EP0778845A1 - Oligonukleotidkonjugate, zusammensetzungen und verfahren zur spaltung von ribonukleinsäuren - Google Patents

Oligonukleotidkonjugate, zusammensetzungen und verfahren zur spaltung von ribonukleinsäuren

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Publication number
EP0778845A1
EP0778845A1 EP95931942A EP95931942A EP0778845A1 EP 0778845 A1 EP0778845 A1 EP 0778845A1 EP 95931942 A EP95931942 A EP 95931942A EP 95931942 A EP95931942 A EP 95931942A EP 0778845 A1 EP0778845 A1 EP 0778845A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
oligonucleotide
oligonucleotide according
building blocks
group
target rna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP95931942A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Dieter Hüsken
Heinz Moser
Robert Häner
Jonathan Hall
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novartis AG
Original Assignee
Ciba Geigy AG
Novartis AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ciba Geigy AG, Novartis AG filed Critical Ciba Geigy AG
Publication of EP0778845A1 publication Critical patent/EP0778845A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0042—Photocleavage of drugs in vivo, e.g. cleavage of photolabile linkers in vivo by UV radiation for releasing the pharmacologically-active agent from the administered agent; photothrombosis or photoocclusion
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • Oligonucleotide coniuqate Compositions and methods for cleaving ribonuccinic acids.
  • the present invention relates to oligonucleotide conjugates with transesterification or hydrolysis catalysts, the oligonucleotide sequence of which is sometimes not complementary to a naturally occurring target ribonucleic acid (target RNA); a method for the sequence-specific cleavage of a target RNA under physiological conditions and under the action of the oligonucleotide associate; a composition of an inert carrier material and the oligonucleotide associate; as well as its use.
  • target RNA target ribonucleic acid
  • LS Kappen et al. describe in Biochemistry, volume 32, pages 13138 to 13145 (1993) that in the oxidative cleavage of single- or double-stranded DNA with neocarzinostatin, a sequence-specific cleavage occurs when, for example, unpaired regions lead to a bulge in a DNA strand.
  • D. Williams et al. in Nucieic Acids Research, Volume 16, pages 11607 to 11615 (1988) disclose that in the hydrolytic reaction of double-stranded DNA with copper phenantroline, the cleavage preferably takes place at sites which additionally contain an unpaired cytidine in the chain.
  • DE-A-2451 358 already describes that when mimicking the production of interferon with a double-stranded (rl n .rC n ) complex, the toxicity is reduced while maintaining the production of interferon if one modifies the rC n chain causes structural disturbances, so that the rC n chain in the cells is more easily hydrolyzed by nucleases.
  • the introduction of a nucleotide that prevents pair formation in the complex is proposed as a structural disorder.
  • KA Kolasa in Inorg. Chem., Volume 32, pages 3983 to 3984 (1993) indicate that RNA in DNA-RNA hybrids are not cleaved by trivalent lanthanide ions.
  • the imine groups of the ligand are susceptible to hydrolysis, so that the effectiveness in aqueous environments wears off relatively quickly, or the residence time is too short for therapeutic use.
  • the hydrolysis of the ligand also releases the metal, which can cause serious toxic problems and unspecific cleavage of RNA.
  • they are weak Lewis acids because a charge of the Eu cation is neutralized by a ligand and there is therefore a double-charged complex.
  • the complexes described are also only accessible through synthetically complex processes.
  • WO 94/29316 discloses a method for phosphate ester hydrolysis using conjugates of an oligonucleotide with a texaphyrin-metal complex.
  • conjugates which contain dysprosium (III) as the metal and whose oligonucleotide sequence is selected such that the binding of the oligonucleotide sequence to a target RNA causes a "loop" of one or more nucleotides in the latter.
  • oligonucleotides the sequence of which is only partially complementary to a target RNA and to which a transesterification catalyst or hydrolysis catalyst is bound, are highly effective and it is even possible to achieve sequence-specific cleavages in a target RNA. It was also found that, under comparable reaction conditions, considerably less oligonucleotide transesterification catalyst is required than free transesterification catalyst that is not bound to an oligonucleotide.
  • the cleavage of the target RNA in the double-strand region greatly increases the instability of the RNA / oligonucleotide complex after cleaving the RNA and facilitates the breakdown into the free RNA fragments and the free conjugate of oligonucleotide and hydrolysis or transesterification catalyst. As a result, the conjugate can develop catalytic activity and the amounts used can be considerably reduced.
  • An object of the invention is an oligonucleotide of deoxyribonuclear nucleotides (NA), unnatural synthetic nucleotides, or peptide nucleic acids PNA, which is characterized in that a transesterification or hydrolysis catalyst is bound to the oligonucleotide, and the internal sequence of the oligonucleotide is in some cases not complementary to a natural one occurring target RNA.
  • NA deoxyribonuclear nucleotides
  • PNA peptide nucleic acids
  • target RNA means that an RNA sequence must be present in the target.
  • polyribonucleic acids can be present. It is preferably m-RNA (messenger RNA), pre-m-RNA (pre-er-m-RNA) t-RNA Transfer RNA), sn-RNA (small nuclear RNA), r-RNA (ribosomal RNA) and viral RNA.
  • RNA polydeoxyribonucleic acids
  • DNA polydeoxyribonucleic acids
  • the RNA has so many building blocks that a complex (double strand) can be formed with the oligonucleotide.
  • the sequence of the oligonucleotide contains a structural disturbance, so that no base pairing takes place with corresponding nucleotide building blocks of the target RNA (for example base pairing means the following complementary nucleosides in the target RNA and in the oligonucleotide : AU, T / U-A, GC and CG).
  • the sequence of the oligonucleotide, which is otherwise complementary to the target RNA lacks one or more successive nucleotide building blocks. As a result, a bulge is formed in the target RNA, which is particularly transesterification and / or hydrolysis instabii.
  • the oligonucleotide contains one or more successive nucleotide building blocks which do not pair with the corresponding nucleotide building blocks of the target RNA. Due to the structural disturbance in the double helix, the RNA in these areas is unstable to transesterification and / or hydrolysis reactions.
  • the oligonucleotide preferably lacks 1 to 10, particularly preferably 1 to 4 and very particularly preferably 1 or 2 consecutive nucleotides.
  • the oligonucleotide contains 1 to 10, particularly preferably 1 to 4 and very particularly preferably 1 or 2 consecutive non-pairing nucleotide building blocks (in English these structural disorders are referred to as mismatch and infernal loop).
  • inner sequence means that, for example, up to 10, preferably up to 5, particularly preferably up to 3 and very particularly preferably 1 or 2 of the outer nucleotide building blocks of the sequence need not be complementary to the target RNA. This can be advantageous in that a transesterification or hydrolysis catalyst bound at the end of a sequence can be more flexible and therefore more efficient.
  • the oligonucleotide can be constructed partially or completely from natural DNA building blocks which are complementary to the target RNA or completely from unnatural synthetic nucleotides which are also complementary to the target RNA, where in some cases means that in the oligonucleotide sequence natural DNA building blocks complementary to the target RNA complementary unnatural synthetic nucleotides are also replaced.
  • Synthetic building blocks include the modifications of natural building blocks in the nucleus base, the furanose ring and / or the bridging groups of the oligonucleotides. Synthetic building blocks are generally used to strengthen the complex binding in duplex structures and / or to increase the stability of the oligonucleotides against the degradation caused by, for example, nucleases.
  • Modifications include modifications in the nucleic base part (for example substitutions, omission of substituents), in the nucleotide bridge group (for example modification of the phosphoric acid ester group or their replacement by other bridge groups) and in furanose ring (for example substitutions on the 2'-hydroxyl group, replacement of the furanose group). O atoms, replacement of the furano ring with mono- or bicarbacyc rings, replacement of the furano ring with open-chain structures) into question.
  • the choice and the order of the building blocks in the sequence of the oligonucleotide is determined by the necessary duplex formation with a target RNA.
  • the type and location of the link to the catalyst can also influence the choice and the order of the building blocks.
  • the non-pairing nucleotides can be natural nucleotides that are selected so that they are non-complementary to nucleotides in the target RNA (according to the Watson / Crick definition, for example, pairs such as AA, UU, AG, AC, G- T, TU).
  • the non-pairing nucleotides can also be unnatural, synthetic nucleotides. These nucleotides can be modified on the nucleotide base, the nucleotide phosphoric acid ester bridge or the furanose ring. A large number of such modified and synthetic, non-complementary building blocks have become known and are familiar to the person skilled in the art.
  • the oligonucleotide is constructed from unnatural complementary nucleotides, the oligonucleotide particularly preferably also containing non-complementary unnatural building blocks.
  • the number of building blocks in the oligonucleotide is dimensioned such that hybridization takes place with the target RNA.
  • the oligonucleotides can contain, for example, 5 to 100, preferably 5 to 50, particularly preferably 8 to 30 and very particularly 10 to 25 building blocks.
  • the regions that prevent pairing with the target RNA are preferably arranged in the middle sequence sequences of the oligonucleotide, for example between the fourth-last, or the third-last, or the second-last, or each last building blocks of the sequence.
  • non-pairing building blocks are preferably in the range from the fourth to the seventeenth building block.
  • Oligonucleotides preferred according to the invention are those in which nucleotides are missing.
  • the oligonucleotides are preferably composed of nucleosides from the purine series and the pyrimidine series. Particularly preferably from 2'-deoxy-2-aminoadenosine, 2'-deoxy-5-methylcytidine, 2'-deoxyadenosine, 2'-deoxycytidine, 2'-deoxyuridine, 2'-deoxyguanosine and 2'-thymidine.
  • 2'-Deoxyadenosine (A), 2-deoxycytidine (C), 2'-deoxyguanosine (G) and 2'-thymidine (T) are very particularly preferred.
  • Modified building blocks are preferably derived from natural nucleosides of the purine series and the pyrimidine series, particularly preferably from adenosine, cytidine, guanosine, 2-aminoadenosine, 5-methylcytosine, thymidine and the deoxy derivatives mentioned above.
  • the nucleosides can also be 2'-modified ribonucleosides.
  • the oligonucleotide from (1) natural deoxynucleosides which is partially complementary to a target RNA, particularly preferably from the group 2'-deoxyadenosine (A), 2'-deoxycytidine (C), 2'-deoxyguanosine (G), and 2'-thymidine (T) or built up from complementary unnatural synthetic building blocks, and (2) the only partially complementary property is due to the absence of preferably 1 to 4, particularly preferably 1 to 3 and particularly preferably 1 or 2 blocks in the otherwise complementary sequence.
  • such modified nucleosides are particularly preferred which increase the stability of the oligonucleotide towards nucleases.
  • the oligonucleotide can also consist of sequences of peptide nucleic acids (PNA), the catalyst preferably being bound to the nucleic acid base, the amino or the carboxyl end.
  • the nucleic bases are bound to the amide N atoms of the peptide sequence.
  • the complementary sequence can consist of natural or unnatural synthetic amino acid building blocks, and the non-complementary property can be achieved as described above by omitting building blocks or by incorporating non-complementary building blocks. The same preferences apply to the construction of the PNA sequence as to the oligonucleotides. Examples of PNA's can be found in Science, volume 254, pages 1497 to 1500.
  • a transesterification and / or hydrolysis catalyst can optionally be linked via a bridging group to N, S or O atoms in the 3 'or 5' end groups in the oligonucleotide sequence.
  • the catalysts can, however, also on C, N or O atoms of nucleic bases in or at the end of the sequence, at 2 'positions of the furano ring on O, S or N atoms in or at the end of the sequence or on O- , S or N atoms of the nucleotide bridge group in the sequence.
  • the type of binding depends on the type of catalyst and the type of its functional groups. For example, a catalyst molecule can be bound to the oligonucleotide directly or via a bridging group.
  • a bridging group can, for example, be a converted functional group, which in turn can be bound to the catalyst and / or the oligonucleotide directly or via a connecting group.
  • the binding to the oligonucleotide can be ionic and preferably covalent.
  • the catalysts can also be attached to the 6'-carbon atom of a carbacyclic nucleotide analog.
  • the bridging group can, for example, preferably correspond to the formula I
  • X 1 is a direct bond or a divalent, open-chain or cyclic hydrocarbon group with 1 to 22 carbon atoms, which is continuous or with residues from the group -S-, -NR-, -C (O) -O-, - C (O) -NR- is interrupted, or represents a polyoxaalkylene radical having 1 to 12 oxaalkylene units and 2 or 3 carbon atoms in the alkylene;
  • R represents H, d-Ce alkyl, phenyl or benzyl;
  • M represents H, Ci-Ce-alkyl, phenyl or benzyl, an alkali metal cation or an ammonium cation; and
  • x represents 0 or 1.
  • X-i preferably contains 1 to 18, particularly preferably, as the divalent hydrocarbon group
  • the hydrocarbon group can be, for example, linear or branched C 1 -C 2 alkylene, preferably C 1 -C alkylene, particularly preferably CrC-12 alkylene and very particularly preferably C ** - C 8 alkylene; Ca-Cs-cycloalkylene, preferably C 5 - or Ce-cycloalkylene; C 6 -C 12 arylene or C ⁇ -C 12 aralkylene.
  • divalent hydrocarbon groups are methylene, ethylene, 1,2- or 1,3-butylene, 1,2-,
  • R as alkyl preferably contains 1 to 4 carbon atoms and is preferably methyl or ethyl. R is particularly preferably H.
  • M is alkyl, it preferably contains 1 to 4 carbon atoms; it is particularly preferably methyl or ethyl.
  • Preferred alkali metal and ammonium cations are Na + , K ⁇ NH 4 * and N (C 1 -C e -alkyl) 4 *.
  • a preferred subgroup of bridge groups of the formula I are those in which X is a direct bond and preferably C 1 -C 4 -alkylene, phenylene or benzylene, the alkylene having -C (O) -O- or -C (O) -NH - can be interrupted; X2 -C (O) -O-, -C (O) -NH-, -NH- C (O) -NH- or -NH-C (S) -NH-; Xa represents rd ⁇ alkylene, more preferably C 2 -Ci2 alkylene; and X denotes a bond to an O, N or C atom of a nucleotide building block, or X * -OP (O) (OM) -O-, -NR-P (O) (OM) -O-, -OP (O) (OM) -NR- or -NR- P (O) (OM) -NR, - represents (Explanation
  • Suitable catalysts bound to the oligonucleotide are polypeptides (transferases / hydrolases), metal salts and metal complexes, the metals preferably being selected from the subgroups of the periodic table of the elements and the main group metals In, Tl, Sn, Pb and Bi.
  • suitable catalysts bound to the oligonucleotide are polypeptides (transferases / hydrolases), metal salts and metal complexes, the metals preferably being selected from the subgroups of the periodic table of the elements and the main group metals In, Tl, Sn, Pb and Bi.
  • Examples are scandium, yttrium, lanthanum, the lanthanide metals, Ti, Zr, Hf, V, Nb, Ta, Cr, Mo, W, Mn, Fe, Ru, Os, Co, Rh, Ir, Ni, Pd, Pt, Cu , Ag, Au, Zn, Cd and Hg.
  • Scandium, yttrium, lanthanum, the lanthanide metals, Cu and lead are preferred. Ce, Eu, Gd and Sm are preferred among the lanthanide metals.
  • the metals are preferably present as divalent or trivalent cations.
  • Suitable anions for the metal salts and metal complex salts can, for example, be selected from the following group: halide (for example CI ' , Br " and 0, the anion of an oxygen acid, BF 4 ' , PF 6 “ , SiF 6 “ and AsF 6 " .
  • the anions of oxygen acids can be, for example, sulfate, phosphate, perchlorate, perbromate, periodate, antimonate, arsenate, nitrate, carbonate, the anion of a d-Cs carboxylic acid such as, for example, formate, acetate, propionate, butyrate, benzoate, Phenyl acetate, mono-, di- or trichloro- or -fluoroacetate, sulfonates such as, for example, methyl sulfonate, ethyl sulfonate, propyl sulfonate, butyl sulfonate, trifluoromethyl sulfonate (triflate), optionally with C 1 -C 4 -alkyl, dC 4 -alkoxy or , especially fluorine, chlorine or bromine substituted phenyl sulfonate or benzyl sulfonate, such as for example to
  • the metal complex catalysts are preferably in the form of metal complex salts with heteroorganic compounds as complexing agents, the complexing agent attached to the oil gonucleotide is bound.
  • a large number of complexing agents are known. They can be open-chain or cyclic organic compounds with heteroatoms selected from the group O, S, N and P. Cyclic or polycyclic organic compounds with a total of 8 to 26, preferably 12 to 20 ring members and 2 to 12, preferably 4 to 12 and particularly preferably 6 to 12 heteroatoms are preferred. O and especially N are preferred among the heteroatoms.
  • complexing agents are crown ethers, cyanines, phthalocyanines, naphthalocyanines, porphyrins, phenantrolines, open and cyclized bis- and terpyridines, ethylenediaminetetraacetic acid and diethylenetriaminepentacetate.
  • the catalytically active oligonucleotides according to the invention are conjugates of the formula II,
  • A is a cyclic or polycyclic metal complex salt which is preferably bonded to B via C atoms and has a complexing agent which contains at least 12 ring atoms and at least 4 heteroatoms from the group N and O in the ring, on the divalent or trivalent metal ions selected from the group Scandium, yttrium, lanthanum and lanthanide metals are bound;
  • B stands for the bridge group of formula I and oligo means an oligonucleotide, the inner sequence of which is sometimes not complementary to a target RNA.
  • the complexing agent can contain up to 22, preferably 6 to 20, more preferably 12 to 20 and particularly preferably 14 to 20 ring atoms, the ring atoms, in addition to the hetero atoms, preferably being carbon atoms.
  • the number of heteroatoms N and / or O is preferably 4 to 12, particularly preferably 4 to 10, and very particularly preferably 4 to 8. With smaller ring sizes (for example 6 to 12 ring atoms), lower contents of heteroatoms are also preferred, to 4 to 8, more preferably 4 to 6.
  • This complexing agent preferably contains 2 to 4 pyridine groups and a further 4 N atoms in the ring.
  • Preferred metal ions are La, Ce, Nd, Eu and Gd.
  • Preferred anions in the metal complex salts are halide (CI “ , Br “ ), sulfate, nitrate, PF 6 " , acetate, methyl sulfonate, trifluoromethyl sulfonate, carbonate, hydrogen sulfate, hydrogen carbonate and perchlorate.
  • conjugates of the formula II are those of the formula III,
  • R 2 and R 7 independently of one another are H, C 1 -C 4 alkyl, C 1 -C 4 alkoxy, C 1 -C 2 aralkyl or C 6 -d 6 -
  • R3 and Re are, independently of one another, H, dC-alkyl, CrdrAralkyl or C 6 -C ⁇ 6 -aryl,
  • R4 represents H, Ci-C-jo-alkyl, C 5 -C 8 cycloalkyl, C 6 -C 12 aryl or C ⁇ -C 12 aralkyl,
  • Y represents an anion
  • n represents the numbers 2 or 3
  • m represents the numbers 1, 2 or 3, where the radicals alkyl, cycloalkyl, aralkyl and aryl are unsubstituted or with dC 4 alkoxy, F,
  • R 5 is a radical of the formula IV
  • R 2 , Ra, Re and R 7 preferably denote methyl or ethyl as alkyl, preferably alkoxy methoxy or ethoxy, preferably arylene benzylene or phenylethylene and preferably aryl naphthyl and especially benzyl.
  • R 2 and R 7 are H and R 3 and R 6 are alkyl.
  • R 2 , R 3 , Re and R 7 can also be C -C * ⁇ 2 - heteroaryl with O, S, N as heteroatoms.
  • Examples are pyrridyl, thiazolyl, imidazolyl, oxazolyl, furanosyl, pyrrolyl, thiophenyl. It can also be C 1 -C 4 -alkylthio, halide, di (dC 4 -alkyi) amino, sulfonamide and carboxamide.
  • Ri and R 5 as a substituent are preferably dC -alkyl, -C-C 4 -alkoxy, C ⁇ -C 12 -aralkyl or C 6 - C 16 -aryl, d-Cir-heteroaryl with O, S, N as heteroatoms, dC 4 -alkylthio , Di (dC - alkyl) amino, halide, sulfonamide and carboxamide.
  • Ri and R 5 are preferably bonded in the p-position to the N atom of the pyridine ring.
