JPH10505353A - オリゴヌクレオチド複合体、構成成分及びリボ核酸の分解方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 オリゴヌクレオチドにエステル交換反応触媒又は加水分解触媒が結合し、そしてオリゴヌクレオチドの内部配列が天然に存在する標的ＲＮＡに対して部分的に相補的でなく、そしてオリゴヌクレオチドが、デオキシリボ核酸構成要素、非天然の合成によるヌクレオチド構成要素、又はペプチド核酸から構成されることを特徴とするオリゴヌクレオチド。本オリゴヌクレオチドは、相補性標的ＲＮＡの分解に著しく適し、このとき分解のあとでオリゴヌクレオチドが再び遊離されるので触媒効果が大きくなる。

Description

【発明の詳細な説明】 オリゴヌクレオチド複合体、構成成分及びリボ核酸の分解方法 本発明は、エステル交換反応触媒又は加水分解触媒によるオリゴヌクレオチド 複合体、配列が天然に存在する標的リボ核酸（標的ＲＮＡ）に対して部分的に相 補的でないオリゴヌクレオチド配列、生理条件及びオリゴヌクレオチド会合体の 作用の下で標的ＲＮＡを配列特異的に分解する方法、不活性担体物質及びオリゴ ヌクレオチド会合体からなる構成成分、並びにその方法の使用に関する。 一本鎖ＲＮＡが金属イオンの触媒作用を受けて加水分解することはかなり前か ら知られている。分解は基本的には英語で“ループ”と呼ばれるＲＮＡの不対部 分で起こる。W.J.Krzyzosiakらはこれについて Biochemistry，Band 27，5771〜 5777頁(1988)において二酢酸鉛の使用を提唱した。G.J.Murakawa らは Nucleic Acids Research，17 巻，5361〜5375頁（1989）において１，１０−フェナント ロリンの銅錯体を使用することを記述している。J.Ciesiolka らは Eur.J.Bioch em．182 巻，445 〜450頁（1989）においてｔＲＮＡ^Pheの分解に三塩化ユウロピ ウムを同じ目的で用いることを開示している。C.S.Chowらは J.Am.Chem.Soc.，1 12巻，2839〜2841頁（1990）において同じＲＮＳに対してフェナントロリンリガ ンドをもつルテニウム錯体及びロジウム錯体を使用している。Bio-chemistry，2 9 巻，2515〜2523頁（1990）において L.S.Behlen らは二酢酸鉛によるｔＲＮＡ^Phe の突然変位体について説明する。さらに N.Hayashiらは Inorg．Chem.，32 巻，5899〜5900頁（1993）においてｔＲＮＡの分解にはランタニド金属錯体も適 することを記述している。 L.S.Kappenらの Biochemistry，32 巻，13138 〜13145 頁（1993）の記述によ ればネオカルチノスタチンによって一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを酸化分解するとき に、位置特異的切断が生じて、このとき例えば不対部分がＤＮＡ鎖に突出部を与 える結果になる。D.Williamsらが Nucleic Acids Research，16 巻，11607 〜11 615頁（1988）で明らかにすることによれば二本鎖ＤＮＡをフェナントロリン銅 で処理して加水分解反応をおこさせると鎖中に不対のシチジンが補足されている 位置で分解が優先的に起こる。 すでにドイツ特許 DE-A-24 51 358 が記述しているが、インターフェロンを二 本鎖（ｒＩ_n ｒＣ_n）錯体によって模写生産するときにｒＣ_n鎖の修飾による構造 阻害を考慮すればインターフェロンの製出につれて毒性が減少し、この結果、細 胞内のｒＣ_n鎖は容易にヌクレアーゼによる加水分解を受ける。構造阻害として 錯体中の対形成を阻止するヌクレオチドの導入が提案されている。この他の解説 として K.A.Kolasa が Inorg．Chem.,32巻，3983〜3984頁（1993）において指摘 するようにＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのなかのＲＮＡは３価のランタニドイオ ンでは分解されない。 さらに D.Magdaらが J.Am.Chem.Soc.，116巻，7439〜7440頁（1994）に記述す るようにユウロピウム（III）−テキサフィリン及びオリゴヌクレオチドからな る複合体はＤＮＡ構成要素によって標的ＲＮＡを分解させることが可能で、この ときＲＮＡ／オリゴヌクレオチド錯体中のテキサフィリン錯体の部分での切断が 多くなり３０％だけが観察される。このテキサフィリン錯体には欠点もあり、か なりの溶解度を与えるためにヒドロキシプロピルがリガンド内に追加して結合さ れなければならない。さらにリガンドのイミン基は加水分解を受けやすいために 水が周辺にあると効果が速やかに低下し、乃至は治療に使用するときの期間が短 縮される。その上リガンドが 加水分解すると金属が遊離して深刻な毒性問題とＲＮＡの非特異性分解をひき起 こす。さらにＥｕカチオンの荷電がリガンドで中和され、このために２価に帯電 した錯体ができるので弱いルイス酸が生成する。そのうえ記載の錯体は合成的方 法によってのみ得られる。 国際特許 WO 94/29316は、オリゴヌクレオチドからなる複合体にテキサフィリ ン金属錯体を使用するリン酸エステル加水分解の方法を開示する。実施例の１つ に複合体が記載されているが、これは金属としてジスプロシウム（III）を含有 し、複合体のオリゴヌクレオチド配列の選び方は、オリゴヌクレオチド配列の標 的ＲＮＡへの結合が１個又は数個のヌクレオチドからなる“ループ”を形成させ るようにしている。 細胞内において生理上有害なポリペプチドは、ｍＲＮＡによる遺伝子制御によ って生成することが知られている。従って疾患を制圧乃至は阻止するためにはｍ ＲＮＡの効果を阻害する薬剤が望まれる。とくに達成されるべきは、定められた 位置でおきる不可逆的分解によってｍＲＮＡが破壊され、これにより情報量が失 われることである。さらに望ましくは、ＲＮＡ鎖の配列特異的切断により断片が 供給され、これを使用して“アンチセンス部分”における適切なオリゴヌクレオ チドをすばやく同定し、細胞内の物質代謝の影響のもとで診断目的（バイオセン サ）又は病気治療を行うことである。 上述の薬剤には高い要求が課せられる。薬剤は特異的に標的ＲＮＡとハイブリ ッド形成しなければならず、他に存在するＤＮＡ分子及び／又はＲＮＡ分子に影 響を与えてはならない。とくに薬剤が少量でも高い効果を示し、身体特有な防御 物質（例えば、ヌクレアーゼなど）を原因とする分解に対して安定でなければな らない。 今回発見されたことは、オリゴヌクレオチドの配列が標的ＲＮＡに対して部分 的にだけ相補性であり、エステル交換反応触媒又は加 水分解触媒が結合しているオリゴヌクレオチドの効果が高いこと、標的ＲＮＡに おいて配列特異的分解さえも行えることである。さらに発見されたことは、比較 しうる反応条件において必要なオリゴヌクレオチドのエステル交換反応触媒の量 が、遊離状態、つまりオリゴヌクレオチドに結合していないエステル交換反応触 媒よりもはるかに少ない量であることである。二本鎖部分における標的ＲＮＡの 切断によってＲＮＡ／オリゴヌクレオチド錯体の不安定性がＲＮＡ切断の後で著 しく高まり、容易に分解が進んで遊離のＲＮＡ断片並びにオリゴヌクレオチド及 び加水分解触媒乃至はエステル交換反応触媒からなる遊離複合体になる。この方 法により複合体の触媒活性が高くなって使用量を大幅に低減させることができる 。 発明の対象は、デオキシリボヌクレオチド（ＮＡ）、非天然の合成によるヌク レオチド、又はペプチド核酸ＰＮＡであり、その特徴は、オリゴヌクレオチドに エステル交換反応触媒又は加水分解触媒が結合し、オリゴヌクレオチドの内部配 列が天然に存在する標的ＲＮＡに対して部分的に相補性がないことにある。 本発明の範囲でいう標的ＲＮＡとは、標的にＲＮＡ配列がなければならないこ とを意味している。これに応じてポリリボ核酸（ＲＮＡ）が存在することができ る。 ｍ−ＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｐｒｅ−ｍ−ＲＮＡ（前駆体−ｍ−ＲＮ Ａ）、ｔ−ＲＮＡ（転移ＲＮＡ）、ｓｎ−ＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｒ−Ｒ ＮＡ（リボソームＲＮＡ）及びウイルス性ＲＮＡが特に重要である。しかし、ま たＲＮＡとポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）からなる混合配列、例えばキメラＲ ＮＡ−ＤＮＡ（岡崎フラグメント）も存在することができる。ＲＮＡの構成要素 は非常に多いのでオリゴヌクレオチドと錯体（二本鎖）を形成することができる 。 本発明の範囲でいう部分的非相補性とは、オリゴヌクレオチドの配列が構造障 害を含むために対応する標的ＲＮＡのヌクレオチド構成要素と塩基対が形成され ないことを意味する（塩基対の意味は、例えば、標的ＲＮＡ及びオリゴヌクレオ チドにおける次ぎの相補性ヌクレオシド：Ａ−Ｕ、Ｔ／Ｕ−Ａ、Ｇ−Ｃ及びＣ− Ｇである）。標的ＲＮＡに対して通常は相補的なオリゴヌクレオチドにおいて実 行方式ではヌクレオチド連続構成要素が１個又は数個欠如する。このために標的 ＲＮＡの中に突出部ができてとくにエステル交換反応又は加水分解を不安定にす る。ほかの実行方式ではオリゴヌクレオチドが１個又は数個のヌクレオチド連続 構成要素を含有して対応する標的ＲＮＡのヌクレオチド構成要素との対形成がで きなくなる。これらの部分において二重らせんにおける構造障害によりＲＮＡは エステル交換反応又は加水分解反応に対して不安定になる。オリゴヌクレオチド において、好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜４個、さらに好ましくは １個又は２個の連続するヌクレオチドが欠如する。ほかの実行方式ではオリゴヌ クレオチドに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜４個、さらに好ましく は１個又は２個の対をなさない連続するヌクレオチド構成要素が含まれる（英語 ではこれらの構造障害をミスマッチ及び内部ループという）。 本発明の範囲でいう内部配列とは、例えば配列の外部ヌクレオチド構成要素で 好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１個又は２ 個が標的ＲＮＡとは相補的であってはならないことを意味している。このことは 配列の末端に結合するエステル交換反応触媒又は加水分解触媒が動き易く、効率 的になるかぎりにおいて有利である。 オリゴヌクレオチドは、部分的又は全部が標的ＲＮＡに対して相補的な天然Ｄ ＮＡ構成要素又は全部が同じく標的ＲＮＡに対して相 補的な非天然の合成ヌクレオチドから組立られるが、ここで部分的とは、オリゴ ヌクレオチド配列において標的ＲＮＡに対して相補的な天然ＤＮＡ構成要素が、 標的ＲＮＡに対して同じく相補的な非天然の合成ヌクレオチドによって置き換え られることを意味する。合成による構成要素には、核塩基、オリゴヌクレオチド のフラノース環及び／又は橋かけ基における天然の構成要素の修飾が包含される 。合成による構成要素は、一般的に二重構造における錯体結合の強化及び／又は オリゴヌクレオチドの、例えば、ヌクレアーゼに起因する分解に対する安定性向 上に使用される。修飾ヌクレオシドは“アンチセンス−テクノロジー”の分野で は相補性オリゴヌクレオチドの合成と修飾を行う非常に多くの例が知られるので ここでは詳しく説明しない（例えば、E.Uhlmann ら，Chemical Reviews，90巻， Nr．4，543〜584 頁（1990）を参照のこと）。 修飾として問題にされる変更は、核塩基部分（例えば、置換、置換基の脱離） 、ヌクレオチド橋かけ基（例えば、リン酸エステル基の変更又は他の橋かけ基に よる交換）及びフラノース環（例えば、２’−ヒドロキシル基における置換、フ ラノース−酸素原子の交換、モノ−又はビカルバ環状環によるフラノース環の交 換、開鎖構造によるフラノース環の交換）において起こる。 オリゴヌクレオチド配列における構成要素の選択と配列順は、標的ＲＮＡとの 必要な二重体形成によって決まる。触媒との連結の仕方と位置も構成要素の選択 と配列順に影響を与える。 対をなさないヌクレオチドでは天然のヌクレオチドが重要であり、これらは標 的ＲＮＡにおけるヌクレオチドに対して相補的でないように選ばれる（Watson/C rickの定義によると、例えばＡ−Ａ、Ｕ−Ｕ、Ａ−Ｇ、Ａ−Ｃ、Ｇ−Ｔ、Ｔ−Ｕ のような対がある）。しかし、対をなさないヌクレオチドでは非天然の合成ヌク レオチド も重要である。