金属イオンとしてはどのような金属イオンでも良いが、特にナトリウム、カリウム、リチウム等のアルカリ金属イオンが好ましい。これらカチオン性イオンを生成する化合物の使用量としては、反応系内において金属イオンの濃度が３００ｍＭ以上の濃度になるような量を用いることが好ましい。
また、本発明に係るカチオン性化合物としては、多価のカチオン性化合物が好ましいものとして挙げられ、例えば親水性基を有するポリカチオン性化合物等が好ましいが、より好ましいものとしては、親水性側鎖を配したポリカチオン性化合物が挙げられる。これらポリカチオン性化合物の使用量としては、プローブ核酸のアニオン量に対し０．０１〜１０００倍当量の広い範囲が挙げられる。
【００１８】
親水性側鎖を配したポリカチオン性化合物としては、例えば、カチオン性基を形成し得るモノマーから構成されるポリマーを主鎖とし、親水性高分子を側鎖とするグラフト共重合体を例示することができる。
カチオン性基を形成し得るモノマーとしては、リジン、アルギニン、ヒスチジン等の塩基性アミノ酸、グルコサミン、ガラクトサミン等のアミノ糖、アリルアミン、エチレンイミン、ジエチルアミノエチルメタクリート、ジメチルアミノエチルメタクリレート等の塩基性合成モノマー等を例示することができる。また、カチオン性基を形成し得るモノマーから構成されるポリマーとしては、これらのカチオン性基を形成し得るモノマーから構成されるポリマーは全て挙げられるが、例えばポリリジン、ポリアリルアミンなどが代表的なものとして挙げられる。
親水性高分子としては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等の水溶性ポリアルキレングリコール、デキストラン、プルラン、アミロース、アラビノガラクタン等の水溶性多糖類、セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン等の親水性アミノ酸を含む水溶性ポリアミノ酸、アクリルアミド又はその誘導体をモノマーとして用いて合成される水溶性高分子、メタクリル酸又はアクリル酸或いはこれらの誘導体（例えばヒドロキシエチルメタクリレート等）をモノマーとして用いて合成される水溶性高分子、ポリビニルアルコール及びその誘導体などを例示することができる。
【００１９】
より好ましいポリカチオン性化合物としては、例えば、Bioconjugate Chem.,9, 292-299(1998)に記載されているデキストラン側鎖修飾α−ポリ（Ｌ−リジン）［以下、「α−ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ」と略記する。］、デキストラン側鎖修飾ε−ポリ（Ｌ−リジン）［以下、「ε−ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ」と略記する。］、デキストラン側鎖修飾ポリアリルアミン［以下、「ＰＡＡ−ｇ−Ｄｅｘ」と略記する。］等を挙げることができる。α−ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ、ε−ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ、ＰＡＡ−ｇ−Ｄｅｘの構造式をそれぞれ以下に示す。
【００２０】
【化１１】
【００２１】
【化１２】
【００２２】
【化１３】
【００２３】
このようなポリカチオン性化合物の分子量、側鎖及び主鎖の長さ、グラフトの程度などは特に限定されず、具体的な使用目的に応じて決めればよい。また、このようなポリカチオン性化合物の製造法としては、例えば、特開平１０−４５６３０号公報に記載されている方法等が挙げられる。
【００２４】
本発明に係る検体核酸鎖としては、単鎖でも２重鎖でもどちらでも良く、また、ＤＮＡでもＲＮＡでもオリゴヌクレオチドでも良い。
【００２５】
かくして、エキサイマー蛍光を発する蛍光物質でラベルしたプローブ核酸（エキサイマー蛍光を発する蛍光物質でラベルしたプローブ核酸単鎖、又はエキサイマー蛍光を発する蛍光物質でラベルしたプローブ核酸単鎖と任意の核酸単鎖とからなる２重鎖）とカチオン性化合物を共に含む試薬を用いて検体核酸の塩基配列を解析することにより、検体核酸鎖とプローブ核酸鎖との相同性、例えばミスマッチの有無等を容易に検出することが出来、核酸配列を厳密に且つ迅速、簡便に精査できる。
また、同試薬を用いる本発明の検出方法によれば、検体核酸の一塩基変異、一塩基挿入、一塩基欠損等の微少の核酸配列の違いを容易に検出することが出来る。
従って、本発明の方法は、ＤＮＡ一塩基変異の配列解析等に特に有用である。
【００２６】
従来の鎖交換反応の追跡は、ラベルしたＤＮＡをプローブとしてゲル電気泳動を利用して行ってきた。この方法は、確実ではあるが操作が煩雑で時間を要すると言う欠点があった。これに対して、本発明の方法ではハイブリダイゼーションに伴って蛍光特性が変化する蛍光プローブを利用するため、溶液中における鎖交換反応を直接モニターすることが可能である。
例えば、ビスピレンでラベルした本発明のプローブ核酸（本発明のビスピレンプローブ）とカチオン性化合物を用いる、本発明に係る鎖交換反応の概念を図１に示す。ターゲットＤＮＡにビスピレンプローブを導入すると、カチオン性化合物によって鎖交換反応が促進されピレンエキサイマー蛍光が発生する。ターゲットＤＮＡに対して完全に相補鎖の関係にあるとき、鎖交換の反応速度は遅く、エキサイマー蛍光が小さくなる。一方、一塩基のミスマッチが存在すると、２本鎖ＤＮＡが不安定なため鎖交換反応の速度が速く、それに伴ってエキサイマー蛍光が著しく増大すると考えられる。
【００２７】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【００２８】
実施例１ ビスピレン修飾ホスホロアミダイトの合成
（１）２,２−ビス（ブロモメチル）−１,３−（Ｏ−イソプロピリデン）−１,３−プロパンジオール（化合物Ｉ）の合成
フラスコに２,２−ビス（ブロモメチル）−１,３−プロパンジオール ５．０ｇ（１９．１ｍｍｏｌ）を量り入れ、五酸化二リン上で一晩減圧乾燥させた。これにドライアセトン ５０ｍｌを加えて溶解させ、ｐ−トルエンスルホン酸一水和物１．３ｇ（７．０７ｍｍｏｌ）を加えて室温で一晩撹拌した。その後、１０％ＮａＨＣＯ３水溶液 ３０ｍｌを加えて２０分間撹拌した。これを濃縮してアセトンを完全に留去し、析出した結晶をろ取し、水で洗浄した後、五酸化二リン上で減圧乾燥した。 収量：４．８ｇ（収率：８３％）、Ｒｆ値（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝３０：１）＝０．８４。