  • alkyl preferably contains 1 to 12, particularly preferably 1 to 8 and in particular 1 to 4 carbon atoms.
  • alkyl are methyl, ethyl and the isomers of propyl, butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl, undecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pentadecyl, hexadecyl, octadecyl, nonadecyl and eicosyl.
  • F preferably contains 5 or 6 ring carbon atoms as cycloalkyl.
  • cycloalkyl are cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyciohexyl, cyclopentyl and cycloctyl.
  • R as aryl is preferably naphthyl and especially phenyl. If R is aralkyl, it is preferably benzyl or phenylethyl.
  • a preferred subgroup for FU is H, -CC alkyl, especially methyl, and phenyl or benzyl.
  • R 1 or R 5 preferably denote methyl or ethyl as alkyl, preferably alkoxy methoxy or ethoxy, preferably naphthyl or phenyl as aryl, and preferably phenyl or phenylethyl as aralkyl.
  • R, or R 5 is preferably H, methyl, ethyl, methoxy or ethoxy.
  • a preferred subgroup of compounds of the formula III are those in which R 2 and R 7 are H, R 3 and R 6 are dC 4 alkyl, FU H, C 1 -C 4 alkyl, phenyl or benzyl, Rt represents the group Xi-X-rXa-p j x -Oligo and R 5 H, methyl or methoxy or R 5 represent the group Xi-XjrXa-PU oligo and R- * H, methyl or methoxy, Xi is a direct bond or Cz- Ce alkylene is, X 2 is -O-, -NH-, -C (O) -O-, -C (O) -NH-, -NH-C (O) -NH- or -HN- C (S ) -NH- means X3 represents C 2 -C 1; alkylene or phenylene, X4 represents a bond to an O, N or C atom of a nucleoside
  • Suitable transesterification or hydrolysis catalysts are also nucleases or nuclease fragments, basic polypeptides, amidine and guanidine derivatives, oligoamines and bisimidazoles. They can be bound to the oligonucleotide via the same bridge groups as the metal complexes.
  • Another object of the invention is a process for the preparation of oligonucleotides to which a transesterification or hydrolysis catalyst is bound, and the inner sequence of the oligonucleotide is sometimes not complementary to a natural one occurring target RNA, and the oligonucleotide is composed of natural deoxyribonucleic acid building blocks or of unnatural synthetic nucleotide building blocks, which is characterized in that a transesterification or hydrolysis catalyst which has a functional group attached to the backbone, with the functional group of a nucleotide building block or a functionally modified group of a nucleoside building block.
  • Examples of functional groups which are optionally bonded to the backbone via a bridging group Xi are OH, -SH, -NCO, -NCS, -CN, -O-CH 2 -OH, -NHR, -C (O) OR, -C (O) SH, -C (O) NHR, -C (O) Hal with shark equal to F, CI or Br, -C (S) SR, -C (S) NHR, -C (S) OR, - SO 3 R, -SO 2 NHR, -SO 2 CI, -P (O) (OH) 2 , -P (O) (OH) -NHR, -P (S) (SH) 2 , -P (S ) (SH) -NHR, - P (S) (OH) 2l -P (S) (OH) -NHR, -P (O) (SH) 2l -P (O) (SH) -NHR,
  • the process according to the invention for the production of the oligonucleotide conjugates can be carried out, for example, by dissolving an optionally functionalized oligonucleotide in a solvent or solvent mixture and then adding the transesterification or hydrolysis catalyst which carries a functional group and then reacting the reaction mixture, if appropriate, with stirring .
  • the conjugate formed can then be purified in a manner known per se and isolated if desired.
  • the reaction temperature can be, for example, 0 to 120 ° C, preferably 20 to 80 ° C.
  • the reaction is particularly preferably carried out at room temperature.
  • the linkage is an esterification, transesterification or amidation reaction
  • the corresponding cabonic acid groups are activated beforehand in a known manner, for example by reaction with carbodiimides and N-hydroxysuccinimide.
  • Suitable solvents are, for example, water and polar aprotic solvents, which are advantageously miscible with water.
  • solvents examples include alcohols (methanol, ethanol, n- or i-propanol, butanol, ethylene glycol, propylene glycol, ethylene glycol monomethyl ether, diethylene glycol, diethylene glycol monomethyl ether), ethers (diethyl ether, dibutyl ether, tetrahydrofuran, dioxane, ethylene glycol dimethyl ether, ethylene glycol ether) , Triethylene glycol dimethyl ether), halogenated hydrocarbons (methylene chloride, chloroform, 1, 2-dichloroethane, 1, 1, 1-trichloroethane, 1,1,2,2-tetrachloroethane, chlorobenzene), carboxylic acid esters and lactones (ethyl acetate, Methyl propionate, ethyl benzoate, 2-methoxyethyl acetate, ⁇ -butyrolactone, ⁇ -valerolactone, pivalolactone
  • the reactants are expediently used in molar ratios. However, an excess of the catalyst or oligonucleotide can be used.
  • HPLC High pressure liquid chromatography
  • reverse HPLC affinity chromatography
  • ion exchange chromatography chromatography
  • gel chromatography chromatography
  • the optionally functionalized oligonucleotides to be used can be produced in a manner known per se by means of automated synthesizers which are commercially available. Nucleosides for their synthesis are known, some of them are commercially available or can be produced by anological methods. Transesterification or hydrolysis catalysts with functional groups are known, some of them are commercially available or can be produced by known or anological methods.
  • the functionalized starting compounds with a basic structure of the formula III are new. They can be obtained by using a terpyridine of the formula V
  • the process can be carried out, for example, by dissolving the compounds of the formulas V, VI and VII in preferably equivalent amounts in a solvent and then reacting with one another at elevated temperatures.
  • Condensate tion catalysts used for example concentrated mineral acids, especially hydrochloric acid, or acidic ion exchangers. It may be expedient to add water-binding agents or to remove the water of reaction from the reaction mixture.
  • the reaction temperature can be, for example, 40 to 220 ° C, preferably 50 to 150 ° C.
  • Organic polar aprotic solvents are advantageously used as solvents. Such solvents have been mentioned previously.
  • the metal salts of formula VII are generally known and for the most part are commercially available.
  • oligonucleotides according to the invention are excellently suited for the, in particular, sequence-specific cleavage of RNA sequences, whereby only surprisingly low amounts have to be used due to their ability for catalytic activity.
  • Another object of the invention is a method for cleaving the phosphate nucleotide bridge of ribonucleic acids under physiological conditions and under the action of a synthetic transesterification and / or hydrolysis catalyst, which is characterized in that (a) the target RNA with an oligonucleotide complexed, the inner sequence of which is partially non-complementary to the target RNA, and to which a transesterification or hydrolysis catalyst is bound, and (b) then react and cleave.
  • the method according to the invention can be carried out in vivo by administration of the oligonucleotides or in vitro by combining a target RNA and an oligonucleotide to be used according to the invention.
  • Physiological conditions are familiar to the person skilled in the art and include, for example, carrying out the process in an aqueous medium and in a pH range from 5 to 9, preferably 5 to 8 and particularly preferably 5 to 7.5, it being possible for the aqueous medium to contain further inert constituents , for example salts of alkali metals or alkaline earth metals, and especially buffer systems.
  • the process can be carried out at a temperature of, for example, 0 to 100 ° C., preferably 20 to 50 ° C. and in particular 30 to 40 ° C.
  • the cleavage takes place during a transesterification of the phosphate bridge bond to form a fragment with a 2 ', 3 l -cyclic phosphate end group and a further fragment with a 5-hydroxyl end group.
  • the cyclic phosphate can then hydrolyze further.
  • the oligonucleotides according to the invention are used as medicaments.
  • the oligonucleotides according to the invention also have a high stability against degradation by nucleases. Their excellent pairing with complementary RNA-type nucleic acid strands is particularly surprising. In addition, they show an unexpectedly high cellular uptake.
  • the oligonucleotides according to the invention are therefore particularly suitable for antisense technology, ie for inhibiting the expression of undesired protein products by binding to suitable complementary nucleotide sequences of mRNA (EP266.099, WO 87/07300 and WO89 / 08146) .
  • oligonucleotide fragments produced according to the invention are also suitable as diagnostics and can be used as gene probes for the detection of viral infections or genetic diseases by selective interaction at the level of single or double-stranded nucleic acids ("gene probes").
  • Another object of the invention relates to the use of the oligonucleotides produced according to the invention as diagnostics for the detection of viral infections or genetically caused diseases.
  • Another object of the invention also relates to the oligonucleotides according to the invention for use in a therapeutic method for the treatment of diseases in warm-blooded animals, including humans, by inactivating nucleotide sequences in the body.
  • the dose when administered to warm-blooded animals of approximately 70 kg body weight can be, for example, 0.01 to 1000 mg per day.
  • Administration is preferably in the form of pharmaceutical preparations parenterally, for example intravenously or intraperitoneally.
  • aqueous solutions of a water-soluble active ingredient for example a water-soluble physiologically acceptable salt, or aqueous suspensions of such active ingredients which have viscosity-increasing agents such as sodium carboxymethyl cellulose, sorbitol and / or Contain dextran and optionally stabilizers.
  • the active ingredient optionally together with auxiliaries, can also be in the form of a lyophilisate and be brought into solution by adding suitable solvents before administration.
  • Another object of the invention relates to an aqueous composition and in particular a pharmaceutical preparation based on an aqueous solution or suspension, containing an effective amount of an oligonucleotide according to the invention alone or together with other active ingredients, water as a pharmaceutical carrier material, preferably in a significant amount and optionally auxiliary substances.
  • the pharmacologically active oligonucleotides according to the invention can be used in the form of parenterally administrable preparations or infusion solutions.
  • solutions are preferably isotonic aqueous solutions or suspensions, these being able to be prepared before use, for example in the case of lyophilized preparations which contain the active substance alone or together with a carrier material, for example mannitol.
  • the pharmaceutical preparations can be sterilized and / or contain auxiliaries, for example preservatives, stabilizers, wetting agents and / or emulsifiers, solubilizers, salts for regulating the osmotic pressure and / or buffers.
  • the pharmaceutical preparations if desired, contain further Pharmacologically active substances such as antibiotics can be produced in a manner known per se, for example by means of conventional solution or lyophilization processes, and contain about 0.1% to 90%, in particular from about 0.5% to about 30%, for example 1% to 5% active substance (s).
  • the conjugates according to the invention can also be used by inhalation or in a liposomal administration form.
  • the conjugates according to the invention can also be used for diagnostic purposes or as molecular biological aids as sequence-specific endoribonucleases.
  • FIG. 1 schematically shows a hybrid of a target RNA (line labeled "5 '") and an antisense oligonucleotide (line labeled "3'"), to which a complex (labeled "Ln") according to the invention is used as a transesterification - or hydrolysis catalyst is bound (so-called conjugate), the binding site of the complex being located within the antisense oligonucleotide sequence.
  • the numbering given relates to the nucleotide building blocks of the target RNA, the numbering being such that the nucleotide of the target RNA which is complementary to the nucleotide of the antisense oligonucleotide to which the complex is bound is referred to as "0" becomes.
  • the further numbering then takes place in ascending order (+1, +2 etc.) in the 3 'direction or descending order (-1, -2 etc.) in the 5' direction of the target RNA.
  • An unpaired nucleotide (due to the structure of the antisense oligonucleotide (several unpaired nucleotides can also occur)) on the target RNA is shown as a bulge and is in the present case, starting from position 0, in the 3 'direction (here: at position +2) on the target RNA.
  • FIG. 2 schematically shows a hybrid of a target RNA and an antisense-oligonucleotide conjugate according to the invention, an unpaired nucleotide starting from position 0 in the 5 'direction on the target RNA (in this case at position -2 ) is located. Otherwise, the definitions given for FIG. 1 apply accordingly.
  • FIG. 3 schematically shows a hybrid of a target RNA and an antisense-oligonucleotide conjugate according to the invention, in which the binding site of the complex is at the end of the antisense-oligonucleotide, and with an unpaired nucleotide starting from position 0 in 5 ' -Direction is located on the target RNA (in this case at position -3). Otherwise, the definitions given for FIG. 1 apply accordingly.
  • the following examples illustrate the invention.
  • the compounds a.1 R ⁇ phenyl-4-OCH 3 ; MS 317.7) and a.2 (Ri: phenyl-4-NO 2 ; MS 333.6) are prepared.
  • the compounds b.1 (Ri: phenyl-4-OCH 3 ; MS 497.1) and b.2 (R,: phenyl-4-NO 2 ; MS 512) are prepared.
  • Lithium aluminum hydride (22 mmol) is added in portions to a solution of titanium tetrachloride (30 mmol) in 75 ml of tetrahydrofuran (abs.) At room temperature under an argon atmosphere. The suspension obtained is stirred for 20 minutes at room temperature and then cooled to 0 ° C. The compound b.2 (10 mmol) is added and the suspension is stirred for 30 minutes at room temperature.
  • the compounds c.1 R phenyl-4-OCH 3 ; MS 427) and c.2 (Ri: phenyl-4-NH 2 ; MS 412.5) are prepared.
  • the methoxy compound c.1 (10 mmol) is suspended in 100 ml of chloroform and, with cooling with an ice bath, mixed with a 1 molar solution of boron tribromide (50 mmol) in methylene chloride for 20 minutes. The suspension is refluxed for 5 days. After cooling to room temperature, it is poured onto 300 ml of ice water and acidified with 200 ml of 2N aqueous hydrochloric acid. After extraction with ether (2 times), the aqueous phase adjusted to pH 9.0 with 10% aqueous sodium carbonate solution and stirred for 30 minutes. The precipitated product c.3 (R-, phenyl-4-OH; MS 413.5) is filtered off and dried in a high vacuum.
  • the CPG solid phase (1) carries the protected 3'-building block (in the example, dC) of the amino oligonucleotide to be synthesized.
  • the phosphoramidites (6), (7), (8) and (9) are used for the oligomerization.
  • the synthesis cycles are carried out with the Applied Biosystem 394 automatic synthesizer with one change (coupling time of the phosphoramidites of the deoxy series (6), (7), (8) and (9) is 2 minutes, that of the amidites (10) and (11) is 10 minutes, (12) is 5 minutes and (13) is 40 minutes; (13) is used 100 times in excess) according to the standard protocol of Applied Biosystem (User Manual Version 2.0 (1992) 1.0 ⁇ mol Cyclus, Appen. 1 -41).
  • T is thymine, (823) 5'-GTA GAC TGG CGA GAT * CGG CAG TCG GCT AG-3 ', where T *
  • T stands for thymine
  • 940 5'-GTA GAC TGG CGA GAT CGG CAG T * CG GCT AG-3 ', where T *
  • Example D1 Preparation of conjugates in which the oligonucleotide is bound to the terpyridine part of the lanthanide complex
  • the product is by reverse phase HPLC (gradient: from 0% to 30% acetonitrile in 0.05 M triethylammonium acetate in 90 minutes) on a Nucleosil / -C ⁇ B column or by ion exchange HPLC (gradient: 10 minutes 20% of a 1st M potassium chloride solution and 80% of a 20 mM potassium phosphate solution pH 6.0, which contains 20% acetonitrile; then within 60 minutes on 80% potassium chloride solution) at 60 ° C on a PVDI.4000A column, 5 ⁇ m gives the pure conjugates 3.1 to 3.13, 3.18 and 3.21 of table 3.
  • reverse phase HPLC gradient: from 0% to 30% acetonitrile in 0.05 M triethylammonium acetate in 90 minutes
  • ion exchange HPLC gradient: 10 minutes 20% of a 1st M potassium chloride solution and 80% of a 20 mM potassium phosphate solution pH 6.0, which contains 20% acetonitrile
  • Example D2 Preparation of conjugates in which the oligonucleotide is bound to the pyridine part of the lanthanide complex
  • Ph-691 -phenyl-N (H) C (S) -oligo 691
  • Ph-821 -phenyl-N (H) C (S) -oligo 821
  • Ph-823 -phenyl-N (H) C (S) -oligo 823
  • A-691 -CH 2 CH 2 C (O) -oligo 691
  • A-821 -CH 2 CH 2 C (O) -oligo 821
  • A-823 -CH 2 CH 2 C (O) -oligo 823
  • A-940 -CH 2 CH 2 C (O) -oligo 940
  • target RNA is mostly chimeric molecules, some of which consist of deoxyribonucleic acid (DNA) building blocks (labeled “d”) and some of ribonucleic acid (RNA) building blocks (with “r “designated) exist.
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • RNA ribonucleic acid
  • CPG 'controied pore glass'
  • (1) carries the protected 3'-building block (in the example, rC) of the RNA to be synthesized.
  • the phosphoramidites (2) to (9) are used for the oligomerization.
  • the synthesis cycles are carried out with the Applied Biosystem 394 automatic synthesizer with one change (coupling time of the phosphoramidites of the ribo series is 10 minutes) according to the standard protocol of the Applied Biosystem company (User Manual Version 2.0 (1992) 1.0 ⁇ mol Cyclus, Appen. 1-41).
  • reagents are: 0.1 M phosphoramidite tetrazole / acetonitrile: 4%, 96% tert-butylphenoxyacetic anhydride / pyridine / tetrahydrofuran: 10%, 10%, 80% N-methylimidazole / tetrahydrofuran: 16%, 84% trichloroacetic acid / dimethylchloromethane: 2%, 98% iodine / water / pyridine / tetrahydrofuran: 3%, 2%, 20%, 75%.
  • RNA-E1 The following substrate RNA is synthesized: title RNA-E1
  • TDMS tertiary-butyl-dimethylsilyl
  • RNA is mixed with 50 mM triethylamine hydrogen carbonate (TAHC) solution pH 7.0 (1 + 1) and dialyzed directly at 4 ° C. (Water is Nanopure quality)
  • TAHC triethylamine hydrogen carbonate
  • Dialysis Dialysis is carried out 3 times against 7.5 mM TAHC solution pH 7.0. (The solution is prepared with Nanopure quality water, adjusted to pH 7.0 with CO 2 and pre-cooled to 4 ° C.) The sample is lyophilized and treated with diethyl pyrocarbonate [Sambrook, Fritsch, Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Laboratory Press (1989)] and autoclaved H 2 O (DEPC-H 2 O). An aliquot is used to determine the concentration at 260 nm. When dealing with RNA, RNase and foreign metal ions are always used.
  • the reaction solution contains 0.5 ⁇ l T4 polynucleotide kinase (Promega, 10 units / ⁇ l), 2 ⁇ l kinase buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl 2 , 5 mM 1.4 dithio-DL-threitol, 0.1 mM spermidine) and 0.5 ⁇ l ⁇ [P] ⁇ -ATP (Amersham,> 1000 Ci / mmol, 10 ⁇ Ci / ⁇ l).
  • Tris-HCl / EDTA (10 mM / 1 mM, pH 7.5), 2 ⁇ l glycogen (35 mg / ml) and 40 ⁇ l NH CH 3 COO (10 M) are then added. After adding 600 ⁇ l of ethanol, the sample is cooled at -20 ° C. for 30 minutes and then centrifuged at 4 ° C. for 20 minutes.
  • the pellet is lyophilized, 15 ⁇ l application buffer (0.025% bromophenol blue, 0.025% xylene-cylanol in a 1: 1 mixture of 80% formamide and 7 M urea, 20 mM citric acid, 1 mM EDTA) is added for 1 minute at a temperature of 95 ° C denatured, immediately placed on ice and applied to a 1.0 cm x 1 mm pocket for gel electrophoretic separation. The gel electrophoretic separation is carried out at 55 watts for 2.5 hours after a run of 40 minutes at 55 watts.
  • the polymerization is started with 170 ⁇ l ammonium peroxydisulfate solution (25% w / v) and 170 ⁇ l TEMED (N, N, N ', N', tetramethylethylenediamine).
  • the gel can be used after 1 hour.
  • a 10-fold diluted TBE buffer is used as the running buffer.
  • RNA is detected using an X-ray film and cut out of the gel.
  • the RNA is eluted from the gel piece with an application of 100 V (3.3 V / cm) in an electrical apparatus (Schleicher and Schuell). 10 times diluted TBE buffer is used as the elution buffer.
  • the isolated RNA in 360 ⁇ l eluate is mixed with 40 ⁇ l NaCH 3 COO (3M pH 5.2) and 1 ml ethanol.
  • the sample is cooled at -20 ° C for 20 minutes and then centrifuged at 4 ° C for 20 minutes.