これらのヌクレオチドは、ヌクレオチド塩基、ヌクレオチドリン 酸エステル橋かけ又はフラノース環における修飾が可能である。これらの修飾し 合成した相補性ではない構成要素は数多くが公知で専門家に知られている。優れ た実行方式においてはオリゴヌクレオチドは非天然の相補性ヌクレオチドから作 られ、ここでオリゴヌクレオチドは特に優先して相補性でない非天然の構成要素 も含有している。 オリゴヌクレオチドにおける構成要素の数は標的ＲＮＡとハイブリッド形成が なされるように割り当てられる。オリゴヌクレオチドは、例えば５〜１００、好 ましくは５〜１５、特に好ましくは８〜３０及びさらに好ましくは１５〜２５個 の構成要素を含むことができる。標的ＲＮＡとの対形成を阻害する部分（欠所乃 至は対をなさないヌクレオチド構成要素）は、とくにオリゴヌクレオチドの中程 の配列順に配置され、例えば、最後の配列の構成要素からそれぞれ４番目、又は ３番目、又は２番目又は最後の構成要素の間にある。例えば、２０個の構成要素 をもつオリゴヌクレオチドにおいて対をなさない構成要素が優先して４個から１ ７個の構成要素の部分で欠けるか、存在するかする。発明による好ましいオリゴ ヌクレオチドはヌクレオチドが欠けるものである。 オリゴヌクレオチドは優先してプリン系列及びピリミジン系列のヌクレオシド から構成される。特に２’−デオキシ−２−アミノアデノシン、２’−デオキシ −５−メチルシチジン、２’−デオキシアデノシン、２’−デオキシシチジン、 ２’−デオキシウリジン、２’−デオキシグアノシン及び２’−チミジン由来が 優先される。特別に優れるのは２’−デオキシアデノシン（Ａ）、２’−デオキ シシチジン（Ｃ）、２’−デオキシグアノシン（Ｇ）及び２’−チミジン（Ｔ） である。修飾構成要素は優先してプリン系列及びピリ ミジン系列の天然ヌクレオシドに由来して、特に優れるのはアデノシン、シチジ ン、グアノシン、２−アミノアデノシン、５−メチルシトシン、チミジン及び前 に挙げたデオキシ誘導体である。ヌクレオシドでは２’−修飾リボヌクレオシド も重要である。 本発明の特に大きくすぐれた実行方式では標的ＲＮＡに対して部分的相補性の オリゴヌクレオチドは、（１）天然デオキシヌクレオシド、特に好ましくは２− デオキシアデノシン（Ａ）、２’−デオキシシチジン（Ｃ）、２’−デオキシグ アノシン（Ｇ）、及び２’−チミジン（Ｔ）の基又は相補性で非天然の合成によ る構成要素から構成され、そして（２）一部だけが相補的な性質は、好ましくは １〜４、特に好ましくは１〜３及びとりわけ好ましくは１又は２個の構成要素の 欠如により通常は相補性を示す配列の中で発生する。発明の範囲においてこのよ うな修飾ヌクレオシドは特に優れ、このヌクレオシドはヌクレアーゼに対するオ リゴヌクレオチドの安定性を高めている。 オリゴヌクレオチドはペプチド核酸（ＰＮＡ）の配列からも構成され、ここで 触媒は優先して核塩基、アミノ基末端又はカルボキシル基末端に結合している。 核塩基はペプチド配列のアミド窒素原子と結合する。相補性配列は、天然か非天 然の合成のアミノ酸構成要素からなり、ここで相補的でない性質は前述したよう に構成要素の脱離又は相補的でない構成要素の構築によって得られる。ＰＮＡ配 列の構成についてはオリゴヌクレオチドと同様な優位性があてはまる。ＰＮＡに ついては Science，254 巻，1497〜1500頁に実例が記載される。 エステル交換反応触媒及び／又は加水分解触媒は、場合によっては橋かけ基を 通してオリゴヌクレオチド配列の３’−又は５’−末端基にある窒素原子、硫黄 原子又は酸素原子と結合することができ る。これらの触媒は、一方、配列中又は配列末端にある核塩基の炭素原子、窒素 原子又は酸素原子と、配列中又は配列末端にある酸素原子、硫黄原子又は窒素原 子についているフラノース環の２’−位置又は配列中のヌクレオチド橋かけ基の 酸素原子、硫黄原子又は窒素原子とも結合することができる。結合の仕方は、例 えば触媒のタイプと官能基の種類によって決まる。触媒分子は、例えば直接又は 橋かけ基を通してオリゴヌクレオチドと結合することができる。橋かけ基は、例 えば、変化した橋かけ基であってよく、直接又は化合物基を通して触媒及び／又 はオリゴヌクレオチドと結合することができる。オリゴヌクレオチドへの結合は イオン結合及び好ましくは共有結合によりなされる。触媒はまたカルバ環状ヌク レオチド類似体の６’−炭素原子とも結合することができる。 橋かけ基は、例えば優先して以下の式（Ｉ）が適用される。 −Ｘ₁−Ｘ₂−Ｘ₃−（Ｘ₄）_x− （Ｉ） ｛ここで、Ｘ₁は直接結合又は１〜２２個の炭素原子を有する２価の開鎖あるい は環状の、不切断又は−Ｓ−、−ＮＲ−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ −の基からなる残基で切断されている炭化水素基、又は１〜１２個のオキサアル キレン単位を有するポリオキサアルキレン残基及びアルキレンの２個あるいは３ 個の炭素原子を意味し、Ｘ₂は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）− ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｃ（Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ −Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ−、−ＲＮ−Ｃ（Ｏ）−、 −Ｓ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）₂−、−Ｓ（Ｏ）₂−ＮＲ−、−ＮＲ−Ｓ（Ｏ ）−、−ＰＯ−（ＯＭ）− Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）−（ＯＭ）−、−Ｐ（Ｏ）−（ＯＭ）−ＮＲ−、−ＮＲ− Ｐ（Ｏ）−（ＯＭ）−、−ＰＨ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＨ（Ｏ）−、−ＰＨ（Ｏ ）−ＮＲ−及び −ＮＲ−ＰＨ（Ｏ）−を表し、Ｘ₃は独立にＸ₁の意味を有し、 そしてｘはＸ₃が直接結合を表す場合は０に等しく、Ｘ₄はヌクレオシド構成要素 の酸素原子、窒素原子又は炭素原子への結合を意味し、又はＸ₄はｘが１に等し く、Ｘ₃が直接結合でない場合には−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＭ）−Ｏ−、−ＮＲ−Ｐ （Ｏ）（ＯＭ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＭ）−ＮＲ−又は−ＮＲ−Ｐ（Ｏ） （ＯＭ）−ＮＲ−を表し、ＲはＨ、Ｃ₁−Ｃ₆−アルキル、フェニル又はベンジル を意味し、ＭはＨ、Ｃ₁−Ｃ₆−アルキル、フェニル又はベンジル、アルカリ金属 カチオン又はアンモニウムカチオンを表し、ｘは０又は１を表す。｝ Ｘ₁は２価の炭化水素基として好ましくは１〜１８個、特に好ましくは１〜１ ２個、そして特に好ましくは１〜８個の炭素原子を含み、そしてポリオキサアル キレン残基として−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−及び−ＣＨ₂−ＣＨ（ＣＨ₃）−Ｏ−の基 からなるオキサアルキレン単位の好ましくは１〜６個、特に好ましくは１〜４個 を含む。炭化水素基については、例えば鎖状又は分枝状のＣ₁−Ｃ₂₂−アルキレ ン、好ましくはＣ₁−Ｃ₁₈−アルキレン、特に好ましくはＣ₁−Ｃ₁₂−アルキレン 及びさらに好ましくはＣ₁−Ｃ₈−アルキレン；Ｃ₃−Ｃ₈−シクロアルキレン、好 ましくはＣ₅−又はＣ₆−シクロアルキレン；Ｃ₆−Ｃ₁₂−アリレン又はＣ₇−Ｃ₁₂ −アラルキレンが重要である。２価の炭化水素基の例をいくつか挙げるとメチレ ン、エチレン、１，２−又は１，３−ブチレン、１，２−，１， ３−又は１，４−ブチレン、１，２−，１，３−，１，４−又は１，５−ペンチ レン、１，２−，１，３−，１，４−，１，５−又は１，６−ヘキシレン、１， ２−，１，３−，１，４−，１，５−，１，６−又は１，７−ヘプチレン、１， ２−，１，３−，１，４−，１，５−，１，６−，１，７−又は１，８−オクチ レン、及びノニレン、デシレン、ウンデシレン、ドデシレン、トリデシレン、テ トラデシレン、ペンタデシレン、ヘキサデシレン、ヘプタデシレン、オクタデシ レン、ノナデシレン及びアイコシレンの異性体；シクロペンチレン、シクロヘキ シレン；ナフチレン及び特にフェニレン；ベンジレン及びフェニルエチレンがあ る。ポリオキサアルキレンのいくつかの例としてエチレンオキシ、ビスエチレン オキシ、トリスエチレンオキシ、テトラエチレンオキシ及び１，２−プロポキシ がある。 Ｒはアルキルとして好ましくは１〜４個の炭素原子を含み、好ましくはメチル 又はエチルを表す。特にＲはＨに等しいことを優先する。 Ｍはアルキルを意味する場合には好ましくは１〜４個の炭素原子を含み、特に 好ましくはメチル又はエチルに関する。アルカリ金属カチオン又はアンモニウム カチオンとしてはＮａ⁺、Ｋ⁺、ＮＨ₄ ⁺及びＮ（Ｃ₁−Ｃ₆−アルキル）₄ ⁺を優先す る。 式（Ｉ）で表される橋かけ基の好ましい小群基とは、Ｘ₁が直接結合又は好ま しくはＣ₁−Ｃ₄−アルキレン、フェニレン又はベンジレンを意味し、ここでアル キレンは−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−又は−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−で切断されてよく、Ｘ₂は− Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−又は−ＮＨ− Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−を表し、Ｘ₃はＣ₂−Ｃ₁₈−アルキレン、好ましくはＣ₂−Ｃ₁₂ −アルキレンを表し、そしてＸ₄はヌクレオチド構成要素の 酸素原子、窒素原子又は炭素原子への結合を意味し、又はＸ₄は−Ｏ−Ｐ（Ｏ） （ＯＭ）−Ｏ−、−ＮＲ−Ｐ（Ｏ）（ＯＭ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＭ）− ＮＲ−又は−ＮＲ−Ｐ（Ｏ）（ＯＭ）−ＮＲ₁−を表す（解説：−Ｏ−Ｐ（Ｏ） （ＯＭ）−Ｏ−、−ＮＲ−Ｐ（Ｏ）（ＯＭ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＭ）− ＮＲ−又は−ＮＲ−Ｐ（Ｏ）（ＯＭ）−ＮＲ−の残基においてヌクレオシド構成 要素の窒素原子及び酸素原子はこれらの橋かけ基の中に包含されている）。 オリゴヌクレオチドに結合する触媒として、例えばポリペプチド（転移酵素／ 加水分解酵素）、金属塩及び金属錯体が考慮され、ここで金属は好ましくは元素 周期系の副族元素並びに主族元素の金属Ｉｎ，Ｔｌ，Ｓｎ，Ｐｂ及びＢｉから選 ばれる。例としてスカンジウム、イットリウム、ランタン、ランタニド金属、Ｔ ｉ、Ｚｒ、Ｈｆ、Ｖ、Ｎｂ、Ｔａ、Ｃｒ、Ｍｏ、Ｗ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｒｕ、Ｏｓ、 Ｃｏ、Ｒｈ、Ｉｒ、Ｎｉ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｃｕ、Ａｇ、Ａｕ、Ｚｎ、Ｃｄ及びＨｇ が挙げられる。スカンジウム、イットリウム、ランタン、ランタニド金属、Ｃｕ 及び鉛が優先される。ランタニド金属ではＣｅ、Ｅｕ、Ｇｄ及びＳｍが優先され る。金属は２価又は３価のカチオンとして存在することが好ましい。 金属塩及び金属錯体に適切なアニオンは、例えば次ぎのグループから選ぶこと ができる：ハロゲン化物（例えば、Ｃｌ^-、Ｂｒ^-及びＩ^-）、酸素酸のアニオン 、ＢＦ₄ ^-、ＰＦ₆ ^-、ＳｉＦ₆ ⁼及びＡｓＦ₆ ^-。 酸素酸のアニオンとして、例えば、硫酸塩、リン酸塩、過塩素酸塩、過臭素酸 塩、過ヨウ素酸塩、アンチモン酸塩、ヒ酸塩、硝酸塩、炭酸塩、例えばギ酸塩、 酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、安息香酸塩、酢酸フェニル、モノ−、ジ−又 はトリクロロ−又はフルオ ロアセタートなどのＣ₁−Ｃ₈−カルンボン酸のアニオン、例えばスルホン酸メチ ル、スルホン酸エチル、スルホン酸プロピル、スルホン酸ブチル、スルホン酸ト リフルオロメチル（トリフラート）などのスルホン酸塩、例えばトシラート、メ シラート、ブロシラート、スルホン酸ｐ−メトキシ−又はスルホン酸ｐ−エトキ シフェニル、スルホン酸ペンタフルオロフェニル又はスルホン酸２，４，６−ト リイソプロピルなどの必要な場合にＣ₁−Ｃ₄−アルキル、Ｃ₁−Ｃ₄−アルコキシ 又はハロゲン、特にフッ素、塩素又は臭素で置換したスルホン酸フェニル又はス ルホン酸ブチル、及び、例えばホスホン酸メチル、ホスホン酸エチル、ホスホン 酸プロピル、ホスホン酸ブチル、ホスホン酸フェニル、ホスホン酸ｐ−メチルフ ェニル及びホスホン酸ベンジルなどのホスホン酸塩が扱われる。 