【００２９】
（２）２,２−ビス（フタルイミドメチル）−１,３−（Ｏ−イソプロピリデン）−１,３−プロパンジオール（化合物II）の合成
フラスコに化合物Ｉ ２．５ｇ（８．３３ｍｍｏｌ）を量り入れ、五酸化二リン上で一晩減圧乾燥させた。これにドライＤＭＦ １５ｍｌを加えて溶解させ、フタル酸イミドのカリウム塩 ３．１ｇ（１６．６ｍｍｏｌ）を加えた。３時間還流した後放冷し、クロロホルムを加えて希釈した。これを水洗し、有機層を無水硫酸ナトリウムで一晩乾燥させた。ろ過後、ろ液を濃縮してクロロホルムを留去し、これにジエチルエーテルを加えて析出した結晶をろ取し、洗浄した後、五酸化二リン上で一晩減圧乾燥した。 収量：２．４ｇ（収率：６５％）、Ｒｆ値（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝５０：１）＝０．４６。
【００３０】
（３）２,２−ビス（アミノメチル）−１,３−（Ｏ−イソプロピリデン）−１,３−プロパンジオール（化合物III）の合成
化合物II ２．０ｇ（４．６０ｍｍｏｌ）をエタノール２５ｍｌに懸濁させ、ヒドラジン一水和物 ２．４ｍｌ（４６．３ｍｍｏｌ）を加えて３時間還流させた。析出した沈殿をろ別し、塩化メチレンで洗浄してろ液を濃縮した。残渣にメタノールを加えて発泡させ、析出した結晶をろ取し、減圧乾燥した。 収量：１．０ｇ（収率：１００％）。
【００３１】
（４）２,２−ビス［（４−ピレニルブチルアミド）メチル］−１,３−（Ｏ−イソプロピリデン）−１,３−プロパンジオール（化合物IV）の合成
フラスコに化合物III ０．３２ｇ（１．８３ｍｍｏｌ）、１−ピレン酪酸 １．０ｇ（３．４７ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（Ｎ,Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド）０．７５ｇ（３．６６ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）０．４９ｇ（３．６６ｍｍｏｌ）を入れて減圧乾燥させた。それをドライＤＭＦ １４ｍｌに溶解させて氷浴上で３時間、次いで室温で一晩撹拌した。析出した尿素をろ別し、ＤＭＦで洗浄した。ろ液を濃縮して残渣を塩化メチレンで希釈し、水洗後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過後、ろ液を濃縮し、残渣にメタノールを加えて析出した結晶をろ別し、ろ液を濃縮してＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝９：１に溶かした後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝９：１）で精製し、目的のフラクションを集めて濃縮した。 収量：０．７３ｇ（収率：５６％）、Ｒｆ値（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝９：１）＝０．７４。
【００３２】
（５）２,２−ビス［（４−ピレニルブチルアミド）メチル］−１,３−プロパンジオール（化合物Ｖ）の合成
化合物IV ０．７０ｇ（０．９８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ ６３ｍｌに溶解させ、０．１Ｎ ＨＣｌ ７．０ｍｌを加えて７０℃、３０分間加熱した。水を加えて懸濁させた後、濃縮してＴＨＦを留去した。析出した結晶をろ取し、減圧乾燥した後、更に、結晶を塩化メチレンで洗浄し、減圧乾燥した。 収量：０．４０ｇ（収率：５９％）、Ｒｆ値（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝９：１）＝０．５０。
【００３３】
（６）２,２−ビス［（４−ピレニルブチルアミド）メチル］−１−Ｏ−（ジメトキシトリチル）−１,３−プロパンジオール（化合物VI）の合成
化合物Ｖ ０．６０ｇ（０．８９ｍｍｏｌ）をドライピリジン６ｍｌで３回共沸乾燥し、１８．４ｍｌのドライピリジンに懸濁させ、４，４’−ジメトキシトリチルクロライド ０．２７ｇ（０．８０ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン０．０２２ｇ（０．１８ｍｍｏｌ）を加えて室温で１時間撹拌した。メタノール１０ｍｌを加えて反応の進行を止め、濃縮してメタノールを留去した。酢酸エチルを加えて水洗し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過してろ液を濃縮し、酢酸エチルを留去した。塩化メチレンを加えて析出した不純物をろ別し、ろ液を再び濃縮して塩化メチレンを加えた。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝１５：１）で精製し、濃縮して数ｍｌになったところで、これを冷ヘキサンに滴下し、析出した結晶をろ取して、減圧乾燥した。
収量：０．５１ｇ（収率：５９％）、Ｒｆ値（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝１５：１）＝０．８０。
【００３４】
（７）２,２−ビス［（４−ピレニルブチルアミド）メチル］−１−Ｏ−（ジメトキシトリチル）−１,３−プロパンジオールホスホロアミダイト（化合物VII）の合成
