DE69433626T2

DE69433626T2 - N-2 substituierte purine

Info

Publication number: DE69433626T2
Application number: DE69433626T
Authority: DE
Inventors: Dan Phillip COOK; S. Kanda RAMASAMY; Muthiah Manoharan
Original assignee: Isis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1993-11-29
Filing date: 1994-11-29
Publication date: 2005-02-10
Anticipated expiration: 2014-11-30
Also published as: US6166199A; EP0731807A4; US5587469A; US5808027A; WO1995014707A1; EP0731807A1; EP0731807B1; JPH09500398A; JP3535519B2; DE69433626D1; ATE261984T1; US5459255A

Description

Die Erfindung betrifft Oligonukleotide mit Verbindungen auf Grundlage von Purin. Oligonukleotide werden für eine Reihe von therapeutischen und diagnostischen Zwecken verwendet, wie zum Beispiel für die Behandlung von Krankheiten, Regulierung der Gen-Expression in Versuchssystemen, Untersuchung auf Ribonukleinsäure (RNA) und RNA-Produkte durch Verwendung von Antisense-Wechselwirkungen komplementär zur RNA, Diagnose von Krankheiten, Modulierung der Proteinproduktion und lagespezifische Aufspaltung der RNA. Die erfindungsgemäßen Verbindungen schließen neuartige heterozyklische Basen, Nukleoside und Nukleotide ein. Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide sind von Nutzen in der Modulierung der Aktivität der RNA.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es ist wohlbekannt, dass die meisten körperlichen Zustände in Säugetieren, einschließlich der meisten Krankheitszustände, durch Proteine beeinflusst werden. Solche Proteine, die entweder direkt oder durch ihre Enzymfunktionen wirken, tragen einen großen Teil zu vielen Krankheiten von Mensch und Tier bei. Die klassische Therapie hat sich im Bemühen um eine Milderung der krankheitsverursachenden oder krankheitsintensivierenden Funktionen im Allgemeinen auf Wechselwirkungen mit solchen Proteinen konzentriert. Kürzlich wurden jedoch Versuche unternommen, die tatsächliche Produktion solcher Proteine durch Wechselwirkungen mit Molekülen, die ihre Synthese steuern, wie etwa intrazelluläre RNA, zu moderieren. Man hofft, durch Eingriff in die Proteinproduktion therapeutische Ergebnisse mit maximaler Wirkung und minimalen Nebenwirkungen beeinflussen zu können. Solche therapeuti schen Annäherungen verfolgen das allgemeine Ziel, eine Gen-Expression, die zu einer unerwünschten Proteinbildung führt, zu stören oder anderweitig zu modulieren.
Ein Verfahren zur Hemmung einer spezifischen Gen-Expression ist der Einsatz von Oligonukleotiden und Oligonukleotid-Analogen als "Antisense-Wirkstoffe". Verwendet werden die Oligonukleotide und Oligonukleotid-Analogen, die komplementär zu einer spezifischen Zielsequenz sind, als Boten-RNA-Sequenz (mRNA). Das Antisense-Verfahren richtet sich oft auf die komplementäre Hybridisierung relativ kurzer Oligonukleotide und Oligonukleotid-Analogen zu Einzelstrang-mRNA oder einzelsträngiger DNA, so dass die normalen, wesentlichen Funktionen dieser intrazellulären Nukleinsäuren unterbrochen werden. Hybridisierung ist die sequenzspezifische Wasserstoffbindung von Oligonukleotiden und Oligonukleotid-Analogen zu Basenpaaren der RNA oder einzelsträngigen DNA des Watson-Crick-DNA-Modells. Solche Basenpaare werden als komplementär zu einander bezeichnet. Es ist beabsichtigt, dass die Oligonukleotide und Oligonukleotid-Analogen die Aktivität der gewählten mRNA nach einer Reihe von Mechanismen hemmen, um die Synthesereaktionen zu stören, nach denen die durch die mRNA codierten Proteine produziert werden. Man hoffte, dass die Hemmung der Bildung von spezifischen Proteinen, die durch die gestörten mRNA-Sequenzen codiert sind, einen therapeutischen Nutzen bringt. Cook, P.D. Anti-Cancer Drug Design 1991, 6, 585; Cook, P. D. Medicinal Chemistry Strategies for Antisense Research, in Antisense Research & Applications, Crooke, et al., CRC Press, Inc.; Boca Raton, FL, 1993; Uhlmann, et al., A. Chem.Rev. 1990, 90,543.
Oligonukleotide und Oligonukleotid-Analogen sind heute anerkannt als vielversprechende therapeutische Wirkstoffe für Therapie- und Diagnoseverfahren. Anwendungen von Oligonukleotiden und Oligonukleotid-Analogen als Antisense-Wirkstoffe für Zwecke der Therapie und Diagnose und für Forschungsreagenzien erfordern jedoch oft, dass die Oligonukleotide und Oligonukleotid-Analogen in großen Mengen synthetisiert, durch Zellmembranen hindurch transportiert oder von Zellen aufgenommen werden, in geeigneter Weise zur Ziel-RNA oder -DNA hybridisiert werden und danach die Nukleinsäurefunktion terminieren oder unterbrechen. Diese kritischen Funktionen hängen von der anfänglichen Stabilität der Oligonukleotide und Oligonukleotid-Analogen gegen den Nukleaseabbau ab. Ein erheblicher Nachteil nicht modifizierter Oligonukleotide für solche Zwecke, insbesondere für die Antisense-Therapie, ist der enzymatische Abbau der zugeführten Oligonukleotide durch eine Reihe von intrazellulären und extrazellulären, allgegenwärtigen nukleolytischen Enzymen, die nachstehend als "Nukleasen" bezeichnet werden.
Zunächst dachte man, dass in der Antisense-Annäherung an die Therapeutik nur zwei Mechanismen oder Terminierungsereignisse wirken. Dabei handelt es sich um den Mechanismus des Hybridisierungsabbruchs und um die Spaltung der hybridisierten RNA durch das Zellenzym Ribonuklease H (RNase H). Cook, 1991, wie oben; Cook, 1993, wie oben; Uhlmann, wie oben; Walder et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA; 1988, 85, 5011; Dagle et al., Antisense Research & Development, 1991, 1, 11. Es ist aber wahrscheinlich, dass an der Zerteilung der Ziel-RNA zusätzliche "natürliche" Ereignisse beteiligt sein können. Viele dieser natürlich vorkommenden Ereignisse werden in Oligonucleotides: Antisense Inhibitors f Gene Expression, CRC Press, Inc., Boca Raton, FI (Cohen ed., 1989) erörtert.
Hybridisierungsabbruch bezeichnet das Terminierungsereignis, bei dem der Oligonukleotid-Hemmer an der Ziel-Nukleinsäure andockt und damit durch einfache sterische Hinderung eine Bindung essentieller Proteine, am häufigsten Ribosome, an die Nukleinsäure verhindert. Methyl-Phosphonat-Oligonukleotide, Miller et al., Anti-Cancer Drug Design, 1987, 2, 117-128 und α-Anomer Oligonukleotide sind zwei eingehend untersuchte Antisense-Wirkstoffe, von denen man annimmt, dass sie die Nukleinsäurefunktion durch Hybridisierungsabbruch unterbrechen.
Das zweite "natürliche" Terminierungsereignis ist die Aktivierung von RNase H durch die Heteroduplex, die zwischen den DNA-Oligonukleotiden oder Oligonukleotid-Analogen und der Ziel-RNA gebildet wird, mit nachfolgender Spaltung der Ziel-DNA durch das Enzym. Die Oligonukleotide oder Oligonukleotid-Analogen, die zum Desoxyribosetyp gehören müssen, bilden Hybride mit der Ziel-DNA und diese Duplex aktiviert das RNase-H Enzym, und spaltet den RNA-Strang, womit die normale Funktion der RNA zerstört wird. Mit Phosphorothioat modifizierte Oligonukleotide sind das herausragendste Beispiel für Antisense-Wirkstoffe, von denen man glaubt, dass sie nach dem Antisense-Terminierungsereignis dieser Art wirken.
Walder, wie oben und Stein et al., Nucleic Acids Research, 1988, 16, 3209-3221 beschreiben die Rolle, die RNase H in der Antisense-Annäherung spielt.
Eine Reihe von chemischen Modifizierungen wurde in Antisense-Wirkstoffen – Oligonukleotiden oder Oligonukleotid-Analogen – eingeführt, um ihre therapeutische Aktivität zu verstärken. Solche Modifikationen sind darauf ausgelegt, die Zellpenetration der Antisense-Wirkstoffe zu erhöhen, die Antisense-Wirkstoffe gegen Nukleasen und andere Enzyme, die ihre Struktur oder Aktivität im Körper abbauen oder stören, zu stabilisieren, die Bindung der Antisense-Wirkstoffe an die Ziel-RNA zu verbessern, eine Abbruchart (Terminierungsereignis) zu schaffen, wenn die Antisense-Wirkstoffe sequenzspezifisch an die Ziel-RNA gebunden sind und die pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Eigenschaften der Antisense-Wirkstoffe zu verbessern. Es ist unwahrscheinlich, dass nicht modifizierte Standard-Oligonukleotide als therapeutische Wirkstoffe brauchbar sind, weil sie durch Nukleasen rasch abgebaut werden. Ein Haupt-Brennpunkt der Antisense-Forschung ist die Modifizierung von Oligonukleotiden, um sie gegen diese Nukleasen beständig zu machen. Diese Modifikationen sind so ausgelegt, dass sie die Aufnahme der Antisense-Wirkstoffe – Oligonukleotide und Oligonukleotid-Analoge – erhöhen und damit einen wirksamen Einsatz in der Therapeutik, als Forschungsreagens oder für die Diagnostik schaffen.
Die am häufigsten zur Erhöhung der Wirksamkeit über die "natürlichen" Terminierungsereignisse verwendete Modifikation der Oligonukleotide ist die Modifizierung an der Zucker-Phosphat-Hauptkette, insbesondere am Phos phoratom. Es wird berichtet, dass Phosphorothioat, Methylphosphonat, Phosphoramidit und Phosphorotriester ein unterschiedliches Niveau der Beständigkeit gegen Nukleasen haben. Modifikationen der Hauptkette sind offengelegt in U.S. Patent 5,378,825, in U.S. Patent 5777092 und in heteroatomischen Oligonukleotidbindungen.
Ein Beispiel für Phosphatmodifikationen schließt Methylphosphonat-Oligonukleotide ein, wobei der Phosphoryl-Sauerstoff des Phosphorodiester-Anteils durch Methylengruppen ersetzt wird oder die Nukleotidelemente ganz oder teilweise durch Methylgruppen ersetzt werden. Weitere Arten der Modifikation am Phosphoratom der Phosphathauptkette von Oligonukleotiden schließen Phophorothioat-Oligonukleotide ein. Die mit Phosphorothioat modifizierten Oligodesoxynukleotide sind in der Lage, die RNA nach Hybridisierung durch Aktivierung der RNase H zu terminieren, obwohl der Nybridisierungs-Abbruch der RNA-Funktion eine Rolle in der Aktivität spielen kann. Phosphoramidite wurden offengelegt wie in U.S. Patent 5,506,351 beschrieben. Alle berichteten Modifikationen der Zucker-Phosphathauptkette, mit Ausnahme von Phosphorothioat und Phosphorodithioat, zerstören jedoch das RNase H Terminierungsereignis. Cook, 1991, wie oben; Cook, 1993, wie oben; Uhlmann, wie oben. Die zwischen der RNA und den Oligodesoxynukleotiden mit 2'-Zuckermodifikationen gebildeten Heteroduplexe, RNA Nachbildungen, wie etwa des Fluoro- und Alkoxytyps, unterstützen die durch RNase vermittelte Spaltung nicht. Diese modifizierten Heteroduplexe nehmen ebenso wie die RNA-RNA-Heteroduplexe, die ebenfalls die Spaltung durch RNase H nicht unterstützen, eine A-Form mit Helixgeometrie an. Kawasaki et al., J. Med. Chem., im Druck 1993; Lesnik et al., Biochemistry, eingereicht 1993; Inoue et al., Nucleic Acids Res.., 1987, 15, 6131.