  • the pellet is taken up lyophilized with 30 ⁇ l H 2 O.
  • the solution is measured according to the Czerenkow protocol in the scintillation counter and set to 12000 cpm / ⁇ l.
  • RNA-E2 The procedure is as in Example E1 and the target RNA "RNA-E2" is produced with the following sequence:
  • CTA GCC GAC TG 5'd (CTA GCC GAC TG) r (CCG AUC UCA AG) d (CCA GTC TAC).
  • Example E1 Analogously to Example E1, further target RNA molecules E3 to E30 and a target DNA molecule E31 are produced, the structures of which are shown in Chapter F in Tables 4, 6 and 8.
  • a 12% Long Ranger 7 gel (AT Biochem, modified polyacrylamide gel) (0.4 mm x 30 cm x 40 cm) is prepared for the gel electrophoretic separation and identification of the RNA products after the cleavage reaction.
  • the polymerization reaction is carried out in 90 ml.
  • 11 ml of TBE buffer (0.89 M tris (hydroxymethyl) aminomethane, 0.89 M boric acid, 0.02 M ethylenediaminetetraacetic acid) and 37 g of urea are mixed with the corresponding amount of H 2 O. .
  • the polymerization is started with 450 ⁇ l ammonium peroxydisulfate solution (10% w / v) and 45 ⁇ l TEMED.
  • the gel can be used after 1 h. 16.66 times diluted TBE buffer is used as the running buffer.
  • the separation takes place within 75 minutes at 60 watts.
  • the labeled cleavage products are detected or counted using an X-ray film or using a phosphorimager.
  • the cleavage reaction is carried out in a volume of 10 ⁇ l.
  • 1 ⁇ l oligonucleotide conjugate (10 ⁇ M) or corresponding dilutions (final concentration 1 ⁇ M, 750 nM, 500 nm, 250 nM, 100 nM, 50 nM, 10 nM, 1 nM and 0.5) are added to 1 ⁇ l substrate RNA (12000 cpm) nM), 4 ⁇ l Tris-HCl buffer (50 mM pH 7.4 at 37 ° C.) and the corresponding amount of H 2 O are pipetted in. This mixture is heated to 85 ° C. for 1 minute and then incubated at 37 ° C. for 16 hours.
  • the reaction is terminated by adding 5 ⁇ l application buffer (0.025% bromophenol blue, 0.025% xylene-cylanol in a 1: 1 mixture of 80% formamide with 7 M urea, 20 mM citric acid and 1 mM EDTA).
  • application buffer 0.025% bromophenol blue, 0.025% xylene-cylanol in a 1: 1 mixture of 80% formamide with 7 M urea, 20 mM citric acid and 1 mM EDTA.
  • 7.5 ⁇ l of the sample are denatured for 1 minute at 95 ° C., immediately placed on ice and placed in a gel pocket.
  • 1 ⁇ l oligonucleotide conjugate (10 ⁇ M), 4 ⁇ l Tris-HCl buffer (50 mM pH 7.4 at 37 ° C.) and the corresponding amount of H 2 O are pipetted into 1 ⁇ l substrate RNA / DNA (12000 cpm).
  • This mixture is heated to 85 ° C. for 1 minute and then incubated at 37 ° C. for 2 hours, 8 hours, 16 hours, 40 hours and 64 hours.
  • the reaction is terminated by adding 5 ⁇ l application buffer (0.025% bromophenol blue, 0.025% xylene-cylanol in a 1: 1 mixture of 80% formamide with 7 M urea, 20 mM citric acid and 1 mM EDTA).
  • 5 ⁇ l application buffer 0.025% bromophenol blue, 0.025% xylene-cylanol in a 1: 1 mixture of 80% formamide with 7 M urea, 20 mM citric acid and 1 mM EDTA
  • the substrate-RNA concentration is estimated as a 25-fold excess as follows: With 100 pmol of crude product of RNA and a yield of 10% in gel cleaning, according to the protocol described, the final concentrations of 0.04 ⁇ M of substrate RNA and 1 ⁇ M are found Oligonucleotide conjugate in the reaction mixture. If only the terpyridine-lanthanide complex is used as a comparison, 400 ⁇ M complex are required to achieve approximately the same cleavage as 40 nM oligonucleotide conjugate. This is a 10,000-fold excess of complex to oligonucleotide conjugate. The concentration series can be cleaved by 40 ⁇ M substrate RNA / DNA with 40 nM
  • Oligonucleotide conjugate can be demonstrated after 16h at 37 ° C.
  • Example E1 The procedure is as in Example E1 using compound 3.20 from Table 3 and the target RNA RNA-E2.
  • TAC TAC
  • the structures of the target RNAs used are shown in Table 4 below.
  • Bold nucleotides are complementary to that nucleotide of the antisene-oligonucleotide conjugate to which the complex is bound.
  • Underlined nucleotides are unpaired in the hybrid of target RNA and conjugate (mismatch).
  • Double underlining for the target RNA E17 means that 2 adjacent nucleotides in the underlined area are unpaired based on the selected sequence, without it being possible to clearly determine which nucleotides are involved.
  • the position of the conjugate, in particular of the complex, in relation to the target RNAs is also shown schematically.
  • the cleavage procedure is as in Example F1, the antisense-oligonucleotide conjugates shown in Table 5 below (see also Table 3) and target RNAs (see Table 4) being used.
  • the main cleavage products of the respective target RNA are shown in Table 5.
  • the indication “+ 5A” when the target RNA E2 is cleaved by conjugate 3.22 means that cleavage takes place between the nucleotides + 5A and + 6A.
  • Table 5 Main cleavage products of the cleavage of different target RNAs by different antisense-oligonucleotide conjugates
  • the cleavage procedure is as in Example F1, the antisense-oligonucleotide conjugates shown in Table 7 below (see also Table 3) and target RNAs (see Table 6) being used.
  • the main cleavage products of the respective target RNA are shown in Table 7 (see also explanation of Table 5).
  • Table 7 Main cleavage products of the cleavage of various target RNAs by an antisense-oligonucleotide conjugate
  • Table 8 Structures of different target RNAs
  • the cleavage procedure is as in Example F1, the antisense-oligonucleotide conjugates shown in Table 9 below (see also Table 3) and target RNAs (see Table 8) being used.
  • the main cleavage products of the respective target RNA are shown in Table 9 (see also explanation of Table 5).
  • Table 9 Main cleavage products of the cleavage of different target RNAs by different antisense-oligonucleotide conjugates:

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Abstract

Oligonukleotid, das dadurch gekennzeichnet ist, dass an das Oligonukleotid ein Umesterungs- oder Hydrolysekatalysator gebunden ist, und die innere Sequenz des Oligonukleotids teilweise nicht komplementär zu einer natürlich vorkommenden Ziel-RNA ist, und das Oligonukleotid aus Desoxyribonukleinsäurebausteinen, unnatürlichen synthetischen Nukleotidbausteinen, oder Peptidnukleinsäuren aufgebaut ist. Die Oligonukleotide eignen sich hervorragend zur Spaltung einer komplementären Ziel-RNA, wobei das Oligonukleotid nach der Spaltung wieder freigesetzt wird und daher katalytische Wirkung entfaltet.

Description

Oliqonukleotidkoniuqate. Zusammensetzungen und Verfahren zur Spaltung von Ribonuk¬ leinsäuren.
Die vorliegende Erfindung betrifft Oligonukieotidkonjugate mit Umesterungs- oder Hy- drolysekatalysatoren, deren Oligonukleotidsequenz teilweise nicht komplementär zu einer natürlich vorkommenden Ziel-Ribonukleinsäure (Ziel-RNA) ist; ein Verfahren zur se¬ quenzspezifischen Spaltung einer Ziel-RNA unter physiologischen Bedingungen und unter Einwirkung des Oligonukleotidassoziats; eine Zusammensetzung aus einem inerten Trä¬ germaterial und dem Oligonukleotidassoziat; sowie dessen Verwendung.
Die hydrolytische Spaltung von RNA-Monosträngen unter der katalytischen Einwirkung von Metallionen ist schon seit längerem bekannt. Die Spaltung erfolgt grundsätzlich in un- gepaarten Bereichen der RNA, die in englisch als "loops" bezeichnet werden. W. J. Krzy- zosiak et al. schlagen hierfür in Biochemistry, Band 27, Seiten 5771 bis 5777 (1988) die Verwendung von Bleidiacetat vor. G. J. Murakawa et al. beschreiben in Nucieic Acid Re¬ search, Band 17, Seiten 5361 bis 5375 (1989) den Einsatz von Kupferkomplexen des 1 ,10- Phenantrolins. J. Ciesiolka et al. offenbart in Eur. J. Biochem. Band 182, Seiten 445 bis 450 (1989) Europiumtrichlorid für den gleichen Verwendungszweck zur Spaltung von tRNAPhβ. C. S. Chow et al. verwenden in J. Am. Chem. Soc, Band 112, Seiten 2839 bis 2841 (1990) für die gleiche RNS Ruthenium- und Rhodium-Komplexe mit Phenantrolinliganden. In Biochemistry, Band 29, Seiten 2515 bis 2523 erwähnen L S. Behlen et al. tRNAphβ Mutanten mit Bleidiacetat. Ferner beschreiben N. Hayashi et al. in Inorg. Chem., Band 32, Seiten 5899 bis 5900 (1993), dass für die Spaltung von tRNA auch Lanthanid- metallkomplexe geeignet sind.
L. S. Kappen et al. beschreiben in Biochemistry, Band 32, Seiten 13138 bis 13145 (1993), dass bei der oxidativen Spaltung von ein- oder doppelsträngiger DNA mit Neocarzinostatin dann eine stetlungsspezifische Spaltung erfolgt, wenn zum Beispiel ungepaarte Bereiche zu einer Ausbuchtung in einem DNA-Strang führen. D. Williams et al. offenbaren in Nucieic Acids Research, Band 16, Seiten 11607 bis 11615 (1988), dass bei der hydrolytischen Reaktion von doppelsträngiger DNA mit Kupferphenantrolin die Spaltung bevorzugt an Stellen stattfindet, die zusätzlich ein ungepaartes Cytidin in der Kette enthalten. ln der DE-A-2451 358 wird schon beschrieben, dass bei der nachgeahmten Produktion von Interferon mit einem doppelsträngigen (rln.rCn)-Komplex die Toxizität unter Erhalt der Interferonproduktion vermindert wird, wenn man durch die Modifikation der rCn-Kette für strukturelle Störungen sorgt, so dass die rCn-Kette in den Zellen leichter durch Nucleasen hydrolysiert wird. Als strukturelle Störung wird die Einführung eines Nukleotids vorgeschlagen, das die Paarbildung im Komplex verhindert. Es ist noch zu erwähnen, dass K. A. Kolasa in Inorg. Chem., Band 32, Seiten 3983 bis 3984 (1993) darauf hinweisen, dass RNA in DNA-RNA Hybriden durch trivalente Lanthanidionen nicht gespalten werden.
Es ist ferner von D. Magda et al. im J. Am. Chem. Soc, Band 116, 7439 bis 7440 (1994) beschrieben worden, dass Konjugate aus Europium(lll)-Texaphyrin und Oligonukleotiden mit DNA-Bausteinen eine Ziel-RNA zu spalten vermögen, wobei im Bereich des Texaphyrin- Komplexes in dem RNA/Oligonukleotid-Komplex eine vermehrte Spaltung von lediglich etwa 30 % beobachtet wird. Nachteilig bei diesen Texaphyrin-Komplexen ist auch, dass zusätzlich Hydroxypropyl im Liganden gebunden sein müssen, damit eine ausreichende Löslichkeit gewährleistet ist. Femer sind die Imingruppen des Liganden hydrolyseanfällig, so dass die Wirksamkeit in wässriger Umgebung relativ schnell nachlässt, beziehungsweise eine zu geringe Verweilzeit bei therapeutischer Anwendung besteht. Durch die Hydrolyse des Liganden wird zudem das Metall frei gesetzt, was ernsthafte toxische Probleme und unspezifische Spaltungen von RNA hervorrufen kann. Femer sind es schwache Lewissäuren, weil eine Ladung des Eu-Kations durch einen Liganden neutralisiert wird und daher ein zweifach geladener Komplex vor liegt. Die beschriebenen Komplexe sind zudem nur durch synthetisch aufwendige Verfahren zugänglich.
Die WO 94/29316 offenbart ein Verfahren zur Phosphatester-Hydrolyse unter Verwendung von Konjugaten aus einem Oligonukleotid mit einem Texaphyrin-Metall-Komplex. In einem Beispiel sind Konjugate beschrieben, die als Metall Dysprosium(lll) enthalten, und deren Oligonukleotidsequenz so gewählt ist, dass die Bindung der Oligonukleotidsequenz an eine Ziel-RNA bei dieser einen "Loop" aus einem oder mehreren Nukleotiden verursacht.
Es ist bekannt, dass in Zellen das Entstehen von physiologisch schädlichen Polypeptiden durch die von Genen gesteuerte Bildung von mRNA erfolgt. Zur Bekämpfung bzw. Ver¬ hinderung von Krankheiten sind daher Mittel wünschenswert, die die Wirkung der mRNA verhindern. Im besonderen soll erreicht werden, dass durch irreversible Spaltung an definierter Stelle die m-RNA zerstört wird, und damit der Informationsgehalt verloren geht. Es ist ferner wünschenswert, durch eine sequenzspezifische Spaltung von RNA-Ketten Bruchstücke bereitzustellen, die man zur schnelleren Identifikation von geeigneten Oligonukleotiden im "Antisense-Gebiet" für diagnostische Zwecke (Biosensoren) oder für die Therapie von Krankheiten unter Beeinflussung von Stoffwechselvorgängen in der Zelle verwenden kann.
An die oben erwähnten Mittel werden hohe Anforderungen gestellt. Sie müssen spezifisch mit einer Ziel-RNA hybridisieren und dürfen andere vorhandene DNA- und/oder RNA-- Moleküle nicht beeinflussen. Insbesondere müssen sie schon in kleinen Mengen hoch¬ wirksam sein, und sie müssen stabil sein gegenüber einem durch körpereigene Abwehr¬ stoffe (wie zum Beispiel Nukleasen) verursachten Abbau.
Es wurde nun gefunden, dass Oligonukleotide, deren Sequenz nur teilweise komplementär zu einer Ziel-RNA ist und an die ein Umesterungskatalysator oder Hydrolysekatalysator gebunden ist, hoch wirksam sind und man sogar sequenzspezifische Spaltungen in einer Ziel-RNA erzielen kann. Es wurde ferner gefunden, dass man unter vergleichbaren Reak¬ tionsbedingungen erheblich weniger an Oligonukleotid-Umesterungskatalysator benötigt als freien, also nicht an ein Oligonukleotid gebundenen Umesterungskatalysator. Durch die Spaltung der Ziel-RNA im Doppelstrangbereich wird die Instabilität des RNA/Oligonukleotid- Komplexes nach der Spaltung der RNA stark erhöht und erleichtert den Zerfall in die freien RNA-Bruchstücke und das freie Konjugat aus Oligonukleotid und Hydrolyse¬ beziehungsweise Umesterungskatalysator. Hierdurch kann das Konjugat katalytische Aktivität entfalten und die Einsatzmengen können erheblich erniedrigt werden.
Ein Gegenstand der Erfindung ist ein Oligonukleotid aus Desoxyribonuklnukleotiden (NA), unnatürlichen synthetischen Nukleotiden, oder Peptidnukleinsäuren PNA, das dadurch gekennzeichnet ist, dass an das Oligonukleotid ein Umesterungs- oder Hydrolysekatalysator gebunden ist, und die innere Sequenz des Oligonukletoids teilweise nicht komplementär zu einer natürlich vorkommenden Ziel-RNA ist.
Ziel-RNA bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass im Target eine RNA-Se- quenz vorliegen muss. Demgemäss können Polyribonukleinsäuren (RNA) vorliegen. Bevorzugt handelt es sich um m-RNA (Boten-RNA), pre-m-RNA (Vorlauf er-m-RNA) t-RNA Transfer-RNA), sn-RNA (small nuclear RNA), r-RNA (ribosomale RNA) und virale RNA. Es können aber auch Mischsequenzen aus RNA und Polydesoxyribonukleinsäuren (DNA) vorliegen, zum Beispiel die Chimären RNA-DNA (Okazaki-Fragment). Die RNA weist soviele Bausteine auf, dass ein Komplex (Doppelstrang) mit dem Oligonukleotid gebildet werden kann.
Teilweise nicht komplementär bedeutet im Rahmen der Erfindung, dass die Sequenz des Oligonukleotids eine strukturelle Störung enthält, so dass keine Basenpaarung mit entspre¬ chenden Nukleotidbausteinen der Ziel-RNA erfolgt (zum Beispiel bedeutet Basenpaarung die folgenden komplementären Nukleoside in der Ziel-RNA und im Oligonukleotid: A-U, T/U- A, G-C und C-G). In einer Ausführungsform fehlen in der zur Ziel-RNA sonst kom¬ plementären Sequenz des Oligonukleotids ein oder mehrere aufeinanderfolgende Nukleo- tidbausteine. Hierdurch bildet sich in der Ziel-RNA eine Ausbuchtung, die besonders um- esterungs- und/oder hydrolyse-instabii ist. In einer anderen Ausführungsform enthält das Oligonukleotid ein oder mehrere aufeinanderfolgende Nukleotidbausteine, die mit den entsprechenden Nukleotidbausteinen der Ziel-RNA keine Paarbildung eingehen. Die RNA ist durch die Strukturstörung in der Doppelhelix in diesen Bereichen instabil gegenüber Umesterungs- und/oder Hydrolysereaktionen. Bevorzugt fehlen im Oligonukleotid 1 bis 10, besonders bevorzugt 1 bis 4 und ganz besonders bevorzugt 1 oder 2 aufeinanderfolgende Nukleotide. In einer anderen Ausführungsform sind in dem Oligonukleotid 1 bis 10, besonders bevorzugt 1 bis 4 und ganz besonders bevorzugt 1 oder 2 aufeinanderfolgende nichtpaarende Nukleotidbausteine enthalten (im Englischen bezeichnet diese strukturellen Störungen als mismatch und infernal loop).
Im Rahmen der Erfindung bedeutet innere Sequenz, dass zum Beispiel bis zu 10, vorzugs¬ weise bis zu 5, besonders bevorzugt bis zu 3 und ganz besonders bevorzugt 1 oder 2 der äusseren Nukleotidbausteine der Sequenz nicht mit der Ziel-RNA komplementär sein müssen. Dies kann insofern von Vorteil sein, als ein am Ende einer Sequenz gebundener Umesterungs- oder Hydrolysekatalysator beweglicher und damit effizienter sein kann.
Das Oligonukleotid kann teilweise oder vollständig aus zur Ziel-RNA komplementären natürlichen DNA-Bausteinen oder vollständig aus zur Ziel-RNA ebenfalls komplementären unnatürlichen synthetischen Nukleotiden aufgebaut sein, wobei teilweise bedeutet, dass in der Oligonukleotidsequenz zur Ziel-RNA komplementäre natürliche DNA-Bausteine durch ebenfalls komplementäre unnatürliche synthetische Nukleotide ersetzt sind. Synthetische Bausteine umfassen die Modifikationen natürlicher Bausteine in der Nukleinbase, dem Furanosering und/oder den Brückengruppen der Oligonukleotide. Synthetische Bausteine werden im allgemeinen eingesetzt, um die Komplexbindung in Duplexstrukturen zu verstärken und/oder die Stabilität der Oligonukleotide gegenüber dem durch zum Beispiel Nukleasen verursachten Abbau zu erhöhen. Modifizierte Nukleoside sind im Bereich der "Antisense-Technologie" für die Synthese oder Modifikation von komplementären Oligonukleotiden in grosser Vielzahl bekannt geworden und werden daher hier nicht näher erläutert (siehe zum Beispiel E. Uhlmann et al., Chemical Reviews, Band 90, Nummer 4, Seiten 543 bis 584 (1990).
Als Modifikationen kommen Abwandlungen im Nukleinbaseteil (zum Beispiel Substitutionen, Weglassen von Substituenten), in der Nukieotidbrückengruppe (zum Beispiel Abwandlung der Phosphorsäureestergruppe oder deren Ersatz durch andere Brückengruppen) und im Furanosering (zum Beispiel Substitutionen an der 2'-Hydroxylgruppe, Ersatz des Furanose- O-Atoms, Ersatz des Furanoserings durch mono- oder bicarbacycliche Ringe, Ersatz des Furanoserings durch offenkettige Strukturen) in Frage.