金属錯体触媒は好ましくは錯体形成剤としての複素有機化合物をもつ金属錯体 塩として存在し、ここで錯体形成剤はオリゴヌクレオチドに結合する。錯体形成 剤は数多く知られている。開鎖又は環状有機化合物でＯ、Ｓ、Ｎ及びＰのグルー プから選ばれたヘテロ原子をもつ化合物が扱われる。環状又は多環状有機化合物 が優先され、全体で８〜２６個、好ましくは１２〜２０個の環成分を有し、２〜 １２個、好ましくは４〜１２個、特に好ましくは６〜１２個のヘテロ原子が存在 する。ヘテロ原子の中ではＯ及び特にＮが好ましい。錯体形成剤のいくつかの例 としてクラウンエーテル、シアニン、フタロシアニン、ナフタロシアニン、ポル フィリン、フェナントロリン、開鎖又は環状のビス−及びテルピリジン、エチレ ンジアミン四酢酸及びジエチレントリアミン五酢酸塩が挙げられる。 本発明に係る触媒効果をもつオリゴヌクレオチドの好ましい実行方式として式 （II）の複合体が重要である。 Ａ−Ｂ−Ｏｌｉｇｏ （II） ｛ここで、Ａは優先して炭素原子を通してＢに結合する環状又は多環状の錯体形 成剤をもつ金属錯体塩を表し、錯体形成剤は少なくとも１２個の環原子及び環に あるＮ及びＯのグループの少なくとも４個のヘテロ原子を含み、ヘテロ原子には スカンジウム、イットリウム、ランタン及びランタニド金属から選ばれた２価又 は３価の金属イオンが結合し、Ｂは式（Ｉ）の橋かけ基を表し、Ｏｌｉｇｏはオ リゴヌクレオチドを意味し、その内部配列は一部が標的ＲＮＡに対して相補性が ない。｝ Ｏｌｉｇｏ及びＢとして優先して適用されるものはすでに挙げた。 錯体形成剤は、２２個まで、好ましくは６〜２０個、より好ましくは１２〜２ ２個、特に好ましくは１４〜２２個の環原子を含むことができ、ここで環原子と はヘテロ原子以外の優先する炭素原子を表す。ヘテロ原子Ｎ及び／又はＯの数は 、好ましくは４〜１２個、特に好ましくは４〜１０個、そしてさらに好ましくは ４〜８個である。比較的小さい環サイズ（例えば、６〜１２個の環原子）では含 有するヘテロ原子も少ないほうが有利であり、これは４〜８個、より好ましくは ４〜６個である。優先する小群基においては錯体形成剤は、１６〜２０個及び特 に１８個の環原子並びに６〜１０個及びより好ましくは８個の窒素原子を含み、 ここで他の環要素には炭素原子が関わり、そして環には１〜６個及び好ましくは ２〜４個の置換されていない又は置換されている基−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ− が１，３の位置で結合し、環の窒素原子とピリジン基を形成する。好ましくはこ の錯体形成剤は環中に２〜４個のピリジン基及びさらに４個の窒素原子を含む。 優先する金属イオンはＬａ、Ｃｅ、Ｎｄ、Ｅｕ及びＧｄである。金属錯体塩で優 先するアニオンは、ハロゲン化物（Ｃｌ^-、Ｂｒ^-）、硫酸塩、硝酸塩、ＰＦ₆ ^-、 酢酸塩、 スルホン酸メチル、スルホン酸トリフルオロメチル、炭酸塩、硫酸水素酸塩、炭 酸水素酸塩及び過塩素酸塩である。 極めて好ましい実行方式において式（II）の複合体の場合に式（III）の複合 体が重要である。 ｛ここで、 Ｒ₂及びＲ₇はそれぞれ独立にＨ、Ｃ₁−Ｃ₄−アルキル、Ｃ₁−Ｃ₄−アルコキシ、 Ｃ₇−Ｃ₁₂−アラルキル又はＣ₆−Ｃ₁₆−アリールを意味し、 Ｒ₃及びＲ₆はそれぞれ独立にＨ、Ｃ₁−Ｃ₄−アルキル、Ｃ₇−Ｃ₁₂−アラルキル 又は Ｃ₆−Ｃ₁₆−アリールであり、 Ｒ₄はＨ、Ｃ₁−Ｃ₂₀−アルキル、Ｃ₅−Ｃ₈−シクロアルキル、Ｃ₆−Ｃ₁₂−アリ ール 又はＣ₇−Ｃ₁₂−アラルキルを表し、 Ｍｅはランタン、ランタニド金属、イットリウム又はスカンジウムを表し、 Ｙはアニオンを表し、 ｎは数２又は３を意味し、そして ｍは数１、２又は３を意味し、 （ここで残基アルキル、シクロアルキル、アラルキル及びアリールは未置換又は Ｃ₁−Ｃ₄−アルコキシ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、−ＣＮ、Ｃ₁−Ｃ₄−アルキル又は−Ｎ Ｏ₂で置換され）、 Ｒ₅は式（IV）： −Ｂ−Ｏｌｉｇｏ− （IV） の残基を表し、そしてＲ₁はＨ若しくは置換基又は、 Ｒ₅はＨ又は置換基そしてＲ₁は式（IV）の残基、（ここでＢ及びＯｌｉｇｏは優 先する物質を含む前述の意味を有する）を意味する。｝。適切でしかも優先する アニオンはＹ^m-として前に述べた。特にＹ^m-＝Ｃｌ^-が好ましい。 Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₆及びＲ₇は、アルキルとしてメチル又はエチルを、アルコキシと してメトキシ又はエトキシを、アラルキルとしてベンジレン又はフェニルエチレ ンを、アリールとしてナフチル及び特にベンジルを優先することを意味する。好 ましい実行方式ではＲ₂及びＲ₇はＨ並びにＲ₃及びＲ₆はアルキルを意味する。特 にＲ₂及びＲ₇はＨ並びにＲ₃及びＲ₆はＣ₁−Ｃ₄−アルキル、及び特別にメチルを 意味する。Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ_6,及びＲ₇ではヘテロ原子としてＯ、Ｓ、ＮをもつＣ₄− Ｃ₁₂−ヘテロアリールが重要である。例としてピリジル、チアゾリル、イミダゾ イル、オキサゾイル、フラノシル、ピロリル、チオフェニルが存在する。さらに Ｃ₁−Ｃ₄−アルキルチオ、ハロゲン化物、ジ（Ｃ₁−Ｃ₄−アルキル）アミノ、ス ルホンアミド及びカルボキシアミドが関係する。 置換基としてのＲ₁及びＲ₅には Ｃ₁−Ｃ₄−アルキル、Ｃ₁−Ｃ₄−アルコキシ 、Ｃ₇−Ｃ₁₂−アラルキル又はＣ₆−Ｃ₁₆−アリール、ヘテロ原子としてＯ、Ｓ、 ＮをもつＣ₄−Ｃ₁₂−ヘテロアリール、Ｃ₁−Ｃ₄−アルキルチオ、ジ（Ｃ₁−Ｃ₄ −アルキル） アミノ、ハロゲン化物、スルホンアミド及びカルボキシアミドがある。 Ｒ₁及びＲ₅はピリジン環の窒素原子のｐ位置に優先して結合する。 Ｒ₄はアルキルとして、好ましくは１〜１２個、特に好ましくは１〜８個、そ して特別に好ましくは１〜４個の炭素原子を含有する。アルキルのいくつかの例 としてメチル、エチル及びプロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、 オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル 、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル及びアイコシルの異 性体がある。 Ｒ₄はシクロアルキルとして５又は６個の環炭素原子を優先して含む。シクロ アルキルのいくつかの例としてシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル 、シクロヘキシル、シクロペンチル及びシクロオクチルがある。 Ｒ₄はアリールとして優先してナフチルを、特にフェニルを表す。Ｒ₄がアラル キルである場合にはベンジル又はフェニルエチルがとくに重要である。 Ｒ₄に対する優先する小群基は、Ｈ、Ｃ₁−Ｃ₄−アルキル、特にメチル、並び にフェニル又はベンジルである。 Ｒ₁乃至はＲ₅は、アルキルとしてメチル又はエチル、アルコキシとしてメトキ シ又はエトキシ、アリールとしてナフチル又はフェニル、そしてアラルキルとし てフェニル又はフェニルエチルを優先して意味する。好ましくはＲ₁乃至はＲ₅は Ｈ、メチル、エチル、メトキシ又はエトキシを意味する。 式（III）で表される好ましい小群基とは、Ｒ₂及びＲ₇がＨを表し、Ｒ₃及びＲ₆ がＣ₁−Ｃ₄−アルキルを意味し、Ｒ₄がＨ，Ｃ₁ −Ｃ₄−アルキル、フェニル又はベンジルを表し、Ｒ₁が基Ｘ₁−Ｘ₂−Ｘ₃−（Ｘ₄ ）_x−ＯｌｉｇｏそしてＲ₅がＨ、メチル又はメトキシ又はＲ₅が基Ｘ₁−Ｘ₂−Ｘ₃ −（Ｘ₄）_x−Ｏｌｉｇｏ 及びＲ₁がＨ、メチル又はメトキシを表し、Ｘ₁が直 接結合又はＣ₂−Ｃ₆−アルキレンであり、Ｘ₂が−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ） −Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−又は−ＨＮ−Ｃ（Ｓ） −ＮＨ−を意味し、Ｘ₃がＣ₂−Ｃ₁₂−アルキレン又はフェニレンを表し、Ｘ₄が ヌクレオシド構成要素のＯ、Ｎ又はＣ原子への結合を意味し、又はＸ₄が−Ｏ− Ｐ（Ｏ）（ＯＭ）−Ｏ−を表し、ｘが０又は１を表し、ＭｅがＬａ、Ｃｅ、Ｎｄ 、Ｅｕ又はＧｄを意味し、ｎが２又は３及びｍが１又は２を表し、ＹがＣｌ、Ｂ ｒ、ＣＨ₃Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＣｌＯ₄、ＢＦ₄、ＰＦ₆、Ｆ₃Ｃ−ＳＯ₃又はトシラートを 表し、ＭがＨ、Ｎａ又はＫを表し、そしてＯｌｉｇｏがオリゴヌクレオチド残基 を意味し、残基の内部配列は標的ＲＮＡに対して部分的にだけ相補性であり、残 基は天然のデオキシリボヌクレオチド構成要素又は非天然の合成によるヌクレオ チド構成要素から構成され、ここで１〜４個の構成要素が欠如する標的ＲＮＡに 関するものである。 ヌクレアーゼ又はヌクレアーゼ断片、塩基性ポリペプチド、アミジン誘導体及 びグアニジン誘導体、オリゴアミン及びビスイミダゾールも適切なエステル交換 反応触媒又は加水分解触媒である。これらは金属錯体と同様に同じ橋かけ基を通 してオリゴヌクレオチドと結合することができる。 さらに発明が対象とするところはエステル交換反応触媒又は加水分解触媒が結 合するオリゴヌクレオチドの製造方法であり、そしてオリゴヌクレオチドの内部 配列は天然に存在する標的ＲＮＡに対して部分的に相補性がなく、オリゴヌクレ オチドは天然のデオキシリ ボ核酸構成要素又は非天然の合成によるヌクレオチド構成要素から構成され、そ の特徴は、官能基を基本構造核に結合させているエステル交換反応触媒又は加水 分解触媒をヌクレオチド構成要素の官能基又はヌクレオシド構成要素の修飾官能 基と反応させることにある。 必要な場合に橋かけ基Ｘ₁を通して基本構造核と結合する官能基の例にＯＨ、 −ＳＨ、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、−ＣＮ、−Ｏ−ＣＨ₂−ＯＨ、−ＮＨＲ、−Ｃ（ Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＳＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ、ＨａｌがＦ、Ｃｌ又はＢｒに等 しい−Ｃ（Ｏ）Ｈａｌ、―Ｃ（Ｓ）ＳＲ、―Ｃ（Ｓ）ＮＨＲ、―Ｃ（Ｓ）ＯＲ、 −ＳＯ₃Ｒ、―ＳＯ₂ＮＨＲ、―ＳＯ₂Ｃｌ、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）₂、−Ｐ（Ｏ）（ ＯＨ）ＮＨＲ、−Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）₂、−Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）−ＮＨＲ、−Ｐ（Ｓ ）（ＯＨ）₂、−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−ＮＨＲ、 −Ｐ（Ｏ）（ＳＨ）₂、−Ｐ（Ｏ ）（ＳＨ）−ＮＨＲ、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）Ｈ、−Ｐ（Ｏ）（ＮＨＲ）Ｈ、−Ｐ（ Ｓ）（ＳＨ）−Ｈ、−Ｐ（Ｓ）（ＮＨＲ）Ｈ、−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）Ｈ、−Ｐ（Ｏ ）（ＳＨ）Ｈが挙げられ、ここでＲはＨ、−Ｃ₁−Ｃ₆−アルキル、−Ｃ_zＨ_2z− ＮＨ₂−、−Ｃ_zＨ_2z−ＳＨ 又は―（Ｃ_zＨ_2zＯ）_yＨを意味し、ｚは数２〜６及 びｙは数１〜２０である。修飾官能基の例に、ヒドロキシアルコキシ又はアミノ アルコキシがあり、これらは、必要な場合には、例えば−Ｐ（Ｏ）ＯＭ−Ｏ−な どのリンカーを通してヌクレオチド構成要素に結合している。官能基は、直接又 は基Ｘ₁を通して基本構造核と結合することができ、基Ｘ₁は優先してＣ₁−Ｃ₁₂ −アルキレン、Ｃ₁−Ｃ₁₂−アルケニレン、Ｃ₁− Ｃ₁₂−アルキニレン、Ｃ₅−Ｃ₈−シクロアルキレン、Ｃ₆−Ｃ₁₂−アリレン又は Ｃ₇−Ｃ₁₂−アラルキレンを意味する。 