バイアル瓶に化合物VI ０．４８ｇ（０．５０ｍｍｏｌ）、テトラゾール ０．０３５ｇ（０．５０ｍｍｏｌ）及び撹拌子を入れ、一晩減圧乾燥した。ドライ塩化メチレン ２．３ｍｌを加えて溶解させ、リン酸化試薬（２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトライソプロピルホスホロジアミダイト）０．２３ｍｌ（０．７５ｍｍｏｌ）を加えて室温下で２．５時間撹拌した。酢酸エチル：ＴＥＡ（トリエチルアミン）＝２０：１の溶液で１．５倍に希釈し、１０％ ＮａＨＣＯ３水溶液で抽出、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過後、ろ液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：酢酸エチル：ＴＥＡ＝６：３：１）で精製し、目的のフラクションを集めて濃縮した後、バイアル瓶に移して真空ポンプで減圧にし、凍結乾燥した。 収量：０．２４ｇ（収率：４１％）、Ｒｆ値（ＣＨ２Ｃｌ２：酢酸エチル：ＴＥＡ＝６：３：１）＝０．８４。
【００３５】
実施例２ ＤＮＡオリゴマーの合成
下記の表１に示すＤＮＡオリゴマーの合成を、ＡＢＩ社製のＤＮＡ自動合成機を用いて１．０μｍｏｌスケールで行った。表中のＢＰｙｒは、５'−末端にビスピレンアミダイトユニット（前記化合物VII）を導入したビスピレン修飾ＤＮＡオリゴマーである。なお、ビスピレンアミダイトユニットはドライ塩化メチレンに０．１１Ｍの濃度になるように溶解させて用いた。コントロールとしては、野生型（コントロール１）と一塩基のミスマッチが存在するもの（コントロール２〜４）を合成した。
合成したＤＮＡオリゴマーは、２８％アンモニア水中５５℃で１１時間処理することにより塩基部の脱保護を行った。その後、ビスピレン修飾ＤＮＡオリゴマーは逆相高速液体クロマトグラフィー［カラム：逆相コスモシール５Ｃ１８ ＡＲ３００（４.６×１５０ｍｍ２）、溶出液：５０ｍＭトリエチルアンモニウム−酢酸緩衝液（ＴＥＡＡ、ｐＨ＝７.０）及びＣＨ３ＣＮ、グラジエントは初期濃度ＴＥＡＡ：ＣＨ３ＣＮ＝９５：５で、ＣＨ３ＣＮの濃度を０.５％／ｍｉｎの割合で上昇、流速：１.０ｍｌ／ｍｉｎ］を用いて精製した。未修飾のＤＮＡオリゴマーは２０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した後、ウォーターズ ＳＥＰ−ＰＡＫ Ｃ１８カートリッジにより脱塩処理（サンプル回収は４０％アセトニトリル／水（Ｖ／Ｖ）で行った。）し、目的のＤＮＡオリゴマーを得た。各ＤＮＡオリゴマーのシークエンスを表１に示す。
【００３６】
【表１】
【００３７】
実施例３ 各ＤＮＡオリゴマーの相補鎖ＤＮＡとの相互作用及び諸性質の比較
（１）ＵＶ融解測定
合成した各オリゴマーの相補鎖ＤＮＡとの２本鎖に関して、２６０ｎｍにおける温度に対する相対吸光度をプロットしたＵＶ融解曲線を作成した（全ＤＮＡ鎖濃度：２．１５μｍｏｌ）。結果を図２に示す。図２中、■はＢＰｙｒ、●はコントロール１（野生型）、◇はコントロール２（Ｔ→Ｇ）、△はコントロール３（Ｔ→Ａ）、×はコントロール４（Ｔ→Ｃ）についてのＵＶ融解曲線をそれぞれ示す。
図２から明らかなように、ビスピレン修飾ＤＮＡとその相補鎖ＤＮＡとの２本鎖は、典型的なシグモイドカーブを示し、未修飾ＤＮＡの２本鎖と同様に、低温側では２本鎖を形成し温度が上昇するにつれて１本鎖に解離していることが判る。
【００３８】
（２）熱安定性
（１）のＵＶ融解測定の値からそれぞれの半解離温度を求めた。表２にそれぞれの半解離温度を示す。
【００３９】
【表２】
【００４０】
表２から明らかなように、ビスピレン修飾ＤＮＡと野生型（コントロール１）は高い熱安定性を示した。一方、一塩基のミスマッチが存在するもの（コントロール２〜４）は、ビスピレン修飾ＤＮＡより半解離温度が低くなり、熱安定性の低下が観測された。
【００４１】
（３）ビスピレン修飾ＤＮＡの蛍光スペクトル
【００４２】
ビスピレン修飾ＤＮＡの１本鎖と２本鎖のそれぞれについて蛍光測定した結果を図３に示す。測定は励起波長３３４ｎｍ、励起側バンド幅５．０ｎｍ、蛍光側バンド幅５．０ｎｍでスキャンスピード６０ｎｍ／ｍｉｎで行った。グラフは１本鎖の４８０ｎｍの蛍光強度を１として相対的にプロットした。
図３中、実線は１本鎖の場合、波線は２本鎖の場合の測定結果をそれぞれ示す。
図３から明らかなように、ハイブリダイゼーションに伴って４８０ｎｍのピレンエキサイマー蛍光が３５倍に増加することが判った。
【００４３】
実施例４ 鎖交換反応に関する実験
鎖交換反応におけるピレンエキサイマー蛍光の変化を下記の操作手順により測定した。
各コントロールの２本鎖（５μｍｏｌ，１ｍｌ）に、ビスピレン修飾ＤＮＡ（２．５μｍｏｌ，５μｌ）を加え、それにＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ（１０μｍｏｌ，１０μｌ）を加えた後、時間毎の蛍光強度を１３℃で測定した。測定は励起波長３３４ｎｍ、励起側バンド幅５．０ｎｍ、蛍光側バンド幅５．０ｎｍで、スキャンスピード１５００ｎｍ／ｍｉｎ、３０秒間隔で２０分間繰り返し行った。
結果を図４に示す。グラフは横軸を時間、縦軸を鎖交換反応率としてプロットしたものである。鎖交換反応率は同濃度のビスピレン修飾ＤＮＡの４８０ｎｍでの蛍光強度を０％、２本鎖を組んだときの蛍光強度を１００％として算出した。図４から明らかなように、半解離温度が低い順に鎖交換反応率が高くなることが判った。
【００４４】
これらの事実から、結論として言えることは、
（１）一塩基のミスマッチをもつＤＮＡは、野生型より鎖交換反応が速く進み、蛍光強度が大きくなる。
（２）ビスピレンプローブとカチオン性化合物を併用した鎖交換反応は、ＤＮＡ一塩基変異の配列解析に特に有用である。
（３）一塩基のミスマッチをもつＤＮＡの中でも、その塩基の種類によって差がみられることから、本発明の方法によれば、塩基判別が出来る可能性があると考えられる。
等々である。
【００４５】
【発明の効果】
核酸配列の微細な変化が遺伝子機能に強く影響を及ぼすことが知られている。とりわけ遺伝子内の一塩基多型は、疾病に対する罹患率、医薬作用および副作用の個人差に関連し、この解析がテーラーメード医療（患者の体質に応じて薬を使い分ける医療）の実現に不可欠である。微細な核酸配列の違いを検出する手法は、これまでにも種々検討されているが、これまでのものは何れも時間やコスト面で充分な性能を持たず、且つ操作が複雑であるなどの欠点を有している。一塩基多型などの微細な遺伝子配列の変化は、その総数が極めて多く、迅速、安価、簡便な検査手法が強く求められている。斯かる現状において、蛍光物質でラベルしたプローブ核酸とカチオン性化合物とを含んでなる試薬を用いる本発明の検出方法によれば、検体核酸の一塩基変異、一塩基挿入、一塩基欠損等の微少の核酸配列の違いを容易に検出することが出来、且つ核酸配列を厳密に克つ迅速、簡便に精査できると言うことは、単なる疾患の診断・予防・治療のみならず、テーラーメード医療の実現に向けて、極めて重要且つ意義のあることである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明に係る鎖交換反応の概念を図式化したものである。