Die Wahl und die Reihenfolge der Bausteine in der Sequenz des Oligonukleotids wird durch die notwendige Duplexbildung mit einer Ziel-RNA bestimmt. Auch die Art und der Ort der Verknüpfung mit dem Katalysator kann die Wahl und die Reihenfolge der Bausteine beeinflussen.
Bei den nicht-paarenden Nukleotiden kann es sich um natürliche Nukleotide handeln, die so ausgewählt werden, dass sie nicht-komplementär zu Nukleotiden in der Ziel-RNA sind (entsprechend der Watson/Crick-Definition zum Beispiel Paare wie A-A, U-U, A-G, A-C, G- T, T-U). Bei den nicht-paarenden Nukleotiden kann es sich aber auch um unnatürliche, synthetische Nukleotide handeln. Diese Nukleotide können an der Nukleotidbase, der Nukleotidphosphorsäureesterbrücke oder dem Furanosering modifiziert sein. Derartige modifizierte und synthetische, nicht-komplementäre Bausteine sind in grosser Vielzahl bekannt geworden und sind dem Fachmann geläufig. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Oligonukleotid aus unnatürlichen komplementären Nukleotiden aufgebaut, wobei das Oligonukleotid besonders bevorzugt auch nicht-komplementäre unnatürliche Bausteine enthält. Die Anzahl der Bausteine in dem Oligonukleotid wird so bemessen, dass eine Hybridisie¬ rung mit der Ziel-RNA erfolgt. Die Oligonukleotide können zum Beispiel 5 bis 100, bevorzugt 5 bis 50, besonders bevorzugt 8 bis 30 und ganz besonders 10 bis 25 Bausteine enthalten. Die Bereiche, die die Paarbildung mit der Ziel-RNA verhindern (fehlende beziehungsweise nicht-paarende Nukleotidbausteine), sind bevorzugt in den mittleren Sequenzfolgen des Oligonukleotids angeordnet, zum Beispiel zwischen den jeweils viertletzten, oder den jeweils drittletzten, oder den jeweils zweitletzten oder den jeweils letzten Bausteinen der Sequenz. Bei einem Oligonukleotid mit zum Beispiel 20 Bausteinen fehlen oder befinden sich nicht-paarende Bausteine bevorzugt im Bereich vom vierten bis siebzehnten Baustein. Erfindungsgemäss bevorzugte Oligonukleotide sind solche, in denen Nukleotide fehlen.
Die Oligonukleotide sind bevorzugt aus Nukleosiden der Purinreihe und der Pyrimidinreihe aufgebaut. Besonders bevorzugt aus 2'-Desoxy-2-aminoadenosin, 2'-Desoxy-5- methylcytidin, 2'-Desoxyadenosin, 2'-Desoxycytidin, 2'-Desoxyuridin, 2'-Desoxyguanosin und 2'-Thymidin. Ganz besonders bevorzugt sind 2'-Desoxyadenosin (A), 2-Desoxycytidin (C), 2'-Desoxyguanosin (G) und 2'-Thymidin (T). Modifizierte Bausteine leiten sich bevorzugt von natürlichen Nukleosiden der Purinreihe und der Pyrimidinreihe, besonders bevorzugt von Adenosin, Cytidin, Guanosin, 2-Aminoadenosin, 5-Methylcytosin, Thymidin und den zuvor genannten Desoxyderivaten ab. Bei den Nukleosiden kann es sich auch um 2'-modifizierte Ribonukleoside handeln.
In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das zu einer Ziel- RNA teilweise komplementäre Oligonukleotid aus (1) natürlichen Desoxynukleosiden, besonders bevorzugt aus der Gruppe 2'-Desoxyadenosin (A), 2'-Desoxycytidin (C), 2'- Desoxyguanosin (G), und 2'-Thymidin (T) oder aus komplementären unnatürlichen synthetischen Bausteinen aufgebaut, und (2) die nur teilweise komplementäre Eigenschaft wird durch das Fehlen von bevorzugt 1 bis 4, besonders bevorzugt 1 bis 3 und ins¬ besondere bevorzugt 1 oder 2 Bausteinen in der sonst komplementären Sequenz erzeugt. Im Rahmen der Erfindung sind solche modifizierten Nukleoside besonders bevorzugt, die die Stabilität des Oligonukleotids gegenüber Nukleasen erhöhen. Das Oligonukleotid kann auch aus Sequenzen von Peptidnukleinsäuren (PNA) bestehen, wobei der Katalysator bevorzugt an die Nukleinbase, das Amino- oder das Carboxylende gebunden ist. Die Nukleinbasen sind an die Amid-N-Atome der Peptidsequenz gebunden. Die komplementäre Sequenz kann aus natürlichen oder unnatürlichen synthetischen Aminosäurebausteinen bestehen, wobei die nicht-komplementäre Eigenschaft wie zuvor beschrieben durch Weglassen von Bausteinen oder durch den Einbau von nicht¬ komplementären Bausteinen erzielt werden kann. Für den Aufbau der PNA-Sequenz gelten die gleichen Bevorzugungen wie für die Oligonukleotide. Beispiele für PNA's finden sich in Science, Band 254, Seiten1497 bis 1500.
Ein Umesterungs- und/oder Hydrolysekatalysator kann gegebenenfalls über eine Brücken¬ gruppe an N-, -S- oder O-Atome in den 3'- oder 5'-Endgruppen in der Oligonukleotidse¬ quenz gebunden sein. Die Katalysatoren können aber auch an C, N- oder O-Atome von Nukleinbasen in oder am Ende der Sequenz, an 2'-Stellungen des Furanoserings an O-, S- oder N-Atome in oder am Ende der Sequenz oder an O-, S- oder N-Atome der Nukleotid- brückengruppe in der Sequenz gebunden sein. Die Art der Bindung hängt vom Katalysa¬ tortyp und der Art seiner funktioneilen Gruppen ab. Ein Katalysatormolekül kann zum Beispiel direkt oder über eine Brückengruppe an das Oligonukleotid gebunden sein. Eine Brückengruppe kann zum Beispiel eine umgewandelte funktioneile Gruppe sein, die ihrer¬ seits direkt oder über eine Verbindungsgruppe an den Katalysator und/oder das Oligonuk¬ leotid gebunden sein kann. Die Bindung an das Oligonukleotid kann ionogen und bevorzugt kovalent sein. Die Katalysatoren können auch an das 6'-Kohlenstoffatom eines carbacyclischen Nukleotidanalogen gebunden sein.
Die Brückengruppe kann zum Beispiel bevorzugt der Formel I entsprechen,
worin X1 eine direkte Bindung oder eine bivalente, offenkettige oder cyclische Kohlen¬ wasserstoffgruppe mit 1 bis 22 C-Atomen, die ununterbrochen oder mit Resten aus der Gruppe -S-, -NR-, -C(O)-O-, -C(O)-NR- unterbrochen ist, oder einen Polyoxaalkylenrest mit 1 bis 12 Oxaalkyleneinheiten und 2 oder 3 C-Atomen im Alkylen bedeutet; X2 -O-, -S-, -NR-, -NH-C(O)-NH-, -NH-C(S)-NH-, -O-C(O)-NH-, -NH-C(O)-O-, -O-C(O)-O-, -C(O)-O-, -C(S)-O-, - O-C(O)-, -O-C(S)-, -C(O)-NR-, -RN-C(O)-, -S(O)-O-, -O-S(O) , -S(O)2-NR-, -NR-S(O)-, - P(O)-(OM)-O-, -O-P(O)-(OM)-, -P(O)-(OM)-NR-, -NR-P(O)-(OM)-, -PH(O)-O-, -O-PH(O)-, - PH(O)-NR- und -NR-PH(O)- darstellt; Xa unabhängig die Bedeutung von Xi hat und x gleich
0 ist, wenn Xa eine direkte Bindung darstellt; X» eine Bindung an ein O-, N- oder C-Atom eines Nukleosidbausteins bedeutet, oder X< -O-P(O)(OM)-O-, -NR-P(O)(OM)-O-, -O- P(O)(OM)-NR- oder -NR-P(O)(OM)-NR- darstellt, wenn x gleich 1 ist und Xa keine direkte Bindung ist; R H, d-Ce-Alkyl, Phenyl oder Benzyl bedeutet; M für H, Ci-Ce-Alkyl, Phenyl oder Benzyl, ein Alkalimetallkation oder ein Ammoniumkation steht; und x für 0 oder 1 steht.
X-i enthält als bivalente Kohlenwasserstoffgruppe bevorzugt 1 bis 18, besonders bevorzugt
1 bis 12, und besonders bevorzugt 1 bis 8 C-Atome; und als Polyoxaalkylenrest bevorzugt 1 bis 6, besonders bevorzugt 1 bis 4 Oxaalkyleneinheiten aus der Gruppe -CH2-CH2-O- und - CH2-CH(CH3)-O-. Bei der Kohlenwasserstoffgruppe kann es sich zum Beispiel um lineares oder verzweigtes Cι-C2 Alkylen, bevorzugt Cι-CιrAlkylen, besonders bevorzugt CrC-12- Alkylen und ganz besonders bevorzugt C**-C8-Alkylen; um Ca-Cs-Cycloalkylen, bevorzugt C5- oder Ce-Cycloalkylen; C6-C12-Arylen oder um Cτ-C12-Aralkylen handeln. Einige Beispiele für bivalente Kohlenwasserstoffgruppen sind Methylen, Ethylen, 1,2- oder 1 ,3-Butylen, 1,2-,
1 ,3- oder 1 ,4-Butylen, 1 ,2-, 1 ,3-, 1 ,4- oder 1 ,5-Pentylen, 1 ,2-, 1 ,3-, 1 ,4-, 1 ,5- oder 1 ,6- Hexylen, 1,2-, 1 ,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6- oder 1 ,7-Heptylen, 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1 ,5-, 1,6-, 1,7- oder 1 ,8-Octylen, und die Isomeren von Nonylen, Decylen, Undecylen, Dodecylen, Tridecylen, Tetradecylen, Pentadecylen, Hexadecylen, Heptadecylen, Octadecylen, Nonadecylen und Eicosylen; Cyclopentylen, Cyclohexylen; Naphthylen und besonders Phenylen; Benzylen und Phenylethylen. Einige Beispiele für Polyoxaalkylene sind Ethylenoxy, Bisethylenoxy, Trisethylenoxy, Tetraethylenoxy und 1 ,2-Propoxy.
R als Alkyl enthält bevorzugt 1 bis 4 C-Atome und stellt bevorzugt Methyl oder Ethyl dar. Besonders bevorzugt ist R gleich H.
Wenn M Alkyl bedeutet, so enthält es bevorzugt 1 bis 4 C-Atome; besonders bevorzugt handelt es sich um Methyl oder Ethyl. Als Alkalimetall- und Ammoniumkationen sind Na+, K\ NH4 * und N(C1-Ce-Alkyl)4* bevorzugt.
Eine bevorzugte Untergruppe von Brückengruppen der Formel I sind solche, worin X eine direkte Bindung und bevorzugt Cι-C4-Alkylen, Phenylen oder Benzylen bedeutet, wobei das Alkylen mit -C(O)-O- oder -C(O)-NH- unterbrochen sein kann; X2 -C(O)-O-, -C(O)-NH-, -NH- C(O)-NH- oder -NH-C(S)-NH- darstellt; Xa rdβ-Alkylen, bevorzugter C2-Ci2-Alkylen darstellt; und X eine Bindung an ein O-, N- oder C-Atom eines Nukleotidbausteins bedeutet, oder X* -O-P(O)(OM)-O-, -NR-P(O)(OM)-O-, -O-P(O)(OM)-NR- oder -NR- P(O)(OM)-NR,- darstellt (Zur Erläuterung: bei den Resten -O-P(O)(OM)-O-, -NR-P(O)(OM)- O-, -O-P(O)(OM)-NR- oder -NR-P(O)(OM)-NR- sind die N- und O-Atome des Nukleosidbausteins in diese Brückengruppen integriert).
Als an das Oligonukleotid gebundene Katalysatoren kommen zum Beispiel Polypeptide (Transferasen/Hydrolasen), Metallsalze und Metallkomplexe in Frage, wobei die Metalle bevorzugt ausgewählt sind aus den Nebengruppen des Periodensystems der Elemente so¬ wie den Hauptgruppenmetallen In, Tl, Sn, Pb und Bi. Beispiele sind Scandium, Yttrium, Lanthan, die Lanthanidenmetalle, Ti, Zr, Hf, V, Nb, Ta, Cr, Mo, W, Mn, Fe, Ru, Os, Co, Rh, Ir, Ni, Pd, Pt, Cu, Ag, Au, Zn, Cd und Hg. Bevorzugt sind Scandium, Yttrium, Lanthan, die Lanthanidenmetalle, Cu und Blei. Unter den Lanthanidenmetallen sind Ce, Eu, Gd und Sm bevorzugt. Die Metalle liegen bevorzugt als zwei- oder dreiwertige Kationen vor.
Geeignete Anionen für die Metallsalze und Metallkomplexsalze können zum Beispiel aus der folgenden Gruppe ausgewählt sein: Halogenid (zum Beispiel CI', Br" und 0, das Anion einer Sauerstoffsäure, BF4 ', PF6 ", SiF6 " und AsF6 ".
Bei den Anionen von Sauerstoffsäuren kann es sich zum Beispiel um Sulfat, Phosphat, Perchlorat, Perbromat, Periodat, Antimonat, Arsenat, Nitrat, Carbonat, das Anion einer d- Cs-Carbonsäure wie zum Beispiel Formiat, Acetat, Propionat, Butyrat, Benzoat, Phe- nylacetat, Mono-, Di- oder Trichlor- oder -fluoracetat, Sulfonate wie zum Beispiel Me- thylsulfonat, Ethylsulfonat, Propylsulfonat, Butylsulfonat, Trifluormethylsulfonat (Triflat), gegebenenfalls mit Cι-C4-Alkyl, d-C4-Alkoxy oder Halogen, besonders Fluor, Chlor oder Brom substituiertes Phenylsulfonat oder Benzylsulfonat, wie zum Beispiel Tosylat, Mesylat, Brosylat, p-Methoxy- oder p-Ethoxypenyisulfonat, Pentafluorphenylsulfonat oder 2,4,6- Triisopropylsulfonat, und Phosphonate wie zum Beispiel Methylphosphonat, Ethylphosphonat, Propylphoshonat, Butylphosphonat, Phenylphosphonat, p-Methyl- phenylphosphonat und Benzylphosphonat handeln.
Die Metallkomplexkatalysatoren liegen bevorzugt als Metallkomplexsalze mit heteroor¬ ganischen Verbindungen als Komplexbildnern vor, wobei der Komplexbildner an das Oli- gonukleotid gebunden ist. Komplexbildner sind in grosser Vielzahl bekannt. Es kann sich um offenkettige oder cyclische organische Verbindungen mit Heteroatomen ausgewählt aus der Gruppe O, S, N und P handeln. Bevorzugt sind cyclische oder polycyclische organische Verbindungen mit insgesamt 8 bis 26, bevorzugt 12 bis 20 Ringgliedern und 2 bis 12, bevorzugt 4 bis 12 und besonders bevorzugt 6 bis 12 Heteroatomen. Unter den Hetero¬ atomen sind O und besonders N bevorzugt. Einige Beispiele für Komplexbildner sind Kro¬ nenether, Cyanine, Phthalocyanine, Naphthalocyanine, Porphyrine, Phenantroline, offene, und cyclisierte Bis- und Terpyridine, Ethylendiamintetraessigsäure und Diethylentriaminpen- taacetat.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den erfindungsgemässen kataly- tisch wirksamen Oligonukleotiden um Konjugate der Formel II,
A-B-Oligo (II),
worin A ein bevorzugt über C-Atome an B gebundenes cyclisches oder polycyclisches Me¬ tallkomplexsalz mit einem Komplexbildner darstellt, der mindestens 12 Ringatome und mindestens 4 Heteroatome aus der Gruppe N und O im Ring enthält, an den zweiwertige oder dreiwertige Metallionen ausgewählt aus der Gruppe Scandium, Yttrium, Lanthan und Lanthanidenmetalle gebunden sind; B für die Brückengruppe der Formel I steht und Oligo ein Oligonukleotid bedeutet, dessen innere Sequenz teilweise nicht komplementär zu einer Ziel-RNA ist.
Für Oligo und B gelten die zuvor angegebenen Bevorzugungen.
Der Komplexbildner kann bis zu 22, bevorzugt 6 bis 20, bevorzugter 12 bis 20 und beson¬ ders bevorzugt 14 bis 20 Ringatome enthalten, wobei die Ringatome ausser den Hetero¬ atomen bevorzugt C-Atome darstellen. Die Anzahl der Heteroatome N und/oder O beträgt bevorzugt 4 bis 12, besonders bevorzugt 4 bis 10, und ganz besonders bevorzugt 4 bis 8. Bei kleineren Ringgrössen (zum Beispiel 6 bis 12 Ringatome) werden auch niedrigere Ge¬ halte an Heteroatomen bevorzugt, zum 4 bis 8, bevorzugter 4 bis 6. In einer bevorzugten Untergruppe enthält der Komplexbildner 16 bis 20 und besonders 18 Ringatome sowie 6 bis 10 und bevorzugter 8 N-Atome, wobei es sich bei den übrigen Ringgliedern um C-Atome handelt, und an den Ring 1 bis 6 und bevorzugt 2 bis 4 unsubstituierte oder substituierte Gruppen -CH=CH-CH=CH- in 1 ,3-Stellung gebunden sind und mit N-Atomen des Rings eine Pyridingruppe bilden. Vorzugsweise enthält dieser Komplexbildner 2 bis 4 Py- ridingruppen und weitere 4 N-Atome im Ring. Bevorzugte Metallionen sind La, Ce, Nd, Eu und Gd. Bevorzugte Anionen in den Metallkomplexsalzen sind Halogenid (CI", Br"), Sulfat, Nitrat, PF6 ", Acetat, Methylsulfonat, Trifluormethylsulfonat, Carbonat, Hydrogensulfat, Hydrogencarbonat und Perchlorat.
In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Konjugaten der Formel II um solche der Formel III,
worin
R2 und R7 unabhängig voneinander H, Cι-C4-Alkyl, Cι-C4-Alkoxy, Cτ-Cι2-Aralkyl oder C6-d6-
Aryl bedeuten,
R3 und Re unabhängig voneinander H, d-C -Alkyl, CrdrAralkyl oder C6-Cι6-Aryl sind,
R4für H, Ci-C-jo-Alkyl, C5-C8-Cycloalkyl, C6-C12-Aryl oder Cτ-C12-Aralkyl steht,
Me für ein Lanthan, Lanthanidmetall, Yttrium oder Scandium steht,
Y für ein Anion steht, n die Zahlen 2 oder 3 bedeutet, und m die Zahlen 1 , 2 oder 3 bedeutet, wobei die Reste Alkyl, Cycloalkyl, Aralkyl und Aryl unsubstituiert oder mit d-C4-Alkoxy, F,
CI, Br, -CN, d-C4-Alkyl oder -NO2 substituiert sind, R5 einen Rest der Formel IV
-B-Oligo (IV)
darstellt und Ri H oder ein Substituent oder
R5 H oder ein Substituent und Ri einen Rest der Formel IV bedeutet, wobei B und Oligo die zuvor angegebenen Bedeutungen haben, einschliesslich der Bevorzugungen. Geeignete und auch bevorzugte Anionen für Y"1' sind zuvor erwähnt worden. Besonders bevorzugt ist γm" = cr.
R2, Ra, Re und R7 bedeuten als Alkyl bevorzugt Methyl oder Ethyl, als Alkoxy bevorzugt Methoxy oder Ethoxy, als Aralkyl bevorzugt Benzylen oder Phenylethylen und als Aryl bevorzugt Naphthyl und besonders Benzyl. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeu¬ ten R2 und R7 H und R3 und R6 Alkyl. Besonders bedeuten R2 und R H sowie R3 und Red- C4-Alkyl, und ganz besonders Methyl. Bei R2, R3, Re und R7 kann es sich auch um C -C*ι2- Heteroaryl mit O, S, N als Heteroatomen handeln. Beispiele sind Pyrridyl, Thiazolyl, Imidazolyl, Oxazolyl, Furanosyl, Pyrrolyl, Thiophenyl. Weiter kann es sich um Cι-C - Alkylthio, Halogenid, Di(d-C4-Alkyi)amino, Sulfonamid und Carboxamid handeln.