Weitere Modifikationen von Standard-Oligonukleotiden, die vorgenommen werden, um die Beständigkeit gegen Nukleasen zu erhöhen, das RNase Terminierungsereignis zu aktivieren oder die Hybridisierungseigenschaften von Duplexen der Oligonukleotide zu verbessern, schließen die Funktionalisierung des natürlich vorkommenden Zuckers des Nukleosids ein. Zuckermodifi kationen sind offengelegt, wie in der PCT-Anmeldung beschrieben, die einem gemeinsamen Bevollmächtigten der gegenwärtigen Veröffentlichung übertragen wurde, mit dem Titel "Compositions and Methods for Detecting and Modulating RNA Activity and Gene Expression" (Zusammensetzungen und Verfahren zur Bestimmung und Modulierung der RNA-Aktivität und Gen-Expression), PCT Patentanmeldung Nr. PCT/US91/00243, Internationale Veröffentlichung Nr. WO 91/10671.
Weitere synthetische Terminierungsereignisse wurden im Vergleich zum Abbruch durch Hybridisierung und zur Spaltung durch RNase H untersucht, mit dem Versuch, die Wirksamkeit der Oligonukleotide und Oligonukleotid-Analogen in der Verwendung zur Antisense-Diagnostik und -Therapeutik zu verstärken. Ein Forschungsbereich basiert auf dem Konzept, dass Antisense-Oligonukleotide mit modifizierten heterozyklischen Abschnitten anstelle der Zucker-Phosphat-Modifikationen gegen den nukleolytischen Abbau beständig sein können, aber nach Hybridisierung mit der Ziel-RNA ein Heteroduplex liefern, das die durch RNase H vermittelte Spaltung unterstützt. Modifikationen im heterozyklischen Abschnitt der Oligonukleotide dürfen die Helixgeometrie des Heteroduplex von Zucker, die für die Spaltung durch RNase erforderlich ist, nicht beeinträchtigen.
Ein weiterer Näherungsweg richtet sich auf die Entwicklung von sequenzspezifischen chemischen Wirkstoffen zur RNA-Spaltung. Dieses Konzept erfordert die Anbindung von Seitengruppen mit Säure/Basen-Merkmalen an die Oligonukleotide. Die Seitengruppe ist nicht an der spezifischen Hybridisierung der Oligonukleotide oder Oligonukleotid-Analogen mit der mRNA im Watson-Crick-Modell beteiligt, sondern wird mit dem Oligonukleotid oder Oligonukleotid-Analogen mitgenommen und dient als reaktionsfähige Funktionsgruppe. Die Seitengruppe dient der Absicht, eine Wechselwirkung mit der mRNA zu erzielen, welche die Translation der mRNA zu Protein wirksamer inhibiert. Solche Seitengruppen wurden auch an Moleküle angeheftet, die einsträngige oder doppelsträngige DNA zum Ziel haben. Solche Seitengruppen schließen Einlagerungs-Substanzen, Vernetzungsmittel, Alkylie rungs-Wirkstoffe oder Koordinationskomplexe ein, die ein Metall-Ion mit zugehörigen Liganden enthalten.
Die Anbindungsorte der Seitengruppen an die Oligonukleotide und Oligonukleotid-Analogen spielen eine wichtige, aber noch nicht vollständig bekannte Rolle in der Wirksamkeit von Oligonukleotiden und Oligonukleotid-Analogen für Therapeutik und Diagnostik.
Die Halbwertzeit der gebildeten RNA-Oligonukleotide oder des Oligonukleotid-Analog-Duplex kann durch die Positionierung der angehängten Funktionsgruppe, welche die reaktionsfähige Funktionalität enthält, stark beeinträchtigt werden. Eine ungeeignete Positionierung reaktionsfähiger Funktionsgruppen, wie etwa das Andocken an den Stellen der Basenpaare des Watson-Crick Modells der Desoxyribonukleinsäure würde wahrscheinlich eine Duplexbildung ausschließen. Andere Anbindungsstellen können möglicherweise eine sequenzspezifische Bindung erlauben, aber eine so geringe Stabilität haben, dass die reaktionsfähige Funktionalität nicht genug Zeit hat, eine RNA-Spaltung einzuleiten.
Ein stabiles RNA-Oligonukleotid oder Heteroduplex eines Oligonukleotid-Analogen wird als wichtig erachtet, weil die erfindungsgemäßen reaktionsfähigen oder reaktionsunfähigen Funktionalitäten ohne eine ausreichende Halbwertzeit eventuell nicht genug Zeit haben, um eine Spaltung oder andere Unterbrechung der RNA-Funktion einzuleiten. Eine verbesserte Komplementierung zwischen modifizierten Oligonukleotiden oder Oligonukleotiden und einer Ziel-RNA ergibt wahrscheinlich die stabilsten Heteroduplexe.
Die Ziel-RNA wird durch Bildung covalenter Bindeglieder zwischen einem modifizierten Oligonukleotid und der RNA 2'Hydroxylgruppe inaktiviert. Eine Reihe von Strukturstudien, wie etwa Röntgenbeugungsdiagramme, chemische Reaktionen und molekulares Design lassen vermuten, dass sich die 2'-Hydroxylgruppe der RNA in einem Duplex oder Heteroduplex in der kleinen Furche der RNA-Doppelhelix befindet. Die kleinere Seite oder kleine Furche der zwischen solchen Oligonukleotiden oder modifizierten Oligonukleotiden und der Ziel-RNA gebildeten Duplexe hat sich als stark bevorzugter Ort für die Aktivität von Funktionsgruppen erwiesen.
Frühere Näherungswege unter Verwendung von Vernetzungsmitteln, Alkylierungs-Wirkstoffen und radikalbildenden Arten als Seitengruppen an Oligonukleotiden für die Antisense-Diagnostik und Therapeutik hatten mehrere signifikante Mängel. Frühere Forscher haben die meisten Seitengruppen als am Phosphoratom angedockt beschrieben, womit Oligonukleotide und Oligonukleotid-Analogen mit minderen Hybridisierungseigenschaften erzielt werden. Die Anheftungsstelle an einem Phosphoratom kann einer reaktionsfähigen Gruppe Zugang zu den großen und kleinen Furchen gestatten. Die innere Modifikation des Phosphors ergibt jedoch eine stark reduzierte Stabilität des Heteroduplex. Anheftungen am 3'-Ende und/oder am 5'-Ende stellen insofern eine Begrenzung dar, als nur eine oder zwei Funktionsgruppen in den Oligonukleotid-Zusammensetzungen aufgenommen werden können.
Weitere Näherungen schließen die Anbindung reaktionsfähiger Funktionalitäten oder Seitengruppen in der Position 5 von Thymin und in der Position 7 von Purinen ein. Funktionalitäten, die in der Position 5 oder 7 von Basen, Pyrimidin und Purin angeordnet sind, befinden sich im typischen Fall in der großen Furche des Duplex und nicht in der Nähe des RNA-2'-Hydroxyl-Substrats. Das 2'-Hydroxyl ist ein "Triggerpunkt" für die Inaktivierung der RNA und deshalb müssen sich reaktionsfähige Funktionalitäten in angemessener Nähe zum aufnahmefähigen Substrat in der Ziel-RNA befinden, insbesondere am sensibelsten Punkt, der 2'-Hydroxylgruppe.
Einige Forscher haben sich mit Substitutionen in der Position 2 bestimmter Purine befasst, wie etwa Hypoxanthin, Guanin oder Adenin. Siehe zum Beispiel Harris et al., J. Am. Chem. Soc'y, 1991, 113, 4328-4329; Johnson et al., J. Am. Chem. Soc'y, 1992, 114, 4923-4924; Lee et al., Tetrahedron Letters, 1990, 31, 6773-6776; Casale et al., J. Am. Chem. Soc'y, 1990, 112, 5264-5271.
Der Anbindungspunkt der Funktionalitäten an den Basiseinheiten, die wiederum in modifizierte Oligonukleotide umgewandelt werden können, kann als wichtig für die Gestaltung von Zusammensetzungen für eine sequenzspezifische Zerstörung oder Modulation der Ziel-RNA betrachtet werden. Es ist wichtig, dass die Funktionalitäten nicht gegen die Regeln der Wasserstoffbrückenbindung der Watson-Crick Basenpaare verstoßen, weil dies ein sequenzspezifischer Erkennungs/-Bindefaktor und wesentlich für die Wahl der RNA ist, die man unterbrechen will. Ferner sollen die Funktionalitäten vorzugsweise die pharmakokinetischen und/oder pharmakodynamischen Eigenschaften und die Transportfähigkeit der Zusammensetzungen von Oligonukleotiden durch die Zellmembranen hindurch verbessern. Es ist ebenfalls wichtig, dass die Seitengruppen, die für die Unterstützung einer enzymatischen oder chemischen Spaltung der RNA ausgelegt sind, mit dem erforderlichen Hybridisierungsschritt kompatibel sein müssen. Bei der Hybridisierung der RNA wären die Seitengruppen über die kleine Furche zugänglich zu den 2'-Hydroxyl und Phosphorodiester Verbindungsglieder der Ziel-RNA.
Diese vorstehend aufgeführten früheren Versuche waren relativ unempfindlich, das heißt, die reaktionsfähigen Seitengruppen gelangten effektiv nicht in einem wirksamen proportionalen Anteil an die zur Alkylierung oder Spaltung vorgesehenen Stellen an den mRNA-Molekülen. Selbst wenn jedoch die Reaktionsfähigkeit dieser Stoffe perfekt wäre (wenn nämlich jede reaktionsfähige Funktionalität tatsächlich mit einem mRNA-Molekül reagieren würde) wäre bestenfalls ein stöchiometrischer Effekt zu erzielen. Das heißt, für jedes Oligonukleotid- oder Oligonukleotid-Analog-Molekül würde nur ein mRNA-Molekül inaktiviert. Wahrscheinlich ist es auch so, dass die nichtspezifischen Wechselwirkungen der Oligonukleotid-Zusamensetzungen mit anderen Molekülen, als denen der Ziel-RNA, zum Beispiel mit anderen Molekülen, die alkyliert werden können oder mit bestimmten Radikalen reagieren können, ebenso wie die Selbstzerstörung nicht nur die diagnostische und therapeutische Wirkung der Antisense-Behandlung vermindern, sondern darüber hinaus zu unerwünschten toxischen Reaktionen in der Zelle oder in vitro führen.
Dies ist besonders akut bei bestimmten Arten von Radikalen, von denen man glaubt, dass sie in der Lage sind, über den Ort der spezifischen Hybridisierung hinaus zu diffundieren und eine unerwünschte Schädigung von nicht angepeilten Stoffen, anderen Molekülen und zellulären Metaboliten zu verursachen. Dieser wahrgenommene Mangel an Spezifität und die stöchiometrische Grenze der Wirksamkeit solcher früheren Alkylierungsmittel und Arten der Antisense-Oligonukleotid-Zusammensetzungen, die Radikale erzeugen, stellen einen signifikanten Nachteil ihrer Verwendung dar.
