JPH04503403A - ５′―結合アクリジンを有するホスホロチオエートおよび通常のオリゴデオキシヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 ５′−結合アクリジンを有するホスホロチオエートおよび通常のオリゴデオキシ ヌクレオチド 技術分野 本発明はホスホルアミダイト（ｐｈｏａｐｈｏｒａｗｔｄｉ　ｔｅ）ファミジド 結合アクリジンを用いる５′−アクリジン結合オリゴヌクレオチドの自動合成方 法に関する。これらの化合物は遺伝子発現の阻害のために有用であり、細胞への 取り込みの速度過程を螢光細胞選別を用いて測定することを可能にするものであ る。

前景技術 オリゴデオキシヌクレオチドは特定の遺伝子メツセージまたはウィルス配列に対 して相補的であり、「アンチセンス」化合物と称される。これらの化合物はまた 、ラウス肉腫ウィルスおよびヒト免疫不全ウィルス、即ち［ＩＩＶに対する阻害 作用を有することが報告されている。

過去数年間に、抗−１２ＮＡとしてのオリゴデオキシヌクレオチドの使用は急速 に確立され拡大し、例えばＨｅ１ｅｎｅ（Ｇｕｓｃｈｌｂａｕｅｒ、　７４．纒 ＤＮＡ　リガンド相互作用：薬剤から蛋白へ、　Ｐ１ｅｎｕｓ＋　１９８６）、 　Ｈｅ１ｋｋｉｌａ等（Ｎａｔｕｒｅｓ３２８：４４５−４４９（１９Ｂ？）お よび５ｔａｉｎ等（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。

１９８８、新聞発表）により報告されている。　Ｍａｔｓｕｋｕｒａ等（Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ　８４ニア７０６−７７１０ （１９８７））はＨＩＶウィルスの＾ＴＨ８細胞に対する細胞毒性作用に対する ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドの阻害作用を観察している。Ｈ ＩＶ　ａｒｔ／ｌｒｓ遺伝子の５′−５１域に対するアンチメツセージＳ−オリ ゴヌクレオチド（２８−ｓ３４）はｐ２４の生産をほぼ完全に阻害できた。興味 深いことに、ホモポリマーＳ−ｄｃｚｍは１マイクロモルはどの低濃度でウィル ス阻害の作用を示している。

Ｍａｊｕ＊ｄａｒによる最近の研究は現在継続中であるが、この分子が低アフィ ニティー結合部位および高アフィニティー結合部位でウィルス逆転写酵素に結合 できることを示している０通常のオリゴ種は、配列特異的なものもホモポリマー も有効ではない。

これらの観察結果の１つの可能性のある説明として、Ｅｃｋｓｔｅｒｉｎ（Ａｎ ｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅ曽　５４：３６７−４０２（１９８５））　の記載す るようにホスホロチオエートジエステル結合のヌクレアーゼ安定性が考えられる 。しかしながら、通常のオリゴヌクレオチドとＳ−オリゴヌクレオチドの分解速 度を実際に比較した報告はなく、また通常のオリゴ−ＰＳ−オリゴニ重らせんの 熱安定性の測定も行なわれていない、単一のＰＳ置換を有するオリゴヌクレオチ ドの２つの立体異性体（ＳｐおよびＲｐ）の合成およびいくらかの性質がＬａＰ ｌａｎｃｈｅ等（Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１４；９０８１−９０９３ 　（１９８６））により報告されているが、極めて広く用いられている自動合成 法は立体特異的なものではない。

実際、これらの化合物が臨床において現実に有用となる前には多くの障害が残っ ている０例えば、現在の価格では２８量体Ｓ−オリゴ１．Ｏｇは５０，０００ド ルを超える。

理論的により短いオリゴ体が低価格である。しかしながら、１５量体より小さい 配列は特異性を有さす、Ｓ−オリゴ／ＲＮ＾ハイブリッドは３７℃のアッセイ温 度より低温の融点を有する。Ｈｅ１ｅｎｅと共同研究者Ａｓ５ｅｌｉｎｅ等（Ｈ ＭＢＯｊｏｕｒｎａｌ　３ニア９５−８００（１９８４））；　Ａｓ５ｅｌｉｎ ｅ等（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８１：３２９７−３３０１（１９８４））：Ｈｅ１ ｅｎｅ等（ＧｕｓｃｈＩｂａｕｅｒ、　ｏｐ　ｃｉｔ）；およびＴｏｕｌ＋ｍｅ 等（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８３：１２２７−１２３１（１９８６））は３′末端で共有 結合し、一部は５′末端で結合した介在アクリジン部分含有する一連のオリゴマ ーを提示している。これらの研究者達は、アクリジンの介在による結合安定性か ら得られたとするより短いオリゴヌクレオチド（ｎ＜１２）の融点の実質的な上 昇を記載している。