オリゴヌクレオチド複合体を製造する発明による方法を実施するには、例えば 必要な場合に官能基を与えたオリゴヌクレオチドを溶媒又は混合溶媒に溶かして から官能基を有するエステル交換反応触媒又は加水分解触媒を添加し、必要な場 合には反応混合液を攪拌しながら反応を行わせる。生成した複合体を引き続いて よく知られた方法で精製し、望ましい場合には分離する。 反応温度は、例えば０〜１２０℃、好ましくは０〜８０℃とする。反応は室温 で行うことが特に好ましい。 エステル化反応、エステル交換反応又はアミド化反応で結合する場合には、例 えば相当するカルボン酸基を前もって公知の方法で活性化するが、これは、例え ばカルボジイミド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの反応によって行う。 適切な溶媒には、例えば水及び水とよく混合する極性の非プロトン性溶媒があ る。このような溶媒の例として、アルコール（メタノール、エタノール、ｎ−又 はｉ−プパノール、ブタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、 エチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコール、ジエチレング リコールモノメチルエーテル）、エーテル（ジエチルエーテル、ジブチルエーテ ル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、エチレングリコールジメチルエーテル、 エチレングリコールジエチルエーテル、ジエチレングリコールジエチルエーテル 、トリエチレングリコールジメチルエーテル）、ハロゲン化炭化水素（塩化メチ レン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、１，１，１−トリクロロエタン 、１，１，２，２−テトラクロロエタン、クロロベンゼン）、カルボン酸エステ ル及びラクトン（酢酸エチルエステル、プロピオン酸メチルエステ ル、安息香酸エチルエステル、２−メトキシエチルアセタート、γ−ブチロラク トン、δ−バレロラクトン、ピバロラクトン）、Ｎ−アルキル化カルボン酸アミ ド及びラクタム（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルホルムアミ ド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、テトラメチル尿素、ヘキサメチルリン酸ト リアミド、Ｎ−メチル−γ−ブチロラクタム、Ｎ−メチル−ε−カプロラクタム 、Ｎ−メチルピロリドン）、スルホキシド（ジメチルスルホキシド、テトラメチ レンスルホキシド）、スルホン（ジメチルスルホン、ジエチルスルホン、トリメ チレンスルホン、テトラメチレンスルホン）、第三級アミン（トリメチルアミン 、トリエチルアミン、Ｎ−ジメチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン、ピリジ ン）、置換されたベンゼン（クロロベンゼン、ｏ−ジクロロベンゼン、１，２， ４−トリクロロベンゼン、ニトロベンゼン、トルエン、キシレン）及びニトリル （アセトニトリル、プロピオニトリル、ベンゾニトリル、フェニルアセトニトリ ル）がある。 反応物は適切なモル比のもとに添加する。しかし、触媒又はオリゴヌクレオチ ドを過剰に使用することもできる。 精製には通常の方法を使用できるが、優れている方法は、例えば透析、電気泳 動、及びクロマトグラフィーであり、クロマトグラフィーには高速液体クロマト グラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ、アフィニティークロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィー及びゲルクロマトグラフィーなどを使用する。 必要な場合に官能基を与えるオリゴヌクレオチドは公知の方法で購入可能な自 動合成装置を使用して製造される。合成に使用するヌクレオシドは公知であり、 購入するか、類似の方法で製造することができる。 官能基を有するエステル交換反応触媒又は加水分解触媒はよく知ら れていて、購入するか、公知乃至は類似の方法により製造することができる。 式（III）の基本構造核を有する官能基をもつ出発化合物は新規である。これ らを得るには以下の式（Ｖ）： のテルピリジンを、 ピリジンジアルデヒド又は式以下の（VI）： のピリジンジケトンと、 式（VII）： Ｍｅⁿ⁺（Ｙ^m-）_n/m （VII） の塩の存在下で縮合させる（ここでＲ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₇、Ｍｅ 、Ｙ、ｎ及びｍは前に述べた意味をもつ）。 この方法を実施するには、例えば式（Ｖ）、（VI）及び（VII）の化合物を好 ましくは当量を溶媒に溶かしてから温度を上げて反応させる。目的に適う縮合触 媒、例えば濃鉱酸、特に塩酸、又は酸性イ オン交換体を共に用いる。水と結合する物質を添加し、又は反応混合体から反応 で生じた水を除くことが適切な処置である。 反応温度は、例えば４０〜２２０℃、好ましくは５０〜１５０℃にすることが できる。 溶媒としては極性の非プロトン性有機溶媒を使用すると有利である。これらの 溶媒については前に説明した。 式（VII）の金属塩は一般に知られ、大部分は購入できる。 官能基を含む式（Ｖ）の新規な化合物は、E.C.Constable，Polyhedron，７巻 ，Nr.24，2531 〜2536頁（1988）が記載するのと類似な方法により製造されるが 、必要な場合には官能基に保護基の性質を付与することができる。 式（Ｖ）及び（VI）の化合物は官能基の有無によらず大部分が公知であり、又 は公知乃至は類似の方法によって製造することができる。式（VI）の化合物、こ こでＲ₄はＨを表し、Ｒ₅はＣ₂−Ｃ₁₈−アルキレン−Ｘ₅を表し、及びＸ₅は−Ｃ （Ｏ）−ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨＲ、−ＳＯ₂−Ｒ又は−ＳＯ₂−ＮＨＲを意味し 、並びにＲはＨ又はＣ₁−Ｃ₆−アルキルであるが、この式（VI）の化合物は新規 であり、次ぎの方法によって得ることができる：すなわち、パラジウム触媒を使 用して相当の３−ハロゲン−ピリジン−１，５−ジカルボン酸エステルを式ＣＨ₂ ＝ＣＨ−Ｃ₁―Ｃ₁₆−アルキレン−カルボン酸エステルのアルケンによってアル ケン化し、アルケン基を例えば触媒で水素化し、引き続いて相当する１，５−ジ ヒドロキシメチルピリジンアルキルカルボン酸エステルに水素化し、ヒドロキシ メチル基をアルデヒド基に酸化、そして必要な場合にはエステル基をカルボン酸 基に加水分解又はエステル基をカルボン酸アミドにアミノ化する。 式（VI）の化合物、ここでＲ₄はＨ又はＣ₁−Ｃ₁₂−アルキルを 表し、Ｒ₅はＣ₂−Ｃ₁₈−アルキレン−Ｘ₅を表し、及びＸ₅は−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ、 −Ｃ（Ｏ）−ＮＨＲ、−ＳＯ₂−Ｒ又は―ＳＯ₂−ＮＨＲを意味し、並びにＲはＨ 又はＣ₁−Ｃ₆−アルキルであるが、この式（VI）の化合物は新規であり、次ぎの 方法によって得ることができる：すなわち、パラジウム触媒を使用して相当する 例えばアセチルで保護した３−ハロゲン−１，５−ジヒドロキシメチルピリジン （相当の３，５−ジカルボン酸メチルエステルの還元により得られる）を式ＣＨ₂ ＝ＣＨ−Ｃ₁―Ｃ₁₆−アルキレン−カルボン酸エステルのアルケンによってアル ケン化し、アルケン基を例えば触媒で水素化し、ヒドロキシル基を脱保護し、そ して必要な場合には相当する３，５−ピリジンアルデヒドに酸化し、このアルデ ヒド基は例えばグリニャール試薬でＣ₁―Ｃ₁₂−アルキル化され、必要な場合に はエステル基をカルボン酸基に加水分解又はエステル基をカルボン酸アミドにア ミノ化し、そして第二級アルコール基をケト基に酸化する。 本発明のオリゴヌクレオチドは、特にＲＮＡ配列の配列特異切断に極めて適性 を有するが、ここで触媒効果の機能があるために驚くべき少量だけを使用しなけ ればならない。 本発明がさらに対象することは、生理的条件並びにエステル交換反応又は加水 分解用の合成触媒の作用のもとでリボ核酸のリン酸ヌクレオチド橋かけを切断す る方法であり、その特徴とするところは（ａ）標的ＲＮＡをオリゴヌクレオチド と錯化させるが、その内部配列が標的ＲＮＡに対して部分的に相補性でなく、オ リゴヌクレオチドにエステル交換反応触媒又は加水分解触媒が結合し、そして（ ｂ）さらに反応を起こさせて切断することにある。 本発明の方法は、オリゴヌクレオチドの生体内投与又は試験管内に標的ＲＮＡ と発明で使用するオリゴヌクレオチドを導入して実施 することができる。 生理的条件は専門家によく知られ、その包含する実施方法は、例えば水媒質中 であり、pH範囲は５〜９、好ましくは５〜８、特に好ましくは５〜7.5 であり、 ここで水媒質は、例えばアルカリ金属塩又はアルカリ土金属塩などの不活性成分 を含み、そして特に緩衝液システムにある。 本方法は、例えば０〜１００℃、好ましくは２０〜５０℃、特に３０〜４０℃ の温度で実施することができる。 発明の方法によるとリン酸橋かけ結合のエステル交換反応のときに２’，３’ −環状リン酸末端基をもつ断片及び５’−ヒドロキシル末端基をもつほかの断片 が生成する。環状リン酸塩は引き続いてさらに加水分解する。 発明によるオリゴヌクレオチドは医薬として使用される。その上発明によるオ リゴヌクレオチドはヌクレアーゼによる分解に対して高い安定性を示す。ＲＮＡ タイプの相補性核酸鎖をもつオリゴヌクレオチドの優れた対は特に驚くべき安定 性がある。その上これらは予想もしないような高い細胞摂取を示す。発明のオリ ゴヌクレオチドは従ってアンチセンステクノロジーに特に適性を示すが、つまり ｍＲＮＡの適切な相補性ヌクレオチド配列への結合によって望ましくないタンパ ク質生成物の発現を抑制することに至らしめるものである（欧州特許 266,099， 国際特許 WO 87/07300及び国際特許 WO89/08146）。オリゴヌクレオチドは感染 と疾患の治療のために、例えば核酸の段階（例えば、癌遺伝子）でバイオ活性タ ンパク質の発現阻止によって使用することができる。発明によって製造されたオ リゴヌクレオチドの断片は、診断薬としても適しており、ウイルス性感染又は遺 伝子関連疾患を選択的相互作用によって一本鎖又は二本鎖核酸の段階で検出する ための遺伝子ゾンデとして使用される（ 遺伝子プローブ）。 さらに本発明が対象とすることは、発明によって製造されたオリゴヌクレオチ ドをウイルス性感染又は遺伝子関連疾患を検出する診断薬としての使用に関する ものである。 本発明の他の対象は、ヒトを含む温血動物の疾患を体内のヌクレオチド配列を 不活性にすることで処置する治療方法へ応用する発明のオリゴヌクレオチドにも 関する。体重が約７０ｋｇの温血動物に投与する用量は、例えば一日当たり 0.0 1 〜1000 mg である。投与は好ましくは医薬調剤の形で腸外に、例えば静脈内又 は腹腔内になされる。腸外投与には先ず水溶性活性物質、例えば水に溶け生理的 に問題のない塩の水溶液、又はこのような活性物質の水懸濁液が適しており、こ れは、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビット及び／又はデ キストランなどの懸濁液の粘度を上げる物質並びに必要な場合には安定剤を含有 する。活性物質は、必要な場合には助剤を入れて凍結乾燥体の形でも保存されて 投与前に適切な溶媒を添加して溶液にすることができる。 発明がさらに対象とすることは、水溶液の組成と特に水溶液又は懸濁液を基に した医薬調剤に関し、発明のオリゴヌクレオチドを単独又は他の活性物質と共に 有効量を含有し、医薬担体としての水を好ましくは意味のある量及び必要な場合 には助剤を含有することにある。 医薬として有効な発明のオリゴヌクレオチドは、腸外投与又は輸液溶液の形で 使用することができる。このような溶液は好ましくは等張性の水溶液又は懸濁液 であり、ここで、これらの溶液は、例えば、活性物質を単独又は例えばマンニッ トなどの担体物質と共に含む凍結乾燥調剤のもとで使用前に製造することができ る。医薬調剤は、殺菌され、及び／又は、例えば保存剤、安定剤、湿潤剤及び／ 又は乳化剤、溶解剤、浸透圧調整用の塩及び／又は緩衝剤などの助剤を含有する ことができる。薬理調剤は、望ましくはさらに例えば抗生物質のような薬理活性 物質を含ませてよく知られた方法、例えば通常用いる溶液又は凍結乾燥方法によ って製造され、そして約 0.1〜90％、特に約0.5 〜約30％、例えば１〜５％の活 性物質を含有する。発明の複合体は、吸入又はリポソーム投与の形でも使用する ことができる。 本発明の複合体は、診断も目的とし、又は配列特異性エンドリボヌクレアーゼ としての分子生物的助剤として使用することもできる。 