【図２】図２は、合成した各オリゴマーの相補鎖ＤＮＡとの２本鎖に関して、２６０ｎｍにおける温度に対する相対吸光度をプロットしたＵＶ融解曲線である。
【図３】図３は、本発明に係るビスピレン修飾ＤＮＡの１本鎖と２本鎖のそれぞれについて蛍光測定した結果を示す。
【図４】図４は、コントロールの２本鎖と、本発明に係るビスピレン修飾ＤＮＡとの鎖交換反応におけるピレンエキサイマー蛍光の変化を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、医薬品や検査薬、診断薬等の分野において利用し得る、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸の配列情報を解析するための試薬及び解析方法に関する。より詳しくは、疾病や病変の原因を突き止め、その修復処置を講じるための、例えば、検体核酸の一塩基変異、一塩基挿入、一塩基欠損等の微少の核酸配列の違いを検出するための試薬及び方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ヒトゲノムプロジェクトを代表とする研究の遂行により、多数の遺伝子の塩基配列情報が明らかにされてきた。なかでも将来可能とされているテーラーメイド医療（患者の体質に応じて薬を使い分ける医療）と関連して、ゲノムレベルでの個体差の代表である一塩基多型（ＳＮＰｓ）の解読とその応用が注目されている。ヒトゲノムＤＮＡの一塩基変異配列を効率よく識別・検出する手法の開拓は、疾患の診断・予防・治療のみならず、望みのテーラーメイド医療の実現に向けて極めて重要な研究課題である。
蛍光性化合物をプローブとなる核酸鎖にラベルし、検体核酸鎖とのハイブリダイゼーション過程を利用して、検体核酸鎖とプローブ核酸鎖との核酸塩基配列の相同性を検出する手法は、従来から知られている。しかしながら、それらの手法は、何れも、検体核酸鎖と結合したプローブ核酸鎖と、結合していないプローブ核酸鎖を、蛍光測定前に分離するいわゆるＢ/Ｆ分離過程が必要とされ、そのため測定過程が複雑化されるか、或いは特殊な装置の利用が不可欠であった。一方、プローブ核酸及び検体核酸がいずれも単鎖核酸である場合には、一塩基変異、一塩基挿入、一塩基欠損などの微少な核酸配列の違いを充分に検出できない欠点があった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、検体核酸鎖と結合したプローブ核酸鎖と、結合していないプローブ核酸鎖を蛍光測定前に分離するいわゆるＢ/Ｆ分離過程を必要とせず、連続的にプローブ核酸・検体核酸間の反応をモニターして、プローブ核酸と検体核酸の反応速度の検出を容易にすることにより、相補性の違いをより厳密に検出する方法とそのための試薬を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、エキサイマー蛍光を発する蛍光物質でラベルしたプローブ核酸単鎖と、単鎖の検体核酸鎖との結合、又は該プローブ核酸単鎖と２重鎖の検体核酸との鎖の交換、に伴う蛍光物質の蛍光挙動の変化を測定することにより、検体核酸鎖とプローブ核酸鎖との相同性を検出する方法に関する。
【０００５】
また、本発明は、エキサイマー蛍光を発する蛍光物質でラベルしたプローブ核酸単鎖と任意の核酸単鎖とからなる２重鎖と、単鎖の検体核酸鎖との鎖の交換に伴う蛍光物質の蛍光挙動の変化を測定することにより、検体核酸鎖とプローブ核酸鎖との相同性を検出する方法に関する。
【０００６】
更に、本発明は、エキサイマー蛍光を発する蛍光物質でラベルしたプローブ核酸単鎖、又はエキサイマー蛍光を発する蛍光物質でラベルしたプローブ核酸単鎖と任意の核酸単鎖とからなる２重鎖と、カチオン性化合物とを含んでなる、検体核酸鎖とプローブ核酸鎖との相同性を検出するための試薬に関する。
【０００７】
更にまた、本発明は、下記一般式［１］
【化７】
で示される化合物に関する。
【０００８】
本発明者らは、これまで蛍光性化合物と核酸との相互作用について種々研究を重ねてきたが、その過程において、核酸のハイブリダイゼーションに依存して蛍光挙動が変化するプローブ核酸の設計法について知見を得、プローブ核酸鎖と検体核酸鎖との結合に依存して蛍光発光効率が著しく変化する蛍光プローブ核酸の調製を行ない、先に文献発表している[Tetrahedron 53,4265-4270(1997).; Nucleic Acids Res., 27, 2387-2392(1999).; Angew. Chem. Int. Ed., 40, 1104-1106(2001)]。
今回、本発明者らは、更に研究を重ねた結果、プローブ核酸鎖と検体核酸鎖との結合に依存して蛍光化合物のエキサイマー発光が著しく変化する新規な蛍光核酸プローブの調製に成功した。また、一方で、核酸間の結合及び鎖交換を促進する化合物について研究を行った結果、カチオン性イオンを生成する化合物（以下、カチオン性化合物と呼ぶ。）とりわけ親水性基を持つポリカチオン誘導体が極めて有用であることを見出し、更に、カチオン性化合物存在下での２重鎖核酸と単鎖核酸間の鎖交換過程がプローブ核酸と検体核酸間の相同性を厳密に検出する上で有用であることを見出し、本発明を完成するに到った。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明において、エキサイマー蛍光を発する蛍光物質でラベルしたプローブ核酸単鎖と、単鎖の検体核酸鎖との結合、又は該プローブ核酸単鎖と、２重鎖の検体核酸との鎖の交換、に伴う蛍光物質の蛍光挙動の変化を測定する場合、或いはエキサイマー蛍光を発する蛍光物質でラベルしたプローブ核酸単鎖と任意の核酸単鎖とからなる２重鎖と、単鎖の検体核酸鎖との鎖交換過程に伴う蛍光物質の蛍光挙動の変化を測定する場合の蛍光物質の蛍光挙動の変化としては、蛍光物質間のエキサイマー形成に原理を置くものであることが望ましい。
【００１０】