Ｈｅ１ｅｎｅ等は、欧州特許第０１６９７８７号、第０２１４９０８号および第 ０１１７７７７号において、ＲＮＡおよびＤＮＡの切断のため、ウィルスの複製 または発現の防止のため、または特定のＤＮＡおよびＲＮＡの配列の検出と生成 のための、介在基に結合した修飾オリゴヌクレオチドを開示している。これらの オリゴヌクレオチドは共有結合により介在基を融合することにより調製される。

化合物は知られた方法、特にホスホトリエステル合成により調製される。開示さ れた工程において、ヌクレオチドの鎖を先ず調製し、反応に関与しない基を反応 の間保護し、その後保護基を除去して最終生成物とする。

例えば３′−ホスホジエステルヌクレオチドを介在する試薬のヒドロキシル誘導 体と結合させる。残念なことに、この合成方法はかなり複雑であり、標準自動合 成工程には容易に適用できない。

その他の研究者はオリゴヌクレオチドに螢光標識を導入する試みを行なっている 。しかしながら、これらの方法は製品の大規模生産には適さなかった。

５ｐｒｏａｔ等のＰＣＴ国際公開−０８７１０７６１１号は、螢光染料を用いた オリゴヌクレオチドの標識方法を開示している。標識は、オリゴヌクレオチドを その５’−（Ｈ３−（Ｙ）ｚ　）−誘導体に変換し、これを螢光染料の誘導体と 反応させ、これが５−誘導体とともに螢光団オリゴヌクレオチドのオリゴヌクレ オチドを形成することにより行なっている。

Ｙａｍａｎｅ等の欧州特許第０．２５１２８３号は、化合物の基本骨格の形成お よび／またはそこへの置換基の導入のために用いた配列を用いることにより多標 識オリゴヌクレオチド誘導体を調製する方法を開示している。一方の方法は、ア ミノアルキル化オリゴヌクレオチドを合成し、次に化合物にポリリジンを導入し 、そしてポリリジンを標識物質で標識することを包含している。

他方、アミノアルキル化オリゴヌクレオチドを、予め標識物質で標識したポリリ ジンと結合させることもできる。

Ｉｎｏｕｅ等の欧州特許第０２３５３０１号は、螢光物質でありグアニジンまた はアデニンと塩基対を形成できるピリドピリミジンオリゴヌクレオチドの生成方 法を開示している。化合物は標準的な方法で合成できる。その化合物は全ては螢 光物質であり、天然のピリミジン塩基の共通の特性を示すとされている。

Ｃｏｈｅｎ等は１９８８年２月２２日出願の０７／１５９．０１７号で、種々の 腫瘍およびレトロウィルスに対する処置のために用いることのできるオリゴデオ キシヌクレオチドを開示している。この出願は参考のために本明細書に組み込ま れる。

現在のところ、ポリヌクレオチド合成のための種々の方法がある。これらの方法 はいくつかの基準により特徴付けられる。第１に、合成は通常は固相支持体上ま たは溶液中で行なわれる。固相合成法は支持体の一端に結合している成長中の鎖 に順次モノヌクレオチドを付加していく方法である。固相法は反応体の分離は容 易であるが、反応体の過剰な量が必要であり、通常、所望の配列は少量、即ち１ ■未満しか得られない、溶液相合成法は高価な反応体の必要量が少なくより多く の量の生成物配列が得られるが、各添加後に中間体生成物の単離および精製を必 要とする。実質的に全ての自動ポリヌクレオチド系は固相合成によるものである 。

オリゴヌクレオチドまたはオリゴデオキシヌクレオチドおよびそれらの誘導体の オリゴマーまたは重合体を調製するための反応系は、これらの化合物を比較的安 価に合成する簡便な方法になってきている。現在使用されている固相反応系は、 強床カラム、別法カラム、バッチ反応器または管状反応器の何れかを使用してい る。このような系はｌ１ｒｄｅａ等の米国特許第４．４８３．９６４号に開示さ れており、その内容は参考のために本明細書に組み込まれる。

発明の要旨 本発明の目的は上記した従来技術の欠点を克服することである。

本発明の別の目的は一連のホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド類縁 体の合成方法を提供することである。

本発明の更に別の目的は遺伝子発現のアンチメツセージ阻害剤の自動調製方法を 提供することである。

本発明の更に別の目的はＦＩＩＶ感染症の治療のための化合物の自動調製方法を 提供することである。

本発明の更に別の目的は螢光標識の付されたオリゴヌクレオチドまたはその化学 修！Ｉ頻緑体をａｌｌ製するための合成方法を提供することである。

本発明の更に別の目的は、螢光アクリジン基の結合したホスホルアミダイトの合 成、および、それを合成オリゴヌクレオチドまたはその類縁体の５′末端へ自動 Ｄ口合成装置中で付加することを提供することである。