図には例として、発明のアンチセンス−オリゴヌクレオチド−複合体及び標的 ＲＮＡ分子からなるハイブリッド構造の種々の可能性を示すが、ここで標的ＲＮ Ａ上のハイブリッドにおいて少なくとも対をなさないヌクレオチドが現れるよう に複合体の構造がその都度選ばれる。 図１は標的ＲＮＡ（５’と書いた線）及びアンチセンス−オリゴヌクレオチド （３’と書いた線）からなるハイブリッドを図示し、これにエステル交換反応触 媒乃至は加水分解触媒としての発明の錯体（Ｌｎと書く）が結合（いわゆる複合 体）し、ここにアンチセンス−オリゴヌクレオチド−配列の中の錯体の結合箇所 が存在する。記載した数字は標的ＲＮＡのヌクレオチド構成要素に関係するが、 ここで番号は、アンチセンス−オリゴヌクレオチドのヌクレオチドに対して相補 性であり、錯体が結合している標的ＲＮＡのヌクレオチドを“０”とするように つけてある。その他の番号は、それぞれ標的ＲＮＡの3'−方向に上昇（＋１，＋ ２など）乃至は5'−方向に下昇（−１，−２など）のようにしてある。アンチセ ンス−オリゴヌクレオチドの構造に基づいて標的ＲＮＡ上に現れる不対ヌクレオ チド（数多くの不対ヌクレオチドも現れることがある）を突出部として表し、こ の場合には標的ＲＮＡ上の位置０から3'−方向（ここでは位置＋２）に向かうよ うになっている。 図２は標的ＲＮＡ及び発明のアンチセンス−オリゴヌクレオチド−複合体から なるハイブリッドを図示し、ここで対をなさないヌクレオチドは標的ＲＮＡ（こ の場合には位置−２）の位置０から5'−方向に向かうようになっている。そのほ か図１に挙げた相当する定義が当てはまる。 図３は標的ＲＮＡ及び発明のアンチセンス−オリゴヌクレオチド−複合体から なるハイブリッドを図示し、ここで錯体の結合箇所はアンチセンス−オリゴヌク レオチドの末端にあり、そしてここで対をなさないヌクレオチドは標的ＲＮＡ（ この場合には位置−３）の位置０から5'−方向に向かうようになっている。その ほか図１にあげた相当する定義が当てはまる。 本発明を以下の実施例により説明する。Ａ）テルピリジン−ランタニド−錯体のための出発化合物の製造 実施例Ａ１ ：テルピリジン−ビス−ヒドラジノ−化合物の製造 （ａ）６−アセチル−２−ブロモピリジン（100 ミリモル）のメタノール溶液 2 00 ml に２Ｎ水酸化カリウム水溶液 40 ml を氷浴で冷却しながら添加する。該 当の置換ベンズアルデヒド（400 ミリモル）を加えてから氷浴を除去し、混合物 を室温で４時間さらに攪拌する。生成物を濾過し、水で３回、冷メタノールで２ 回洗浄し、高真空中で乾燥する。 この処方により化合物 a.1．（Ｒ₁：フェニ ル−４−ＯＣＨ₃；ＭＳ 317.7）及び a.2．（Ｒ₁：フェニル−４−ＮＯ₂；ＭＳ 333.6）が製造される。 （ｂ）（ａ）で製造したα，β−不飽和カルボニル化合物（30ミリモル）、１− （２−ブロモピリジルカルボニルメチル）ピリジンヨージド（12.1 g，30ミリモ ル）及び酢酸アンモニウム（13.9 g，180 ミリモル）をフラスコに入れて酢酸 1 00 ml を加える。混合物を還流のもとに煮沸する。２時間後に室温まで冷却し、 濾過して得られた生成物を高真空中で乾燥する。 この処方により化合物 b.1．（Ｒ₁：フェニル−４−ＯＣＨ₃；ＭＳ 497.1）及び b.2．（Ｒ₁：フェニル−４−ＮＯ₂；ＭＳ 512）が製造される。 四塩化チタン（30ミリモル）のテトラヒドロフラン（純品）溶液 75 mlに室温 のアルゴン雰囲気下で水素化リチウムアルミニウム（22ミリモル）を少量ずつ添 加する。得られた懸濁液を室温で20分攪拌し、引き続いて０℃に冷却する。化合 物 b.2.(10ミリモル)を添加して懸濁液を室温で30分攪拌する。水 50 mlを０℃ において注意して滴下してから25％のアンモニア水溶液 25 mlを加える。混合物 にクロロホルム 150 ml を加えてシーライト上で濾過する。水相を分離してから クロロホルムで３回抽出する。有機相をすべて併せてから水で１回洗浄、硫酸ナ トリウム上で乾燥・濃縮する。この処方により化合物 b.3．（Ｒ₁：フェニル− ４−ＮＨ₂；ＭＳ 482.5）が製造される。 （ｂ）で製造した該当するジブロモテルピリジン化合物（10ミリモル）をメチル ヒドラジン 30 ml に溶かし１７時間還流のもとに加熱する。室温まで冷却して から濃縮して残分をメタノール 20 mlに採取する。生成物を濾過して高真空中で 乾燥する。 この処方により化合物 c.1.（Ｒ₁：フェニル−４−ＯＣＨ₃；ＭＳ 427）及び c.2.（Ｒ₁：フェニル−４−ＮＨ₂；ＭＳ 412.5）が製造される。 メトキシ化合物 c.1.(10ミリモル)をクロロホルム 100 ml に懸濁させて氷浴 で冷却しながら20分間で塩化メチレンに溶かした三臭化ホウ素の１モル溶液（50 ミリモル）を加える。懸濁液を５日間還流のもとに加熱する。室温に冷却してか ら氷水 300 ml に注入し、２Ｎ塩酸水溶液 200 ml で酸性にする。エーテル（２ 倍量）で抽出してから水相に１０％炭酸ナトリウム水溶液を加えてpHを9.0 に設 置して３０分攪拌する。沈殿した生成物ｃ.3（Ｒ₁：フェニル−４−ＯＨ；ＭＳ 413.5）を濾過して高真空中で乾燥する。 実施例Ａ２： ３−〔４’−（２’，６’−ジホルミルピリジン）〕プロピオン 酸の製造 （ａ）４−ブロモピリジン−２，６−カルボン酸ジメチルエステル 3.5 g、トリ トリルホスフィン 390 mg、アクリル酸−ｔ−ブチルエステル 9.3 ml、トリエチ ルアミン 7.1 ml、ジメチルホルムアミド30ml及び酢酸パラジウム 287 mg を混 合して 110℃まで加熱する。90分後に反応混合物を室温まで冷却し、エーテル／ 塩化メチレン（１：１）で希釈してＮＨ₄Ｃｌ／Ｈ₂Ｏでよく振盪する。有機相を Na₂SO₄で乾燥，回転蒸発器で濃縮、高真空中で乾燥する。 活性炭（５％）上のパラジウム 250 mg と上で得られた化合物 2.5 gをメタノ ール 250mlに溶かし、一夜室温の水素雰囲気で水素化する。生成物をフィルター Hyfloで濾過し、濾過液を回転蒸発器で濃縮，室温の高真空中で乾燥する。 上で得た化合物 5.0 gをメタノール 50 mlとテトラヒドロフラン 50 mlに溶か す。 ０℃に冷却してＮａＢＨ₄1.1 g を加える。５０分後にさらにＮａＢＨ₄1.1 g を 加えて１３０分後にさらにまたＮａＢＨ₄ 0.5 g を加える。全体で１６５分経過 してから室温まで加熱する。そして０℃に冷却する。3.5 時間後にいま一度Ｎａ ＢＨ₄ 1.1 g を加える。６時間後に容積が60 ml になるまで濃縮する。その後で 塩化アンモニウムの飽和溶液を滴下し，ＣＨ₂Ｃｌ₂で４回抽出、有機相を塩化ア ンモニウム溶液で１回洗浄して、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥、濾過そして濃縮する。 上で得た化合物 19.8 g をジオキサン 300 ml に溶かす。引き続いて二酸化セ レン16.2 gを添加する。反応混合物を 100℃まで加熱・攪拌して、４５分後に室 温まで冷却する。さらに２時間攪拌してから反応混合物を濾過して回転蒸発器で 濃縮する。 上で得た化合物 4.7 gを氷冷したトリフルオロ酢酸 17.2 mlに加える。酸と混 合してから混合物を０℃で濃縮する。 （ｂ）４−ブロモピリジン−２，６−ジカルボン酸ジメチルエステル ５g を室 温でテトラヒドロフラン 175 ml に溶解する。引き続いてメタノール 75 mlを加 える。０℃に冷却して４５分間にホウ水素化ナトリウム 3.44 g を少量ずつ加え て室温まで加熱する。１時間後にアセトン 30 mlを１０分内に滴下する。還流の もとに１時間反応混合物を加熱する。反応混合物を引き続いて回転蒸発器で濃縮 して乾燥する。残分を室温でピリジン 50 mlのなかに攪拌しながら入れる。これ に４−ジメチルアミノピリジン 0.1 gを加え、引き続いて０℃まで冷却する。３ ０分間で無水酢酸 34.4 mlを滴下する。懸濁液を室温まで加熱する。テトラヒド ロフラン 50 mlを添加する。一夜室温で攪拌してから反応混合物を濾過し、それ ぞれテトラヒドロフラン 50 mlで２回洗浄する。濾過液を回転蒸発器で濃縮する 。結晶化により４−ブロモ−２，６−ジ（アセトキシメチル）ピリジンが得られ る。 （融点：６６〜６９℃） ４−ブロム−２，６−ジ（アセトメチル）ピリジン 0.982 g、3−（トリブチ ルスタンニル）−アクリル酸エチルエステル 1.5 g及びパラジウムテトラキス（ トリフェニルホスフィン）176 mg をジオキサン 25 mlに溶かして90℃まで加熱 する。90分後に反応混合物を冷却する。固形生成物を分離してヘキサン／酢酸エ ステルで再結晶する。 ＭＳ321（Ｍ⁺）。 上で得た化合物 2.74 g とウイルキンソン触媒 70 mgをベンゼン 150 ml に溶 かす。トリエチルシラン 12.2 mlを添加して溶液を還流のもとに加熱する。過剰 な触媒トリエチルシラン 270 mg を１時間内に少量ずつ加える。生成物をクロマ トグラフィーで生成する。 ＭＳ323。 ナトリウム 267 mg をエタノール 50 mlに溶かす。この溶液 7.2 ml を、上に 得た化合物 1.845 g をエタノール35 ml に溶かした溶液に加える。2.5 時間室 温で攪拌してから反応混合物をシリカゲルで濾過し、濾過液を濃縮して乾燥する 。生成物を一夜高真空中で乾燥する。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ 7.0（２Ｈ，ｓ） ，4.7（４Ｈ，ｓ），4.1（２Ｈ，ｑ），2.9（２Ｈ，ｔ），1.2（３Ｈ，ｔ）。 上で得た化合物 1.27 g をジオキサン 30 mlに溶かす。これに二酸化セレン 7 14mgを添加する。反応混合物を加熱し、２時間後に綿で濾過する。濾過液を濃縮 して乾燥する。残分を酢酸エステル／塩化メチレン（５％）に採取してシリカゲ ルで濾過する。¹ ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ 10.1（２Ｈ，ｓ），8.0（２Ｈ，ｓ），4.1（２Ｈ， ｑ），3.1（２Ｈ，ｔ），2.7（２Ｈ，ｔ），1.2（３Ｈ，ｔ）。 エーテル 45 mlと上で得た化合物 350 mg の溶液に０℃において前に調合した 溶液（臭化銅 0.949 g、ジメチルスルフィドをエーテル 10 ml に溶かし、０℃ に冷却してメチルリチウム 5.9 ml を加える）を添加する。5.5 時間室温で攪拌 してから０℃に冷却する。氷酢酸 2 ml をエーテル 8 ml に加え、エタンチオー ル 8 ml を添加する。一夜室温で攪拌してから水 60 ml を加えて塩化メチレン で４回振盪する。有機相をＮａ₂ＳＯ₄で前乾燥、濾過、回転蒸発器で濃縮、そし てクロマトグラフィーで精製する。 ＭＳ２６６（Ｍ＋Ｈ）⁺ 塩化メチレン＋塩化オキサリルの溶液 4.5 ml に−７８℃においてＤＭＳＯ 0 .5 ml を加える。１５分後にこの溶液を、上で得た化合物 193 mg を塩化メチレ ン 4 ml に溶かした溶液に添加する。２時間後に−７８℃においてトリエチルア ミン 1.5 ml を添加する。 ３０分後に０℃で攪拌しながら水 15 mlを加えてジエチルエーテルで４回振盪す る。有機相をＮａ₂ＳＯ₄で前乾燥、回転蒸発器で濃縮、そしてクロマトグラフィ ーで精製する。 上で得た化合物 0.464 gと5 mlの４Ｎ ＨＣｌを共に５０℃まで加熱する。９ ０分後に反応混合物を室温まで冷却して氷水で希釈する。結晶性生成物が得られ る。 Ｂ）テルピリジン−ランタニド−錯体の製造 実施例Ｂ１： （ａ）実施例Ａ１（ｃ）からの該当するテルピリジン−ビス−ヒドラジノ−化合 物１ミリモルをアルゴンのもとで無水メタノール 60 ml に採取して酢酸ランタ ニド（III）（１ミリモル）を加えて１０分間還流のもとに加熱する。この溶液 に相当する２，６−ジカルボニル化合物 1.2ミリモルと濃塩酸水溶液 5 ml を順 次添加する。２日間煮沸する。室温まで冷却してから生成物を濾過し、高真空中 で乾燥する。 この処方によって表１の化合物 1.1〜1.28 が製造される。 （ｂ）実施例Ａ１（ｃ）からの該当するテルピリジン−ビス−ヒドラジノ−化合 物１ミリモルをアルゴンの下で無水メタノール 60 ml に採取して塩化ランタニ ド（III）（１ミリモル）を加えて１０分間還流のもとに加熱する。この溶液に 実施例Ａ２（ａ）に含まれる化合物1.2 ミリモルを順次添加する。一夜煮沸する 。室温まで冷却 してから溶媒を除去して生成物をジメチルスルホキシドとトルエンから再結晶し て得る。 この処方によって表１の化合物 1.29 〜1.32 が製造される。 