Demgemäß besteht weiterhin ein großer Bedarf an Zusammensetzungen von Antisense-Oligonukleotiden, die ohne unerwünschte Nebenwirkungen zu einer verbesserten Spezifität und Wirksamkeit sowohl in der Bindung und Modulation der mRNA, als auch in der Inaktivierung der mRNA fähig sind. Die gegenwärtige Erfindung ist auf die Erfüllung dieser und anderer Erfordernisse gerichtet, durch Darbietung neuartiger Verbindungen auf Grundlage des Purinringsystems, das als Oligonukleotid-Zwischenstufe benützt werden kann. Jetzt wurde herausgefunden, dass bestimmte Positionen an den Nukleosiden doppelsträngiger Nukleinsäuren in der kleinen Furche exponiert sind und substituiert werden können, ohne die Bildung von Basenpaaren oder die Duplexstabilität im Watson-Crick Modell zu beeinträchtigen. In diesen Positionen plazierte reaktionsfähige und reaktionsunfähige Funktionalitäten können die Spaltung und Zerstörung der Ziel-RNA am besten einleiten oder ihre Aktivität stören.
G. Wang et al offenbaren in "Synthesis of oligonucleotides containing N²-(5-Carboxypentyl)2'-Desoxyguanosin and 5-[2-(4'-Methyl-2,2'-Dipyrid-4-yl-Carboxamido)-Äthylthio]-2'-Desoxyuridin", Tetrahedron Letters, Vol. 34, Ni. 42, Seiten 6725-6728 Oligonukleotide, die an N-2 gebundenes Imidazol und Bipyridyl-Nukleotid-Substituenten aufweisen.
Das internationale Patent WO91/10671 offenbart Zusammensetzungen zum Nachweis und zur Modulation der RNA-Aktivität und der Gen-Expressionen von Verbindungen, die an N² gebundenes Imidazol enthalten.
S. Freese et al.offenbaren in "N²-substituted-2'-Deoxyguanosine-5'-Triphosphates as substrates for Escheria Coli DNA Polymerase I", Nucleosides & Nucleotides, Vol. 10, Nr. 7, 1991, Seiten 1507-1524, einen Starter zum Einsatz für die Replikation der E. Coli DNA Polymerase.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung schafft neuartige Oligonukleotide, die mindestens eine Verbindung auf Grundlage des Purinringsystems aufweisen.
Im Allgemeinen können die Oligonukleotide ein mit Zucker modifiziertes oder natives Oligonukleotid beinhalten, das eine Zielsequenz aufweist, die spezifisch mit einer vorbestimmten Nukleotidsequenz, einer DNA- oder RNA-Sequenz hybridisierbar ist, die an der Produktion von Proteinen beteiligt ist, deren Synthese letztendlich moduliert oder insgesamt inhibiert werden soll.
Die heterozyklischen Verbindungen der erfindungsgemäßen Oligonukleotide sind durch sorgfältige Auswahl der Anbindung des RNA spaltenden Anteils angepasst für die Plazierung des reaktionsfähigen, die RNA spaltenden Anteils oder eines anderen reaktionsfähigen Anteils an der in der kleinen Furche gelegenen Stelle der aus der RNA und den erfindungsgemäßen Oligonukleotiden gebildeten Hybridstruktur.
Die Position 2 des Purinrings hat sich jetzt als Anbindungsstelle für potentielle die RNA spaltende Anteile, sowie anderer Anteile erwiesen, welche die pharmacokinetischen Antisense-Eigenschaften verbessern können, ohne den RNase H Abbau der Ziel-RNA zu beeinträchtigen. Darüber hinaus ist eine bemerkenswerte Erhöhung der Affinität zur Heteroduplexbindung zu beobachten, wenn bestimmte Seitengruppen in der Position 2 der neuartigen erfindungsgemäßen Verbindungen auf Puringrundlage angeheftet werden. Diese Seitengruppen erstrecken sich in die kleine Furche des DNA-RNA-Heteroduplex und beeinträchtigen die Bindungsaffinität nicht.
Unter einem Aspekt der Erfindung ist ein Oligonukleotid zur therapeutischen Verwendung vorgesehen, das mindestens eine Verbindung nach der folgenden Formel I aufweist:

wobei G ein CH oder N;
X ein NH₂ oder OH
Y ein NHRQ oder N(C(O)CH(CH₃)₂)RQ ist, wobei R eine zweiwertige Hydrocarbylgruppe mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen und Q ein Stickstoff enthaltender Heterozyklus, eine Alkylgruppe mit 5 bis 20 Kohlenstoffatomen, ein Amin, eine Thiolgruppe, ein Aldehyd, ein Keton, ein Alkohol, eine Alkoxygruppe oder ein Halogen ist, mit der Maßgabe, dass Q kein Imidazol oder Bipyridin ist,
und Z ein Zuckerrest ist

Unter einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung ist ein Oligonukleotid vorgesehen, das die Spaltung der RNase H der RNA beeinflusst, aufweisend: Eine erste Oligonukleotidregion und eine zweite Oligonukleotidregion, wobei die erste und die zweite Region zusammen eine Nukleotidsequenz haben, die im Wesentlichen komplementär zu mindestens einem Teil der RNA ist;
wobei die erste Region mindestens ein Nukleotid aufweist, das einer Verbindung mit der Formel I entspricht:

In der: G ein CH oder N ist,
X ein NH_2' oder OH ist,
Y ein NHRQ oder N(C(O)CH(CH₃)₂RQ ist,
wobei R eine zweiwertige Hydrocarbylgruppe mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen und Q ein Stickstoff enthaltender Heterozyklus, eine Alkylgruppe mit 5 bis 20 Kohlenstoffatomen, ein Amin, eine Thiolgruppe, ein Aldehyd, ein Keton, ein Alkohol, eine Alkoxygruppe oder ein Halogen ist, mit der Maßgabe, dass Q kein Imidazol oder Bipyridin sein darf;
Z ein Zuckerrest ist;

Die zweite Region eine Vielzahl von aufeinanderfolgenden, mit Phosphorothioat verknüpften Nukleotiden mit einem 2'-Desoxy-Erythro-Pentofuranosyl-Zuckerrest umfasst.
Die Erfindung sieht Oligonukleotide mit mindestens einer Verbindung vor, die einen Zucker und einen Basenanteil enthält, wie vorstehend erörtert, wobei in der Position 3' des Zuckeranteils ein Derivat mit einer Phosphatgruppe gebildet wird. Der Zuckeranteil der Nukleosideinheiten zur Aufnahme in Oligonukleotid-Zusammensetzungen kann Ribose, Desoxyribose oder ein Zuckeranalog sein. Vorzugsweise ist der Zucker eine Ribose oder Desoxyribose. Bei den Gruppen, welche die heterozyklischen Basen oder modifizierten Basen miteinander verbinden, kann es sich um die übliche, in der Natur vorkommende Hauptkette aus Zucker, Phosphat und Nukleinsäure handeln, sie können aber auch modifiziert sein zu Phosphorothioat, Methylphosphonat oder einem mit Phosphat alkylierten Anteil zur weiteren Verbesserung der abgewandelten Eigenschaften des Oligonukleotids. Weitere Modifikationen der Stammkette können ebenfalls zum Einsatz kommen, wie etwa mit Entfernung der 5'-Methylengruppe und der Verwendung von Alkyl oder Zucker mit Heteroatomen.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist der Zuckeranteil Ribose oder Desoxyribose und das Phosphat ein Methylphosphonat, Phosphorothioat, Phosphoramidit, Phosphorotriester. In anderen bevorzugten Ausfüh rungsformen enthalten die erfindungsgemäßen Oligonukleotide ferner eine dritte Region, die mindestens ein Nukleotid mit einer wie vorstehend in Verbindung mit den erfindungsgemäßen heterozyklischen Verbindungen definierten Baseneinheit, wobei die zweite Region zwischen der ersten und dritten Region angeordnet ist.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die gegenwärtige Erfindung stellt Oligonukleotide vor, die mindestens eine Verbindung auf Grundlage des Purinringsystems aufweisen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Oligonukleotide beruhen auf dem Purinringsystem und umfassen einen heterozyklischen Abschnitt auf Purinbasis, eine reaktionsfähige oder reaktionsunfähige Funktionalität und einen Anbindungsabschnitt zum Anhängen der Funktionalitäten an den Rest der Verbindung. Die Position 2 des Purinrings erwies sich als der einzige Punkt zur Anbindung der reaktionsfähigen und reaktionsunfähigen Funktionalitäten. Die Anbindung in dieser Position verbessert die Fähigkeit der Oligonukleotide und Oligonukleotid-Analogen zur Modulierung der RNA-Aktivität ohne die Stabilität eines RNA-Oligonukleotid-Heteroduplex zu beeinträchtigen und verbessert ferner die Transportfähigkeit des Oligonukleotids. Der Nutzen der reaktionsunfähigen Funktionalitäten liegt zum Teil in ihrer Fähigkeit, die pharmakodynamischen und pharmakokinetischen Eigenschaften der Oligonukleotid-Zusammensetzungen zu verbessern, unabhängig davon, ob diese Funktionalitäten bei der Einleitung der Spaltungsreaktionen eine Rolle spielen oder nicht. Dieses und andere Merkmale machen solche Verbindungen zu brauchbaren Zwischenstufen für die Aufnahme in Nukleotid-Zusammensetzungen.
Die Funktionsorte an den Grundeinheiten sind wichtig in der Gestaltung von Zusammensetzungen für eine sequenzspezifische Zerstörung oder Modulation der Ziel-RNA. Man glaubt, dass die Halbwertzeit der Duplexbildungen stark von der Positionierung der angehängten Gruppe abhängt, welche die reaktionsfähige Funktionalität mit der Grundeinheit verbindet. Eine ungeeig nete Positionierung der funktionellen Gruppen, etwa an den Orten der Basenpaare des Watson-Crick Modells, würde eine Duplexbildung ausschließen. Es ist wichtig, dass die Anbindungsfunktionalität nicht gegen die Regeln der Wasserstoffbrückenbindung der Basenpaare des Watson-Crick Modells verstösst, denn dies ist der sequenzspezifische Erkennungs-/Bindungsfaktor für die Wahl der RNA, deren Abbruch gewünscht wird.
Andere Anbindungsstellen als die Position 2 des Purinrings erlauben zwar vielleicht eine sequenzspezifische Bindung, die jedoch eine so geringe Stabilität aufweisen kann, dass die reaktionsfähige Funktionalität nicht genug Zeit hat, die Unterbrechung der RNA einzuleiten. Jetzt wurde herausgefunden, dass bestimmte Positionen an den Nukleosiden der doppelsträngigen Nukleinsäuren in der kleinen Furche exponiert sind und substituiert werden können, ohne die Bildung der Basenpaare des Watson-Crick Modells oder die Duplexstabilität zu beeinträchtigen. Die erfindungsgemäß in diesen Positionen angedockten reaktionsfähigen oder reaktionsunfähigen Funktionalitäten sind am besten geeignet, die Spaltung und Zerstörung der Ziel-RNA einzuleiten oder ihre Aktivität zu beeinflussen. Die Orte der Funktionalität bei den erfindungsgemäßen heterozyklischen Verbindungen – die Position 2 im Purinringsystem – sind neuartig und sie werden vorzugsweise so gestaltet, dass sich die Funktionalität in oder an der vom Heteroduplex zwischen den modifizierten Oligonukleotiden und der Ziel-RNA gebildeten kleinen Furche befindet.
Die Verbindungen der Formel I der erfindungsgemäßen Oligonukleotide können mindestens eine reaktionsfähige Funktionalität oder einen anderen daran angehängten Anteil aufweisen, der in der Lage ist, mit einer RNA in Wechselwirkung zu treten und diese vorzugsweise zu spalten. Diese Anteile sind vorzugsweise angepasst für die Positionierung des reaktionsfähigen oder anderen Anteils am Ort der kleinen Furche der Hybridstruktur, die aus der RNA und den Oligonukleotiden und Oligonukleotid-Analogen einschließlich der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen gebildet wird.