本発明はオリゴデオキシヌクレオチドの５′末端を螢光標識するための単純で、 自動化された高収率の方法を包含するホスホルアミダイト合成法を提供する０反 応過程を図１に示す、５′−アクリジン結合分子はＰＯおよびＰＳともに、逆相 クロマトグラフィーで容易に精製される。２つの主要ピークが観察され、各々は アクリジンを含有しているが、ＩＢおよび”Ｐ　ＮＭＲによれば、所望の化合物 はより長い保持時間で一定に溶出することが解る。より早く溶出する成分の性質 はこの時点では明らかではない。

ＨＬ６Ｇ細胞は流動血球１夏分析により解るとおり、チミジンのホモオリゴデオ キシヌクレオチドを取り込む。

即ち、オリゴデオキシヌクレオチドのエネルギー依存性輸送機構が存在すると考 えられる。即ちこれらの化合物は遺伝子発現のマーカーおよび阻害剤として有用 である。

図面の簡単な説明 図１は自動合成装置における結合ホスホルアミダイトを用いた５′−結合アクリ ジンオリゴデオキシヌクレオチドの合成過程を示す。

図２は、５′−アクリジン−ｄＴ、の芳香族部分の４００　ＭＦＩｚおよび６５ ℃におけるプロトンＮＭ費スペクトルである。

図３は種々のＧＣ含有量のホスホロチオエート１４−ｓ３４オリゴデオキシヌク レオチドと通常のもの七の融点の差を示す。

図４は遊離アクリジンおよび５′−アクリジン−ｄＴ＋を細胞への取り込みに対 する温度の影響を示すものである。

図５＾および５Ｂは通常のｄＴおよび５−ｄＴオリゴデオキシヌクレオチドの細 胞への取り込みを示すものである。

発明の詳細の記述 ５′−結合オリゴデオキシヌクレオチドはホスホルアミダイトアクリジンを用い て自動合成装置で合成できる。これらの化合物は、特定のホスホロチオエートオ リゴデオキシヌクレオチド類縁体がその通常の同族体とは異り、Ｍａｔｓｕｋｕ ｒａ等（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８４ニア７０６−７ ７１０（１９Ｂ？）＞　（７）報告の通り、明らかな抗ＨＩＶ活性を示すことか ら重要である。

ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドのアクリジン−チミジン塩基対 の融点は通常のオリゴデオキシヌクレチドに比べて明らかに低下しているが、Ｇ Ｃ含有ホスホロヂチオートオリゴデオキシヌクレオチドは更に低下した融点を示 す、ポリ−「＾を有する５−ｄＴオリゴマーの融点は通常のｄＡオリゴマーの二 重らせんより低温である。これらの結果は遺伝子発現のアンチメツセージ阻害剤 としてのＳ−ｄ　（ＣＧ）配列の理論的ｍ拠を与えるものである。

ホスホルアミダイト結合アクリジンを用いた５′−アクリジン結合オリゴチミジ レートの自動合成の間に、アクリジンの６−クロロ置換基がチオフェノールによ り置き換えられることが解った。対応するｄＡ、を有する二重重らせん型上の通 常およびホスホロチオエートのｄＴｎ　（ｎ・３−４０）に結合した３つおよび ５つのメチレン基を有する化合物と比較して５−メチレン結合アクリジン誘導体 の融点は僅かに上昇していた。これらの螢光標識オリゴデオキシヌクレオチドは より大きい化合物よりもより速く取り込まれ、通常のオリゴデオキシヌクレオチ ドはＳ−オリゴデオキシヌクレオチドより速く取り込まれることが解った。この 細胞取り込みの温度依存性はエネルギー依存性過程およびオリゴデオキシヌクレ オチドの膜受容体の存在の可能性を示唆するものである。

Ｎ−（６−クロロ−２−メトキシ−アクリジニル）−〇−メトキシージイソプロ ピルアミノホスフィニル、３−アミノプロパン（１）オールおよび５−アミノペ ンタン（１）オールの調製 ３−アミノプロパツール、５−アミノペンタノールおよび６．９−ジクロロ−２ −メトキシアクリジンは＾ｌｄｒｌｃｈＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、より入手した 。６−クロロ−２−メトキシ（ヒドロキシアルキルアミノ）−９−アクリジンは ＾５ｓｅｌｉｎｅ等の方法により！ｊ［した（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ。