Ri und R5 als Substituent sind bevorzugt d-C -Alkyl, Cι-C4-Alkoxy, Cτ-C12-Aralkyl oder C6- C16-Aryl, d-CirHeteroaryl mit O, S, N als Heteroatomen, d-C4-Alkylthio, Di(d-C - Alkyl)amino, Halogenid, Sulfonamid und Carboxamid.
Ri und R5 sind bevorzugt in p-Stellung zum N-Atom des Pyridinrings gebunden.
F enthält als Alkyl bevorzugt 1 bis 12, besonders bevorzugt 1 bis 8 und insbesondere 1 bis 4 C-Atome. Einige Beispiele für Alkyl sind Methyl, Ethyl und die Isomeren von Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Heptyl, Octyl, Nonyl, Decyl, Undecyl, Dodecyl, Tridecyl, Tetradecyl, Pentadecyl, Hexadecyl, Octadecyl, Nonadecyl und Eicosyl.
F enthält als Cycloalkyl bevorzugt 5 oder 6 Ringkohlenstoffatome. Einige Beispiele für Cycloalkyl sind Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyciohexyl, Cyclopentyl und Cyc- looctyl. R stellt als Aryl bevorzugt Naphthyl und besonders Phenyl dar. Wenn R Aralkyl ist, handelt es sich bevorzugt um Benzyl oder Phenylethyl.
Eine bevorzugte Untergruppe für FU ist H, Cι-C -Alkyl, besonders Methyl, sowie Phenyl oder Benzyl.
Ri beziehungsweise R5 bedeuten als Alkyl bevorzugt Methyl oder Ethyl, als Alkoxy be¬ vorzugt Methoxy oder Ethoxy, als Aryl bevorzugt Naphthyl oder Phenyl, und als Aralkyl bevorzugt Phenyl oder Phenylethyl. Bevorzugt bedeuten R, beziehungsweise R5 H, Methyl, Ethyl, Methoxy oder Ethoxy.
Eine bevorzugte Untergruppe von Verbindungen der Formel III sind solche, worin R2 und R7 für H stehen, R3 und R6 d-C4-Alkyl bedeuten, FU H, Cι-C4-Alkyl, Phenyl oder Benzyl darstellen, Rt die Gruppe Xi-X-rXa-p jx-Oligo und R5 H, Methyl oder Methoxy oder R5die Gruppe Xi-XjrXa-P-U Oligo und R-* H, Methyl oder Methoxy darstellen, Xi eine direkte Bin¬ dung oder Cz-Ce-Alkylen ist, X2 -O-, -NH-, -C(O)-O-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-NH- oder -HN- C(S)-NH- bedeutet, X3 C2-Cι;rAlkylen oder Phenylen darstellt, X4 eine Bindung an ein O-, N- oder C-Atom eines Nukleosidbausteins bedeutet, oder X«-O-P(O)(OM)-O- darstellt, x für 0 oder 1 steht, Me La, Ce, Nd, Eu oder Gd bedeutet, n für 2 oder 3 und m für 1 oder 2 stehen, Y CI, Br, CH3C(O)O, CIO4, BF4, PF6, F3C-SO3 oder Tosylat darstellt, M für H, Na oder K steht, und Oligo einen Oligonukleotidrest bedeutet, dessen innere Sequenz zu einer Ziel-RNA nur teilweise komplementär ist und der aus natürlichen Desoxyribonuleotidbausteinen oder unnatürlichen synthetischen Nukleotidbausteinen aufgebaut ist, wobei bezogen auf die Ziel-RNA 1 bis 4 Bausteine fehlen.
Geeignete Umsterungs- oder Hydrolysekatalysatoren sind auch Nukleasen oder Nuklease- fragmente, basische Polypeptide, Amidin- und Guanidinderivate, Oligoamine und Bisimi- dazole. Sie können über die gleichen Brückengruppen an das Oligonukleotid gebunden sein wie die Metallkomplexe.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Oligonuk- leotiden, an die ein Umesterungs- oder Hydrolysekatalysator gebunden ist, und die innere Sequenz des Oligonukletoids teilweise nicht komplementär zu einer natürlich vorkommenden Ziel-RNA ist, und das Oligonukleotid aus natürlichen Desoxyribonukleinsäurebausteinen oder aus unnatürlichen synthetischen Nukleotidbausteinen aufgebaut ist, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen Umesterungs- oder Hydrolysekatalysator, der eine funktioneile Gruppe an das Grundgerüst gebunden aufweist, mit der funktioneilen Gruppe eines Nukleotidbausteins oder einer funktionell modifizierten Gruppe eines Nukleosidbausteins umsetzt.
Beispiele für funktioneile Gruppen, die gegenenfalls über eine Brückengruppe Xi an das Grundgerüst gebunden sind, sind OH, -SH, -NCO, -NCS, -CN, -O-CH2-OH, -NHR, -C(O)OR, -C(O)SH, -C(O)NHR, -C(O)Hal mit Hai gleich F, CI oder Br, -C(S)SR, -C(S)NHR, -C(S)OR, - SO3R, -SO2NHR, -SO2CI, -P(O)(OH)2, -P(O)(OH)-NHR, -P(S)(SH)2, -P(S)(SH)-NHR, - P(S)(OH)2l -P(S)(OH)-NHR, -P(O)(SH)2l -P(O)(SH)-NHR, -P(O)(OH)H, -P(O)(NHR)H, - P(S)(SH)H, -P(S)(NHR)H, -P(S)(OH)H, -P(O)(SH)H, wobei R H, -Ci-Ce-Alkyl, -dHaz-NHz, - CzH^-SH oder -(dHöOjyH bedeutet und z eine Zahl von 2 bis 6 und y eine Zahl von 1 bis 20 ist. Beispiele für funktionell modifizierte Gruppen sind Hydroxyalkoxy oder Aminoalkoxy, die gegebenenfalls über einen Linker, zum Beispiel -P(O)OM-O- an einen Nukleotidbaustein gebunden sind. Die funktioneile Gruppe kann direkt oder über eine Gruppe X1 an das Grundgerüst gebunden sein und die Gruppe X1 bedeutet bevorzugt Cι-C12-Alkylen, d-Cι2- Alkenylen, Cι-C12-Alkinylen, C3-C8-Cycloalkylen, C6-d2-Arylen oder Cτ-d2-Aralkylen.
Das erfind ungsgemässe Verfahren zur Herstellung der Oligonukleotidkonjugate kann zum Beispiel so durchgeführt werden, dass man ein gegebenenfalls funktionalisiertes Oligo¬ nukleotid in einem Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch löst und dann den eine funktioneile Gruppe tragenden Umesterungs- oder Hydrolysekatalysator zugibt und darauf das Reaktionsgemisch gegebenenfalls unter Rühren ausreagieren lässt. Das gebildete Konjugat kann anschliessend in an sich bekannter Weise gereinigt und wenn gewünscht isoliert werden.
Die Reaktionstemperatur kann zum Beispiel 0 bis 120 °C, bevorzugt 20 bis 80 °C betragen. Besonders bevorzugt wird die Reaktion bei Raumtemperatur durchgeführt.
Ist die Verknüpfung eine Veresterungs-, Umesterungs- oder Amidierungsreaktion, werden entsprechende Cabonsäuregruppen zuvor in bekannter Weise aktiviert, zum Beispiel durch Reaktion mit Carbodiimiden und N-Hydroxysuccinimid. Geeignete Lösungsmittel sind zum Beispiel Wasser und polare aprotische Lösungsmittel, die vorteilhaft mit Wasser mischbar sind. Beispiele für solche Lösungsmittel sind Alkohole (Methanol, Ethanol, n- oder i-Propanol, Butanol, Ethylenglykol, Propylenglykol, Ethy- lenglykolmonomethylether, Diethylenglykol, Diethylenglykolmonomethylether), Ether (Diethylether, Dibutylether, Tetrahydrofuran, Dioxan, Ethylenglykoldimethylether, Ethy- lenglykoldiethylether, Diethylenglykoldiethylether, Triethylenglykoldimethylether), halo- genierte Kohlenwasserstoffe (Methylenchlorid, Chloroform, 1 ,2-Dichlorethan, 1 ,1 ,1-Tri- chlorethan, 1,1,2,2-Tetrachlorethan, Chlorbenzol), Carbonsäureester und Lactone (Essig- säureethylester, Propionsäuremethylester, Benzoesäureethylester, 2-Methoxyethylacetat, γ- Butyrolacton, δ-Valerolacton, Pivalolacton), N-alkylierte Carbonsäureamide und Lactame (N,N-Dimethylformamid, N,N-Diethylformamid, N,N-Dimethylacetamid, Tetramethylharnstoff, Hexamethylphosphorsäuretriamid, N-Methyl-γ-Butyrolactam, N-Methyl-ε-Caprolactam, N- Methylpyrrolidon,), Sulfoxide (Dimethylsulfoxid, Tetramethylensulfoxid), Sulfone (Dimethylsulfon, Diethylsulfon, Trimethylensulfon, Tetramethylensulfon), tertiäre Amine (Trimethylamin, Triethylamin, N-Methylpiperidin, N-Methylmorpholin, Pyridin), substituierte Benzole (Chlorbenzol, o-Dichlorbenzol, 1,2,4-Trichlorbenzol, Nitrobenzol, Toluol, Xylol) und Nitrile (Acetonitril, Propionitril, Benzonitril, Phenylacetonitril).
Die Reaktanden werden zweckmässig in molaren Verhältnissen eingesetzt. Es kann jedoch ein Überschuss des Katalysators oder des Oligonukleotids verwendet werden.
Zur Reinigung können die üblichen Methoden angewendet werden, vorteilhaft zum Beispiel Dialyse, Elektrophorese, und chromatographische Verfahren wie
Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC), Umkehr-HPLC, Affinitätschromatographie, lonentauscherchromatographie, und Gelchromatographie.
Die zu verwendenden gegebenenfalls funktionalisierten Oligonukleotide können in an sich bekannter Weise mittels automatisierten Synthesizern hergestellt werden, die käuflich sind. Nukleoside für deren Synthese sind bekannt, teilweise käuflich oder nach anologen Verfahren herstellbar. Umesterungs- oder Hydrolysekatalysatoren mit funktioneilen Gruppen sind bekannt, teil¬ weise käuflich oder nach bekannten beziehungsweise anologen Verfahren herstellbar.
Die funktionalisierten Ausgangsverbindungen mit einem Grundgerüst der Formel III sind neu. Sie sind erhältlich, indem man ein Terpyridin der Formel V
mit einem Pyridindialdehyd oder F-tyridindiketon der Formel VI
in Gegenwart eines Salzes der Formel VII
kondensiert, worin Ri, R2, Rs, R4, R5, Re, R7, Me, Y, n und m die zuvor angegebenen Be¬ deutungen haben.
Das Verfahren kann zum Beispiel so durchgeführt werden, dass man die Verbindungen der Formeln V, VI und VII in bevorzugt äquivalenten Mengen in einem Lösungsmittel löst und dann bei erhöhten Temperaturen miteinander umsetzt. Zweckmässig werden Konden- sationskatalysatoren mitverwendet, zum Beispiel konzentrierte Mineralsäuren, besonders Salzsäure, oder saure Ionenaustauscher. Es kann zweckmässig sein, wasserbindende Mit¬ tel zuzugeben, oder das Reaktionswasser aus dem Reaktionsgemisch zu entfernen.
Die Reaktionstemperatur kann zum Beispiel 40 bis 220 °C, bevorzugt 50 bis 150 °C betra¬ gen.
Als Lösungsmittel werden vorteilhaft organische polare aprotische Lösungsmittel eingesetzt. Solche Lösungsmittel sind zuvor erwähnt worden.
Die Metallsalze der Formel VII sind allgemein bekannt und zum grossen Teil käuflich.
Die Herstellung der neuen eine funktionelle Gruppe enthaltenden Verbindungen der Formel V kann analog zu dem von E. C. Constable in Polyhedron, Band 7, Nr. 24, Seiten 2531 bis 2536 (1988) beschriebenen Verfahren erhalten werden, wobei funktionelle Gruppen gegebenenfalls mit Schutzgruppen versehen werden.
Die Verbindungen der Formeln V und VI mit oder ohne funktionelle Gruppen sind grossenteils bekannt oder sie können nach bekannten beziehungsweise analogen Verfahren hergestellt werden. Verbindungen der Formel VI, worin F für H steht, R5 für C2- dβ-Alkylen-Xs steht und X5 -C(O)-OR, -C(O)-NHR, -SO2-R oder -SO-rNHR bedeutet, sowie R H oder d-C6-Alkyl ist, sind neu und auf folgende Weise erhältlich: Man alkenyliert unter Palladiumkatalyse einen entsprechenden 3-Halogen-pyridin-1 ,5-dicarbonsäureester mit einem Alken der Formel CH2=CH-Cι-Cι6-Alkylen-carbonsäurester, hydriert die Alkengruppe zum Beispiel katalytisch, hydriert anschliessend zum entsprechenden 1 ,5-Dihydroxyme- thylpyridinalkylcarbonsäureester, oxidiert die Hydroxymethylgruppen zu Aldehydgruppen und hydrolysiert gegebenenfalls die Ester- zur Carbonsäuregruppe oder amidiert die Ester¬ gruppe zum Carbonsäureamid.
Verbindungen der Formel VI, worin R4 für H oder Cι-Cι2-Alkyl steht, R5 für C2-C18-Alkylen-X5 steht und Xs -C(O)-OR, -C(O)-NHR, -SO2-R oder -SO2-NHR bedeutet, sowie R H oder d- Ce-Alkyl ist, sind neu und auf folgende Weise erhältlich: Man alkenyliert unter Palladiumkatalyse ein entsprechendes mit zum Beispiel Acetyl geschütztes 3-Halogen-1 ,5- dihydroxymethylpyridin (erhältlich durch Reduktion des entsprechenden 3,5-Dicar- bonsäuremethylesters) mit einem Alken der Formel CH2=CH-d-Ci6-Alkylen-carbonsaur- ester, hydriert die Alkengruppe zum Beispiel katalytisch, entschützt die Hydroxylgruppen und oxidiert gegebenenfalls zum entsprechenden 3,5-Pyridinaldehyd, dessen Aldehyd¬ gruppen mit zum Beispiel Grignardreagenzien Ci-Ciralkyliert werden können, hydrolysiert gegebenenfalls die Ester- zur Carbonsäuregruppe oder amidiert die Estergruppe zum Carbonsäureamid, und oxidiert die sekundären Alkoholgruppen zu Ketogruppen.
Die erfindungsgemässen Oligonukleotide eignen sich hervorragend zur insbesondere se¬ quenzspezifischen Spaltung von RNA-Sequenzen, wobei durch deren Fähigkeit zur kata- lytischen Wirkung nur überraschend niedrige Mengen eingesetzt werden müssen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Spaltung der Phosphatnuk- leotidbrücke von Ribonukleinsäuren unter physiologischen Bedingungen und unter Ein¬ wirkung eines synthetischen Umesterungs- und/oder Hydrolysekatalysators, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man (a) die Ziel-RNA mit einem Oligonukleotid komplexiert, dessen innere Sequenz teilweise nicht-komplementär mit der Ziel-RNA ist, und an das ein Umesterungs- oder Hydrolysekatalysator gebunden ist, und (b) dann reagieren lässt und spaltet.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann in vivo durch Verabreichung der Oligonukleotide oder in vitro unter Zusammenführung einer Ziel-RNA und eines erfindungsgemäss zu ver¬ wendenden Oligonukleotids durchgeführt werden.
Physiologische Bedingungen sind dem Fachmann geläufig und umfassen zum Beispiel die Durchführung des Verfahrens im wässrigen Medium und in einem pH-Bereich von 5 bis 9, bevorzugt 5 bis 8 und besonders bevorzugt 5 bis 7,5, wobei das wässrige Medium weitere inerte Bestandteile enthalten kann, zum Beispiel Salze von Alkalimetallen oder Erdal¬ kalimetallen, und besonders Puffersysteme.
Das Verfahren kann bei einer Temperatur von zum Beispiel 0 bis 100 °C, bevorzugt 20 bis 50 °C und insbesondere 30 bis 40 °C durchgeführt werden. Bei dem erfindungsgemässen Verfahren erfolgt die Spaltung bei einer Umesterung der Phosphatbrückenbindung unter Bildung eines Bruchstückes mit einer 2',3l-cyclischen Phosphatendgruppe und eines weiteren Bruchstückes mit einer 5-Hydroxylendgruppe. Das cyclische Phosphat kann anschliessend weiter hydrolysieren.
Die erfindungsgemässen Oligonukleotide finden als Arzneimittel Verwendung. Die erfin¬ dungsgemässen Oligonukleotide weisen zudem eine hohe Stabilität gegenüber einem Ab¬ bau durch Nukleasen auf. Besonders überraschend ist ihre ausgezeichnete Paarung mit komplementären Nukleinsäuresträngen vom RNA-Typ. Zusätzlich zeigen sie eine uner¬ wartet hohe zelluläre Aufnahme. Die erfindungsgemässen Oligonukleotide eignen sich da¬ her besonders für die Antisense-Technologie, das heisst zur Inhibition der Expression un¬ erwünschter Proteinprodukte durch die Bindung an geeignete komplementäre Nukleotid¬ sequenzen von mRNA (EP266.099, WO 87/07300 und WO89/08146). Sie können zur Behandlung von Infektionen und Krankheiten zum Beispiel durch die Blockierung der Ex¬ pression von bioaktiven Proteinen auf der Stufe der Nukleinsäuren (zum Beispiel Onkoge- ne) eingesetzt werden. Die erfindungsgemäss hergestellten Oligonukleotid-Bruchstücke eignen sich auch als Diagnostika und können als Gensonden zum Nachweis von viralen Infektionen oder genetisch bedingten Krankheiten durch selektive Interaktion auf der Stufe von einzel- oder doppelsträngigen Nukleinsäuren verwendet werden ("gene probes").
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäss hergestellten Oligonukleotide als Diagnostika zum Nachweis von viralen Infektionen oder genetisch bedingten Krankheiten.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung betrifft auch die erfindungsgemässen Oligonukleo¬ tide zur Anwendung in einem therapeutischen Verfahren zur Behandlung von Krankheiten bei Warmblütern einschliesslich des Menschen durch Inaktivierung von Nukleotidsequenzen im Körper. Die Dosierung bei Verabreichung an Warmblüter von etwa 70 kg Körpergewicht kann zum Beispiel 0,01 bis 1000 mg pro Tag betragen. Die Verabreichung erfolgt vorzugsweise in Form pharmazeutischer Präparate parenteral, zum Beispiel intravenös oder intraperitoneal. Zur parenteralen Verabreichung eignen sich in erster Linie wässrige Lösungen eines wasserlöslichen Wirkstoffes, zum Beispiel eines wasserlöslichen physiolo¬ gisch unbedenklichen Salzes, oder wässrige Suspensionen solcher Wirkstoffe, welche vis- kositätssteigernde Mittel wie zum Beispiel Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbit und/oder Dextran und gegebenenfalls Stabilisatoren enthalten. Dabei kann der Wirkstoff, gegebenenfalls zusammen mit Hilfsstoffen, auch in Form eines Lyophilisats vorliegen und vor der Verabreichung durch Zugabe von geeigneten Lösungsmitteln in Lösung gebracht werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft eine wässrige Zusammensetzung und ins¬ besondere ein pharmazeutisches Präparat auf Basis einer wässrigen Lösung oder Suspen¬ sion, enthaltend eine wirksame Menge eines erfindungsgemässen Oligonukleotids alleine oder zusammen mit anderen Wirkstoffen, Wasser als pharmazeutisches Trägermaterial vorzugsweise in einer signifikanten Menge und gegebenenfalls Hilfsstoffe.