実施例Ｂ２：イソチオシアナート誘導体の製造 炭酸水素ナトリウム 4.4ミリモルとチオホスゲン 3.5ミリモルをクロロホルム 4 ml に懸濁させて表１の該当する錯体溶液を添加する。混合物を室温において 2.5 時間烈しく攪拌する。クロロホルム相を分離して水で１回洗浄する。すべ ての水相を合わせて乾燥する。このようにして得られた表２の生成物 2.1〜2.15 がさらに精製することなしに使用に供せられる。 Ｃ）アミノオリゴヌクレオチドの製造 制御多孔性ガラス（ＣＰＧ）固相約 30 mg を標準応用バイオシステム反応装 置に 1.5μmol の合成だけ秤量する。ＣＰＧ固相（１）は合成するアミノオリゴ ヌクレオチドの保護された 3'-構成要素（実施例でｄＣ）を担う。 オリゴマー化のためにホスホルアミジット（６）、（７）、（８）及び（９） を使用する。 アミノ官能基を介して後に金属錯体を結合するために分離されたホスホルア ミジット（１０）、（１１）、（１２）及び（１３）を使用する。 合成サイクルは Applied Biosystem社の自動合成器 394を変形（デオキシ系列 (6)、(7)、(8)及び(9)のホスホルアミジットの結合時間は２分、アミジット（10 ）及び(11)は10分、(12)は５分、そして(13)は40分、(13)は過剰100 倍を使用す る）して Applied Bio-system 社の標準書類に従って実施する(ユーザーマニュ アル版 2.0（1992）1.0 μMol Cyclus，Appen．1-41)。 さらに市販の試薬として使用されるものを挙げる： 0.1 M ホスホルアミジット テトラゾール／アセトニトリル：４％，９６％ ｔ−ブチルフェノキシ無水酢酸／ピリジン／テトラヒドロフラン：10％，10％， 80％ Ｎ−メチルイミダゾール／テトラヒドロフラン：１６％，８４％ トリクロロ酢酸／ジメチルクロロメタン：２％，９８％ ヨウ素／水／ピリジン／テトラヒドロフラン、３％，２％，２０％，７５％ 次ぎのアミノオリゴヌクレオチドが合成される： （８２１）5'- GTA GAC TGG CGA GAT ^* CGG CAG TCG GCT AG-3' ここで T^* は、 を意味し、ここでＴはチミンを表し、 （８２３）5'- GTA GAC TGG CGA GAT^* CGG CAG TCG GCT AG-3' ここで T^* は、 を意味し、ここでＴはチミンを表し、 （９４０）5'- GTA GAC TGG CGA GAT CGG CAG T^*CG GCT AG-3' ここで T^* は、 を意味しそして （６９１） Ｄ）テルピリジン−ランタニド−オリゴヌクレオチド−複合体の製造 実施例Ｄ１ ：オリゴヌクレオチドがランタニド錯体のテルピリジン部分に結合す る複合体の製造 （ａ） 該当するアミノオリゴヌクレオチド 0.2 mg をピリジン／水／トリエチ ルアミン（９０：１５：１）150 μl に溶かす。表２の該当するイソチオシアナ ト錯体 1 mg を添加してから混合物を１時間室温のもとに放置する。反応混合物 を 0.1モル塩化カリウム溶液に対して１回、水に対して３回透析する。生成物を 逆相ＨＰＬＣ（グラジエント溶離：0.05Ｍトリエチルアンモニウムアセタート中 の０〜３０％アセトニトリルで９０分）によりヌクレオシル−Ｃ₁₈−カラム上で 、イオン交換ＨＰＬＣ（グラジエント溶離：１Ｍ塩化カリウム溶液が２０％及び アセトニトリルを２０％含むｐＨ6.0 の 20 mMリン酸カリウム溶液が80％の溶離 液で10分、続いて６０分内に８０％塩化カリウム溶液処理を行う）により６０℃ においてＰＶ ＤＩ．４０００Ａカラム、５μｍにかけると表３の純粋な複合体 3.1〜3.13，3. 18 及び 3.21 が生成する。実施例Ｄ２ ：オリゴヌクレオチドがランタニド錯体のピリジン部分に結合する複 合体の製造 番号 1.29 〜1.32 に該当するカルボン酸誘導体 3μmol をジメチルスルホキ シド 200μl に溶かした溶液にジシクロヘキシルカルボジイミド 3.3μmol 及び Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド 3.3μmol を加えて１６時間室温に放置する。Ｎ ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン 100μmol を加えてから相当するアミノオリ ゴヌクレオチド 0.2 mg を添加する。室温で４日おいてから炭酸水素トリエチル アンモニウム 50 mmolに対して２回、水に対して２回透析する。 逆相ＨＰＬＣ（(a)参照）で精製すると表３の化合物 3.14 〜3.17、3.19、3.2 0 及び 3.22 〜3.25が生成する。 Ｅ）標的ＲＮＡの製造 “標的ＲＮＡ”と命名されるオリゴヌクレオチドにおいて調剤上 の理由で大部分がキメラ分子に関し、これらは一部はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ ）- 構成要素（記号ｄ）及び一部はリボ核酸（ＲＮＡ）- 構成要素（記号ｒ）か ら構成される。相当するアンチセンスオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成 により対を形成しなくなった標的ＲＮＡのヌクレオチドはそのリボ核酸部分に存 在する。実施例Ｅ１： 5'd （CTA GCC GAC TGC）r(CGA UGA CUC GCC AC)，RNA-E1 の合成 ‘制御多孔性ガラス’（ＣＰＧ）固相の約 30 mgを標準応用バイオシステム反 応装置に1.5 μmol の合成だけ秤量する。ＣＰＧ固相（１）は合成するＲＮＡの 保護された３’−構成要素（実施例で、ｒＣ）を担う。 オリゴマー化にためにホスホルアミジット（２）〜（９）を加える。 合成サイクルは Applied Biosystem社の自動合成器 394を変形（リボ系列のホ スホルアミジットの結合時間は10分）して Applied Biosystem社の標準書に従っ て実施する(ユーザーマニュアル版 2.0（1992）1.0 μMol Cyclus，Appen．1-41 )。 さらに市販の試薬として使用されるものを挙げる： 0.1 M ホスホルアミジット テトラゾール／アセトニトリル：４％，９６％ ｔ−ブチルフェノキシ無水酢酸／ピリジン／テトラヒドロフラン：10％，10％， 80％ Ｎ−メチルイミダゾール／テトラヒドロフラン：１６％，８４％ トリクロロ酢酸／ジメチルクロロメタン：２％，９８％ ヨウ素／水／ピリジン／テトラヒドロフラン：３％，２％，２０％，７５％。 次ぎのＲＮＡ基質が合成される：名称ＲＮＡ−Ｅ１ （ｂ）固相（ＣＰＧ）の分離及び塩基の脱保護： 固相（1.5 μmol 合成）をア ンモニアで飽和したエタノール 800μl と混合して室温で一夜インキュベータに 入れる。アンモニアで飽和したエタノールは、エタノール１部と３３％アンモニ ア３部から調製される。インキュベートしたあとアンモニア飽和のエタノール溶 液をデカンテーションしてＣＰＧをアンモニア性エタノールで後洗浄して溶液を 合わせて凍結乾燥する。 （ｃ）ｔ−ブチル−ジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）保護基の脱保護： 凍結乾燥 した試料を１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオリド−テトラヒドロフラン（Ｔ ＢＡＦ／ＴＨＦ）溶液 800μl に加える。試料を３０分間強く混合する。インキ ュベーションは２４時間室温で光を遮断して行う。 ＲＮＡを炭酸水素酸トリエチルアミン（ＴＡＨＣ）50 ｍＭの溶液ｐＨ 7.0（１ ＋１）と混合して直ちに４℃で透析する（水は９桁超純水を使用する）。 （ｄ）透析：透析はｐＨ 7.0 のＴＡＨＣ溶液 7.5 mM に対して３回行う（溶液 は９桁超純水を使用して調製し、ＣＯ₂でｐＨを 7.0に調節し、４℃まで前冷却 する）。試料は、凍結乾燥し、ピロ炭酸ジエチルで処理〔Sambrook，Fritsch，M aniatis，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Sp ring Habor L aboratory Press(1989)〕してオートクレーブ製造による水（ＤＥＰＣ−Ｈ₂Ｏ） に採取する。アリコートは２６０ｎｍにおける濃度定量にかける。さらにＲＮＡ と操作するにはＲＮアーゼと異種金属イオンを常に分離して行う。 （ｅ）ＲＮＡ基質の³²〔Ｐ〕γ−ＡＴＰによる５’末端標識化：キナーゼの酵素 反応を行わせるために上述の合成記録にあるＲＮＡ 100 pmol を体積 20 μl の 中で３７℃において２０分間インキュベートする。 反応溶液は、Ｔ４−ポリヌクレオチドキナーゼ（プロメガ、１０単位／μl）0 .5 μl、キナーゼ緩衝液 2μl（50 mM トリス−ＨＣｌ pH 7.5，ＭｇＣｌ₂10 mM，１，４ジチオ−ＤＬ−トレイトール 5 mM，スペルミジン 0.1 mM）及び³³〔 Ｐ〕γ−ＡＴＰ0.5 μl（アメルスハム、＞1000 Ci/mmol，10μCi/ μl）を含有 する。 引き続いてトリス−ＨＣｌ／ＥＤＴＡ 138μl（10 mM/ 1 mM，pH 7.5、グリコー ゲン 2μl(35 mg/ml)及びＮＨ₄ＣＨ₃ＣＯＯ 40 μl（10 M）を追加する。エタノ ール 600μl を添加してから試料を−20℃において 30 分間冷却し、引き続いて ４℃において 20分間遠心分離する。ペレット錠剤を凍結乾燥し、着色緩衝液 15 μl（0.025 ％ブロモフェノールブリュー、80％ホルムアミド及び７M 尿素の1: 1 混合液中の 0.025％キシレンシラノール、クエン酸 20mM、EDTA 1 mM）を加え て１分間９５℃で変性させ、直ちに氷上に置いてゲル電気泳動で分離するために 1.0 cm × 1 mm のキットに入れる。ゲル電気泳動による分離は 55 ワットで40 分の前泳動の後で 55 ワットにおいて2.5 時間行う。 （ｆ）キナーゼ化したＲＮＡ基質の精製と分離：キナーゼ反応のゲル電気泳動に よる分離のために１２％ポリアクリルアミドゲル（１ mm × 30 cm × 40 cm）を調製する。重合反応は 170 ml で行う。このために アクリルアミド溶液 51 ml(40％アクリルアミド/ ビスアクリルアミド 10:1)、 ＴＢＥ緩衝液 17 ml（0.89 M トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、0.89 M ホウ酸、0.02 M エチレンジアミン四酢酸）及び尿素 71.4 g を相応量の水と 混合する。重合はペルオキシ二硫酸アンモニウム溶液 170μl（２５％ W/V）及 びＴＥＭＥＤ（N,N,N'，N'- テトラメチルエチレンジアミン）によって開始され る。ゲルは１時間後に使用する。泳動用緩衝液として１０倍希釈のＴＢＥ緩衝液 を使用する。 ゲル電気泳動による分離の後でキナーゼ化したＲＮＡはレントゲンフィルムに よって検出され、ゲルから分離される。電気溶離装置（Schleier und Schuell製 ）においてＲＮＡはゲル体から 100 V（3.3 V/cm）をかけると溶離する。溶離緩 衝液として10倍希釈のＴＢＥ緩衝液を使用する。溶離液 360μl 中の分離したＲ ＮＡにＮａＣＨ₃ＣＯＯ 40 μl（３Ｍ pH 5.2）及びエタノール 1 ml を加える 。試料を−20℃において 20 分間冷却して引き続き４℃において 20 分間遠心分 離にかける。ペレット錠剤を水 30 μl で凍結乾燥して採取する。溶液はチェレ ンコフ記録書によりシンチレーションカウンタで測定して 12000 cpm/μl に合 わせる。実施例Ｅ２： 実施例Ｅ１のような方法により以下の配列をもつ標的ＲＮＡ“ＲＮＡ−Ｅ２”が 製造される： 5'd（CTA GCC GAC TG）r（CCG AUC UCA AG）d（CCA GTC TAC）。実施例Ｅ３〜Ｅ３１： 実施例Ｅ１と類似な方法でさらに標的ＲＮＡ分子Ｅ３〜Ｅ３０及び標的ＲＮＡ 分子 Ｅ３１が製造され、その構造は章Ｆの表４、６及び８に示される。Ｆ）応用例（ＲＮＡ分解） 発明の種々のアンチセンス−オリゴヌクレオチド−複合体が種々の標的ＲＮＡ に対して示す分解挙動を調べた。それぞれのアンチセンス−オリゴヌクレオチド −配列での錯体の結合位置乃至は標的ＲＮＡとアンチセンス−オリゴヌクレオチ ド−複合体からなるハイブリッドに現れるミスマッチ（不対ヌクレオチド）の位 置に関しては図１、２及び３に示した事例で区別される。実施例Ｆ１： 本項では図３に図解するように発明のアンチセンス−オリゴヌクレオチド−複 合体による標的ＲＮＡの分解について扱う。 分解反応によるＲＮＡ生成物のゲル電気泳動による分離と同定には１２％のLo ng Ranger Gel（AT Biochem 製，修飾ポリアクリルアミドゲル）(0.4 mm × 30 cm ×40 cm)が調達される。