ｕｓ＾、　ｏｐ、ｃ口）、ホスホルアミダイトはＣｏｎｎａｌｌｙの方法の変法 により！Ｍ製した。６−クロロ−２〜メトキシ〜９−（３−ヒドロキシプロピル ）アミノアクリジン（３１８ｍｇ、　ｌ■−〇暑）または５−ヒドロキシペンチ ルアミノ誘導体（３４６Ｂ、　１ｓｓｏｌ）を塩化メチレン（ＣＨｘｃ　ｊ！　 ｚ　）２ｍｌに溶解した０次いで、Ｎ−エチル−ジイソプロピルアミン（３８０ ｍ１ｃｒｏ　Ｌ、２＋ｗ＋ｇｔｏｌ）Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル−メチル−ホスホ ナミドクロリドＣ１９４ｍ１ｃｒｏ　Ｌ、　ｌ５ｓｏｌ）を約５分間かけて添加 した。更に３０分後、シリカゲル上の薄層クロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸 エチル：トリエチニルアミン、１０：１０：１）によれば、反応が終了していた （出発物質のＲｆは０．１．生成物のＲｆは０．８（■＝３）および０．７５（ −５））、塩化メチレン５ｍｌ　を添加し、混合物を５％重炭酸ナトリウム（２ Ｘ５■ｌ）および飽和塩化ナトリウム５ｍｌで抽出した。有機層を硫酸ナトリウ ム上で乾燥し、蒸発させて黄色油状物を得た。これを少量の９：１ヘキサン／ト リメチルアミンに溶解し、この混合溶媒を用いながらシリカゲルカラム（１０ｘ 　２　ｃｍ）上のクロマトグラフィーで精製した。生成物は上記薄層クロマトグ ラフィー系では単一のスポットとして溶離し、正しいプロトンＮＭＲスペクトル を有していた。更に、”ＩＰ　ＮＭＲスペクトルによれば、単一のピーク１４７ ．３３１（ｍ讃３）および１４７．１７１（−・５）がみとめられた、約６５％ の収率であった。

オリゴデオキシリボヌクレオチドの調製５−メチルシチジンローシアノエチルホ スホルアミダイトをＧｌｅｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ（Ｈｅｒｎｄｏｎ、　ＶＡ）よ り入手した０通常のオリゴデオキシヌクレオチドは全て、ＡＰｐｌｔｅｄＢｉｏ ｓｙｓｔｅｍｓ　３８０Ｂ　ＤＮＡ合成装置で合成し、ＨＰＬＣ逆相り１　ロマ トグラフィー（ＰＲＰ−１）　カラムで精製した。アセトニトリル中アクリジニ ルホスホルアミダイトの１００ｍＭ溶液を用いて合成を１同素分に実施した。こ の最終カップリングの後、メチルホスフェート保護基をチオフェノールで除去し く、！曝露時間３０分）、樹脂からの分離は濃アンモニア水を用いて行なった。

ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドの自動合成は、５ｔｅｉｎ等（ Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　ｒｅｓｅａｒｃｈ＋　１９８Ｌ新聞発表）の報告のと おり、５ｔｅｃの方法の変化法により実施した。

即ち、標準ヨウ素酸化をＣ５ｔ／ピリジン／　トリエチルアミン（４５：４５： １０）中の元素イオウの１０％溶液を用いたイオウ化段階と置き換えた。酸化段 階の前後、カラムを二硫化炭素およびピリジンの１：１溶液で繰り返し洗浄して 残存イオウを除去した。ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドを上記 した逆相ＨＰＬＣで精製したが、その際の％有機層（アセトニトリル）は高値で ある。試料を３％酢酸中室温でトリチル除去し、酢酸エチルで抽出し、凍結乾燥 した。

融点 ポリ−ｒＡおよびポリ−ｒ１　をＰｈａｒ腸ａｃｉａより入手した。

全光学測定は、ＣＰＳコントローラーサーモスタットに連結したＳｈｉｗａｄｚ ｕ−ＬＩＶ−１６０記録分光光度計で行なった。

吸光度は１０−Ｍナトリウムカコジレートハ４０５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液、　 ＰＨ７，０中、２６０ｎｍで記録した。全ての二重らせんは、１本鎖とその相補 鎖との１：ｌ混合物として形成した。全試料を７５〜９８℃で予ｇＩＩ溶融して 二次構造を破壊し、次に熱的に平衡とした。各溶融曲線は最低２０の独立した点 よりなる。

ＮＭ［？測定 ＮＭＲスペクトルは２２℃で、′Ｈでは４００ＭＨｚ、　”Ｐでは１６２ＭＨｚ でＶａｒｉａｎ　ＸＬ−４００分光型で測定記録した。化学シフトは内部ＴＭＳ および外部Ｔ？ＩＰに対してそれぞれ測定した。リサイクル時間は２〜３秒とし 、スキャン回数はＩ）で６４〜２００回、ｌｌｐで３０００回までとした。積分 はＶａｒｉａｎプログラムにより行なった。