Es ist in Übereinstimmung mit der gegenwärtigen Erfindung nicht notwendig, an den Oligonukleotid-Zusammensetzungen mehr als eine, zwei oder eine relativ kleine Anzahl von RNA-spaltenden Funktionalitäten anzuhängen, um die erfindungsgemäßen Vorteile zu erzielen. Ein RNA-spaltender Anteil wird vorzugsweise an einem relativ kleinen proportionalen Anteil der Untereinheiten, im Allgemeinen nur an einer oder zwei der erfindungsgemäßen Oligonukleotid-Zusammensetzungen, angehängt. In anderen Ausführungsformen der Erfindung können jedoch im Wesentlichen alle Nukleotide so modifiziert werden, dass sie eine oder mehrere Funktionalitäten, wie etwa RNA-spaltende Anteile, einschließen.
Die Verbindungen von Formel I der erfindungsgemäßen Oligonukleotide können zur Zubereitung der gewünschten Oligonukleotide und Oligonukleotid-Analogen verwendet werden; diese Oligonukleotide und Oligonukleotid-Analogen liegen ebenfalls im Geltungsbereich der Erfindung.
Die Aufnahme der Verbindungen von Formel I in die Oligonukleotid-Zusammensetzungen verbessert die pharamkodynamischen und pharmakokinetischen Eigenschaften dieser Zusammensetzungen, ihre Beständigkeit gegen Nukleasen, erleichtert therapeutische Antisense-Anwendungen und nichtantisense-Anwendungen, den Einsatz in der Diagnostik und für Forschungsreagenzien, verbessert die Bindungsfähigkeit der Zusammensetzungen ohne begleitende Störeinflüsse auf die Bindung des Watson-Crick Modells und erhöht das Eindringvermögen der Zusammensetzungen in die Zellen. Einige der verbesserten Eigenschaften sind nachstehend in der Tabelle 1 veranschaulicht.
Im Zusammenhang mit der gegenwärtigen Erfindung ist ein "Nukleosid" eine stickstoffhaltige heterozyklische Base, die mit einem Pentosezucker, einer Ribose, Desoxyribose oder Derivaten oder Analogen davon verbunden ist. Der Begriff "Nukleotid" bedeutet einen Phosphorsäureester eines Nukleosids, der eine stickstoffhaltige heterozyklische Base, einen Pentosezucker, ein oder mehrere Phosphate oder andere die Hauptkette bildende Gruppen enthält und die monomere Einheit eines Oligonukleotids darstellt. Der Begriff "Oligonukleotid" bezieht sich auf eine Vielzahl mit einander verbundener Nukleotideinheiten, die in einer spezifischen Sequenz aus natürlich vorkommenden heterozyklischen Basen und Pentofuranosyl-Äquivalentgruppen gebildet werden, die durch Phosphorodiester oder andere Hauptketten bildende Gruppen zusammengefügt sind.
Nukleotideinheiten können gewöhnliche Basen einschließen, wie etwa Guanin, Adenin, Cytosin, Thymin oder Derivate davon. Beim Pentosezucker kann es sich um Desoxyribose, Ribose, oder dafür substituierte Gruppen handeln. Die Begriffe "Antisense-Wirkstoffe" und "Oligonukleotid-Zusammensetzungen" können in ihrer Verwendung im Zusammenhang mit dieser Erfindung Oligonukleotide und Oligonukleotid-Analogen umfassen und sie sind unter einander austauschbar. Im Zusammenhang mit der gegenwärtigen Erfindung schließen die Phosphat-Derivate Phosphorothioat, Methylphosphonat, Phosphoramidit, Phosphorotriester und andere dem Fachmann bekannte Gruppen ein.
"Modifizierte Base", "Basen-Analog", "modifizierte Nukleoside", Nukleotid-Analog" oder "modifiziertes Nukleotid" beziehen sich im Zusammenhang mit dieser Erfindung auf Anteile, die ähnlich funktionieren wie ihre natürlich vorkommenden Gegenstücke, aber funktionalisiert wurden, um ihre Eigenschaften zu ändern.
"Zuckeranteil" bzw. Zuckerrest bedeutet in seiner Verwendung im Textzusammenhang mit dieser Erfindung natürlich vorkommende Zucker, wie etwa Ribose oder Desoxyribose und Zucker, sowie Nichtzucker-Analoge, die funktionalisiert wurden, um ihre Eigenschaften zu verändern.
"Oligonukleotid-Analogen" oder "modifizierte Oligonukleotide" bezieht sich im Zusammenhang mit dieser Erfindung auf Zusamensetzungen, die ähnlich funktionieren, wie natürliche Oligonukleotide, aber auch Abschnitte enthalten, die nicht natürlich vorkommen.
Oligonukleotid-Analogen oder modifizierte Oligonukleotide können geänderte Zuckeranteile, geänderte Basen, veränderte Zucker und Basen oder veränderte Bindungen zwischen Zuckern, zum Beispiel Phosphorothioate und an dere Schwefelhaltige Arten aufweisen, deren Verwendung dem Fachmann vertraut ist.
Im Textzusammenhang mit der Erfindung bedeutet "verbesserte pharmakodynamische Eigenschaft" eine verbesserte Aufnahme der Oligonukleotide, höhere Abbaubeständigkeit der Oligonukleotide und/oder Stärkung der sequenzspezifischen Hybridisierung mit RNA.
"Verbesserte pharmakokinetische Eigenschaft" bedeutet verbesserte Aufnahme, Verteilung, verbesserten Metabolismus oder Ausscheidung der Oligonukleotide.
Die hierin geoffenbarten und beanspruchten "Hydrocarbylgruppen" sind Verbindungsstücke, die reaktionsfähige oder reaktionsunfähige Funktionalitäten an die auf Purin aufbauenden erfindungsgemäßen Verbindungen anheften können. Der hierin verwendet Begriff "Hydrocarbylverbindungen" bedeutet geradlinige, verzweigte oder zyklische Kohlenstoffe und Wasserstoff enthaltende Verbindungen. Im Textzusammenhang mit der gegenwärtigen Erfindung bedeutet eine geradkettige Verbindung eine Verbindung mit offener Kette, wie etwa eine aliphatische Verbindung, einschließlich Alkyl-, Alkenyl- oder Alkynylverbindungen. Eine verzweigte Verbindung schließt im hier verwendeten Gebrauch eine geradkettige Verbindung, wie Alkyl, Alkenyl, Alkynyl ein, wobei an die Kohlenstoffatome der geraden Kette weitere gerade Ketten angehängt sind. Im Textzusammenhang mit dieser Erfindung bedeuten die Begriffe "niedrigeres Alkyl", niedrigeres Alkenyl" oder niedrigeres Alkynyl" geradkettige oder verzweigte Verbindungen mit zwischen 2 und 10 Kohlenstoffatomen. Eine zyklische Verbindung bezieht sich in der Verwendung hierin auf Ketten, die zu Ringverbindungen geschlossen sind, einen Ring von Kohlenstoffatomen, eine zyklische aliphatische oder aromatische Verbindung. Die geradkettigen, verzweigten oder zyklischen Verbindungen können innen unterbrochen sein. Im Textzusammenhang mit dieser Erfindung bedeutet innen unterbrochen, dass die Kohlenstoffketten durch Heteroatome, wie O, N oder S unterbrochen sein können. Falls dies erwünscht ist, können in der Kohlenstoffkette auch keine Heteroatome vorhanden sein. Die vorstehend aufgeführten Hydrocarbylverbindungen können substituiert oder nicht substituiert werden. Im Textzusammenhang mit der gegenwärtigen Erfindung bedeutet "substituiert" oder "nicht substituiert", dass in den Hydrocarbylverbindungen einer von einer Reihe von Substituenten als Ersatz für beispielsweise ein oder mehrere Wasserstoffatome eingesetzt wird oder dass andererseits kein Substituent eingesetzt wird. Geeignete Substituenten sind dem Fachmann anhand dieser Offenlegung vertraut.
Der Begriff Seitengruppen bezieht sich in seiner Verwendung hierin auf reaktionsfähige und reaktionsunfähige Funktionalitäten. "Reaktionsfähige Funktionalität" ist in der Verwendung hierin ein Anteil, der mit der mRNA in irgendeiner Weise in Wechselwirkung tritt, um die Umsetzung der mRNA in Protein wirkungsvoller zu hemmen. Ein solcher Anteil kann zum Beispiel als Wirkstoff zur RNA-Spaltung fungieren. Eine "reaktionsunfähige Funktionalität" bedeutet in der Verwendung hierin eine Funktionsgruppe, die keinen reaktionsfähigen Abschnitt aufweist oder keine chemischen Reaktionen einleiten kann, aber die pharmakodynamischen und pharmakokinetischen Eigenschaften der Oligonukleotide verbessert, unabhängig davon, ob sie bei der Spaltung der RNA eine Rolle spielt oder nicht. Wenn mit Bezug auf die reaktionsfähige oder reaktionsunfähige Funktionalität der Begriff endständig benützt wird, bedeutet dies das nicht an den Purinkern gebundene Ende.
Unter einem bevorzugten Gesichtspunkt der Erfindung hat mindestens eine Verbindung des erfindungsgemäßen Oligonukleotids die folgende Formel I:

wobei G ein CH oder N;
X ein NH₂ oder OH
Y ein NHRQ oder N(C(O)CH(CH₃)₂)RQ ist, wobei R eine zweiwertige Hydrocarbylgruppe mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen und Q ein Stickstoff enthaltender Heterozyklus, eine Alkylgruppe mit 5 bis 20 Kohlen-stoffatomen, ein Amin, eine Thiolgruppe, ein Aldehyd, ein Keton, ein Alkohol, eine Alkoxygruppe oder ein Halogen ist, mit der Maßgabe, dass Q kein Imidazol oder Bipyridin ist,
und Z ein Zuckerrest ist

In weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist G ein N; X ist NH₂; Y ist NHRQ, R ist N und Q ist ein Alkan mit 5 bis 20 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit zwischen 5 und 10 Kohlenstoffatomen.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist G ein N; X ist OH; Y ist NHRQ, R ist H und Q ist ein Alkan mit zwischen 5 und 20 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit zwischen ca. 5 und ca. 10 Kohlenstoffatomen.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist Y ein NHRQ, wobei R ein niedrigeres Alkan und Q ein Amin ist wobei das Amin NH₂, Polyalkylamine, Aminoalkylamine, Hydrazin(-NH-NH-), Hydroxylamin (-NH-OH), Semicarbazide (-NH-C(O)-(-NH-NH₂) Thiosemicarbazide (-NH-C(S)-NH-NH₂-), Hydrazone (-N=NH) oder Hydrazide (-C(O)-NHNH₂ enthält; und Z ist Ribose oder Desoxyribose.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist G ein N; X ist NH₂; Y ist NHRQ, wobei R eine niedrigeres Alkan ist; Q ist ein Amin, wobei das Amin NH₂, Polyalkylamin, Aminoalkylamin, Hydrazin (-NH-NH-), Hydroxylamin (-NH-OH), Semicarbazide (-NH-C(O)-NH-NH₂), Thiosemicarbazid (-NH-C(S)-NH-NH₂, Hydrazon (-N=NH) oder Hydrazid (-C(O)-NHNH₂, insbesondere NH₂ enthält.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist G ein N; X ist OH; Y ist NHRQ, R ist ein niedrigeres Alkan; und Q ist ein Amin, wobei da Amin NH₂, Polyalkylamin, Aminoalkylamin, Hydrazin (-NH-NH-), Hydroxylamin (-NH-OH), Semicarbazide (-NH-C(O)-(-NH-NH₂) Thiosemicarbazide (-NH-C(S)- NH-NH₂-), Hydrazone (-N=NH) oder Hydrazide (-C(O)-NHNH₂ enthält, insbesondere NH₂. In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform ist G ein N; X ist OH; Y ist NHRQ, R ist Hexan und Q ist NH₂.