本発明において用いられるエキサイマー蛍光を発する蛍光物質としては、エキサイマー蛍光を発する化合物であればどのような化合物でもよいが、好ましくはピレン等の多環芳香族化合物に由来するエキサイマー、例えばビスピレン誘導体等が代表的なものとして挙げられる。
【００１１】
本発明において、エキサイマー蛍光を発する蛍光物質として用いられるビスピレン誘導体としては、例えば下記一般式［１］
【化８】
【００１２】
上記一般式［１］で示されるビスピレン誘導体の中で代表的なものとしては、例えば下式［２］
【化９】
【００１３】
本発明で用いられるエキサイマー蛍光を発する蛍光物質でラベルしたプローブ核酸、例えば上記式［２］で示されるビスピレン誘導体でラベルしたプローブ核酸を調製するために用いられるビスピレン修飾ホスホロアミダイトは、例えば下記の合成スキームに従って合成される。
【化１０】
(1)ｐ−トルエンスルホン酸一水和物，アセトン中
(2)フタルイミドＫ塩，ＤＭＦ中
(3)ヒドラジン一水和物，ＥｔＯＨ中
(4)１−ピレン酪酸、Ｎ,Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド，１−ヒドロキシ ベンゾトリアゾール，ＤＭＦ中
(5)０.１Ｎ ＨＣｌ，ＴＨＦ中
(6)４,４'−ジメトキシトリチルクロライド，４−ジメチルアミノピリジン，ピリ ジン中
(7)２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトライソプロピルホスホロジアミダイト，テトラゾール，ＣＨ２Ｃｌ２中
【００１４】
即ち、２，２−ビス（ブロモメチル）−１，３−プロパンジオールを出発原料として、水酸基をイソプロピリデン化により保護して化合物Ｉを得る。次いで、Ｇａｂｒｉｅｌ合成法により化合物IIを得、二段階目の加水分解反応においてジアミン体IIIを得る。このジアミン体IIIと１−ピレン酪酸とをＤＣＣ脱水縮合させることにより化合物IVが得られる。次に、縮合体IVのイソプロピリデン基を酸により脱保護すれば上記式［２］で示される本発明のビスピレン誘導体Ｖを得る。ＤＭＴｒ（ジメトキシトリチル）化は、反応部位である一級の水酸基が２個所あるので、常法とは違いジメチルアミノピリジンを触媒として用いて１時間程度で反応を停止させ、できるだけ二置換体の生成を押さえる。これにより得られた化合物VIのもう一方の水酸基をリン酸化することにより、ＤＮＡ自動合成機に適用可能なビスピレン修飾ホスホロアミダイトユニットを得ることが出来る。
各段階の生成物は１Ｈ ＮＭＲにより構造確認を行えばよい。
【００１５】
本発明で用いられる、エキサイマー蛍光を発する蛍光物質でラベルしたプローブ核酸単鎖、例えばビスピレン修飾ＤＮＡは、オリゴヌクレオチドの５'−末端にビスピレンアミダイトユニットを導入したものであるが、その合成法としては、例えば、上で得られたビスピレン修飾ホスホロアミダイトユニットを使用し、市販のＤＮＡ自動合成機を用いて常法に従って合成を行う方法等が挙げられる。合成後はアンモニア水によって塩基部の脱保護を行い、次いで、逆相高速液体クロマトグラフィー等により精製を行えばよい。
【００１６】
本発明の検出方法は、核酸鎖と核酸鎖の結合又は核酸鎖と核酸鎖の交換に伴う蛍光物質の蛍光挙動の変化を測定することにより行うものであるが、該結合反応及び交換反応に際しては、カチオン性化合物の共存下にこれを行うことが好ましい。カチオン性化合物を共存させることにより、該結合反応及び交換反応が促進されるからである。
【００１７】
本発明において用いられるカチオン性化合物としては、例えば金属イオンやアンモニウムイオン等のカチオン性イオンを生成し得る化合物が挙げられる。金属イオンとしてはどのような金属イオンでも良いが、特にナトリウム、カリウム、リチウム等のアルカリ金属イオンが好ましい。これらカチオン性イオンを生成する化合物の使用量としては、反応系内において金属イオンの濃度が３００ｍＭ以上の濃度になるような量を用いることが好ましい。
また、本発明に係るカチオン性化合物としては、多価のカチオン性化合物が好ましいものとして挙げられ、例えば親水性基を有するポリカチオン性化合物等が好ましいが、より好ましいものとしては、親水性側鎖を配したポリカチオン性化合物が挙げられる。これらポリカチオン性化合物の使用量としては、プローブ核酸のアニオン量に対し０．０１〜１０００倍当量の広い範囲が挙げられる。
【００１８】
親水性側鎖を配したポリカチオン性化合物としては、例えば、カチオン性基を形成し得るモノマーから構成されるポリマーを主鎖とし、親水性高分子を側鎖とするグラフト共重合体を例示することができる。
カチオン性基を形成し得るモノマーとしては、リジン、アルギニン、ヒスチジン等の塩基性アミノ酸、グルコサミン、ガラクトサミン等のアミノ糖、アリルアミン、エチレンイミン、ジエチルアミノエチルメタクリート、ジメチルアミノエチルメタクリレート等の塩基性合成モノマー等を例示することができる。また、カチオン性基を形成し得るモノマーから構成されるポリマーとしては、これらのカチオン性基を形成し得るモノマーから構成されるポリマーは全て挙げられるが、例えばポリリジン、ポリアリルアミンなどが代表的なものとして挙げられる。
親水性高分子としては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等の水溶性ポリアルキレングリコール、デキストラン、プルラン、アミロース、アラビノガラクタン等の水溶性多糖類、セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン等の親水性アミノ酸を含む水溶性ポリアミノ酸、アクリルアミド又はその誘導体をモノマーとして用いて合成される水溶性高分子、メタクリル酸又はアクリル酸或いはこれらの誘導体（例えばヒドロキシエチルメタクリレート等）をモノマーとして用いて合成される水溶性高分子、ポリビニルアルコール及びその誘導体などを例示することができる。
【００１９】