酸素の速度過程 Ｓ１ヌクレアーゼおよびＰＩヌクレアーゼをＢＩ？Ｌより入手した。ウシ肺臓ホ スホジェステラーゼおよびヘビ毒ホスホジェステラーゼをＰｈａｒ＊ａｃｆａよ り入手した。反応は全て３７℃で総容積１１１１で行なった。ＷＪｊＬ光度値は λｗａｘで測定した。　Ｓｌヌクレアーゼ（１００（ｌｓｉｃｒｏｎｓ／ｍｌ） を３０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，６）、　５０５Ｍ塩化ナトリウム、１■Ｈ 酢酸亜鉛および５χ（ｖ／ｖ）グリセロールを含有する官能緩衝液中１：１０に 希釈した。酵素の最終濃度は１００ｕ／−１であった。　ｐｉヌクレアーゼ（４ ０１１／−１）を５０−Ｍ酢酸ナトリウム（ｐｔ１５．３）を含有する反応緩衝 液中１：１０に希釈した。酵素の最終濃度は４ｕ／ｍｌであった。ウシ肺臓ホス ホジェステラーゼを水に溶解しく０．０４ｕ／　ｐ　Ｌ）、１２５ｍＭスクシネ ート−塩酸を含有する溶液ｐｆ１６．５に添加（１ｕ／−１）シた。ヘビ毒ホス ホジェステラーゼ（４６閤ｇ　５ｏｌｉｄ）／層Ｉ）を５００　ａ　Ｌ　の水に 溶解した。この溶液のうちＩＩＩＬを、１００５Ｍ　）リス塩酸、　ｐＨ８，９ ，１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび１４ｗＭ塩化マグネシウムを含有する反応混 合物に添加した。

データ分析 全データをＮＩＨコンビエータ−センターのＤＨＣＰＤＰＩＯコンピューター上 のＭＬＡＢプログラムを用いて分析した。

単純指数をヌクレアーゼ分解データに通用しく吸光度対時間）、そして、下記式 ： ％式％（１） 〔式中００（Ｔ）　は時間Ｔにおける光学密度であり、ε。

およびε、は最小および最大の吸光度値であり、Ｋｍｅｘｐ（Ｈ（Ｔ−Ｔｍ）Ｒ Ｔａ＋”）　）であり、Ｈはファントホヮフのエンルビーである〕のシグモイド 曲線を溶融曲線に適用した（規格化吸光度対温度）。

アクリジンＩＩ識オリゴデオキシヌクレオチドの細胞蓄積の流動血球計数分析 ５′−アクリジンを有する種々の長さのオリゴデオキシヌクレオチド（ｄτｙ、 　ｄＴ＋ｚ、　ｄＴｔｏおよびｄＴｔｏ）を１０％ウシ胎児血清および抗生物質 を含有するＲＰ１１６４０培地中、０．２〜０．５マイクロモルの最終濃度で、 ＨＬ６０細胞とともにインキュベートした。所定の時間の培養液から細胞１００ ，０００を採取し、リン酸塩緩衝食塩水で３回洗浄し、Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋ ｉｎｓｏｎ　Ｆａｃｓｔａｒ装置を用いて流動血球計数分析により分析した。細 胞内アクリジンを３００−　に設定したアルゴンレーザーの４８８ｎｍ線で励起 し、個々の細胞の発光螢光を記録した。集団の対数増幅螢光が単峰型であったた め、データをＦａｃｓｔａｒによるＣｏｎ５ｏｒｔ　３０ソフトウエアを用いて 計算された集団の螢光中央値として表わした。

アクリジン含有オリゴマーの特性化 アクリジン結合オリゴデオキシヌクレオチドの合成に用いた反応工程を図１に示 す、生成物はＨＰＬＣ，ＵＶ。

Ｉおよび”Ｐ　ＮＭＲ分析で特性化した。全生成物は単一の主要ピークを”Ｐ　 ＮＭＲスペクトル上で示した。　ＵＶおよび’ＨＮＭＲスペクトルは単一のアク リジン結合化合物とは合致しなかった。観察されたピークはＡｓ５ｅｌｉｎｅ等 （ｏｐ、ｃｉｔ、、　１９８４ａ）　の報告した６−クロロ化合物には相当しな い、芳香族プロトン共鳴の相対領域は一貫して、図２に示すように、生成物中に 存在する余分の芳香族部分を示していた。ヌクレオチドの結合しないアクリジン 前駆体を合成装置の条件下でチオフェノールで処理したところ、やはり余分の芳 香族基を有する生成物が得られた。従ってこれは、図１に示すようにアクリジン の６−クロロ置換基とチオフェノールとの置換反応であると考えられた。このチ オフェノール置換に関わらず、得られた生成物は以下に述べる溶融試験および細 胞取り込み試験で使用するのに適していることが解った。