In bestimmten anderen bevorzugten Ausführungsformen ist Y = NHRQ und die reaktionsfähige Funktionalität Q eine Thiolgruppe, Aldehyd, Keton, Alkohol oder eine Alkoxygruppe.
Die Hydrocarbylgruppen (R) können als Verbindungsstellen für die Anheftung von reaktionsfähigen oder reaktionsunfähigen Funktionalitäten an das Purinringsystem der erfindungsgemäßen Verbindungen dienen. Die Hydrocarbylgruppen R, die sich zur Durchführung der Erfindung eignen, sind etwa Alkyl, Alkenyl, Aryl oder zyklische Gruppen. Die erfindungsgemäßen Alkylgruppen schließen folgende ein, ohne darauf beschränkt zu sein: geradkettige und verzweigte Alkylketten, wie Äthyl, Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Heptyl, Octyl, Nonyl, Decyl, Undecyl, Dodecyl, Isopropyl, 2-Butyl, Isobutyl, 2-Methylbutyl, Isopentyl, Isopentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 2-Äthylhexyl, 2-Propylpentyl. Propylgruppen haben sich als sehr nützliche R-Gruppen erwiesen, andere Alkylgruppen, einschließlich von Methyl, Äthyl, Butyl und andere bis ungefähr zum Octyl, können Verwendung finden; bevorzugt werden C₂ bis C₄, wobei Alkyl mit Propyl am meisten bevorzugt wird. Auch Äthylen, Propylen und andere Glykole und Polyamine sind brauchbar.
Zu den Alkenylgruppen, die sich für die Erfindung als brauchbar erweisen, gehören, ohne darauf begrenzt zu sein, ungesättigte Anteile, die aus den vorstehend aufgeführten Alkylgruppen abgeleitet sind, einschließlich von, aber nicht beschränkt auf Vinyl, Allyl, Crotyl, Propargyl.
Brauchbare Arylgruppen schließen Phenyl, Tolyl, Benzyl, Naphthyl, Anthracyl, Penanthryl und Xylyl ein, ohne darauf begrenzt zu sein.
Jede der Hydrocarbylgruppen, das heisst die vorstehend aufgeführten geradkettigen, verzweigten oder zyklischen Alkyle, können intern mit Heteroatomen, wie O, N, oder S unterbrochen werden, das ist jedoch nicht erforderlich. Zum Beispiel sind Polyoxyhydrocarbyl oder Polyaminohydrocarbyl Ver bindungen, die voll in den Geltungsbereich der Erfindung fallen. Einige weitere Beispiele schließen solche ein, bei denen R einen polyhydrischen Alkohol, wie etwa -CH₂-(CHOH)_n, – CH₂OH, mit n = 1 bis 5. Enthalten kann. Alternativ kann R zum Beispiel einen Äther, wie etwa -CH₂(CHOH)_nCH₂O-(CH₂)_m enthalten, wobei n=1 bis 10 und m=1 bis 10 ist.
Die Hydrocarboxylgruppen können weiter substituiert werden. Die Substituentengruppen für die vorstehenden schließen folgende ein, ohne darauf beschränkt zu sein: weitere Alkylgruppen, Haloalkyl, Alkenyl, Alkoxy, Thioalkoxy, Haloalkoxy und Arylgruppen, ebenso wie Halogene, Hydroxyl, Amino, Azido, Carboxy, Cyano, Nitro, Merkapto, Sulfide, Sulfone, Sulfoxide und Heterozyklen.
Reaktionsfähige Funktionalitäten, die sich bei der Durchführung der Erfindung als Q eignen, schließen folgende ein, ohne darauf beschränkt zu sein: Halogene, substituierte oder nicht substituierte heterozyklische Verbindungen, mit der Maßgabe, dass Q kein Imidazol oder Bipyridin sein darf, zum Beispiel substituierte oder nicht substituierte Heterozykloalkyle, Aminohaltige Gruppen, wie etwa Heterozykloalkylamino, Polyalkylamino, Imidazol, Imidazolamid, Alkylimidazol; substituierte oder nicht substituierte Aldehyde; substituierte oder nicht substituierte Ketone; substituierte oder nicht substituierte Äther; substituierte oder nicht substituierte Ester; substituierte oder nicht substituierte Arylverbindungen mit ca. 6 bis ca. 20 Kohlenstoffatomen, wie zum Beispiel Aralkylamino mit ca. 6 bis ca. 20 Kohlenstoffatomen, Aminoaralkylamino mit ca. 6 bis ca. 20 Kohlenstoffatomen, Alkyloxyaryl-Verbindungen oder Allyloxyaryl-Verbindungen.
Die Amin-Funktionalitäten können primäre Amine sein, Hydrazine (-NH-NH-), Hydroxylamine (-NH-OH), Semicarbazide (-NH-C(O)-NH-NH₂), Thiosemicarbazide (-NH-C(S)-NH-NH₂), Hydrazone (-N=NH) oder Hydrazide (-C(O)-NHNH₂), oder ähnliche stickstoffhaltige Arten. Die erfindungsgemäßen Amine schließen auch Polyalkylamino-Verbindungen ein und Aminoalkylamine, wie etwa Aminopropylamine und weitere Heterozykloalkylamine.
Polyamide, Polyester und Polyäthylenglykole im Sinne der Erfindung haben eine Struktur analog zu den vorstehend beschriebenen Polyaminen, mit der Ausnahme, dass eine Amid-, Ester- oder Alkohol-Funktionalität für die stickstoffhaltige Art des Polyamins substituiert wird. Polyäthergruppen haben ebenfalls analoge Strukturen, mit der Ausnahme, dass in der Kohlenstoffkette verstreut eine oder mehrere Äthersauerstoffatome eingefügt sind.
Die folgenden Verbindungen zur Gestaltung von Verbindungen mit Aminfunktionalisierten Andockgruppen sind im kommerziellen Maßstab verfügbar bei der Firma Aldrich Chemical Co., Inc., Milwaukee, WI: N-(2-Bromoäthyl) phthalimid, N-(3-Bromopropyl)phthalimid und N-(4-Bromobutyl)phthalimid. Weitere phthalimidgeschützte Aminverbindungen lassen sich bequem aus einem geeigneten Alkyl, Aralkyl oder Arylhalid und Phthalimid synthetisieren. Zu den repräsentativen Verbindungen gehören N-(7-Bromoheptyl) phthalimid; N-(8-Bromooctyl)phthalimid; N-(9-Bromononyl)phthalimid; N-(10-Bromododecyl) Phthalimid; N-(11-Bromo-undecyl) Phthalamid; N-(12-Bromododecyl)phthalimid; N-(13-Bromotridecy)phthalimid; N-(14-Bromotetradecyl)phthalimid; N-(15-Bromopentadecyl)phthalimid; N-(16-Bromohexadecyl)phthalimid; N-(17-Bromoheptadecyl)phthalimid; N-(18-Bromooctadecyl)phthalimid; N-(19-Bromononadecyl)phthalimid; N-(3-Bromo-2-Methylpropyl)phthalimid; N-(4-Bromo-2-Methyl-3-Äthylbutyl)phthalimid; N-(3-Bromo-2,2-Diäthylpropyl)phthalimid; N-(4-Bromo-3-Propylbutyl)phthalimid; N-(10-Bromo-2,8-Dibutyl-Decyl)phthalimid; N-(8-Bromo-6,6-Dimethyloctyl)phthalimid; N-(8-Bromo-6-Propyl-6-Butyloctyl)phthalimid; N-(4-Bromo-2-Methyl-Butyl)phthalimid; N-(5-Bromo-2-Methylpentyl)phthalimid; N-(5-Bromo-3-Methylpentyl)phthalimid; N-(6-Bromo-2-Äthylhexyl)phthalimid; N-(5-Bromo-3-Penten-2-eins)phthalimid; N-(4-Bromo-3-Methyl-2-Butanol)phthalimid; N-(8-Bromo-3-Amino-4-Chloro-2-Cyanooctyl)phthalimid;N-(7-Bromo-3-Methoxy-4-Heptanal)phthalimid; N-(4-Bromo-2-lodo-3-Nitrobutyl)phihalimid; N-(12-Bromo4-Isopropoxydodecyl)phthalimid; N-(10-Bromo-4-Azido-2-Nitrodecyl)phthalimid; N-(9-Bromo-5-Merkaptononyl)phthalimid;N-(5-Bromo-4-Amino-Pentenyl)phthalimid; N-(5-Bromo-Penten-2-yl)phthalimid; N-(3-Bromoallyl)phthalimid; N-(4-Bromocrotyl)phthalimid; N-(3-Bromopropargyl)phthalimid; N-(1-Bromonaphth-4-yl)phthalimid; N-(2-Bromoanthrac-7-yl)phthalimid und N-(2-Bromophenanthr-6-yl)phthalimid. Diese Halide werden dann mit einem geeigneten 2 Amino- oder anderen 2-substituierten Purin zur Reaktion gebracht.
Geeignete heterozyklische Gruppen schließen Tetrazol, Triazol, Pyrrplidin, Piperidin, Piperazin und Morpholin ein, ohne auf diese beschränkt zu sein. Die Amine schließen die Amine aller vorstehend aufgeführten Alkyl-, Alkenyl- und Arylgruppen ein, einschließlich der primären und sekundären Amine und der "maskierten", bzw. verdeckten Amine, wie etwa das Phthalimid. Weitere reaktionsfähige Funktionalitäten, die sich für die Durchführung der Erfindung eignen, schließen die Verbindungen mit Thiol- (SH), Aldehyd- (C=0) oder Alkohol- (OH) Funktionalitäten ausnahmslos ein.
Diese reaktionsfähigen Funktionalitäten sind in der Lage, die Spaltung, Zerstörung oder Inaktivierung der RNA, insbesondere ihrer Phosphorodiester-Bindungen durch Katalysieren, Alkylieren oder auf andere Weise zu erzielen. Die reaktionsfähigen Funktionalitäten können basisch, säurebildend oder amphoter sein. Heteroatomische Arten können für solche Zwecke entweder basisch oder sauer oder tatsächlich amphoter rezeptiert werden. Für diese Zwecke können auch alkylierende und freie Radikale bildende Funktionalitäten zum Einsatz kommen.
Reaktionsunfähige Funktionalitäten für Q schließen Alkylketten, Polyamine, Äthylenglykol, Polyamide, Aminoalkylketten, amphipathische Anteile, Stellen zum Anheften von Reportergruppen und interkalierende Wirkstoffe zur Anbindung an beliebige bevorzugte Andockstellen ein, ohne darauf beschränkt zu sein.
Die reaktionsfähigen und reaktionsunfähigen Funktionalitäten können weiter substituiert werden. Geeignete Substituenten schließen die folgenden ein, ohne auf sie begrenzt zu sein: weitere Hydrocarbylgruppen, Alkoxy-, Thioalkoxy-, Haloalkoxy-, oder Arylgruppen, ebenso wie Halogene, Hydroxyl, Amino, Azido, Carboxy, Cyano, Nitro, Merkapto, Sulfide, Sulfone und Sulf oxide. Jeder der geradkettigen, verzweigten oder zyklischen Hydrocarbyl-Substituenten kann ferner intern mit O, N oder S abgebrochen werden. Substituentengruppen können an den vorstehend beschriebenen Alkyl-, Alkenyl-, Alkyn-, Polyäther-, Aryl-, Aralkyl- und heterozyklischen raumumspannenden Gruppen vorhanden sein. Die Substituentengruppen schließen folgende ein, ohne darauf begrenzt zu sein: Halogene, Hydroxyl, Keto, Carboxy, Nitrat, Nitrit, Nitro, Nitroso, Nitril, Trifluoromethyl, O-Alkyl, S-Alkyl, NH-Alkyl, Amino, Azido, Sulfoxid, Sulfon, Sulfid, Silyl, Interkalatoren, Konjugate, Polyamine, Polyamide, Polyäthylenglykol, Polyäther, Gruppen, welche die pharmakodynamischen Eigenschaften der Oligonukleotide verbessern und Gruppen, welche die pharmakokinetischen Eigenschaften der Oligonukleotide verbessern. Typische Interkalatoren und Konjugate schließen Cholesterol, Phospholipide, Biotin, Phenanthrolin, Phenazin, Phenanthridin, Anthrachinon, Acridin, Fluorescein, Rhodamin, Coumarin und Farbstoffe ein. Die Halogene schliessen Fluor, Chlor, Brom und Jod ein.