より好ましいポリカチオン性化合物としては、例えば、Bioconjugate Chem.,9, 292-299(1998)に記載されているデキストラン側鎖修飾α−ポリ（Ｌ−リジン）［以下、「α−ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ」と略記する。］、デキストラン側鎖修飾ε−ポリ（Ｌ−リジン）［以下、「ε−ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ」と略記する。］、デキストラン側鎖修飾ポリアリルアミン［以下、「ＰＡＡ−ｇ−Ｄｅｘ」と略記する。］等を挙げることができる。α−ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ、ε−ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ、ＰＡＡ−ｇ−Ｄｅｘの構造式をそれぞれ以下に示す。
【００２０】
【化１１】
【化１２】
【化１３】
このようなポリカチオン性化合物の分子量、側鎖及び主鎖の長さ、グラフトの程度などは特に限定されず、具体的な使用目的に応じて決めればよい。また、このようなポリカチオン性化合物の製造法としては、例えば、特開平１０−４５６３０号公報に記載されている方法等が挙げられる。
【００２４】
本発明に係る検体核酸鎖としては、単鎖でも２重鎖でもどちらでも良く、また、ＤＮＡでもＲＮＡでもオリゴヌクレオチドでも良い。
【００２５】
かくして、エキサイマー蛍光を発する蛍光物質でラベルしたプローブ核酸（エキサイマー蛍光を発する蛍光物質でラベルしたプローブ核酸単鎖、又はエキサイマー蛍光を発する蛍光物質でラベルしたプローブ核酸単鎖と任意の核酸単鎖とからなる２重鎖）とカチオン性化合物を共に含む試薬を用いて検体核酸の塩基配列を解析することにより、検体核酸鎖とプローブ核酸鎖との相同性、例えばミスマッチの有無等を容易に検出することが出来、核酸配列を厳密に且つ迅速、簡便に精査できる。
また、同試薬を用いる本発明の検出方法によれば、検体核酸の一塩基変異、一塩基挿入、一塩基欠損等の微少の核酸配列の違いを容易に検出することが出来る。
従って、本発明の方法は、ＤＮＡ一塩基変異の配列解析等に特に有用である。
【００２６】
従来の鎖交換反応の追跡は、ラベルしたＤＮＡをプローブとしてゲル電気泳動を利用して行ってきた。この方法は、確実ではあるが操作が煩雑で時間を要すると言う欠点があった。これに対して、本発明の方法ではハイブリダイゼーションに伴って蛍光特性が変化する蛍光プローブを利用するため、溶液中における鎖交換反応を直接モニターすることが可能である。
例えば、ビスピレンでラベルした本発明のプローブ核酸（本発明のビスピレンプローブ）とカチオン性化合物を用いる、本発明に係る鎖交換反応の概念を図１に示す。ターゲットＤＮＡにビスピレンプローブを導入すると、カチオン性化合物によって鎖交換反応が促進されピレンエキサイマー蛍光が発生する。ターゲットＤＮＡに対して完全に相補鎖の関係にあるとき、鎖交換の反応速度は遅く、エキサイマー蛍光が小さくなる。一方、一塩基のミスマッチが存在すると、２本鎖ＤＮＡが不安定なため鎖交換反応の速度が速く、それに伴ってエキサイマー蛍光が著しく増大すると考えられる。
【００２７】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【００２８】
実施例１ ビスピレン修飾ホスホロアミダイトの合成
（１）２,２−ビス（ブロモメチル）−１,３−（Ｏ−イソプロピリデン）−１,３−プロパンジオール（化合物Ｉ）の合成
フラスコに２,２−ビス（ブロモメチル）−１,３−プロパンジオール ５．０ｇ（１９．１ｍｍｏｌ）を量り入れ、五酸化二リン上で一晩減圧乾燥させた。これにドライアセトン ５０ｍｌを加えて溶解させ、ｐ−トルエンスルホン酸一水和物１．３ｇ（７．０７ｍｍｏｌ）を加えて室温で一晩撹拌した。その後、１０％ＮａＨＣＯ３水溶液 ３０ｍｌを加えて２０分間撹拌した。これを濃縮してアセトンを完全に留去し、析出した結晶をろ取し、水で洗浄した後、五酸化二リン上で減圧乾燥した。 収量：４．８ｇ（収率：８３％）、Ｒｆ値（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝３０：１）＝０．８４。
【００２９】
（２）２,２−ビス（フタルイミドメチル）−１,３−（Ｏ−イソプロピリデン）−１,３−プロパンジオール（化合物II）の合成
フラスコに化合物Ｉ ２．５ｇ（８．３３ｍｍｏｌ）を量り入れ、五酸化二リン上で一晩減圧乾燥させた。これにドライＤＭＦ １５ｍｌを加えて溶解させ、フタル酸イミドのカリウム塩 ３．１ｇ（１６．６ｍｍｏｌ）を加えた。３時間還流した後放冷し、クロロホルムを加えて希釈した。これを水洗し、有機層を無水硫酸ナトリウムで一晩乾燥させた。ろ過後、ろ液を濃縮してクロロホルムを留去し、これにジエチルエーテルを加えて析出した結晶をろ取し、洗浄した後、五酸化二リン上で一晩減圧乾燥した。 収量：２．４ｇ（収率：６５％）、Ｒｆ値（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝５０：１）＝０．４６。
【００３０】
（３）２,２−ビス（アミノメチル）−１,３−（Ｏ−イソプロピリデン）−１,３−プロパンジオール（化合物III）の合成
化合物II ２．０ｇ（４．６０ｍｍｏｌ）をエタノール２５ｍｌに懸濁させ、ヒドラジン一水和物 ２．４ｍｌ（４６．３ｍｍｏｌ）を加えて３時間還流させた。析出した沈殿をろ別し、塩化メチレンで洗浄してろ液を濃縮した。残渣にメタノールを加えて発泡させ、析出した結晶をろ取し、減圧乾燥した。 収量：１．０ｇ（収率：１００％）。
【００３１】
（４）２,２−ビス［（４−ピレニルブチルアミド）メチル］−１,３−（Ｏ−イソプロピリデン）−１,３−プロパンジオール（化合物IV）の合成
フラスコに化合物III ０．３２ｇ（１．８３ｍｍｏｌ）、１−ピレン酪酸 １．０ｇ（３．４７ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（Ｎ,Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド）０．７５ｇ（３．６６ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）０．４９ｇ（３．６６ｍｍｏｌ）を入れて減圧乾燥させた。それをドライＤＭＦ １４ｍｌに溶解させて氷浴上で３時間、次いで室温で一晩撹拌した。析出した尿素をろ別し、ＤＭＦで洗浄した。ろ液を濃縮して残渣を塩化メチレンで希釈し、水洗後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過後、ろ液を濃縮し、残渣にメタノールを加えて析出した結晶をろ別し、ろ液を濃縮してＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝９：１に溶かした後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝９：１）で精製し、目的のフラクションを集めて濃縮した。 収量：０．７３ｇ（収率：５６％）、Ｒｆ値（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝９：１）＝０．７４。