重合反応は 、ＴＢＥ緩衝液 11 ml（0.89 M トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン 、0.89 Mホウ酸、0.02 M エチレンジアミン四酢酸）及び尿素 37 g を相応量の 水と混合する。重合はペルオキシ二硫酸アンモニウム溶液 450μl（１０％ W/V ）及びＴＥＭＥＤ 45 μlによって開始する。ゲルは１時間後に使用する。泳動 用緩衝液として 16.66倍希釈のＴＢＥ緩衝液を使用する。分離は 60 ワットで75 分かけて行う。ゲル電気泳動で分離したあと標識分解生成物（ＲＮＡオリゴマー ）はセットしたレントゲンフィルム又はりん光画像によって検出乃至は計数され る。 分解反応は 10 μl の容積で行う。 濃度系列の例： ＲＮＡ基質（12000 cpm）1 μl にオリゴヌクレオチド複合体 1μl（10 μM） 又は該当の希釈液（最終濃度 1μM、750mM、500 nm、250 nM、100 nM、50 nM、10 nM、1 nM 及び 0.5 nM）、トリス−ＨＣｌ緩衝 液 4μl（50 mM pH 7.4，37 ℃）及び相応量の水をピペットで加える。混合物 を１分で８５℃まで加熱し、引き続いて１６時間３７℃でインキュベートする。 反応は着色緩衝液 5μl（0.025 ％ブロモフェノールブルー、80％ホルムアミド 及び７M 尿素の1:1 混合液中の 0.025％キシレンシラノール、クエン酸 20mM 及 び 1 mM EDTA）を添加して終了させる。ゲル電気泳動による分離には試料 7.5μ l を１分間９５℃で変性させて直ちに氷上に置き、ゲルキットに入れる。 時間系列の例： ＲＮＡ／ＤＮＡ基質（12000 cpm）1 μl にオリゴヌクレオチド複合体 1μl(1 0 μM)、トリス−ＨＣｌ緩衝液 4μl（50 mM pH 7.4，37 ℃）及び相応量の水 をピペットで加える。混合物を１分で８５℃まで加熱し、引き続いて２時間、８ 時間、１６時間、４０時間及び６４時間３７℃でインキュベートする。反応は着 色緩衝液 5μl（0.025 ％ブロモフェノールブルー、80％ホルムアミド及び７M 尿素の1:1 混合液中の 0.025％キシレンシラノール、クエン酸 20mM 及び EDTA 1 mM 0.025）を添加して終了させる。ゲル電気泳動による分離には試料 7.5μl を１分間９５℃で変性させて直ちに氷上に置き、ゲルキットに入れる。 ＲＮＡ基質の濃度は次ぎのように２５倍過剰として評価される：ＲＮＡの未精 製品 100 pmol 及びゲル精製での 10 ％収量において記載記録によればＲＮＡ基 質 0.04 μM とオリゴヌクレオチド複合体 1μM が最終濃度として反応混合物中 に存在する。 テルピリジン−ランタニド錯体だけを比較として使用するとオリゴヌクレオチ ド複合体 40 nMと同じ分解を得るためには錯体 400μM が必要になる。ここでは オリゴヌクレオチド複合体に対して錯体 を 10,000 倍過剰に使用している。 濃度系列においてＲＮＡ／ＤＮＡ基質 40 μM をオリゴヌクレオチド複合体 40 nMで分解するのに１６時間３７℃によることが明らかにされている。 表３の化合物 3.2のＲＮＡ−Ｅ１による分解生成物： 出発物質 5'd（CTA GCC GAC TGC）r（CGA UGA CUC GCC AC）の＜２０％は分解し ない。主要分解生成物（Σ８０％）： 5'd（CTA GCC GAC TGC）r（CGA UGcp） 5'd（CTA GCC GAC TGC）r（CGA Ucp） 5'd（CTA GCC GAC TGC）r（CGcp）他分解生成物（Σ５％）： 5'd（CUA GCC GAC UGC CGA UCU CGCcp） 5'd（CUA GCC GAC UGC CGA UCU Ccp） (cp は 2',3'−シクロホスファートを意味する。実施例Ｆ２： 本項では図１に図解するようにアンチセンス−オリゴヌクレオチド−複合体に よる標的ＲＮＡの分解について扱う。 表３の化合物 3.20 及び標的ＲＮＡ ＲＮＡ−Ｅ２を使用して実施例Ｅ１のよ うな処理を行う。 分解生成物： 出発物質 5'd（CTA GCC GAC TG）r（CCG AUC UCA AG）d(CCA GTC TAC)の＜５％ は分解しない。主要分解生成物（Σ９５％）： 5'd（CTA GCC GAC TG）r（CCG AUC UCA Acp） 5'd（CTA GCC GAC TG）r（CCG AUC UCAcp） 5'd（CTA GCC GAC TG）r（CCG AUC UCcp）実施例Ｆ３： 本項では図１に図解するように種々のアンチセンス−オリゴヌクレオチド−複 合体による種々の標的ＲＮＡの分解について行った他の試験を扱う。 次ぎの表４には使用した標的ＲＮＡの構造を記載する。太字印刷のヌクレオチ ドは、アンチセンス−オリゴヌクレオチド−複合体の同じヌクレオチドに対して 相補性であり、これに錯体が結合する。下線を引いたヌクレオチドは標的ＲＮＡ と複合体からなるハイブリッドにおいて対をなさない（ミスマッチ）。 標的Ｒ ＮＡ Ｅ１７に引いた二重下線は、選んだ配列に基づいてそれぞれ２個の隣接す るヌクレオチドが下線部において対をなさず、該当するヌクレオチドが明確に定 められないことを意味する。さらに複合体、特に錯体の位置を標的ＲＮＡと関連 づけて図解してある。 実施例Ｆ１のようにして分解が行われるが、ここで次ぎの表５記載のアンチセ ンス−オリゴヌクレオチド−複合体（表３も参照のこと）及び標的ＲＮＡ（表４ 参照）が使用される。表５はそれぞれの標的ＲＮＡの主要分解生成物を記載する 。例えば、表記“＋５Ａ”とは、標的ＲＮＡ Ｅ２の複合体 3.22 による分解に おいて分解がヌクレオチド＋５Ａと＋６Ａの間で起きることを意味する。 実施例Ｆ４： 本項では図２に図解するように種々のアンチセンス−オリゴヌクレオチド−複 合体による種々の標的ＲＮＡの分解について行った他の試験を扱う。 次ぎの表６に使用した標的ＲＮＡの構造を記載する。表４で行った説明が適用 される。 実施例Ｆ１のようにして分解が行われるが、ここで次ぎの表７記載のアンチセ ンス−オリゴヌクレオチド−複合体（表３も参照のこと）及び標的ＲＮＡ（表６ 参照）が使用される。表７にはそれぞれの標的ＲＮＡの主要分解生成物が記載さ れる（表５の解説も参照の こと）。 実施例Ｆ５： 図３に図示したように種々のアンチセンス−オリゴヌクレオチド−複合体によ る標的ＲＮＡの分解をさらに試験した。 表８に使用した標的ＲＮＡの構造を示す。そのほかに比較用としてＤＮＡ（Ｅ ３１）が使用される。表４で行った説明が適用される。 実施例Ｆ１のようにして分解が行われるが、ここで次ぎの表９記載のアンチセ ンス−オリゴヌクレオチド−複合体（表３も参照のこと）及び標的ＲＮＡ（表８ 参照）が使用される。表９にはそれぞれの標的ＲＮＡの主要分解生成物が記され る（表５の解説も参照）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ ，ＶＮ (72)発明者 ハル，ヨナタン スイス国，ツェーハー−3012 ベルン，ド ンネルビールベク 41

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．オリゴヌクレオチドにエステル交換反応触媒又は加水分解触媒が結合し、 そしてオリゴヌクレオチドの内部配列が天然に存在する標的ＲＮＡに対して部分 的に相補性がないこと、ここで条件として内部配列が天然に存在する標的ＲＮＡ に対して部分的に相補性がなくエステル交換反応触媒又は加水分解触媒としてテ キサフィリン−金属−錯体が結合しているオリゴヌクレオチドを除外すること、 を特徴とするデオキシリボヌクレオチド、非天然の合成によるヌクレオチド構成 要素、又はペプチド核酸からなるオリゴヌクレオチド。 ２．配列のなかで部分的に相補性でない性質が構造障害によって引き起こされ るために塩基対が形成されないことを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌク レオチド。 ３．オリゴヌクレオチド配列のなかの標的ＲＮＡと比較して１個又は数個の連 続したヌクレオチド構成要素が欠如することを特徴とする、請求項１に記載のオ リゴヌクレオチド。 ４．１〜１０個のヌクレオチド構成要素が欠如することを特徴とする、請求項 ３に記載のオリゴヌクレオチド。 ５．オリゴヌクレオチドが１個又は数個の連続したヌクレオチド構成要素を含 み、これが標的ＲＮＡの対応するヌクレオチド構成要素と対を形成しないことを 特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 ６．オリゴヌクレオチドが１〜１０個の対を形成をしない構成要素を含むこと を特徴とする、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。 ７．１０個までの標的ＲＮＡと対を形成をしない外部ヌクレオチ ド構成要素が内部配列に結合することを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌ クレオチド。 ８．対を形成しない構成要素として天然のヌクレオチド構成要素を含むことを 特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 ９．対を形成しない構成要素として非天然の合成によるヌクレオチド構成要素 を含むことを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 10．５〜１００個のヌクレオチド構成要素を含むことを特徴とする、請求項１ に記載のオリゴヌクレオチド。 11．５〜５０個のヌクレオチド構成要素を含むことを特徴とする、請求項１０ に記載のオリゴヌクレオチド。 12．８〜３０個のヌクレオチド構成要素を含むことを特徴とする、請求項１０ に記載のオリゴヌクレオチド。 13．対を形成しない部分が配列の中間部分にあることを特徴とする、請求項５ に記載のオリゴヌクレオチド。 14．プリン系列及びピリミジン系列の天然のデオキシヌクレオシドから構成さ れることを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 15．２’−デオキシ−２−アミノアデノシン、２’−デオキシ−５−メチルシ トシン、２’−デオキシアデノシン、２’−デオキシシチジン、２’−デオキシ グアノシン及び２’−チミジンから構成されることを特徴とする、請求項１４に 記載のオリゴヌクレオチド。 16．２’−デオキシアデノシン（Ａ）、２’−デオキシシチジン（Ｃ）、２’ −デオキシグアノシン（Ｇ）及び２’−チミジン（Ｔ）から構成されることを特 徴とする、請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド。 17．非天然の合成による構成要素がプリン系列及びピリミジン系列の天然のヌ クレオシドに由来することを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド 。 18．構成要素が、アデノシン、シチジン、グアノシン、２−アミノアデノシン 、５−メチルシトシン、チミジン及び前にあげたデオキシ誘導体に由来すること を特徴とする、請求項１７に記載のオリゴヌクレオチド。 19．標的ＲＮＡに対して部分的に相補性のオリゴヌクレオチドが（１）天然の デオキシヌクレオシド又は非天然の合成による構成要素から構成され、そして（ ２）部分的にだけ相補的な性質が、通常は相補性を示す配列の中で１〜４個の構 成要素が欠如することによって生じることを特徴とする、請求項１に記載のオリ ゴヌクレオチド。 20．エステル交換反応触媒及び／又は加水分解触媒が、オリゴヌクレオチド配 列の３’−若しくは５’−末端基にある窒素原子、硫黄原子又は酸素原子と、配 列中若しくは配列末端にある核塩基の炭素原子、窒素原子又は酸素原子と、配列 中若しくは配列末端にある酸素原子、硫黄原子又は窒素原子につくフラノース環 の２’−位置と、又は配列中にあるヌクレオチド橋かけ基の酸素原子、硫黄原子 又は窒素原子と直接あるいは橋かけ基を通して結合することを特徴とする、請求 項１に記載のオリゴヌクレオチド。 21．