Die Erfindung schafft fernerOligonukleotide, die mindestens einen Zucker in Kombination mit einem Basenanteil enthalten, wie vorstehend beschrieben. Geeignete Zuckeranteile schließen Ribose, Desoxyribose und Zuckeranaloge ein, ohne darauf begrenzt zu sein.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist Z Ribose oder Desoxyribose. In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform ist Z ein Zuckeranalog, vorzugsweise ähnlich dem Desoxyribosetyp.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist G ein N; X ist NH₂; Y ist NHRQ, R ist H und Q ist ein Alkan mit 5 bis 20 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 5 bis 10 Kohlenstoffatomen; Z ist Ribose oder Desoxyribose, vorzugsweise Desoxyribose.
In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform ist G ein N; X ist NH₂, Y ist NHRQ, R ist ein niedrigeresAlkan; und Q ist ein Amin, wobei das Amin NH₂ Polyalkylamine, Aminoalkylamine, Hydrazin (-NH-NH-), Hydroxylamin (-NH-OH), Semicarbazide (-NH-C(O)-NH-NH₂, Thiosemicarbazide (-NH-C(S)- NH-NH₂, Hydrazon (-N=NH) oder Hydrazid (-C(O)-NH-NH₂, insbesondere NH₂ einschließt und Z ist Ribose oder Desoxyribose, vorzugsweise Desoxyribose.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist G ein N; X ist OH; Y ist NHRQ, R ist ein niedrigeres Alkan; und Q ist ein Amin, wobei dieses Amin NH₂, Polyalkylamino, Aminoalkylamin, Hydrazin (-NH-NH-), Hydroxylamin (-NH-OH), Semicarbazide (-NH-C(O)-NH-NH₂, Thiosemicarbazid (-NH-C(S)-NH-NH₂, Hydrazone (-N=NH) oder Hydrazide, insbesondere NH₂ enthält; und Z ist Ribose oder Desoxyribose, vorzugsweise Desoxyribose. In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform ist G ein N; X ist OH; Y ist NHRQ; R ist Hexan und Q ist NH₂; Z ist Ribose oder Desoxyribose, vorzugsweise Desoxyribose.
In bestimmten weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist Y das NHRQ und die reaktionsfähige Funktionallität, Q, ist eine Thiol-Gruppe, Aldehyd, Keton, Alkohol odere eine Alkoxy-Gruppe; Z ist Ribose oder Desoxyribose, vorzugsweise Desoxyribose.
Im Allgemeinen können den neuartigen erfindungsgemäßen Verbindungen auf Purinbasis Zuckeranteile nach Verfahren angehängt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Siehe Revankar, wie vorstehend.
Substituierte Zucker können synthetisiert werden nach den Verfahren, die in der PCT Patentanmeldung Nr. WO 91 10671 "Compositions and Methods for Detecting and Modulating RNA Activity and Gene Expression" (Zusammensetzungen und Verfahren zum Nachweis und zur Modulation der RNA-Aktivität und Gen-Expression) offengelegt sind.
Zum Beispiel lässt sich ein substituerter Zucker, wie Methyl 3-O-(t-Butyldiphenylsilyl)-2,5-Didesoxy-5-C-Formyl-α/β-D-Erythro-Pentofuranosid zubereiten durch Modifikation von 2-Desoxy-D-Ribose zu Methyl 2-Desoxy- α/β-D-Erythro-Pentofuranosid (zubereitet nach dem Verfahren von Motawai et al., Liebigs Ann. Chem., 1990, 599-602), wobei man nach selektiver Tosylierung, gefolgt von einer 3-O-Silylierung Methyl 3-O-(t-Butyldimethylsilyl)-2-Desoxy-S-O-Tosyl-α/β-D-Erythro-Pentofuranosid erhielt.
Dem Fachmann ist klar, dass in der Struktur des Zuckeranteils Variationen vorgenommen werden können, die sich zur Zubereitung der betreffenden Zusammensetzungen als nützlich erweisen, ohne vom Geist der Erfindung abzuweichen. Geeignete Substituenten am Zuckeranteil schließen die folgenden ein, ohne darauf begrenzt zu sein: OH, niedrigere Alkylgruppen, substituierte niedrigere Alkylgruppen, Aralkyl, Heteroalkyl, Heterozykloalkyl, Aminoalkylamino, Heterozykloalkyl, Polyalkylamino, substituiertes Silyl, F, Cl, Br, CN, CF₃, OCF₃, OCN, O-Alkyl, S-Alkyl, SOMe, SO₂Me, ONO₂, NO₂, N₃, NH₂, HN-Alkyl, OCH₂CH=CH₂, OCH₂CCH, OCCHO; oder ein RNA spaltender Anteil. Nicht jede Zuckerbindungsfunktion muss in modifizierter Form vorhanden sein, denn eine erhebliche Anzahl und sogar ein überwiegender Teil der Verbindungsgruppen kann in Form von Phosphorodiester vorliegen, so lange der gesamte Zielabschnitt der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen effektiv in die intrazellulären Räume des betreffenden Organismus eindringen oder auf andere Art mit der Ziel-RNA in Kontakt kommen und sich spezifisch damit verbinden kann, um ein Hybrid zu bilden, das in der Lage ist, die RNA-Aktivität nachzuweisen und zu modulieren. Natürlich kann auch die vollständig unmodifizierte, native Phosphorodiester-Struktur für solche Zwekke zum Einsatz kommen.
Die Erfindung bezieht sich ferner auf Oligonukleotide, die einen Zucker und einen basischen Anteil aufweisen, wie vorstehend erörtert, wobei die Position 3' des Zuckeranteils mit einer Phosphatgruppe ein Derivat bildet. Im Allgemeinen können erfindungsgemäße Nukleotide zubereitet werden, indem die Position 5' des Zuckeranteils im Imidazolring geschützt und in der Position 3' mit einem geeigneten Phosphoramidit oder einem anderen Phosphat, das zur Verwendung an einem DNA Synthetisierungs-Wirkstoff geeignet ist, ein Derivat gebildet wird, einschließlich und ohne Einschränkung von Alkyl-Phosphonat, Phosphorothioat oder Phosphorotriester.
Im Allgemeinen lassen sich die erfindungsgemäßen Oligonukleotide unter den folgenden Reaktionsbedingungen synthetisieren. Die folgende Reaktion beschreibt die Anheftung des 3-(1H-Imidazol-l-yl)Propylanteils an die Aminogruppe von Desoxyguanosin und 2-Aminodesoxyadenosin und die nachfolgende Aufnahme dieser Nukleoside in die Oligonukleotide. Die in Klammern angegebenen Zahlen beziehen sich auf die Verbindungen aus dem Im Abschnitt mit den Beispielen nachstehend dargestellten Reaktionsschema.
2-Chloro-9-(2-Desoxy-β-D-Erythropentofuranosyl) Inosin (3), ein vielseitiges wesentliches Zwischenprodukt, erhielt man durch Erhitzen von 2,6-Dichloro-9-(2-Desoxy-b-D-Erythropentofuranosyl)-Purin (1), Kazimierczuk et al., J. Am. Chem. Soc. 1984, 106, 6379, mit Natriumhydrid (NaH) in Alylalkohol, mit nachfolgender Hydrierung des Zwischenproduktes (2) mit Pd/C bei atmosphärischem Druck. Ein ähnliches Verfahren ist beschrieben bei Kern et al., Heterocyclic Chem, 1980, 17, 461. Der Ersatz des 2-Chloroatoms von (3) durch 1-(3-Aminopropyl)Imidazol ergab (4). Das Isobutyrylderivat von (4) Lesnik, wie oben wurde der Reaktionsbedingung nach Mitsunobu unterworfen, siehe Himelsbach et al., Tefrahedron, 1984, 40, 59, in Gegenwart von 2-(p-Nitrophenyl)Äthanol, um das vollständig geschützte Nukleosid zu erhalten (6). Die selektive Entfernung der Isobutyrylgruppen in (6) und nachfolgende Dimethoxy-Tritylierung, Schalter et al., Am. Chem. Soc. 1963. 85, 3821 und Phosphitylierung, Karpyshev et al., Russ. Chem.Rev. 1988, 57, 886 lieferte das Synthon Desoxyguanosin Amidit (8) in einer Ergiebigkeit von 73%.
2-Chloro-Desoxyadenosin (9) Christensen et al., J. Med. Chem. 1972, 15, 735, wurde mit 1-(3-Aminopropyl)Imidazol behandelt, um N²-substituiertes 2-Aminodesoxyadenosin (10) zu erhalten, das durch Sequenzbehandlung mit TipSiCl, Markiewicz et al., Nucleic. Acid Res., Symp. Ser. 1980, 7, 115 und Isobutyrylchlorid (IbCl) geschützt wurde, um (12) zu erhalten. Die Entfernung der schützenden TipSi-Gruppe von (12) mit Bu₄NF, Huss et al., Org. Chem. Soc., 1988, 53, 499 und nachfolgende Dimethoxytritylierung und Phosphitylierung ergab das Desoxyadenosin Amidit Synthon (14).

1. 2,6-Dichloro-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)Purin.
2. R₁ und R₂ = H; X = Allyloxy; Y = Cl.
3. R₁ und R₂ = H; X = OH; Y = Cl.
4. R₁ und R₂ = H; X = OH; Y = N; Ch₂)₃Im.
5. R₁ und R₂ = Ib; X = OH; Y = IbN(CH₂)₃Im.
6. R₁ und R₂ = Isobutyryl; X = ONPE; Y = IbN(CH₂)₃Im.
7. R₁ und R₂ = H; X = ONPE; Y = IbN(CH₂)₃Im.
8. Desoxyguanosin Amidit Synthon.
9. 2-Chloro-Desoxyadenosin.
10. R₁ und R₂ = H; X = NH₂; Y = NH(CH₂)₃-Im.
11. R₁ und R₂ = TipSi; X = NH₂; Y = NH(CH₂)₃-Im.
12. R₁ und R₂ = N; X = NHIb; Y = NH(CH₂)₃-Im.
13. R₁ und R₂ = H; X = NHIb; Y = NH(CH₂)₃-Im.

Ib = Isobutyryl
Im = Imidazol
NPE = (Nitrophenyl)Äthanol

Reaktionsbedingungen:
(a) NaH/Allylalkohol; (b) Pd/C/H/EtOH; (c) 1-(3-Aminopropyl)Imidazol/2-Äthoxyäthanol (90°C); (d) IbCI/TEA/PY; (e) 2-(p-Nitrophenyl)Äthanol /Ph₃P/-DEAD/Dioxan; (f) NH₄OH/CH₃ON; (g) DMTCL/TEA/PY; (h) 2-Cyanoäthyl N,N-Diisopropylchloro-Phosphoramidit/N,N-Diisopropyläthylamin-/CH₂Cl₂; (i) 1-(3-Aminopropyl)Imidazol/2-Methoxyäthanol (125°C); (j) TipSiCl/TEA/PY; und (k) Bu₄NF/THF.