融点温度 全てのＰＳおよび通常の種々の長さくｎ・１２．１５．２０）のオリゴｄＴのポ リ−ｒ＾との二重らせんの融点を表■に示すように措定した。オリゴｄＣ（１５ および２８量体）をおよび５−メチル−オリゴ−ｄＣ（２８量体）のＰＳおよび 通常のものとポリ−ｒｌ　の二重らせんの融点も測定した。

表１ ボ’）−ｒＡを伴った５′−アクリジンオリゴ−ｄＴの融点ＰＯ−オ　１　ゴ　 ａ＋Ｔ−ΔＨΔＴｍ　ＰＳ−オ　１　ゴ　ｍＴ−ΔＨΔ丁−〇−ｄＴ１２　３２ 　４２　５−ｄＴ１２　＜　１２０−ｄＴ１２−Ａｃｒ３　３７　３７　５　５ −ｄＴ１２−Ａｃｒ３　＜１２５　３９　４３　７　５＜１２ ０−ｄＴ１５　３９　５４　５−ｄＴ１５　２２　３８０−ｄＴ１５−Ａｃｒ３ 　４３　４１　４　５−ｄＴ１５−Ａｃｒ３　２０　４０　−２Ｏ−ｄＴ２０　 ４５　６５　５−ｄＴ２０　２９　４９０−ｄＴ２０−Ａｃｒ３　４９　６０　 ４　５−ｄＴ２０−Ａｃｒ３　３０　２４　−１表Ｈに示す通り、Ｓ−オリゴは 相当するＰＯ？Ｊ合体より約１０〜１２℃低い融点を有している。意外にも、５ −メチル５−ｄｃ、、、　４２℃、ΔＨ・８０の融点は未メチル化通常同族体と ほぼ等しい、全ｐｓおよび通常の１５量体の融点をＧＣ含を量の関数としてその 相補的なオリゴ体と比較したところ、図３に示すように、約５０％含有量におい て最も小さい差が観察された。

表■ ポリ−ｒｌ　を伴ったオリゴ−ｄＣの融点ＰＯ−オリゴ　Ｔ−ΔＨＰＳ−オリゴ 　Ｔｍ　ΔＨ６１階０−ｄｃ１５　２９　８３３−ｄｃ１５　２０　８５　９Ｏ −ｄＣ２８４１１０７５−ｄＣ２８３１９２１ＯＳ−５Ｍｅ１０Ｓ−５４２８０ ５′結合アクリジン誘導体を有する覆々の長さのポリ−ｒＡ　とオリゴｄＴとの 二重らせん（通常およびＰＳ）の融点を、表■に示すように、同じ長さの未修飾 のホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドと比較した。

各々の場合において、Ａｓ５ｅｌｉｎｅ等（ｏｐ、　ｃｉ　ｔ、　、　１９８４ ｂ）の報告のとおり、介在部分とオリゴ部分との間の結合には３または５つのメ チレン基が含まれていた＊　ｎ　＜１２のＳ−オリゴとポリ−ｒＡ　との二重ら せんの融点はそれらが極めて低温であったため測定できなかった。ｄＴ、□。

ｄＴｉｚおよびｓＴ、。の試験の場合は、平均で、−・３の５′結合修飾アクリ ジンの融点は４℃、―・５の場合は７　’Ｃの上昇が認められた。デルタＨの値 は通常のオリゴのものと大きく変化しなかった。しかしながら、全２３１９１体 （ｄＴｉｚ、ｄＴｚ。）について、未修飾のＰＳオリゴ体と比較して、−・３お よび欄・５の何れの場合も、本質的な融点の変化はみとめられなかった。５−ｄ Ｔポリ−ｒＡ二重らせんについては、顕著なΔＨの減少が認められた（４９ｋｃ ａｌ／５ｉｏ１から２９ｋｃａｌ／＋＊ｏｌ）。

ヌクレアーゼ感受性 通常−・３の５′−アクリジン−ｄＴｉｚのデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａ ｓｅ）感受性について表■に示すように検討した。使用したＤＮａｓｅは大部分 がエンドヌクレアーゼＳｌ、エキソ−およびエンドヌクレアーゼＰ１．ヘビ毒ホ スホジェステラーゼ（ＳＶＰ）およびウシ肺臓ホスホジェステラーゼ（ＢＳＰ） であり、遊離の５’−ＯＨ基を要するものであった。ヌクレアーゼ分解は、未修 飾およびアクリジン結合オリゴ体で実質的に等しい速度で進行したが（Ｓｌ、　 Ｐｉ、　５ＶＰ）　、ＢＳＰを使用した場合ニハアクリジンオリゴ体では約２０ 倍遅かった（ｔｌ／２＝８５５秒に対してａｃｒＴ１５の場合は１．９５　ｘ　 １０量秒）。