【００３２】
（５）２,２−ビス［（４−ピレニルブチルアミド）メチル］−１,３−プロパンジオール（化合物Ｖ）の合成
化合物IV ０．７０ｇ（０．９８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ ６３ｍｌに溶解させ、０．１Ｎ ＨＣｌ ７．０ｍｌを加えて７０℃、３０分間加熱した。水を加えて懸濁させた後、濃縮してＴＨＦを留去した。析出した結晶をろ取し、減圧乾燥した後、更に、結晶を塩化メチレンで洗浄し、減圧乾燥した。 収量：０．４０ｇ（収率：５９％）、Ｒｆ値（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝９：１）＝０．５０。
【００３３】
（６）２,２−ビス［（４−ピレニルブチルアミド）メチル］−１−Ｏ−（ジメトキシトリチル）−１,３−プロパンジオール（化合物VI）の合成
化合物Ｖ ０．６０ｇ（０．８９ｍｍｏｌ）をドライピリジン６ｍｌで３回共沸乾燥し、１８．４ｍｌのドライピリジンに懸濁させ、４，４’−ジメトキシトリチルクロライド ０．２７ｇ（０．８０ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン０．０２２ｇ（０．１８ｍｍｏｌ）を加えて室温で１時間撹拌した。メタノール１０ｍｌを加えて反応の進行を止め、濃縮してメタノールを留去した。酢酸エチルを加えて水洗し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過してろ液を濃縮し、酢酸エチルを留去した。塩化メチレンを加えて析出した不純物をろ別し、ろ液を再び濃縮して塩化メチレンを加えた。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝１５：１）で精製し、濃縮して数ｍｌになったところで、これを冷ヘキサンに滴下し、析出した結晶をろ取して、減圧乾燥した。
収量：０．５１ｇ（収率：５９％）、Ｒｆ値（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝１５：１）＝０．８０。
【００３４】
（７）２,２−ビス［（４−ピレニルブチルアミド）メチル］−１−Ｏ−（ジメトキシトリチル）−１,３−プロパンジオールホスホロアミダイト（化合物VII）の合成
バイアル瓶に化合物VI ０．４８ｇ（０．５０ｍｍｏｌ）、テトラゾール ０．０３５ｇ（０．５０ｍｍｏｌ）及び撹拌子を入れ、一晩減圧乾燥した。ドライ塩化メチレン ２．３ｍｌを加えて溶解させ、リン酸化試薬（２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトライソプロピルホスホロジアミダイト）０．２３ｍｌ（０．７５ｍｍｏｌ）を加えて室温下で２．５時間撹拌した。酢酸エチル：ＴＥＡ（トリエチルアミン）＝２０：１の溶液で１．５倍に希釈し、１０％ ＮａＨＣＯ３水溶液で抽出、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過後、ろ液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：酢酸エチル：ＴＥＡ＝６：３：１）で精製し、目的のフラクションを集めて濃縮した後、バイアル瓶に移して真空ポンプで減圧にし、凍結乾燥した。 収量：０．２４ｇ（収率：４１％）、Ｒｆ値（ＣＨ２Ｃｌ２：酢酸エチル：ＴＥＡ＝６：３：１）＝０．８４。
【００３５】
実施例２ ＤＮＡオリゴマーの合成
下記の表１に示すＤＮＡオリゴマーの合成を、ＡＢＩ社製のＤＮＡ自動合成機を用いて１．０μｍｏｌスケールで行った。表中のＢＰｙｒは、５'−末端にビスピレンアミダイトユニット（前記化合物VII）を導入したビスピレン修飾ＤＮＡオリゴマーである。なお、ビスピレンアミダイトユニットはドライ塩化メチレンに０．１１Ｍの濃度になるように溶解させて用いた。コントロールとしては、野生型（コントロール１）と一塩基のミスマッチが存在するもの（コントロール２〜４）を合成した。
合成したＤＮＡオリゴマーは、２８％アンモニア水中５５℃で１１時間処理することにより塩基部の脱保護を行った。その後、ビスピレン修飾ＤＮＡオリゴマーは逆相高速液体クロマトグラフィー［カラム：逆相コスモシール５Ｃ１８ ＡＲ３００（４.６×１５０ｍｍ２）、溶出液：５０ｍＭトリエチルアンモニウム−酢酸緩衝液（ＴＥＡＡ、ｐＨ＝７.０）及びＣＨ３ＣＮ、グラジエントは初期濃度ＴＥＡＡ：ＣＨ３ＣＮ＝９５：５で、ＣＨ３ＣＮの濃度を０.５％／ｍｉｎの割合で上昇、流速：１.０ｍｌ／ｍｉｎ］を用いて精製した。未修飾のＤＮＡオリゴマーは２０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した後、ウォーターズ ＳＥＰ−ＰＡＫ Ｃ１８カートリッジにより脱塩処理（サンプル回収は４０％アセトニトリル／水（Ｖ／Ｖ）で行った。）し、目的のＤＮＡオリゴマーを得た。各ＤＮＡオリゴマーのシークエンスを表１に示す。
【００３６】
【表１】
実施例３ 各ＤＮＡオリゴマーの相補鎖ＤＮＡとの相互作用及び諸性質の比較
（１）ＵＶ融解測定
合成した各オリゴマーの相補鎖ＤＮＡとの２本鎖に関して、２６０ｎｍにおける温度に対する相対吸光度をプロットしたＵＶ融解曲線を作成した（全ＤＮＡ鎖濃度：２．１５μｍｏｌ）。結果を図２に示す。図２中、■はＢＰｙｒ、●はコントロール１（野生型）、◇はコントロール２（Ｔ→Ｇ）、△はコントロール３（Ｔ→Ａ）、×はコントロール４（Ｔ→Ｃ）についてのＵＶ融解曲線をそれぞれ示す。