Die Aufnahme von Amiditen (das heisst 8 und 14 im Reaktionsschema, das nachstehend im Zusammenhang mit der Synthese der erfindungsgemäßen Heterozyklen umrissen ist) in die Oligonukleotid-Sequenzen kann über das Protokoll der automatisierten DNA-Synthese erreicht werden. (Das Standardprotokoll unter Verwendung der DNA-Synthetisierungs-Substanz ABI 380B wurde modifiziert durch Verlängerung der Wartestufe nach der pulsierenden Zuführung von Tetrazol auf 900 Sekunden. Die Bedingungen des Schutzentzugs sind bei Himmelbach et al., Tetrahedron 1984, 40, 59) erörtert.
Im Allgemeinen können Oligonukleotide, welche die erfindungsgemäßen Verbindungen aufnehmen, mittels der Synthese im festen Aggregatzustand nach bekannten Verfahren angemessen so synthetisiert werden, dass sie komplementär zu der vorbestimmten Nukleotidsequenz der RNA oder DNA oder zumindest spezifisch hybridisierbar sind. Synthetisierungs-Substanzen für Nukleinsäure sind im Handel verfügbar und ihre Verwendung zur wirksamen Herstellung fast aller gewünschten Oligonukleotide oder Oligonukleotid-Analogen von angemessener Länge ist dem Fachmann im Allgemeinen vertraut.
Die resultierenden neuartigen Oligonukleotide werden mit einer automatischen Standardausrüstung für die Nukleinsäuresynthese aus der Feststoffphase, wie etwa dem Gerät von Applied Biosystems, Incorporated 380B oder von MilliGen/Biosearch 7500 oder 8800 synthetisiert. Chemische Kopplungsverfahren für Triester, Phosphoramidit oder Wasserstoffphosphonat, siehe Oligonucleotides Antisense Inhibitors vorstehend Seiten 7-24, werden im Zusammenhang mit diesen Synthesegeräten verwendet, um die erwünschten Oligonukleotide oder Oligonukleotid-Analogen herzustellen. Das Beaucage-Reagens, J.Chem. Society, 1990, 112, 1253-1255, oder elementarer Schwefel, Beaucage et al., Tetrehedron Letters, 1981, 22, 1859-1862, wird in Verbindung mit den chemischen Verfahren für Phosphoramidit oder Wasserstoffphosphonat verwendet, um substituierte Phosphorothioat-Oligonukleotide zu erhalten. Diese Oligonukleotid-Zusammensetzungen enthalten einen Zielabschnitt, der spezifisch mit einer vorher ausgewählten Nukleotidsequenz der RNA hybridisierbar ist und einige der Phosphodiester-Bindungen können mit einer Struktur substituiert werden, deren Funktion eine Verbesserung der Fähigkeit der Zusammensetzung zum Eindringen in die intrazelluläre Region, in der sich die RNA, deren Aktivität moduliert werden soll, befindet. Die Standardmodifikationen der Hauptkette schließen Phosphorothioat, Methylphosphonat, Phosphoramidit und Phosphorotriester ein, ohne darauf begrenzt zu sein. Es wird angenommen, dass diese Substitutionen in einigen Fällen die Eigenschaften der mit Zucker modifizierten Oligonukleotide verbessern. Solche Modifikationen der Phosphatbindungen sind offengelegt in U.S. Patent 5,378,825 und in U.S. Patent 5777 092 mit dem Titel "Heteroatomische Oligonukleotid-Verkettungen", Serie Nr. 903,160. Hauptketten-Modifizierungen können verwendet werden, ohne vom Geist der Erfindung abzuweichen. Es ist jedoch nicht notwendig, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen modifizierte Phosphat-Hauptketten enthalten.
Modifikationen, die Oligonukleotide schaffen, die weniger Ionisch sind als native Formen und das Eindringen modifizierter oder nicht modifizierter Oligonukleotide in den intrazellulären Raum erleichtern, werden in dieser Erfindung ebenfalls in Betracht gezogen. Jedes bestehende oder noch zu entdeckende Verfahren zur Erreichung dieses Ziels kann in Übereinstimmung mit der Durchführung der Erfindung verwendet werden. Der Fachmann wird erkennen, dass Modifikationen der Phosphatbindung in dieser Hinsicht nützlich sind. Variationen in der Phosphathauptkette, die für die Zubereitung der betreffenden Zusammensetzungen nützlich sind, können vorgenommen werden, ohne vom Geist der Erfindung abzuweichen. Modifikationen im Phosphoratom sind in der U.S. Patentanmeldung 5,138,048 mit dem Titel "Polyamin-Oligonukleotide zur Verbesserung der Aufnahme in der Zelle," beschrieben und an einen gemeinsamen Rechtsnachfolger hiervon übertragen.
Die Erfindung richtet sich vor allem auf Substitutionen in der Position N-2 einer Purinbase oder heterozyklischen Substanz, aber es ist zu verstehen, dass vorzugsweise nur eine oder höchstens einige wenige RNA-spaltende Anteile allgemein zu verwenden sind. Deshalb steht den Praktikern auf diesem Gebiet eine breite Auswahl für die Anbindung der RNA-spaltenden Anteile, der Gruppen, welche die pharmakodynamischen Eigenschaften verbessern und der Gruppen, welche die pharmakokinetischen Eigenschaften verbessern in Übereinstimmung mit der Erfindung zur Verfügung.
BEZUGSBEISPIELE
Die Beispiele 1-45 sind im Synthese-Schema 1 veranschaulicht, das unmittelbar auf Beispiel 45 folgt. Die Beispiele 46-53 sind im Synthese-Schema 2 veranschaulicht, das unmittelbar nach Beispiel 53 folgt. Die Beispiele 54-56 sind im Synthese-Schema 3 veranschaulicht, das unmittelbar nach Beispiel 56 folgt. Die in Klammern gesetzten Ziffern nach dem Titel der im Beispiel beschriebenen Verbindung stimmen mit den Nummern der Verbindungen im zugehörigen Schema überein.
Referenz: BEISPIEL 1
2,6-Dichlor-9-(2-Desoxy-3,5-die-O-p-Toluoyl-β-D-Erythropentofuranosyl)Purin (1)
Einer gerührten Lösung von 2,6-Dichlorpurin (25,0 g, 132,27 mmol) in trockenem Acetonitril (1000 ml) wurde Natriumhydrid (60% Öl, 5,40 g, 135 mmol) in kleinen Portionen über einen Zeitraum von 30 Minuten unter Argonatmosphäre zugegeben. Nach der Zugabe von NaH wurde das Reaktionsgemisch 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt. Vorgetrocknete und pulverisierte 1-Chlor-2'-Desoxy-3,5,Di-O-p-Toluoyl-δ-D-Erythro-Pentofuranose (53,0 g, 136 mmol) wurde über einen Zeitraum von 15 Minuten zugefügt und der Rührvorgang 10 Stunden lang bei Raumtemperatur über Argonatmosphäre fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bis zum trockenen Zustand verdunstet und der Rückstand in einem Gemisch aus CH₂Cl₂/H₂O (250:100 ml) aufgelöst und in Dichlormethan (2 × 250 ml) extrahiert. Der organische Extrakt wurde mit Salzlösung (100 ml) gewaschen, getrocknet und bis zum trockenen Zustand verdunstet. Der Rückstand wurde in Dichlormethan (300 ml) aufgelöst, mit Silicagel (60-100 mesh Maschenweite, 250 g) gemischt und bis zum trockenen Zustand verdunstet. Das trockene Silicagel wurde oben auf einer Silicagelsäule (250-400 mesh, 12 × 60 cm), in Hexan gepackt, angeordnet. Die Säule wurde mit Hexan (1000 ml), Toluol (2000 ml) und Toluol:Äthylacetat (9:1, 3000 ml) eluiert. Die Fraktionen mit dem erforderlichen Produkt wurden zusammengegeben und verdunstet, um 52 g (72%) von 3 als weiße Festsubstanz zu erhalten. Eine kleine Menge der Festsubstanz wurde für analytische Zwecke aus Äthanol auskristallisiert.
mp 160-162°C; ¹H NMR (DMSO-d₆); δ 2.36 (s, 3 H, CH₃), 2.38 (s, 3 H, CH₃), 2.85 (m, 1 H, C₂'H), 3.25 (m, 1 H, C₂'H), 4 .52 (m, 1 H, C₄H), 4.62 (m, 2 H, C₅,CH₂), 5.80 (m, 1 H, C₃'H), 6.55 (t, 1.H, J_1',2' = 6.20 Hz, C₁,H), 7,22 (dd, 2 H, ArH), 7.35 (dd, 2 H, ArH), 7,72 (dd, 2 H, ArH), 7.92 (dd, 2 H, ArH), and 8.92 (s, 1 H, C₈H).
Referenz: BEISPIEL 2
2-Chlor-6-Allyloxy-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)Purin (2)
Einer gerührten Suspension von 2,6-Dichlor-9-(2'-Desoxy-3',5'-Di-O-p-Toluoyl-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)-Purin (1, 10,3 g, 19,04 mmol) in Allylalkohol (150 ml) wurde Natriumhydrid (60%, 0,8 g, 20,00 mmol) in kleinen Portionen über einen Zeitraum von 10 Minuten bei Raumtemperatur zugegeben. Nach der Zugabe von NaH wurde das Reaktionsgemisch in ein auf 55°C vorgewärmtes Ölbad gestellt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 55°C 20 Minuten lang unter Ausschluss von Feuchtigkeit gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde gekühlt, gefiltert und mit Allylalkohol (50 ml) gewaschen. Dem Filtrat wurde IRC-50 (schwach säurehaltiges) H⁺ Harz zugefügt, bis die Lösung einen pH-Wert von 4-5 erreichte. Das Harz wurde gefiltert, mit Methanol (100ml) gewaschen und das Filtrat bis zum trockenen Zustand verdunstet. Der Rückstand wurde auf Silicagel (10 g, 60-100 mesh) absorbiert und bis zum trockenen Zustand verdunstet. Das getrocknete Silicagel wurde oben auf der Silicasäule (5×25 cm, 100 bis 250 mesh), in Dichlormethan gepackt, angeordnet. Dann wurde die Säule mit CH₂Cl₂/Aceton (1:1) eluiert. Die Fraktionen, die das Produkt aufwiesen, wurden zusammengenommen und bis zum trockenen Zustand verdunstet, um 6 g (96%) der im Titel aufgeführten Verbindung als Schaum zu erhalten.
¹H NMR (Me₂SO-d₆); δ 2.34 (m, 1 H, C_2'H), 2.68 (m, 1 H, C_2'H), 3.52 (m, 2 H, C_5'H), 3.86 (m, 1 H, C_4'H), 4.40 (m, 1 H, C_3'H), 4.95 (t, 1 H, C_5'OH), 5. 08 (d, 2 H, CH₂), 5.35 (m, 3 H, CH₂ and C_3'OH), 6.10 (m, 1 H, CH), 6.35 (t, 1 H, J_1',2' = 6.20 Hz, C_1'H), 8.64 (s, 1 H, C₈H). Analytisch berechnet für C₁₃H₃₅ClN₄O₄: C, 47.78; H, 4.63; N, 17.15; Cl, 10.86. Gefunden: C, 47.58; H, 4.53; N, 17.21; Cl, 10.91.