表■ オリゴデオキシヌクレオチドのヌクレアーゼ分解（ｔ　１／２秒） オリゴマー　ＤＮａｓｅＳＩ　５ＮａｓｅＰＩ　５ＶＰａ　ＢＳＰａｄＴ＋ｓ　 ２１　１２４　１８　８５５５’−Ａｃｒ−ｄＴｉｚ　２３　８５　２３　１９ ５００略号：　５ｖｐ＝ヘビ毒ホスホジエステラーゼ；ＢＳＰ・ウシ膵臓ホスホ ロジェステラーゼＪＬ６０細胞による５′−アクリジン標識オリゴ体の蓄積遊離 のアクリジンと比較した場合の、５′−アクリジン−ｄＴｉｚ（ＰＯ，−一３） の蓄積による細胞内螢光物質の増加を図４に示す。オリゴ体は数時間に渡り細胞 内に蓄積し、この過程は３７°Ｃでは生じるが４℃では生じないことが明らかで ある。遊離のアクリジンアミノブロバノ−ルは拡散により細胞に侵入し、３７゛ ｃおよび４℃の何れの場合も同様に蓄積する。異る長さの通常のオリゴ体の蓄積 を調べたところ、図５ａに示すとおり、５′−アクリジン−ｄＴ、は６丁１．お よびｄＴｚ。より急速に取り込まれることが解った。５′−アクリジン−５ｄＴ ｙ　は図５Ａと５Ｂを比較することにより解るとおり、通常のｄＴ、よりかなり 遅く取り込まれた。

図１に示されるとおり、本発明のホスホルアミダイト合成ハ簡便で、自動化され た高収率のオリゴデオキシヌクレオチド５′末端螢光標識法を提供するものであ る０分子を塩基性脱ブロツク条件下、例えば水性アンモニア６０″ＣＩＯ時間の 条件下に付した場合にアクリジンはオリゴデオキシヌクレオチドから切断除去さ れる。

従って、この方法は基本的にチミジンのホモオリゴ体に適する。穏やかな条件下 での６位でのチオフェノールによる環塩素基の置換は新規なものであり、混合物 中のチミジンの存在により可能になると考えられる。

ＰＯおよびＰＳともに、５′−アクリジン結合分子は逆相クロマトグラフィーに より迅速に精製される。２つの主要ピークが観察され、各々はアクリジンを含有 するが、′ｌｌおよび”Ｐ　ＮＭＲによれば、所望の化合物はより長い保持時間 に一定に溶離することが解る。

ポリ−ｒＡ二重らせんの一連の融点測定をＰＯおよびＰＳ両方のチミジンのアク リジン結合ホモオリゴデオキシヌクレオチドを用いて実施した。２６０ｎ−にお ける吸光度の変化を使用したが、これはオリゴ体およびアクリジンの発色団の両 方の吸収よりなる複合吸収帯である。

ｎ〉１２では、この吸収帯は実質的にオリゴ体の性質のものであった。オリゴ体 が幾分異るアクリジン誘導体で３′および５′末端を標識された過去の観察結果 とは対照的に（Ａｓｓｅｌｉｎｅ等、　ｏｐｓ、ｃｉ　ｔｓ　）　、今回みとめ られた結果では融点の上昇は小さかった。例えば、ｎ・１２の場合は、Ａｓ５ｅ ｌｉｎｅ等は融点上昇的１４°Ｃ，ｅｐ＝５を報告しているが、表■によれば、 異る修飾アクリジンを使用したところ上昇は僅か７℃であった。さらに、通常の ５′アクリジン−ｄＴｙを使用した同様の実験においては、融点の上昇は認めら れても極僅かなものであったのに対し、Ａｓ５ｅｌｉｎｅ等は、３′〜アクリジ ン−ｄＴｓの融点が２３℃上昇したことを報告している。本発明の系においては 、融点の上昇はｎ・２０でもなお観察された（７℃、ｍ・５）。

さらに、同様の実験でａｉｉへたｐｓ化合物（Ｓ−ｄＴ＋ｓ、　５−ｄＴｚｏ） の全てについて融点上昇が観察されなかった。これらの結果は、本発明で合成し た種類の５′−結合アクリジンが寛際に極めて弱い介在物質であることを示して いると考えられる。これはアクリジンに結合しているより大きい置換基の厳密な 性質を反映しているものと考えられる。またさらに、−一５は、この特定のアク リジン部分による最大介在のためには不十分なメチレン基数である可能性もある 。介在が生じていないことが示されたものの、Ｓ−オリゴポリ−ｒＡ二重らせん が５′結合アクリジンによる安定化を示さない理由は明らかではない。イオウは 酸素と比較した場合、より大きいファンデルワールス半径を有するため、既に弱 い介在部分がその結合部位に近付くのが妨害されたと考えられる。