Man kann die pharmakologisch wirksamen erfindungsgemässen Oligonukleotide in Form von parenteral verabreichbaren Präparaten oder von Infusionslösungen verwenden. Solche Lösungen sind vorzugsweise isotonische wässrige Lösungen oder Suspensionen, wobei diese zum Beispiel bei iyophilisierten Präparaten, welche die Wirksubstanz allein oder zu¬ sammen mit einem Trägermaterial, zum Beispiel Mannit, enthalten, vor Gebrauch herge¬ stellt werden können. Die pharmazeutischen Präparate können sterilisiert sein und/oder Hilfsstoffe, zum Beispiel Konservier- Stabilisier-, Netz- und/oder Emulgiermittel, Lös- lichkeitsvermittler, Salze zur Regulierung des osmotischen Drucks und/oder Puffer enthal¬ ten. Die pharmazeutischen Präparate, die gewünschtenfalls weitere pharmakologisch wirk¬ same Stoffe wie zum Beispiel Antibiotka enthalten können, werden in an sich bekannter Weise, zum Beispiel mittels konventioneller Lösungs- oder Lyophilisierungsverfahren, hergestellt, und enthalten etwa 0,1 % bis 90 %, insbesondere von etwa 0,5 % bis etwa 30 %, zum Beispiel 1 % bis 5 % Aktivstoff (e). Die erfindungsgemässen Konjugate können auch mittels Inhalation oder in einer liposomalen Verabreichungsform angewendet werden.
Die erfindungsgemässen Konjugate können auch für diagnostische Zwecke oder als molekularbiologische Hilfsmittel als sequenzspezifische Endoribonukleasen Verwendung finden.
In den Zeichnungen sind beispielhaft verschiedene Möglichkeiten der Struktur eines Hybrides aus einem erfindungsgemässen Antisense-Oligonukleotid-Konjugat und einem Ziel-RNA-Molekül dargestellt, wobei die Struktur des Konjugates jeweils so gewählt ist, dass im Hybrid auf der Ziel-RNA mindestens ein ungepaartes Nukleotid auftritt. Fig. 1 zeigt schematisch ein Hybrid aus einer Ziel-RNA (mit "5' " bezeichnete Linie) und einem Antisense-Oligonukleotid (mit "3' " bezeichnete Linie), an das erfindungsgemäss ein Komplex (mit "Ln" bezeichnet) als Umesterungs- bzw. Hydrolysekatalysator gebunden ist (sog. Konjugat), wobei sich die Bindungstelle des Komplexes innerhalb der Antisense- Oligonukleotid-Sequenz befindet. Die angegebene Numerierung bezieht sich auf die Nukleotidbausteine der Ziel-RNA, wobei die Numerierung so erfolgt, dass das Nukleotid der Ziel-RNA, das komplementär zu dem Nukleotid des Antisense-Oligonukleotides ist, an das der Komplex gebunden ist, als "0" bezeichnet wird. Die weitere Numerierung erfolgt dann jeweils aufsteigend (+1, +2 usw.) in 3'-Richtung bzw. absteigend (-1, -2 usw.) in 5'-Richtung der Ziel-RNA. Ein aufgrund der Struktur des Antisense-Oligonukleotides auftretendes ungepaartes Nukleotid (es können auch meherere ungepaarte Nukleotide auftreten) auf der Ziel-RNA ist als Ausbuchtung dargestellt und befindet sich im vorliegenden Fall, ausgehend von der Position 0, in 3'-Richtung (hier: an der Position +2) auf der Ziel-RNA.
Fig. 2 zeigt schematisch ein Hybrid aus einer Ziel-RNA und einem erfindungsgemässen Antisense-Oligonukleotid-Konjugat, wobei sich ein ungepaartes Nukleotid von der Position 0 ausgehend in 5'-Richtung auf der Ziel-RNA (in diesem Fall an der Position -2) befindet. Im übrigen gelten die zur Fig. 1 gegebenen Definitionen entsprechend.
Fig. 3 zeigt schematisch ein Hybrid aus einer Ziel-RNA und einem erfindungsgemässen Antisense-Oligonukleotid-Konjugat, bei dem sich die Bindungsstelle des Komplexes am Ende des Antisense-Oligonukleotides befindet, und wobei sich ein ungepaartes Nukleotid von der Position 0 ausgehend in 5'-Richtung auf der Ziel-RNA (in diesem Fall an der Position -3) befindet. Im übrigen gelten die zur Fig. 1 gegebenen Definitionen entsprechend. Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
A^ Herstelluno von Ausgangsverbindungen für die Terpyridin-Lanthanid-Komplexe
Beispiel A1 : Herstellung von Terpyridin-bis-hydrazino-Verbindungen
(a) Zu einer Lösung von 6-Acetyl-2-brompyridin (100 mMol) in 200 ml Methanol werden unter Kühlung mit einem Eisbad 40 ml einer 2 N wässrigen Kaliumhydroxid-Lösung gegeben. Nach Zugabe des entsprechend substituierten Benzaldehyds (400 mMol) wird das Kühlbad entfernt und das Gemisch 4 Stunden bei Raumtemperatur weitergerührt. Das Produkt wird abfiltriert, dreimal mit Wasser und zweimal mit kaltem Methanol gewaschen und am Hochvakuum getrocknet.
Nach dieser Vorschrift werden die Verbindungen a.1 (R^ Phenyl-4-OCH3; MS 317.7) und a.2 (Ri: Phenyl-4-NO2; MS 333.6) hergestellt.
(b) Die α.ß-ungesättigte Carbonylverbindung aus (a) (30 mMol), 1-(2-Brompyridylcarbonyl- methyl)pyridinjodid (12,1 g, 30 mMol) und Ammoniumacetat (13,9 g, 180 mMol) werden in einem Kolben vorgelegt und mit 100 ml Essigsäure versetzt. Das Gemisch wird am Rückfluss gekocht. Nach 2 Stunden wird auf Raumtemperatur abgekühlt, abfiltriert und das so erhaltene Produkt am Hochvakuum getrocknet.
Nach dieser Vorschrift werden die Verbindungen b.1 (Ri: Phenyl-4-OCH3; MS 497.1) und b.2 (R,: Phenyl-4-NO2; MS 512) hergestellt. Zu einer Lösung von Titantetrachlorid (30 mMol) in 75 ml Tetrahydrofuran (abs.) wird bei Raumtemperatur unter Argon-Atmosphäre portionenweise Lithiumaluminiumhydrid (22 mMol) gegeben. Die erhaltene Suspension wird 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und anschliessend auf 0°C gekühlt. Die Verbindung b.2 (10 mMol) wird zugegeben und die Suspension 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Nach vorsichtiger tropfenweise Zugabe von 50 ml Wasser bei 0°C werden 25 ml einer 25 % igen wässsrigen Ammoniaklösung zugegeben. Das Gemsich wird mit 150 ml Chloroform versetzt und über Celite filtriert. Die wässrige Phase wird abgetrennt und dreimal mit Chloroform extrahiert. Alle organischen Phasen werden vereinigt, einmal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und konzentriert. Nach dieser Vorschrift wird die Verbindung b.3 (R,: Phenyl-4-NH2; MS 482.5) hergestellt.
Die entsprechende Dibromoterpyridin-Verbindung aus (b) (10 mMol) wird in 30 ml Methylhydrazin gelöst und 17 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wird eingeengt und der Rückstand in 20 ml Methanol aufgenommen. Das Produkt wird abfiltriert und im Hochvakuum getrocknet.
Nach dieser Vorschrift werden die Verbindungen c.1 (R Phenyl-4-OCH3; MS 427) und c.2 (Ri: Phenyl-4-NH2; MS 412.5) hergestellt.
Die Methoxyverbindung c.1 (10 mMol) wird in 100 ml Chloroform suspendiert und unter Kühlen mit dem Eisbad während 20 Minuten mit einer 1 molaren Lösung von Bortribromid (50 mMol) in Methylenchlorid versetzt. Die Suspension wird 5 Tage unter Rückfluss erhitzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wird auf 300 ml Eiswasser gegossen, mit 200 ml 2 N wässriger Salzsäure angesäuert. Nach Extraktion mit Ether (2 mal) wird die wässrige Phase mit 10 % iger wässriger Natriumcarbonat-Lösung auf pH 9.0 gestellt und 30 Minuten gerührt. Das ausgefallene Produkt c.3 (R-,: Phenyl-4-OH; MS 413.5) wird abfiltriert und im Hochvakuum getrocknet.
Beispiel A2: Herstellung von 3-[4'-(2,,6,-Diformylpyridin)]propionsäure
(a) 3,5 g 4-Brompyridin-2,6-carbonsäuredimethylester, 390 mg Tritolylphosphin, 9,3 ml Acrylsäuretert.butylester, 7,1 ml Triethylamin, 30 ml Dimethylformamid und 287 mg Palladiumacetat werden gemischt und auf 110°C erwärmt. Nach 90 Minuten wird das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abgekühlt, mit Ether/Methylenchlorid (1:1) verdünnt und mit NH4CI/H2O ausgeschüttelt. Die organische Phase wird mit Na2SO4 getrocknet, am Rotationsverdampfer eingeengt und im Hochvakuum getrocknet.
C H N berechnet: 59,81 5,96 4,36 gefunden: 59,8 6,0 4,1
250 mg Palladium auf Aktivkohle (5 %) und 2,5 g der oben erhaltenen Verbindung werden in 250 ml Methanol gelöst und über Nacht bei Raumtemperatur unter H2-Atmosphäre hydriert. Das Produkt wird durch Hyflo filtriert, das Filtrat wird am Rotatationsverdampfer eingeengt und bei Raumtemperatur im Hochvakuum getrocknet.
C H N berechnet: 59,43 6,55 4,33 gefunden: 59,3 6,6 4,3 5,0 g der oben erhaltenen Verbindung werden in 50 ml Methanol und 50 ml Tetrahydrofuran gelöst. Nach Abkühlung auf 0°C werden 1 ,1 g NaBH4 dazugegeben. Nach 50 Minuten werden weitere 1 ,1 g NaBH dazugegeben und nach 130 Minuten weitere 0,5 g NaBH4 dazugegeben. Nach insgesamt 165 Minuten wird auf Raumtemperatur erwärmt. Es wird auf 0°C abgekühlt. Nach 3,5 Stunden werden nochmals 1 ,1 g NaBH4 dazugegeben. Nach 6 Stunden wird auf ein Volumen von 60 ml eingeengt. Danach wird eine gesättigte Ammoniumchlorid-Lösung zugetropft, viermal mit CH2CI2 extrahiert, die organischen Phasen werden einmal mit Ammoniumchlorid-Lösung gewaschen, mit Na2SO getrocknet, abfiltriert und eingeengt.
C H N berechnet: 62.90 7.92 5.24 gefunden: 63.0 7.9 5.2
19,8 g der oben erhaltenen Verbindung werden in 300 ml Dioxan gelöst. Anschliessend werden 16,2 g Selendioxid dazugegeben. Das Reaktionsgemisch wird auf 100°C erwärmt und gerührt, nach 45 Minuten wird auf Raumtemperatur abgekühlt. Nach weiteren zwei Stunden Rühren wird das Reaktionsgemisch filtriert und am Rotationsverdampfer eingeengt.
C H N berechnet: 63,87 6,51 5,32 gefunden: 64,14 6,53 5,43
4,7 g der oben erhaltenen Verbindung werden in 17,2 ml eiskalte Trifluoressigsäure gegeben. Nach der Umsetzung zur Säure wird das Gemisch bei 0°C eingeengt.
C H N berechnet: 57,97 4,38 6,76 gefunden: 57,55 4,21 6,61
(b) 5 g 4-Brompyridin-2,6-dicarbonsäuredimethylester werden in 175 ml Tetrahydrofuran bei Raumtemperatur gelöst. Anschliessend werden 75 ml Methanol zugegeben. Man kühlt auf 0°C ab, gibt portionenweise während 45 Minuten 3,44 g Natriumborhydrid hinzu und lässt auf Raumtemperatur erwärmen. Nach 1 Stunde werden 30 ml Aceton innerhalb von 10 Minuten zugetropft. Man erwärmt das Reaktionsgemisch während 1 Stunde unter Rückfluss, Das Reaktionsgemisch wird anschliessend am Rotationsverdampfer zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird bei Raumtemperatur in 50 ml Pyridin eingerührt. Dazu werden 0,1 g 4-Dimethylaminopyridin gegeben, anschliessend wird auf 0°C abgekühlt. Innerhalb von 30 Minuten werden 34,4 ml Essigsäureanhydrid zugetropft. Man lässt die Suspension auf Raumtemperatur erwärmen. 50 ml Tetrahydrofuran werden zugegeben. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch filtriert und zweimal mit je 50 ml Tetrahydrofuran gewaschen. Das Filtrat wird am Rotationsverdampfer konzentriert. Durch Kristallisation erhält man 4-Brom-2,6-di(acetoxymethyl)pyridin. (Schmelzpunkt: 66-69°C).
0,982 g 4-Brom-2,6-di(acetoxymethyl)pyridin, 1 ,5 g 3-(Tributylstannyl)-acrylsäureethylester und 176 mg Palladiumtetrakis(triphenylphosphin) werden in 25 ml Dioxan gelöst und auf 90°C erwärmt. Nach 90 Minuten wird das Reaktionsgemisch abgekühlt. Das feste Produkt wird abgetrennt und aus Hexan/Essigester umkristallisiert. MS 321 (M+)
2,74 g der oben erhaltenen Verbindung und 70 mg Wilkinsonskatalysator werden in 150 ml Benzol gelöst. 12,2 ml Triethylsiian werden zugegeben und die Lösung am Rückfluss erhitzt. 270 mg Katalysator Triethylsiian im Überschuss werden portionenweise innerhalb von einer Stunde zugegeben. Das Produkt wird chromatographisch gereinigt. MS 323.
267 mg Natrium werden in 50 ml Ethanol gelöst. 7,2 ml dieser Lösung werden zu einer Lösung von 1 ,845 g der oben erhaltenen Verbindung in 35 ml Ethanol gegeben. Nach 2,5 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch durch Kieselgel filtriert und das Filtrat zur Trockne eingeengt. Das Produkt wird über Nacht im Hochvakuum getrocknet. NMR (CDCI3) δ 7.0 (2H,s), 4,7 (4H,s), 4,1 (2H,q), 2,9 (2H,t), 1 ,2 (3H,t)
1 ,27 g der oben erhaltenen Verbindung werden in 30 ml Dioxan gelöst. Dazu werden 714 mg Selendioxid gegeben. Das Reaktionsgemisch wird erwärmt und nach 2 Stunden durch Watte filtriert. Das Filtrat wird zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird in Essigester/Methylenchiorid (5 %) aufgenommen und über Kieselgel filtriert. 1H NMR (CDCI3)δ 10,1 (2H,s), 8,0 (2H,s), 4,1 (2H,q), 3,1 (2H,t), 2,7 (2H,t), 1 ,2 (3H,t) Zu einer Lösung von 45 ml Ether und 350 mg der oben erhaltenen Verbindung werden bei 0°C 13 ml einer zuvor bereiteten Lösung (0,949 g Kupferbromid.Dimethylsulfid in 10ml Ether, auf 0°C abgekühlt, 5,9 ml Methyllithium zugegeben) gegeben. Nach 5,5 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wird auf 0°C abgekühlt. Es werden 2 ml Eisessig in 8 ml Ether zugegeben und 8 ml Ethanthiol. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur werden 60 ml Wasser zugefügt und viermal mit Methylenchlorid ausgeschüttelt. Die organische Phase wird mit Na2SO4 vorgetrocknet, filtriert, am Rotationsverdampfer eingeengt und durch Chromatographie gereinigt. MS 266 (M+H)+
Zu einer Lösung von 4,5 ml Methylenchlorid + Oxalylchlorid werden bei -78°C 0,5 ml DMSO zugegeben. Nach 15 Minuten wird diese Lösung zu einer Lösung von 193 mg der oben erhaltenen Verbindung in 4 ml Methylenchlorid gegeben. Nach zwei Stunden bei -78°C werden 1 ,5 ml Trieethylamin zugegeben. Nach 30 Minuten Rühren bei 0°C werden 15 ml Wasser zugegeben, und mit Diethylether viermal ausgeschüttelt. Die organische Phase wird mit Na->Sθ4 vorgetrocknet, am Rotationsverdampfer eingeengt und durch Chromatographie gereinigt.
C H N berechnet: 63,87 6,51 5,32 gefunden: 63,96 6,55 5,45
0,464 g der oben erhaltenen Verbindung und 5 ml 4 N HCI werden zusammen auf 50°C erwärmt. Nach 90 Minuten wird das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abgekühlt und mit Eiswasser verdünnt. Man erhält das kristalline Produkt.
C H N berechnet: 61 ,27 5,57 5,95 gefunden: 61 ,2 5,5 6,2
B) Herstellung der Terpyridin-Lanthanid-Komplexe
Beispiel B1 :
(a) 1 mMol der entsprechenden Terpyridin-bis-hydrazino-Verbindung aus Beispiel A1 (c) wird unter Argon in 60 ml absolutem Methanol aufgenommen, mit dem Lanthanid(lll)acetat (1 mMol) versetzt und 10 Minuten unter Rückfluss erhitzt. Zu dieser Lösung werden nacheinander ,2 mMol der entsprechenden 2,6-Dicarbonylverbindung und 5 mMol konzentrierte wässrige Salzsäure gegeben. Es wird 2 Tage gekocht. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wird das Produkt abfiltriert und am Hochvakuum getrocknet. Nach dieser Vorschrift werden die Verbindungen 1.1 bis 1.28 der Tabelle 1 hergestellt.
(b) 1 mMol der entsprechenden Terpyridin-bis-hydrazino-Verbindung aus Beispiel A1 (c) wird unter Argon in 60 ml absolutem Methanol aufgenommen, mit dem Lanthanid(lll)chlorid (1 mMol) versetzt und 10 Minuten unter Rückfluss erhitzt. Zu dieser Lösung werden nacheinander 1 ,2 mMol der in Beispiel A2(a) erhaltenen Verbindung gegeben. Es wird über Nacht gekocht. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wird das Lösungsmittel abgezogen und das Produkt durch Umkristallisation aus Dimethylsulfoxid und Toluol erhalten. Nach dieser Vorschrift werden die Verbindungen 1.29 bis 1.32 der Tabelle 1 hergestellt.
Tabelle 1:
Verbdg. Nr. Ln 3+
Ri R4 Molmasse [M-Cl"] berechnet/gefunden
1.31 La Ph-H H CH2CH2COOH 1.32 Eu Ph-H H CH2CH2COOH **
Ph: 4-Phenylen
* C H N CI berechnet (+ 2DMSO): 45.81 4.16 11.55 10.96 gefunden: 45.3 4.3 11.8 10.6 ** C H N CI berechnet (+2DMSO+4H2O): 42.11 4.58 10.62 10.07 gefunden: 42.2 4.6 10.6 9.5
Beispiel B2: Herstellung von Isothiocyanat-Derivaten
Zu einer Suspension von 4,4 mMol Natriumbicarbonat und 3,5 mMol Thiophosgen in 4 ml Chloroform wird eine Lösung des entsprechenden Komplexes der Tabelle 1 gegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 2,5 Stunden heftig gerührt. Die Chloroform-Phase wird abgetrennt und einmal mit Wasser gewaschen. Alle wässrigen Phasen werden vereinigt und getrocknet. Die so erhaltenen Produkte 2.1 bis 2.15 der Tabelle 2 werden ohne weitere Reinigung weiterverwendet.
Tabelle 2:
Etwa 30 mg der 'controied pore glass' (CPG) Festphase werden in einem Standard Applied Biosystem Reaktionsgefäß für eine 1.5 μMol Synthese eingewogen. Die CPG-Festphase (1) trägt den geschützten 3'-Baustein (im Beispiel, dC) des zu synthetisierenden Amino- Oligonukleotids.
Für die Oligomerisierung werden die Phosphoramidite (6), (7), (8) und (9) eingesetzt.
Für die spätere Aufknüpfung der Metallkomplexe via der Aminofunktion werden gesonderte Phosphoramidite (10), (11), (12) und (13) eingesetzt.
(11)
Die Synthesezyklen werden mit dem Syntheseautomat 394 von Applied Biosystem mit einer Veränderung (Kopplungszeit der Phosphoramidite der Desoxy-Reihe (6), (7), (8) und (9) beträgt 2 Minuten, die der Amidite (10) und (11) beträgt 10 Minuten, (12) beträgt 5 Minuten und (13) beträgt 40 Minuten; (13) wird lOOfach im Uberschuss eingesetzt) nach dem Standardprotokoll der Firma Applied Biosystem durchgeführt (User Manual Version 2.0 (1992) 1.0 μMol Cyclus, Appen. 1-41).