橋かけ基が以下の式（Ｉ）： −Ｘ₁−Ｘ₂−Ｘ₃−（Ｘ₄）_x− （Ｉ） ｛ここで、Ｘ₁は直接結合又は１〜２２個の炭素原子を有する２価の開鎖あるい は環状の、不切断又は−Ｓ−、−ＮＲ−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ −の基からなる残基で切断されている炭化水素基、又は１〜１２個のオキサアル キレン単位を有するポリオ キサアルキレン残基及びアルキレンの２個あるいは３個の炭素原子を意味し、Ｘ₂ は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｓ） −ＮＨ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ） −Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｃ（Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−Ｃ（ Ｓ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ−、−ＲＮ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ− Ｓ（Ｏ）₂−、−Ｓ（Ｏ）₂−ＮＲ−、−ＮＲ−Ｓ（Ｏ）−、−ＰＯ−（ＯＭ）− Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）−（ＯＭ）−、−Ｐ（Ｏ）−（ＯＭ）−ＮＲ−、−ＮＲ− Ｐ（Ｏ）−（ＯＭ）−、−ＰＨ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＨ（Ｏ）−、−ＰＨ（Ｏ ）−ＮＲ− 及び −ＮＲ−ＰＨ（Ｏ）−を表し、Ｘ₃は独立にＸ₁の意味を有し 、そしてｘはＸ₃が直接結合を表す場合は０に等しく、Ｘ₄はヌクレオシド構成要 素の酸素原子、窒素原子又は炭素原子への結合を意味し、又はＸ₄はｘが１に等 しくＸ₃が直接結合でない場合には、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＭ）−Ｏ−、−ＮＲ− Ｐ（Ｏ）（ＯＭ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＭ）−ＮＲ−又は−ＮＲ−Ｐ（Ｏ ）（ＯＭ）−ＮＲ−を表し、ＲはＨ、Ｃ₁−Ｃ₆−アルキル、フェニル又はベンジ ルを意味し、ＭはＨ、Ｃ₁−Ｃ₆−アルキル、フェニル又はベンジル、アルカリ金 属カチオン又はアンモニウムカチオンを表し、そしてｘは０又は１を表す。｝に より表されることを特徴とする、請求項２０に記載のオリゴヌクレオチド。 22．式（Ｉ）において、Ｘ₁が直接結合又はＣ₁−Ｃ₄−アルキレン、フェニレ ン又はベンジレンを意味し、ここでアルキレンは− Ｃ（Ｏ）−Ｏ−又は−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−で切断されてよく、Ｘ₂は−Ｃ（Ｏ）− Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−又は−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）− ＮＨ−を表し、Ｘ₃はＣ₂−Ｃ₁₈−アルキレン、好ましくはＣ₂−Ｃ₁₂−アルキレ ンを表し、そしてＸ₄はヌクレオチド構成要素の酸素原子、窒素原子又は炭素原 子への結合を意味し、又はＸ₄は−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＭ）−Ｏ−、−ＮＲ−Ｐ（ Ｏ）（ＯＭ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＭ）−ＮＲ−又は−ＮＲ−Ｐ（Ｏ）（ ＯＭ）−ＮＲ₁−を表すことを特徴とする請求項２１に記載のオリゴヌクレオチ ド。 23．オリゴヌクレオチドに結合する触媒がポリペプチド、金属塩及び金属錯体 にかかわることを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 24．金属が元素周期系の副族元素並びに主族元素の金属Ｉｎ、Ｔｌ、Ｓｎ、Ｐ ｂ及びＢｉから選ばれることを特徴とする、請求項２３に記載のオリゴヌクレオ チド。 25．金属がスカンジウム、イットリウム、ランタン、ランタニド金属、Ｔｉ、 Ｚｒ、Ｈｆ、Ｖ、Ｎｂ、Ｔａ、Ｃｒ、Ｍｏ、Ｗ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｒｕ、Ｏｓ、Ｃｏ 、Ｒｈ、Ｉｒ、Ｎｉ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｃｕ、Ａｇ、Ａｕ、Ｚｎ、Ｃｄ及びＨｇから 選ばれることを特徴とする、請求項２３に記載のオリゴヌクレオチド。 26．金属がスカンジウム、イットリウム、ランタン、ランタニド金属、Ｃｕ及 び鉛から選ばれることを特徴とする、請求項２３に記載のオリゴヌクレオチド。 27．金属がランタニド金属のなかでＣｅ、Ｅｕ、Ｇｄ及びＳｍのグループから 選ばれることを特徴とする、請求項２３に記載のオリゴヌクレオチド。 28．金属塩及び金属錯体のアニオンが次ぎのグループ: ハロゲン化物、酸素酸 のアニオン、ＢＦ₄ ^t、ＰＦ₆ ^t、ＳｉＦ₆ ^t又はＡｓＦ₆ ^tから選ばれることを特徴と する、請求項２３に記載のオリゴヌクレオチド。 29．金属錯体触媒が、錯体形成剤として複素有機化合物をもつ金属錯体塩とし て存在し、ここで錯体形成剤がオリゴヌクレオチドと結合することを特徴とする 、請求項２３に記載のオリゴヌクレオチド。 30．錯体形成剤がＯ、Ｓ、Ｎ及びＰのグループから選ばれたヘテロ原子を有す る開鎖又は環状有機化合物にかかわることを特徴とする、請求項２９に記載のオ リゴヌクレオチド。 31．錯体形成剤が全体で８〜２６個の環成分及び環に２〜１２個のヘテロ原子 を有する環状又は多環状有機化合物にかかわることを特徴とする、請求項２９に 記載のオリゴヌクレオチド。 32．錯体形成剤がクラウンエーテル、シアニン、フタロシアニン、ナフタロシ アニン、ポルフィリン、フェナントロリン、開鎖又は環状のビス−及びテルピリ ジン、エチレンジアミン四酢酸又はジエチレントリアミン五酢酸塩にかかわるこ とを特徴とする、請求項２９に記載のオリゴヌクレオチド。 33．複合体が以下の式（II）： Ａ−Ｂ−Ｏｌｉｇｏ （II） ｛ここでＡが炭素原子を通してＢに結合する環状又は多環状の錯体形成剤をもつ 金属錯体塩を表し、錯体形成剤は少なくとも１２個の環原子及び環にあるＮ及び Ｏのグループの少なくとも４個のヘテロ原子を含み、環にはスカンジウム、イッ トリウム、ランタン及びランタニド金属から選ばれた２価又は３価の金属イオン が結合し、Ｂは式（Ｉ）の橋かけ基を表し、Ｏｌｉｇｏはオリゴヌクレオチドを 意味し、その内部配列は標的ＲＮＡに対して部分的に相補性でない。｝により表 されることを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 34．錯体形成剤が全部で２２個までの環原子を含み、環原子がヘテロ原子以外 は炭素原子であることを特徴とする、請求項３３に記載のオリゴヌクレオチド。 35．錯体形成剤がＯ及びＮからのヘテロ原子を４〜１２個含むことを特徴とす る、請求項３４に記載のオリゴヌクレオチド。 36．錯体形成剤が全体で１６〜２０個の環原子並びに６〜１０個の窒素原子を 含み、ここで他の環要素に炭素原子がかかわり、そして１〜６個及び好ましくは ２〜４個の置換されていない又は置換されている基−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ− が、１，３の位置で環に結合し、そして環の窒素原子とピリジン基を形成するこ とを特徴とする、請求項３３に記載のオリゴヌクレオチド。 37．複合体が以下の式（III）： ｛ここで、 Ｒ₂及びＲ₇はそれぞれ独立にＨ、Ｃ₁−Ｃ₄−アルキル、Ｃ₁−Ｃ₄−アルコキシ、 Ｃ₇−Ｃ₁₂−アラルキル又はＣ₆−Ｃ₁₆−アリールを意味し、 Ｒ₃及びＲ₆はそれぞれ独立にＨ、Ｃ₁−Ｃ₄−アルキル、Ｃ₇−Ｃ₁₂−アラルキル 又はＣ₆−Ｃ₁₆−アリールであり、 Ｒ₄はＨ、Ｃ₁−Ｃ₂₀−アルキル、Ｃ₅−Ｃ₈−シクロアルキル、Ｃ₆−Ｃ₁₂−アリ ール又はＣ₇−Ｃ₁₂−アラルキルを表し、 Ｍｅはランタン、ランタニド金属、イットリウム又はスカンジウムを表し、 Ｙはアニオンを表し、 ｎは数２又は３を意味し、及び ｍは数１、２又は３を意味し、 ここで残基のアルキル、シクロアルキル、アラルキル及びアリールは未置換又は Ｃ₁−Ｃ₄−アルコキシ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、−ＣＮ、Ｃ₁−Ｃ₄−アルキルあるいは −ＮＯ₂で置換され、 Ｒ₅は以下の式（IV）の残基： −Ｂ−Ｏｌｉｇｏ− （IV） を表し、及びＲ₁はＨ又は置換基を意味し、又は Ｒ₅はＨ又は置換基を表し、及びＲ₁は式IVの残基を意味し、ここでＢ及びＯｌｉ ｇｏは請求項３３で述べた意味を有する。｝により表されることを特徴とする、 請求項３３に記載のオリゴヌクレオチド。 38．式（III）において、Ｒ₂及びＲ₇がＨを表し、Ｒ₃及びＲ₆がＣ₁−Ｃ₄−ア ルキルを意味し、Ｒ₄がＨ、Ｃ₁−Ｃ₄−アルキル、フェニル又はベンジルを表し 、Ｒ₁が基Ｘ₁−Ｘ₂−Ｘ₃−（Ｘ₄）_x−Ｏｌｉｇｏ 及び Ｒ₅がＨ，メチル又は メトキシ又はＲ₅が基Ｘ₁−Ｘ₂−Ｘ₃−（Ｘ₄）_x−Ｏｌｉｇｏ 及びＲ₁が Ｈ、メチル又はメトキシを表し、Ｘ₁が直接結合又はＣ₂−Ｃ₆−アルキレンであ り、Ｘ₂が−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ −Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−又は−ＨＮ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−を意味し、Ｘ₃がＣ₂−Ｃ₁₂− アルキレン又はフェニレンを表し、Ｘ₄がヌクレオシド構成要素の酸素、窒素又 は炭素原子への結合を意味し、又はＸ₄が−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＭ）−Ｏ−を表し 、ｘが０又は１を表し、ＭｅがＬａ、Ｃｅ、Ｎｄ、Ｅｕ又はＧｄを意味し、ｎが ２又は３及びｍが１又は２を表し、ＹがＣｌ、Ｂｒ、ＣＨ₃Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＣｌＯ₄ 、ＢＦ₄、ＰＦ₆、Ｆ₃Ｃ−ＳＯ₃又はトシラートを表し、ＭがＨ、Ｎａ又はＫを表 し、そしてＯｌｉｇｏがオリゴヌクレオチド残基を意味し、残基の内部配列は標 的ＲＮＡに対して部分的にだけ相補性であり、残基が天然のデオキシリボヌクレ オチド構成要素又は非天然の合成によるヌクレオチド構成要素から構成され、こ こで１〜４個の構成要素が欠如する標的ＲＮＡに関することを特徴とする、請求 項３７に記載のオリゴヌクレオチド。 39．エステル交換反応触媒又は加水分解触媒がオリゴヌクレオチドと結合し、 そしてオリゴヌクレオチドの内部配列が天然に存在する標的ＲＮＡに対して部分 的に相補性がなく、そしてオリゴヌクレオチドが天然のデオキシリボ核酸構成要 素又は非天然の合成によるヌクレオチド構成要素から構成され、その特徴が、官 能基を基本構造核に結合させているエステル交換反応触媒又は加水分解触媒をヌ クレオチド構成要素の官能基又はヌクレオシド構成要素の修飾官能基と反応させ ることにある、オリゴヌクレオチドの製造方法。 40．生理的条件並びにエステル交換反応及び／又は加水分解用の合成触媒の作 用の下で（ａ）標的ＲＮＡをオリゴヌクレオチドで錯化させ、その内部配列が標 的ＲＮＡに対して部分的に相補性でなく 、そしてオリゴヌクレオチドにエステル交換反応触媒又は加水分解触媒が結合す るが、ここでオリゴヌクレオチドの内部配列が天然に存在する標的ＲＮＡに対し て部分的に相補性でなくエステル交換反応触媒又は加水分解触媒としてテキサフ ィリン−金属−錯体が結合することを除くことを条件とし、及び（ｂ）次ぎに反 応を起こさせて切断することを特徴とする、リボ核酸のリン酸ヌクレオチド橋か けを切断する方法。 41．ヒトを含む温血動物の疾患を体内のヌクレオチド配列を不活化することで 処置する治療方法において請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを応用する方法 。 42．請求項１記載のオリゴヌクレオチドの有効量を単独又はほかの活性物質、 医薬担体物質としての水及び必要な場合には助剤と共に含有する水溶液又は懸濁 液に基づいた構成成分。 43．請求項１記載のオリゴヌクレオチドの有効量を単独又は他の活性物質、医 薬担体物質として意味がある量の水及び必要な場合には助剤と共に含有する水溶 液又は懸濁液に基づいた薬剤調剤。 44．ウイルス性感染又は遺伝子関連疾患を検出する診断薬として請求項３９に より製造した請求項１記載のオリゴヌクレオチドの使用。 45．ヒトを含む温血動物の疾患を体内のヌクレオチド配列を不活性にすること で治療するための請求項１記載のオリゴヌクレオチドの使用。