図２から明らかなように、ビスピレン修飾ＤＮＡとその相補鎖ＤＮＡとの２本鎖は、典型的なシグモイドカーブを示し、未修飾ＤＮＡの２本鎖と同様に、低温側では２本鎖を形成し温度が上昇するにつれて１本鎖に解離していることが判る。
【００３８】
（２）熱安定性
（１）のＵＶ融解測定の値からそれぞれの半解離温度を求めた。表２にそれぞれの半解離温度を示す。
【００３９】
【表２】
表２から明らかなように、ビスピレン修飾ＤＮＡと野生型（コントロール１）は高い熱安定性を示した。一方、一塩基のミスマッチが存在するもの（コントロール２〜４）は、ビスピレン修飾ＤＮＡより半解離温度が低くなり、熱安定性の低下が観測された。
【００４１】
（３）ビスピレン修飾ＤＮＡの蛍光スペクトル
【００４２】
ビスピレン修飾ＤＮＡの１本鎖と２本鎖のそれぞれについて蛍光測定した結果を図３に示す。測定は励起波長３３４ｎｍ、励起側バンド幅５．０ｎｍ、蛍光側バンド幅５．０ｎｍでスキャンスピード６０ｎｍ／ｍｉｎで行った。グラフは１本鎖の４８０ｎｍの蛍光強度を１として相対的にプロットした。
図３中、実線は１本鎖の場合、波線は２本鎖の場合の測定結果をそれぞれ示す。
図３から明らかなように、ハイブリダイゼーションに伴って４８０ｎｍのピレンエキサイマー蛍光が３５倍に増加することが判った。
【００４３】
実施例４ 鎖交換反応に関する実験
鎖交換反応におけるピレンエキサイマー蛍光の変化を下記の操作手順により測定した。
各コントロールの２本鎖（５μｍｏｌ，１ｍｌ）に、ビスピレン修飾ＤＮＡ（２．５μｍｏｌ，５μｌ）を加え、それにＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ（１０μｍｏｌ，１０μｌ）を加えた後、時間毎の蛍光強度を１３℃で測定した。測定は励起波長３３４ｎｍ、励起側バンド幅５．０ｎｍ、蛍光側バンド幅５．０ｎｍで、スキャンスピード１５００ｎｍ／ｍｉｎ、３０秒間隔で２０分間繰り返し行った。
結果を図４に示す。グラフは横軸を時間、縦軸を鎖交換反応率としてプロットしたものである。鎖交換反応率は同濃度のビスピレン修飾ＤＮＡの４８０ｎｍでの蛍光強度を０％、２本鎖を組んだときの蛍光強度を１００％として算出した。図４から明らかなように、半解離温度が低い順に鎖交換反応率が高くなることが判った。
【００４４】
これらの事実から、結論として言えることは、
（１）一塩基のミスマッチをもつＤＮＡは、野生型より鎖交換反応が速く進み、蛍光強度が大きくなる。
（２）ビスピレンプローブとカチオン性化合物を併用した鎖交換反応は、ＤＮＡ一塩基変異の配列解析に特に有用である。
（３）一塩基のミスマッチをもつＤＮＡの中でも、その塩基の種類によって差がみられることから、本発明の方法によれば、塩基判別が出来る可能性があると考えられる。
等々である。
【００４５】
【発明の効果】
核酸配列の微細な変化が遺伝子機能に強く影響を及ぼすことが知られている。とりわけ遺伝子内の一塩基多型は、疾病に対する罹患率、医薬作用および副作用の個人差に関連し、この解析がテーラーメード医療（患者の体質に応じて薬を使い分ける医療）の実現に不可欠である。微細な核酸配列の違いを検出する手法は、これまでにも種々検討されているが、これまでのものは何れも時間やコスト面で充分な性能を持たず、且つ操作が複雑であるなどの欠点を有している。一塩基多型などの微細な遺伝子配列の変化は、その総数が極めて多く、迅速、安価、簡便な検査手法が強く求められている。斯かる現状において、蛍光物質でラベルしたプローブ核酸とカチオン性化合物とを含んでなる試薬を用いる本発明の検出方法によれば、検体核酸の一塩基変異、一塩基挿入、一塩基欠損等の微少の核酸配列の違いを容易に検出することが出来、且つ核酸配列を厳密に克つ迅速、簡便に精査できると言うことは、単なる疾患の診断・予防・治療のみならず、テーラーメード医療の実現に向けて、極めて重要且つ意義のあることである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明に係る鎖交換反応の概念を図式化したものである。
【図２】図２は、合成した各オリゴマーの相補鎖ＤＮＡとの２本鎖に関して、２６０ｎｍにおける温度に対する相対吸光度をプロットしたＵＶ融解曲線である。
【図３】図３は、本発明に係るビスピレン修飾ＤＮＡの１本鎖と２本鎖のそれぞれについて蛍光測定した結果を示す。
【図４】図４は、コントロールの２本鎖と、本発明に係るビスピレン修飾ＤＮＡとの鎖交換反応におけるピレンエキサイマー蛍光の変化を示す。
Claims (19)
- 下記一般式［１］
- 化合物が下式［２］
- 鎖の交換反応をカチオン性イオンを生成する化合物（以下、カチオン性化合物と呼ぶ。）の共存下に行う請求項１又は２に記載の方法。
- カチオン性イオンが金属イオン又はアンモニウムイオンである請求項３に記載の方法。
- 金属イオンがアルカリ金属イオンである請求項４に記載の方法。
- カチオン性イオンの濃度が３００ｍＭ以上である請求項４又は５に記載の方法。
- カチオン性化合物が多価のカチオン性化合物である請求項３に記載の方法。
- カチオン性化合物が親水性基をもつポリカチオン性化合物である請求項３に記載の方法。
- カチオン性化合物が親水性側鎖を配したポリカチオン性化合物である請求項３に記載の方法。
- 検体核酸の一塩基変異配列が、検体核酸の一塩基置換、一塩基挿入 又は一塩基欠損である、請求項１〜９の何れかに記載の方法。
- 下記一般式［１］
- 化合物が下式［２］
- カチオン性イオンが金属イオン又はアンモニウムイオンである請求項１１又は１２に記載の試薬。
- 金属イオンがアルカリ金属イオンである請求項１３に記載の試薬。
- カチオン性イオンの濃度が反応系内で３００ｍＭ以上の濃度になるような量である請求項１３又は１４に記載の試薬。
- カチオン性化合物が多価のカチオン性化合物である請求項１１又は１２に記載の試薬。
- カチオン性化合物が親水性基をもつポリカチオン性化合物である請求項１１又は１２に記載の試薬。
- カチオン性化合物が親水性側鎖を配したポリカチオン性化合物である請求項１１又は１２に記載の試薬。
- 検体核酸の一塩基変異配列が、検体核酸の一塩基置換、一塩基挿入又は一塩基欠損である、請求項１１〜１８の何れかに記載の試薬。
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