Als weitere käufliche Reagenzien werden eingesetzt: 0,1 M Phosphoramidit Tetrazol/Acetonitril: 4 %, 96 % Tert.-Butylphenoxyessigsäureanhydrid/Pyridin/Tetrahydrofuran: 10 %, 10 %, 80 % N-Methylimidazol/Tetrahydrofuran: 16%, 84% Trichloressigsäure/Dimethylchlormethan: 2%, 98% Jod/Wasser/Pyridin/Tetrahydrofuran: 3%, 2%, 20%, 75%
Synthetisiert werden die folgenden Amino-Oligonukleotide:
(821 ) 5'-GTA GAC TGG CGA GAT* CGG CAG TCG GCT AG-3', worin T*
bedeutet, wobei T für Thymin steht, (823) 5'-GTA GAC TGG CGA GAT* CGG CAG TCG GCT AG-3', worin T*
bedeutet, wobei T für Thymin steht, (940) 5'-GTA GAC TGG CGA GAT CGG CAG T*CG GCT AG-3', worin T*
bedeutet, und
D) Herstellung der Terpyridin-Lanthanid-Oligonukleotid-Konjugate
Beispiel D1 : Herstellung von Konjugaten, bei denen das Oligonukleotid an den Terpyridin- Teil des Lanthanid-Komplexes gebunden ist
(a) 0,2 mg des entsprechenden Aminooligonukleotids werden in 150 μl Pyridin/Wasser/Triethylamin (90:15:1) gelöst. Nach Zugabe von 1 mg des entsprechenden Isothiocyanato-Komplexes der Tabelle 2 wird das Gemisch 1 Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Reaktionsgemisch wird einmal gegen eine 0,1 molare Kaliumchloridlösung und dreimal gegen Wasser dialysiert. Das Produkt wird durch Umkehrphasen-HPLC (Gradient: von 0 % bis 30 % Acetonitril in 0,05 M Triethylammoniumacetat in 90 Minuten) auf einer Nucleosil/-CιB-Säule oder durch lonentauscher-HPLC (Gradient: 10 Minuten 20 % einer 1 M Kaliumchloridlösung und 80 % einer 20 mM Kaliumphosphatlösung pH 6.0, welche 20 % Acetonitril enthält; dann innerhalb von 60 Minuten auf 80 % Kaliumchloridlösung) bei 60°C auf einer PVDI.4000A-Säule, 5 μm ergibt die reinen Konjugate 3.1 bis 3.13, 3.18 und 3.21 der Tabelle 3.
Beispiel D2: Herstellung von Konjugaten, bei denen das Oligonukleotid an den Pyridin-Teil des Lanthanid-Komplexes gebunden ist
Eine Lösung von 3 μMol des entsprechenden Carbonsäure-Derivates 1.29 bis 1.32 in 200 μl Dimethylsulfoxid wird mit 3.3 μMol Dicyclohexylcarbodiimid und 3.3 μMol N- Hydroxysuccinimid versetzt und 16 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Nach Zugabe von 100 μMol N,N-Diisopropylethylamin werden 0,2 mg des entsprechenden Aminooligonukleotids zugegeben. Nach vier Tagen bei Raumtemperatur wird zweimal gegen 50 mM Triethylammoniumhydrogencarbonat und zweimal gegen Wasser dialysiert. Die Reinigung durch Umkehrphasen-HPLC (siehe (a) ergibt die Verbindungen 3.14 bis 3.17, 3.19, 3.20 und 3.22 bis 3.25 der Tabelle 3.
Tabelle 3:
Vbdg. Nr. Ln R4 MM RZ
35,6*
MM: Molmasse berechnet/gefunden
RZ: lonentauscher-HPLC Retentionszeit (Minuten)
Ph-691 : -Phenyl-N(H)C(S)-oligo 691
Ph-821 : -Phenyl-N(H)C(S)-oligo 821
Ph-823: -Phenyl-N(H)C(S)-oligo 823
A-691 : -CH2CH2C(O)-oligo 691
A-821 : -CH2CH2C(O)-oligo 821
A-823: -CH2CH2C(O)-oligo 823
A-940: -CH2CH2C(O)-oligo 940
*Umkehrphasen-HPLC Retentionszeit (Minuten)
E) Herstelluno der Ziel-RNA
Bei den als "Ziel-RNA" bezeichneten Oligonukleotiden handelt es sich aus praparativen Gründen grösstenteils um chimäre Moleküle, die teilweise aus Desoxyribonukleinsäure (DNA)-Bausteinen (mit "d" bezeichnet) und teilweise aus Ribonukleinsäure (RNA)- Bausteinen (mit "r" bezeichnet) bestehen. Die nach Hybridisierung mit einem entsprechenden Antisense-Oligonukleotid ungepaarten Nukleotide einer Ziel-RNA befinden sich in deren Ribonukleinsäure-Teil. Beispiel E1 :
Synthese von 5'd(CTA GCC GAC TGQ rfCGA UGA CUC GCC AC). RNA-E1.
Etwa 30 mg der 'controied pore glass' (CPG) Festphase werden in einem Standard Applied
Biosystem Reaktionsgefäß für eine 1.5 μMol Synthese eingewogen. Die CPG-Festphase
(1) trägt den geschützten 3'-Baustein (im Beispiel, rC) der zu synthetisierenden RNA.
Für die Oligomerisierung werden die Phosphoramidite (2) bis (9) eingesetzt.
(7)
Die Synthesezyklen werden mit dem Syntheseautomat 394 von Applied Biosystem mit einer Veränderung (Kopplungszeit der Phosphoramidite der Riboreihe beträgt 10 Minuten) nach dem Standardprotokoll der Firma Applied Biosystem durchgeführt (User Manual Version 2.0 (1992) 1.0 μMol Cyclus, Appen. 1-41).
Als weitere käufliche Reagenzien werden eingesetzt: 0,1 M Phosphoramidit Tetrazol/Acetonitril: 4 %, 96 % Tert.-Butylphenoxyessigsäureanhydrid/Pyridin/Tetrahydrofuran: 10 %, 10 %, 80 % N-Methylimidazol/Tetrahydrofuran: 16%, 84% Trichloressigsäure/Dimethylchlormethan: 2%, 98% Jod/Wasser/Pyridin/Tetrahydrofuran: 3%, 2%, 20%, 75%.
Synthetisiert wird folgende Substrat-RNA : Titel-RNA-E1
(b) Abspaltung von der Festphase (CPG) und Entschύtzung der Base: Die Festphase (1.5 μMol Synthese) wird mit 800 μl ammoniakgesättigtem Ethanol versetzt und bei Raum¬ temperatur über Nacht inkubiert. Das ammoniakgesättigte Ethanol wird aus einem Teil Ethanol und drei Teilen Ammoniak 33% hergestellt. Nach der Inkubation wird die ammo¬ niakgesättigte ethanolische Lösung abdekantiert, mit ammoniakalischem Ethanol das CPG nachgewaschen und die vereinten Lösungen lyophilisiert.
(c) Entschützuno der Tertiärbutyl-dimethylsilyl (TBDMS) Schutzoruppe: Die lyophilisierte Probe wird mit 800 μl 1 M Tetrabutylammoniumfluorid-Tetrahydrofuran (TBAF/THF) Lösung versetzt. Die Probe wird 30 Minuten intensiv vermischt. Die Inkubation erfolgt 24 Stunden bei Raumtemperatur unter Lichtausschluss.
Die RNA wird mit 50 mM Triethylamin-hydrogencarbonat (TAHC) Lösung pH 7.0 (1 + 1) gemischt und direkt bei 4°C dialysiert. (Wasser hat Nanopure'-Qualität)
(d) Dialyse: Dialysiert wird 3 mal gegen 7.5 mM TAHC-Lösung pH 7.0. (Die Lösung wird mit Nanopure'-Qualität Wasser hergestellt, mit CO2 auf pH 7.0 eingestellt und auf 4°C vorgekühlt.) Die Probe wird lyophilisiert und mit Diethylpyrocarbonat-behandeltem [Sambrook, Fritsch, Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Habor Laboratory Press (1989)] und autoklaviertem H2O (DEPC-H2O) auf¬ genommen. Ein Aliquot wird zur Konzentrationsbestimmung bei 260 nm eingesetzt. Im weiteren Umgang mit RNA wird immer RNase- und Fremdmetallionen-frei gearbeitet.
(e) 5' Endmarkieruno der Substrat-RNA mit ^fPI v-ATP: Zur enzymatischen Kinasereaktion werden 100 pMol RNA aus dem obigen Syntheseprotokoll in 20 μl Volumen bei 37°C 20 Minuten inkubiert. Die Reaktionslösung enthält 0.5 μl T4-Polynukleotidkinase (Promega, 10 Units/μl), 2 μl Kinasepuffer (50 mM Tris-HCI pH 7.5, 10 mM MgCI2, 5 mM 1,4 Dithio-DL-threitol, 0.1 mM Spermidin) und 0.5 μl ∞[P] γ-ATP (Amersham, >1000 Ci/mMol, 10μCi/μl). Anschliessend werden 138 μl Tris-HCl/EDTA (10 mM/1 mM, pH 7.5), 2 μl Glycogen (35 mg/ml) und 40 μl NH CH3COO (10 M) hinzugefügt. Nach Zugabe von 600 μl Ethanol wird die Probe 30 Minuten bei -20°C gekühlt und anschliessend 20 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Das Pellet wird lyophilisiert, mit 15 μl Auftragspuffer (0.025 % Bromphenolblau, 0.025 % Xylen Cylanol in einer Mischung 1:1 aus 80 % Formamid und 7 M Harnstoff, 20 mM Citronensäure, 1 mM EDTA) versetzt, 1 Minute bei einer Temperatur von 95°C denaturiert, sofort auf Eis gestellt und für die gelelektrophoretische Auftrennung in eine 1.0 cm x 1 mm Tasche aufgetragen. Die gelelektrophoretische Trennung wird 2.5 h bei 55 Watt nach einem Vorlauf von 40 Minuten bei 55 Watt durchgeführt.
(f) Reinigung und Isolierung der kinasierten Substrat-RNA: Für die gelelektrophoretische Auftrennung der Kinasereaktion wird ein 12 %iges Poiyacrylamidgel (1 mm x 30 cm x 40 cm) angefertigt. Die Polymerisationsreaktion wird in 170 ml durchgeführt. Hierzu werden 51 ml Acrylamidlösung (40 % Acrylamid/Bisacrylamid 10:1), 17 ml TBE-Puffer (0.89 M Tris- (hydroxymethyl)-aminomethan, 0.89 M Borsäure, 0.02 M Ethylendiamin-tetraessigsäure) und 71.4 g Harnstoff mit der entsprechenden Menge H2O gemischt. Die Polymerisation wird gestartet mit 170 μl Ammoniumperoxidisuffat Lösung (25 % w/v) und 170 μl TEMED (N,N,N',N', Tetramethylethylendiamin). Das Gel kann nach 1 Stunde verwendet werden. Als Laufpuffer wird 10 fach verdünnter TBE-Puffer verwendet.
Nach der gelelektrophoretischen Auftennung wird die kinasierte RNA mittels eines auf¬ gelegten Röntgenfilms detektiert und aus dem Gel ausgeschnitten. In einer Elektroeiutions- Apparatur (Schleicher und Schuell) wird die RNA aus dem Gelstück unter Anlegen von 100 V eluiert (3.3 V/cm). Als Elutionspuffer wird 10 fach verdünnter TBE-Puffer verwendet. Die isolierte RNA in 360 μl Eluat wird mit 40 μl NaCH3COO (3M pH 5.2) und 1 ml Ethanol versetzt. Die Probe wird 20 Minuten bei -20°C gekühlt und anschliessend 20 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Das Pellet wird lyophilisiert mit 30 μl H2O aufgenommen. Die Lösung wird nach dem Czerenkow-Protokoll im Szintillationszähler vermessen und auf 12000 cpm/μl eingestellt. Beispiel E2:
Es wird wie in Beispiel E1 verfahren und die Ziel-RNA "RNA-E2" mit der folgenden Sequenz hergestellt:
5'd (CTA GCC GAC TG) r(CCG AUC UCA AG) d(CCA GTC TAC).
Beispiele E3 bis E31 :
Analog zu Beispiel E1 werden weitere Ziel-RNA-Moleküle E3 bis E30 sowie ein Ziel-DNA- Molekül E31 hergestellt, deren Strukturen im Kapitel F in den Tabellen 4, 6 und 8 dargestellt sind.
F) Anwendungsbeispiele (RNA-Spaltunq)
Es wird das Spaltungsverhalten von verschiedenen erfindungsgemässen Antisense- Oligonukleotid-Konjugaten gegenüber verschiedenen Ziel-RNAs untersucht. Je nach Position der Bindung des Komplexes auf der jeweiligen Antisense-Oligonukleotid-Sequenz bzw. je nach Position des auftretenden Mismatch (ungepaarte Nukleotide) im Hybrid aus Ziel-RNA und Antisense-Oligonukleotid-Konjugat in Bezug auf wird zwischen die in den Figuren 1 , 2 und 3 dargestellten Fälle unterschieden.
Beispiel F1 :
Hier handelt es sich um die Spaltung einer Ziel-RNA durch ein erfindungsgemässes Antisense-Oligonukleotid-Konjugat, wie in Fig. 3 illustriert.
Für die gelelektrophoretische Auftrennung und Identifizierung der RNA Produkte nach der Spaltreaktion wird ein 12 %iges Long Ranger7 Gel (AT Biochem, modifiziertes Poly- acrylamidgel) (0.4 mm x 30 cm x 40 cm) angefertigt. Die Polymerisationsreaktion wird in 90 ml durchgeführt. Hierzu werden 21 ml Long Ranger' Lösung (50%) 11 ml TBE-Puffer (0.89 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, 0.89 M Borsäure, 0.02 M Ethylendiamin- tetraessigsäure) und 37 g Harnstoff mit der entsprechenden Menge H2O gemischt. Die Polymerisation wird gestartet mit 450 μl Ammoniumperoxidisulfat Lösung (10 % w/v) und 45 μl TEMED. Das Gel kann nach 1 h verwendet werden. Als Laufpuffer wird 16.66 fach verdünnter TBE-Puffer verwendet. Die Trennung erfolgt innerhalb 75 Minuten bei 60 Watt. Nach der gelelektrophoretischen Auftrennung werden die markierten Spaltprodukte (RNA- Oligomere) mittels eines aufgelegten Röntgenfilms oder mittels Phosphorimager'detektiert, respektive ausgezählt.
Die Spaltreaktion wird in 10 μl Volumen durchgeführt. Beispiel einer Konzentrationsreihe:
Zu 1 μl Substrat-RNA (12000 cpm) werden 1 μl Oligonukleotidkonjugat (10 μM) oder entsprechende Verdünnungen (Endkonzentration 1 μM, 750 nM, 500 nm, 250 nM, 100 nM, 50 nM, 10 nM, 1 nM und 0,5 nM), 4 μl Tris-HCI Puffer (50 mM pH 7.4 bei 37°C) und die entsprechende Menge H2O zupipettiert. Diese Mischung wird 1 Minute auf 85°C erhitzt und anschliessend 16 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wird beendet durch Zugabe von 5 μl Auftragspuffer (0.025 % Bromphenolblau, 0.025 % Xylen Cylanol in einer 1 :1 Mischung aus 80 % Formamid mit 7 M Harnstoff, 20 mM Citronensäure und 1 mM EDTA). Für die gelelektrophoretische Trennung werden 7.5 μl der Probe 1 Minute bei 95°C denaturiert, sofort auf Eis gestellt und in eine Geltasche aufgetragen.
Beispiel einer Zeitreihe:
Zu 1 μl Substrat-RNA/DNA (12000 cpm) werden 1 μlOligonukleotidkonjugat (10 μM), 4 μl Tris-HCI Puffer (50 mM pH 7.4 bei 37°C) und die entsprechende Menge H2O zupipettiert. Diese Mischung wird 1 Minute auf 85°C erhitzt und anschliessend 2h, 8h, 16h, 40h und 64h bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wird beendet durch Zugabe von 5 μl Auftragspuffer (0.025 % Bromphenolblau, 0.025 % Xylen Cylanol in einer 1:1 Mischung aus 80 % Formamid mit 7 M Harnstoff, 20 mM Citronensäure und 1 mM EDTA). Für die gelelektrophoretische Trennung werden 7.5 μl der Probe 1 Minute bei 95°C denaturiert, sofort auf Eis gestellt und in eine Geltasche aufgetragen
Die Substrat-RNA Konzentration wird als 25-facher Uberschuss wie folgt abgeschätzt: Bei 100 pMol Rohprodukt an RNA und einer Ausbeute von 10 % bei der Gelreinigung be¬ finden sich nach dem beschriebenen Protokoll die Endkonzentrationen von 0.04 μM an Substrat-RNA und 1 μM Oligonukleotidkonjugat in der Reaktionsmischung. Wird nur der Terpyridin-Lanthanidkomplex als Vergleich eingesetzt, so werden 400 μM Komplex benötigt, um etwa die gleiche Spaltung zu erreichen wie 40 nM Oligonukleotidkonjugat erreicht. Dabei handelt es sich um einen 10.000-fachen Uberschuss von Komplex zum Oligonukleotidkonjugat. Bei der Konzentrationsreihe kann eine Spaltung von 40 μM Substrat-RNA/DNA mit 40 nM
Oligonukleotidkonjugat nach 16h bei 37 °C demonstriert werden.
Spaltprodukte bei der Spaltung mit Verbindung 3.2 aus Tabelle 3 mit von RNA-E1 : <20% des Ausgangsmaterial 5'd(CTA GCC GAC TGC) r(CGA UGA CUC GCC AC) ist ungespalten.
Hauptspaltprodukte (J, 80%): 5'd(CTA GCC GAC TGC) r(CGA UGcp) 5'd(CTA GCC GAC TGC) r(CGA Ucp) 5'd(CTA GCC GAC TGC) r(CGcp) Weitere Spaltprodukte (Y 5%): 5'r(CUA GCC GAC UGC CGA UCU CGCcp) 5'r(CUA GCC GAC UGC CGA UCU Ccp) (cp bedeutet 2',3'-Cyclophosphat.
Beispiel F2:
Hier handelt es sich um die Spaltung einer Ziel-RNA durch ein Antisense-Oligonukleotid-
Konjugat, wie in Fig. 1 illustriert.
Es wird wie in Beispiel E1 verfahren unter Verwendung der Verbindung 3.20 aus Tabelle 3 und der Ziel-RNA RNA-E2.
Spaltprodukte:
<5% des Ausgangsmaterial 5'd(CTA GCC GAC TG) r(CCG AUC UCA AG) d(CCA GTC
TAC) ist ungespalten.
Hauptspaltprodukte (T 95%):
5'd(CTAGCCGACTG) r(CCGAUCUCAAcp)
5'd(CTAGCCGACTG) r(CCGAUCUCAcp)
5'd(CTAGCCGACTG) r(CCGAUCUCcp) Beispiel F3:
Hier handelt es sich um weitere Untersuchungen der Spaltung verschiedener Ziel-RNAs durch verschiedene Antisense-Oligonukleotid-Konjugate, wie in Fig. 1 illustriert.
In der folgenden Tabelle 4 sind die Strukturen der verwendeten Ziel-RNAs dargestellt. Fettgedruckte Nukleotide sind komplementär zu demjenigen Nukleotid des Antisene- Oligonukleotid-Konjugates, an das der Komplex gebunden ist. Unterstrichene Nukleotide sind im Hybrid aus Ziel-RNA und Konjugat ungepaart (Mismatch). Doppelte Unterstreichung bei der Ziel-RNA E17 bedeutet, dass aufrund der gewählten Sequenz jeweils 2 benachbarte Nukleotide im unterstrichenen Bereich ungepaart sind, ohne dass eindeutig bestimmt werden kann, um welche Nukleotide es sich handelt. Weiterhin ist schematisch die Lage des Konjugates, insbesondere des Komplexes, in Bezug auf die Ziel-RNAs dargestellt.