通常およびＳ−オリゴ体の融点の差は、ＧＣ含有量が増大するほど減少し、図３ に示すとおり、約５０％のＧＣ含有量で最小値を示した。さらに、現在得られて いる最も活性の高い抗ＨＩＶ　Ｓ−オリゴ体は、高いＧＣ含有量を有する（Ｍａ ｔｓｕｋｕｒａ等、ｐｏ、ｃｉｔ）。

本発明の合成方法は４つの塩基全てに適用できる。

チオホスフェート側鎖反応は、別の置換アクリジンを用いることにより回避でき る。

細胞系において通常のオリゴデオキシヌクレオチドを使用する際の主要な問題の １つは、ヌクレアーゼ感受性である。しかしながら、Ｓ−オリゴデオキシヌクレ オチドは極めて高いヌクレアーゼ耐性を示す、修飾アクリジンでオリゴデオキシ ヌクレオチドの５′末端をキャンピングすることにより、５′エキソヌクレアー ゼウシ膵臓ホスホジエステラーゼに対する感受性は大きく変化するが、Ｓｌおよ びＰＩヌクレアーゼ、またはヘビ毒ホスホジェステラーゼに対する感受性は変化 しない。

チミジンのホモオリゴ体は流動血球計数分析により示されるとおり、ＨＬ６０細 胞により取り込まれる。死亡細胞には細胞内螢光物質はみとめられず、これらの 化合物の蓄積がエネルギー依存性の過程であることを示している。この仮説を裏 付けるものとして、図４に示されるとおり、遊離のアクリジンの細胞内への侵入 は温度独立性（４゛ｃ対３７’Ｃ）であるのに対し、５′アクリジン−ｄＴ＋ｚ は４°Ｃでは侵入しないことが解っている。

５′アクリジン−５−ａＴ？の細胞取り込みは通常のアクリジン−ｄＴ、。より も緩やかであり、恐らく約４８時間、検知限界未満であることが図５により示さ れている。この時点以降、オリゴデオキシヌクレオチドの分解および遊離アクリ ジンの形成が顕著になる。Ｓ−オリゴ体はまた、螢光標識通常オリゴ体の取り込 みを抑制することも解っている。

オリゴデオキシヌクレオチドの螢光基を用いることにより螢光細胞選択を用いた 細胞取り込み速度過程の測定が可能になる。さらに、この螢光基を用いることに より、細胞取り込み、代謝作用およびオリゴ体および関連ヌクレオチド誘導体、 例えばプラスミドおよび未被Ｊｌｌ　ｌ？ＮＡ分子の放出に対するその他の物質 の阻害作用を観察することができる。

特定の実施ａｍに関する上記記載は本発明の一般的性質を充分説明するものであ るから、現在の知識を提供することにより、本発明に一貫する概念から外れるこ となく、特定の実施Ｍ様を種々の用途の為に容易に変形および／または応用する ことができるが、そのような応用や変形は開示した実施態様と等しい意味および 領域に含まれるものである。本発明で用いた用語、および表現は、それに限定す る意図のものではなく、本発明を説明するためのものである。

ＦＩＧ、　１ ｔｉｍｅ　ｏず　１ｎｃｕｂａｔｉｏｎ　（ｈｏｕｒｓ）インキエーベーシッン 時間　（時間） −１ハ　Ａ 国際調査報告

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．下記段階： ホスホルアミダイトを６−置換アクリジンに結合させること、および、ホスホル アミダイトーアクリジンをオリゴデオキシヌクレオチドと反応させて螢光標識オ リゴデオキシヌクレオチドを形成すること、を包含するオリゴデオキシヌクレオ チドまたはその修飾類縁体の５′末端を螢光標識するための方法。
2. ２．アクリジン上の６−置換基が塩素である請求項１記載の方法。
3. ３．アクリジン上の６−置換基がチオフェノールである請求項１記載の方法。
4. ４．自動ヌクレオチド合成反応器で工程を行なう請求項１記載の方法。
5. ５．オリゴデオキシヌクレオチドがＧＣ含有ホスホロチオエートオリゴデオキシ ヌクレオチドである請求項１記載の方法。
6. ６．オリゴデオキシヌクレオチドがＳ−オリゴデオキシヌクレオチドである請求 項１記載の方法。
7. ７．オリゴデオキシヌクレオチドが１０〜３０の単量体を含有する請求項１記載 の方法。
8. ８．オリゴデオキシヌクレオチドがチミジンのホモオリゴマーである請求項１記 載の方法。