Tabelle 4: Strukturen verschied ner Ziel-RNAs
E15 5'd (CTA GCC GAC TG)r(C CGA UCU AGCG)d(C CAG
E16 5"d (CTA GCC GAC TG)r(C CGA UCU AACG)d(C CAG
E17 5'd (CTA GCC GAC TG)r(C CGA LLCU £U£G)d(C CAG
E18 5*d (CTA GCC GAC TG)r(C CGA UCU CGAG)d(C CAG
E2(s.o.) 5'd (CTA GCC GAC TG)r(C CGA UCU CAAG)d(C CAG
E19 5'r CUA GCC GAC UGC CGA UCU AACGC CAG
Zur Spaltung wird wie in Beispiel F1 verfahren, wobei die in der folgenden Tabelle 5 dargestellten Antisense-Oligonukleotid-Konjugate (siehe auch Tab. 3) und Ziel-RNAs (siehe Tab. 4) verwendet werden. In Tabelle 5 sind die Hauptspaltprodukte der jeweiligen Ziel- RNA wiedergegeben. Beispielsweise bedeutet die Angabe " +5A" bei der Spaltung der Ziel- RNA E2 durch das Konjugat 3.22, dass eine Spaltung zwischen den Nukleotiden +5A und +6A stattfindet.
Tabelle 5: Hauptspaltprodukte der Spaltung verschiedener Ziel-RNAs durch verschiedene Antisense-Oligonukleotid-Konjugate
*: nicht untersucht
Beispiel F4:
Hier handelt es sich um weitere Untersuchungen der Spaltung verschiedener Ziel-RNAs durch verschiedene Antisense-Oligonukleotid-Konjugate, wie in Fig. 2 illustriert.
In der folgenden Tabelle 6 sind die Strukturen der verwendeten Ziel-RNAs dargestellt. Es gelten die zur Tabelle 4 gegebenen Erläuterungen.
Tabelle 6: Struk ren v i -
E2 5'd (CTA GCC GAC TG) r(C CGA UCU CAAG)d(C CAG TCT AC) E19 5'r CUA GCC GAC UGC CGA UCU AACGC CAG UCU AC
Zur Spaltung wird wie in Beispiel F1 verfahren, wobei die in der folgenden Tabelle 7 dargestellten Antisense-Oligonukleotid-Konjugate (siehe auch Tab. 3) und Ziel-RNAs (siehe Tab. 6) verwendet werden. In Tabelle 7 sind die Hauptspaltprodukte der jeweiligen Ziel- RNA wiedergegeben (siehe auch Erläuterung zur Tab. 5).
Tabelle 7: Hauptspaltprodukte der Spaltung verschiedener Ziel-RNAs durch ein Antisense- Oligonukleotid-Konjugat
ERSATZBLAH (REGEL 26)
Beispiel F5:
Hier handelt es sich um weitere Untersuchungen der Spaltung verschiedener Ziel-RNAs durch verschiedene Antisense-Oligonukleotid-Konjugate, wie in Fig. 3 illustriert.
In der folgenden Tabelle 8 sind die Strukturen der verwendeten Ziel-RNAs dargestellt. Darüberhinaus wird eine Kontroll-DNA (E31) verwendet. Es gelten die zur Tabelle 4 gegebenen Erläuterungen. Tabelle 8: Strukturen verschiedener Ziel-RNAs
Zur Spaltung wird wie in Beispiel F1 verfahren, wobei die in der folgenden Tabelle 9 dargestellten Antisense-Oligonukleotid-Konjugate (siehe auch Tab. 3) und Ziel-RNAs (siehe Tab. 8) verwendet werden. In Tabelle 9 sind die Hauptspaltprodukte der jeweiligen Ziel- RNA wiedergegeben (siehe auch Erläuterung zur Tab. 5). Tabelle 9 Hauptspaltprodukte der Spaltung verschiedener Ziel-RNAs durch verschiedene Antisense-Oligonukleotid-Konjugate:
nicht untersucht

Claims

PATENTANSPRÜCHE:
1. Oligonukleotid aus Desoxyribonukleotiden, unnatürlichen synthetischen Nukleotidbausteinen, oder Peptidnukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass an das Oligonukleotid ein Umesterungs- oder Hydrolysekatalysator gebunden ist, und die innere Sequenz des Oiigonukletoids teilweise nicht komplementär zu einer natürlich vorkommenden Ziel-RNA ist, mit der Massgabe, dass Oligonukleotide, deren innere Sequenz teilweise nicht komplementär zu einer natürlich vorkommenden Ziel-RNA ist und an die als Umesterungs- oder Hydrolysekatalysator ein Texaphyrin-Metall-Komplex gebunden ist, ausgenommen sind.
2. Oligonukleotid gemäss Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die teilweise Nicht- Komplementarität in der Sequenz durch eine strukturelle Störung hervorgerufen wird, so dass keine Basenpaarung erfolgen kann.
3. Oligonukleotid gemäss Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass verglichen mit der Ziel-RNA in der Sequenz des Oligonukleotids ein oder mehrere aufeinanderfolgende Nukleotidbausteine fehlen.
4. Oligonukleotid gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass 1 bis 10 Nukleotid¬ bausteine fehlen.
5. Oligonukleotid gemäss Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Oligonukleotid ein oder mehrere aufeinanderfolgende Nukleotidbausteine enthält, die mit den entspre¬ chenden Nukleotidbausteinen der Ziel-RNA keine Paarbildung eingehen.
6. Oligonukleotid gemäss Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligonukleotid 1 bis 10 nicht-paarende Bausteine enthält.
7. Oligonukleotid gemäss Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass bis zu 10 mit der Ziel- RNA nicht-paarende äussere Nukleotidbausteine an die innere Sequenz gebunden sind.
8. Oligonukleotid gemäss Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es natürliche Nuk¬ leotidbausteine als nicht-paarende Bausteine enthält.
9. Oligonukleotid gemäss Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es unnatürliche, syn¬ thetische Nukleotidbausteine als nicht-paarende Bausteine enthält.
10. Oligonukleotid gemäss Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es 5 bis 100 Nuk¬ leotidbausteine enthält.
11. Oligonukleotid gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es 5 bis 50 Nuk¬ leotidbausteine enthält.
12. Oligonukleotid gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es 8 bis 30 Nuk¬ leotidbausteine enthält.
13. Oligonukleotid gemäss Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass sich der nicht-paa¬ rende Bereich im mittleren Bereich der Sequenz befindet.
14. Oligonukleotid gemäss Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es aus natürlichen Desoxynukleosiden der Purinreihe und der Pyrimidinreihe aufgebaut ist.
15. Oligonukleotid gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass es aus 2'-Desoxy- 2-aminoadenosin, 2'-Desoxy-5-methylcytosin, 2'-Desoxyadenosin, 2'-Desoxycytidin, 2'- Desoxyguanosin und 2'-Thymidin aufgebaut ist.
16. Oligonukleotid gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass es aus 2-Desoxy- adenosin (A), 2'-Desoxycytidin (C), 2'-Desoxyguanosin (G) und 2'-Thymidin (T) aufgebaut ist.
17. Oligonukleotid gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich die unnatürli¬ chen synthetischen Bausteine von natürlichen Nukleosiden der Purinreihe und der Pyrimi¬ dinreihe ableiten.
18. Oligonukleotid gemäss Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass sich der Baustein von Adenosin, Cytidin, Guanosin, 2-Aminoadenosin, 5-Methylcytosin, Thymidin und den zuvor genannten Desoxyderivaten ableitet.
19. Oligonukleotid gemäss Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das zu einer Ziel- RNA teilweise komplementäre Oligonukleotid aus (1) natürlichen Desoxynukleosiden oder aus unnatürlichen synthetischen Bausteinen aufgebaut ist, und (2) die nur teilweise komplementäre Eigenschaft durch das Fehlen von 1 bis 4 Bausteinen in der sonst komple¬ mentären Sequenz erzeugt wird.
20. Oligonukleotid gemäss Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass ein Umesterungs- oder Hydrolysekatalysator an N-, -S- oder O-Atome in den 3'- oder 5'-Endgruppen in der Oligonukleotidsequenz; an C, N- oder O-Atome von Nukleinbasen in oder am Ende der Sequenz; an 2'-Stellungen des Furanoserings an O-, S- oder N-Atome in oder am Ende der Sequenz; oder an O-, S- oder N-Atome der Nukleotidbrückengruppe in der Sequenz ge¬ bunden sein direkt oder über eine Brückengruppe gebunden ist.
21. Oligonukleotid gemäss Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Brückengruppe der Formel I entspricht,
worin X1 eine direkte Bindung oder eine bivalente, offenkettige oder cyclische Kohlen¬ wasserstoffgruppe mit 1 bis 22 C-Atomen, die ununterbrochen oder mit Resten aus der Gruppe -S-, -NR-, -C(O)-O-, -C(O)-NR- unterbrochen ist, oder einen Polyoxaalkylenrest mit 1 bis 12 Oxaalkyleneinheiten und 2 oder 3 C-Atomen im Alkylen bedeutet; X2 -O-, -S-, -NR-, -NH-C(O)-NH-, -NH-C(S)-NH-, -O-C(O)-NH-, -NH-C(O)-O-, -O-C(O)-O-, -C(O>-O-, -C(S)-O-, - O-C(O)-, -O-C(S)-, -C(O)-NR-, -RN-C(O)-, -S(O)-O-, -O-S(O)2-, -S(O)2-NR-, -NR-S(O)-, - P(O)-(OM)-O-, -O-P(O)-(OM)-, -P(O)-(OM)-NR-, -NR-P(O)-(OM)-, -PH(O)-O-, -O-PH(O)-, - PH(O)-NR- und -NR-PH(O)- darstellt; X3 unabhängig die Bedeutung von X1 hat und x gleich 0 ist, wenn X3 eine direkte Bindung darstellt; X» eine Bindung an ein O-, N- oder C-Atom eines Nukleosidbausteins bedeutet, oder X4 -O-P(O)(OM)-O-, -NR-P(O)(OM)-O-, -O- P(O)(OM)-NR- oder -NR-P(O)(OM)-NR- darstellt, wenn x gleich 1 ist und X3 keine direkte Bindung ist; R H, d-Ce-Alkyl, Phenyl oder Benzyl bedeutet; M für H, C-i-Cβ-Alkyl, Phenyl oder Benzyl, ein Alkalimetallkation oder ein Ammoniumkation steht; und x für 0 oder 1 steht.
22. Oligonukleotid gemäss Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, dass in Formel I Xi eine direkte Bindung oder Cι-C4-Alkylen, Phenylen oder Benzylen bedeutet, wobei das Alkylen mit -C(O)-O- oder -C(O)-NH- unterbrochen sein kann; Xg -C(O)-O-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)- NH- oder -NH-C(S)-NH- darstellt; X3 CrC-iβ-Alkylen, bevorzugter C2-Ci2-Alkylen darstellt; und X eine Bindung an ein O-, N- oder C-Atom eines Nukleotidbausteins bedeutet, oder XA -O-P(O)(OM)-O-, -NR-P(O)(OM)-O-, -O-P(O)(OM)-NR- oder -NR-P(O)(OM)-NR darstellt.
23. Oligonukleotid gemäss Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem an das Oligonukleotid gebundenen Katalysatoren um Poiypeptide, Metalisalze und Metall¬ komplexe handelt.
24. Oligonukleotid gemäss Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Metalle ausge¬ wählt sind aus den Nebengruppen des Periodensystems der Elemente sowie den Haupt¬ gruppenmetallen In, Tl, Sn, Pb und Bi.
25. Oligonukleotid gemäss Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Metalle ausge¬ wählt sind aus Scandium, Yttrium, Lanthan, die Lanthanidenmetalle, Ti, Zr, Hf, V, Nb, Ta, Cr, Mo, W, Mn, Fe, Ru, Os, Co, Rh, Ir, Ni, Pd, Pt, Cu, Ag, Au, Zn, Cd und Hg.
26. Oligonukleotid gemäss Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Metalle ausge¬ wählt sind aus Scandium, Yttrium, Lanthan, den Lanthanidenmetallen, Cu und Blei.
27. Oligonukleotid gemäss Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass unter den Lantha¬ nidenmetallen die Gruppe Ce, Eu, Gd und Sm ausgewählt ist..
28. Oligonukleotid gemäss Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Anionen für die Metallsalze und Metallkomplθxsalze aus der folgenden Gruppe ausgewählt sein: Halogenid, das Anion einer Sauerstoffsäure, BF41, PF6 l , SiFβ oder AsFe*.
29. Oligonukleotid gemäss Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Metallkom- plexkatalysatoren als Metallkomplexsalze mit heteroorganischen Verbindungen als Kom¬ plexbildnern vorliegen, wobei der Komplexbildner an das Oligonukleotid gebunden ist.
30. Oligonukleotid gemäss Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Komplexbildnern um offenkettige oder cyclische organische Verbindungen mit Heteroato¬ men ausgewählt aus der Gruppe O, S, N und P handelt.
31. Oligonukleotid gemäss Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Komplexbildnern um cyclische oder polycyclische organische Verbindungen mit insgesamt 8 bis 26 Ringgliedern und 2 bis 12 Heteroatomen im Ring handelt.
32. Oligonukleotid gemäss Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Komplexbildnern um Kronenether, Cyanine, Phthalocyanine, Naphthalocyanine, Porphy¬ rine, Phenantroiine, offene und cyclisierte Bis- und Terpyridine, Ethylendiamintetraessig- säure oder Diethylentriaminpentaacetat handelt.
33. Oligonukleotid gemäss Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Konjugat der Formel II entspricht,
A-B-Oligo (II),
worin A ein über C-Atome an B gebundenes cyclisches oder polycyclisches Metallkom¬ plexsalz mit einem Komplexbildner darstellt, der mindestens 12 Ringatome und mindestens 4 Heteroatome aus der Gruppe N und O im Ring enthält, an den zweiwertige oder dreiwertige Metallionen ausgewählt aus der Gruppe Scandium, Yttrium, Lanthan und Lan¬ thanidenmetalle gebunden sind; B für die Brückengruppe der Formel I steht und Oligo ein Oligonukleotid bedeutet, dessen innere Sequenz teilweise nicht komplementär zu einer Ziel-RNA ist.
34. Oligonukleotid gemäss Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass der Komplexbildner insgesamt bis zu 22 Ringatome enthält und die Ringatome ausser den Heteroatomen C- Atome sind.
35. Oligonukleotid gemäss Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass der Komplexbildner 4 bis 12 Heteroatome aus der Gruppe O und N enthält.
36. Oligonukleotid gemäss Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass der Komplexbildn insgesamt 16 bis 20 Ringatome sowie 6 bis 10 N-Atome enthält, wobei es sich bei den übrigen Ringgliedern um C-Atome handelt, und an den Ring 1 bis 6 und bevorzugt 2 bis 4 unsubsfituierte oder substituierte Gruppen -CH=CH-CH=CH- in 1 ,3-Stellung gebunden sin und mit N-Atomen des Rings eine Pyridingruppe bilden.
37. Oligonukleotid gemäss Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Konjugaten um solche der Formel III handelt,
woπn
R und R7 unabhängig voneinander H, C1-C4-Alkyl, d-C4-Alkoxy, CrCirAralkyl oder C6-C1
Aryl bedeuten,
R3 und R6 unabhängig voneinander H, d-C4-Alkyl, C Cι2-Aralkyl oder C6-C-ι6-Aryl sind,
R4 für H, d-Caj-Alkyl, C5-Cβ-Cycloalkyl, C6-C12-Aryl oder Cτ-C12- Aralkyl steht,
Me für ein Lanthan, Lanthanidmetall, Yttrium oder Scandium steht,
Y für ein Anion steht, n die Zahlen 2 oder 3 bedeutet, und m die Zahlen 1 , 2 oder 3 bedeutet, wobei die Reste Alkyl, Cycloalkyl, Aralkyl und Aryl unsubstituiert oder mit C-ι-C4-Alkoxy, F,
CI, Br, -CN, d-C4-Alkyl oder -NO2 substituiert sind, R5 einen Rest der Formel IV
-B-Oligo (IV)
darstellt, und Ri ein H oder einen Substituenten bedeutet, oder
R5 H oder einen Substituenten darstellt und Ri einen Rest der Formel IV bedeutet, wobei B und Oligo die in Anspruch 33 angegebennen Bedeutungen haben.
38. Oligonukleotid gemäss Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass in Formel IM R2und R7 für H stehen, R3 und R6 Cι-C4-Alkyl bedeuten, R4 H, d-C4-Alkyl, Phenyl oder Benzyl darstellen, R, die Gruppe Xi-X- Xa-P Jx-Oligo und R5 H, Methyl oder Methoxy oder R5 die Gruppe und R H, Methyl oder Methoxy darstellen, Xi eine direkte Bin¬ dung oder Cz-Ce-Alkylen ist, X2 -O-, -NH-, -C(O)-O-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-NH- oder -HN- C(S)-NH- bedeutet, X3 d-CirAlkylen oder Phenylen darstellt, X» eine Bindung an ein O-, N- oder C-Atom eines Nukleosidbausteins bedeutet, oder X4-O-P(O)(OM)-O- darstellt, x für 0 oder 1 steht, Me La, Ce, Nd, Eu oder Gd bedeutet, n für 2 oder 3 und m für 1 oder 2 stehen, Y CI, Br, CH3C(O)O, CIO4, BF4, PF6, F3C-SO3 oder Tosylat darstellt, M für H, Na oder K steht, und Oligo einen Oligonukleotidrest bedeutet, dessen innere Sequenz zu einer Ziel-RNA nur teilweise komplementär ist und der aus natürlichen Desoxyribonuleotidbausteinen oder unnatürlichen synthetischen Nukleotidbausteinen aufgebaut ist, wobei bezogen auf die Ziel-RNA 1 bis 4 Bausteine fehlen.
39. Verfahren zur Herstellung von Oligonukleotiden, an die ein Umesterungs- oder Hydro- iysekataiysator gebunden ist, und die innere Sequenz des Oiigonukletoids teilweise nicht komplementär zu einer natürlich vorkommenden Ziel-RNA ist, und das Oligonukleotid aus natürlichen Desoxyribonukleinsäurebausteinen oder aus unnatürlichen synthetischen Nukleotidbausteinen aufgebaut ist, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen Umesterungs- oder Hydrolysekatalysator, der eine funktionelle Gruppe an das Grundgerüst gebunden aufweist, mit der funktioneilen Gruppe eines Nukleotidbausteins oder einer funktionell modifizierten Gruppe eines Nukleosidbausteins umsetzt.
40. Verfahren zur Spaltung der Phosphatnukleotidbrücke von Ribonukleinsäuren unter physiologischen Bedingungen und unter Einwirkung eines synthetischen Umesterungs- und/oder Hydrolysekatalysators, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man (a) die Ziel- RNA mit einem Oligonukleotid komplexiert, dessen innere Sequenz teilweise nicht-kom¬ plementär mit der Ziel-RNA ist, und an das ein Umesterungs- oder Hydrolysekatalysator gebunden ist, mit der Massgabe, dass Oligonukleotide, deren innere Sequenz teilweise nicht komplementär zu einer natürlich vorkommenden Ziel-RNA ist und an die als Umesterungs- oder Hydrolysekatalysator ein Texaphyrin-Metall-Komplex gebunden ist, ausgenommen sind, und (b) dann reagieren lässt und spaltet.
41. Verfahren zur Anwendung von Oligonukleotiden gemäss Anspruch 1 in einem thera¬ peutischen Verfahren zur Behandlung von Krankheiten bei Warmblütern einschliesslich des Menschen durch Inaktivierung von Nukleotidsequenzen im Körper.
42. Zusammensetzung auf Basis einer wässrigen Lösung oder Suspension, enthaltend eine wirksame Menge eines Oligonukleotids gemäss Anspruch 1 alleine oder zusammen mit anderen Wirkstoffen, Wasser als pharmazeutisches Trägermaterial und gegebenenfalls Hilfsstoffe.
43. Pharmazeutisches Präparat auf Basis einer wässrigen Lösung oder Suspension, enthal¬ tend eine wirksame Menge eines Oligonukleotids gemäss Anspruch 1 alleine oder zusam¬ men mit anderen Wirkstoffen, Wasser als pharmazeutisches Trägermaterial in einer signi¬ fikanten Menge und gegebenenfalls Hilfsstoffe.
44. Verwendung der gemäss Anspruch 39 hergestellten Oligonukleotide gemäss Anspruch 1 als Diagnostika zum Nachweis von viralen Infektionen oder genetisch bedingten Krankheiten.
45. Verwendung eines Oiigonukleotides gemäss Anspruch 1 zur Behandlung von Krankheiten bei Warmblütern einschliesslich des Menschen durch Inaktivierung von Nukleotidsequenzen im Körper.
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