Referenz: BEISPIEL 3
2-Chlor-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)Inosin. (3)
Ein Gemisch aus 2 (6 g, 18,4 mmol) Pd/C (10%, 1 g) und Triäthylamin (1,92 g, 19,00 mmol) in Äthylalkohol wurde bei atmoshärischem Druck 30 Minuten lang bei Raumtemperatur hydriert. Danach folgte die Absorption des Wasserstoffvolumens aus dem Reaktionsgemisch. Das Reaktionsgemisch wurde gefiltert, mit Methanol (50 ml) gewaschen und das Filtrat bis zum trockenen Zustand verdunstet. Das Produkt , 5,26 g (100%) erwies sich als feuchtigkeitsempfindlich und blieb als viskoses Öl bestehen. Das Öl wurde so ohne Reinigung zur weiteren Reaktion verwendet. Eine kleine Menge der Feststoffsubstanz wurde in Wasser aufgelöst und zu einem amorphen Feststoff gefriergetrocknet:
¹H NMR (Me₂SO-d₆); δ 2.35 (m, 1 H, C_2'H), 2.52 (m, 1 H, C_2'H), 3.54 (m, 2 H, C_5'H), 3.82 (m, 1 H, C_4'H), 4.35 (m, 1 H, C_3'H), 4.92 (b s, 1 H, C_5'OH), 5.35 (s, 1 H, C_3'OH), 6.23 (t, 1 H, J_1',2' = 6 .20 Hz, C_1'H), 8.32 (s, 1 H, C₈H), 13.36 (b s, 1 H, NH).
Referenz: BEISPIEL 4
N₂-[Imidazol-1-yl(Propyl)]-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)-Guanosin. (4)
Eine Lösung des Nukleosids von 3 (10,3 g, 36,00 mmol) und 1-(3-Aminopropyl)Imidazol (9,0 g, 72,00 mmol) in 2-Methoxyäthanol (60 ml) wurde in einer Stahlflasche 24 Stunden lang bei 100°C (Ölbad) erhitzt. Die Flasche wurde auf 0°C abgekühlt, vorsichtig geöffnet und der ausgefällte Feststoff wurde gefiltert. Der Feststoff wurde mit Methanol (50 ml), Aceton (50 ml) gewaschen und über Natriumhydroxid getrocknet, um 9 g reine 4 zu erhalten. Eine kleine Menge wurde für analytische Zwecke aus DMF rekristallisiert:
mp 245-47°C: ¹H NMR (Me₂SO-d₆); δ 1.94 (m, 2 H, CH₂), 2.20 (m, 1 H, C_2'H), 2.54 (m, 1 H, C_2'H), 3.22 (m, 2 H, CH₂), 3.51 (m, 2 H, C_3'H), 3.80 (m, 1 H, C_4'H), 3.98 (m, 2 H, CH₂), 4.34 (m, 1 H, C_3'H), 4.90 (b s, 1 H, C_5'OH), 5.51 (s, 1 H, C_3'OH), 6.12 (t, 1 H, J_1',2' = 6.20 Hz, C_1'H), 6.46 (b s, 1 H, NH), 6.91 (s, 1 H, ImH), 7.18 (s, 1 H, ImNH), 7.66 (s, 1 H, ImH), 7.91 (s, 1 H, C₈H), 10.60 (b s, 1 H, NH). Anal. Calcd (analytisch berechnet für) C₁₆H₂₁N₇O₄: C, 51.19; H, 5.64; N, 26.12. Gefunden: C, 50.93; H, 5.47; N, 26.13.
Referenz: BEISPIEL 5
N₂-3',5'-Tri-O-Isobutyryl-N₂-[Imidazol-1-yl(Propyl)]-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)-Guanosin. (5)
Einer gut getrockneten Lösung des Substrates aus 4 (1,5 g, 4,00 mmol) und Triäthylamin (1,62 g, 16,00 mmol) in trockenem Pyridin (30 ml) und trockener DMF (30 ml) wurde bei Raumtemperatur Isobutyrylchlorid (1,69 g, 16,00 mmol) zugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde 12 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und bis zum trockenen Zustand verdunstet. Der Rückstand wurde verteilt zwischen Dichlormethan (100 ml) und Wasser (50 ml) und mit CH₂Cl₂ (2×200 ml) extrahiert. Der organische Extrakt wurde mit Salzlauge (100 ml) gewaschen und über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet. Der getrocknete organische Extrakt wurde bis zum trockenen Zustand verdunstet und der Rückstand über Blitzlichtchromatographie unter Verwendung von CH₂Cl₂/MeOH als Elutionsmittel gereinigt. Die gereinigten Fraktionen wurden zusammengefasst und bis zur Trockenheit verdunstet, woraus sich nach der Kristallisation aus CH₂Cl₂/MeOH 1,8 g (77%) von 5 als farblose kristalline Festsubstanz ergaben:
mp 210-212°C; ¹H NMR (Me₂SO-d₆) δ 1.04 (m, 18 H, 3 Isobutyryl CH₃), 1.94 (m, 2 H, CH₂), 2.56 (m, 4 H, C_2'H and 3 Isobutyryl CH) 2.98 (m, 1 H, C_2'H), 3.68 (m, 2 H, CH₂), 3.98 (m,, 2 H, CH,), 4.21 (2 m, 3 H, C_5'H and C_4'H), 5.39 (m, 1 H, C_3'H), 6.30 (t, 1 H, J_1',2' = 6.20 Hz, C_1'H), 6.84 (s, 1 H, ImH), 7.18 (s, 1 H, ImH), 7.34 (s, 1 H, ImH), 8.34 (s, 1 H, C₈H), 10.60 (b s, 1 H, NH). Analytisch berechnet für C₂₈H₃₉H₇O₇: C, 57.42; H, 6.71; N, 16.74. Gefunden: C, 57.291 H, 6.58; N, 16.56.
Referenz: BEISPIEL 6
6-0-[2-(-Nitrophenyl)Äthyl]-N₂-3',5'-Tri-O-Isobutyryl-N₂-[Imidazol-1-yl(Propyl)]-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)-Guanosin. (6)
Einer gerührten Lösung aus 5 (2,0 g, 3,42 mmol), Triphenylphosphin (2,68 g, 10,26mmol) und p-Nitrophenyläthanol (1,72 g, 10,26 mmol) in trockenem dioxan wurde bei Raumtemperatur Diäthylazodicarboxylat (1,78 g, 10,26 mmol) zugefügt. Das Reaktionsgemisch wurd 12 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und bis zum trockenen Zustand verdunstet. Der Rückstand wurde mit Blitzlichchromatographie über Silicagel gereinigt, unter Verwendung von CH₂Cl₂/Aceton als Elutionsmittel. Die reinen Fraktionen wurden zusammengefasst und bis zum trockenen Zustand verdunstet, um 2,4 g (96%) der im Titel aufgeführten Mischung als amorphe Festsubstanz zu erhalten.
¹H NMR (Me₂SO-d₆) δ 1.04. (m, 18 H, 3 Iaobutyryl CH₃), 1.94 (m, 2 H, CH₂), 2. 50 (m, 3 H, C_2'H and 2 Isobutyryl CH), 3.00 (m, 1 H, C_2'H), 3.12 (m, 1 H, Isobutyryl CH), 3.24 (m, 2 H, CH,), 3.82 (m, 2 H, CH₂), 3.98 (m, 2 H, CH₂), 4.21 (2 m, 3 H, C_5'CH₂ and C_4'H), 4.74 (m, 2 H, CH₂), 5.39 (m, 1 H, C_3'H), 6.34 (t, 1 H, J_1',2' = 6.20 Hz, C_1'H), 6.82 (s, 1 H, ImH), 7.08 (s, 1 H, ImH), 7.56 (s, 1 H, ImH), 7.62 (d, 2 H, ArH), 8.1 (d, 2 H, ArH), 8.52 (s, 1 H, C₈H). Analytisch berechnet für C₃₆H₄₆N₈O₉-1/2 H₂O: C, 58.13; H, 6.37; N, 15.01. Gefunden: C, 58.33; H, 6,.39; N, 14.75.
Referenz: BEISPIEL 7
6-O-[2-(4-Nitrophenyl)-Äthyl]-N₂-Isobutyryl-N₂-[Imidazol-1-yl(Propyl)]-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)-Guanosin. (7)
Einer gerührten Lösung von 6 (9,00 g, 12,26 mmol) in Methanol (250 ml) wurde bei Raumtemperatur mit Ammoniumhydroxid (30%, 150 ml) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde 4 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und unter reduziertem Druck bis zum trockenen Zustand verdunstet. Der Rückstand wurde durch Blitzlichtchromatographie über Silicagel gereinigt, unter Verwendung von CH₂Cl₂/MeOH als Elutionsmittel. Die reinen Fraktionen wurden zusammengenomen und bis zum trockenen Zustand verdunstet, um 5.92 g (81%) der unter dem Titel angegebenen Verbindung zu erhalten:
¹H NMR (Me₂SO-d₆) δ 1.04 (m, 6H, Isobutyryl CH₃), 1.96 (m, 2 H, CH₂), 2.32 (m, 1 H, C_2'H), 2.62 (m, 1 H, C_2'H), 3.14 (m, 1 H, Isabutyryl CH), 3.26 (m, 2 H, CH₂), 3.52 (m, 2 H, C_5'CH₂), 3 .82 (m, 3 H, CH₂ and C_4'H), 3.96 (m, 2 H, CH₂), 4.36 (m, 1 H, C_3'H), 4.70 (m, 2 H, CH₂), 4.96 (b s, 1 H, C_5'OH), 5.42 (b s, 1 H, C_3'OH), 6.34 (t, 1 H, J_1',2' = 6.20 Hz, C_1'H), 6.82 (s, 1 H, ImH), 7.12 (s, 1 H, ImH), 7.54 (s, 1 H, ImH), 7.62 (d, 2 H, ArH), 8.16 (d, 2 H, ArH), 8.56 (s, 1 H, C₈H). Analytisch berechnet für C₂₈H₃₄N₈O₇-1/2 H₂O: C, 55.71; H, 5.84; N, 18.56. Gefunden: C, 55. 74 ; H, 5.67; N, 18.43.
Referenz: BEISPIEL 8
5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-6-O-[2-(4-Nitrophenyl)Äthyl]-N₂-Isobutyryl-N₂-Imidazol-1-yl(Propyl)]-2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)-Guanosin. (8)
Das Substrat 7 (5,94 g, 10 mmol) wurde in trockenem Pyridin (75 ml) aufgelöst und bis zum trockenen Zustand verdunstet. Dieser Vorgang wurde 3 mal wiederholt, um Spuren von Feuchtigkeit zu entfernen. Dieser gut getrockneten Lösung des Substrats in trockenem Pyridin (100 ml) wurde bei Raumtemperatur trockenes Triäthylamin (4.04 g, 40 mmol) zugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 12 Stunden lang unter Argon atmosphäre gerührt. Methanol (50 ml) wurde zugefügt und das Rühren für eine Dauer von 15 Minuten fortgesetzt, wonach die Verdunstung bis zu einem trockenen Zustand erfolgte. Der Rückstand wurde durch Blitzlichtchromatographie über Silicagel gereinigt, unter Verwendung von Dichlormethan-Aceton, das 1 % Triäthylamin enthielt, als Elutionsmittel. Die reinen Fraktionen wurden zusammen genommen und bis zum trockenen Zustand verdunstet, um 7,2 g (80%) der im Titel aufgeführten Verbindung als farblosen Schaum zu erhalten:
¹H NMR (Me₂SO-d₆) δ 1.04 (m, 6 H, Isobutyryl CH₃), 1.94 (m, 2 H, CH₂), 2.34 (m, 1 H, C_2'H), 2.80 (m, 1 H, C_2'H), 3.04 (m, 1 H, Isobutyryl CH), 3.18 (m, 2 H, CH,), 3.28 (m, 2 H, CH₃), 3.62 (s, 3 H, OCH₃), 3.66 (s, 3 H, OCH₃), 3.74 (2 m, 2 H, C_3'CH₂), 3.98 (m, 3 H, CH₂ and C_4'H), 4.36 (m, 1 H, C_3'H), 4.70 (m, 2 H, CH₂), 5.44 (b s, 1 H, C_3'OH), 6.32 (t, 1 H, J_1',2' = 6.20 Hz C_1'H), 6.64 – 7.32 (m, 15 H, ImH und ArH), 7.52 (s, 1 H, ImH), 7.62 (d, 2 H, ArH), 8.16 (d, 2 H, ArH), 8.42 (s, 1 H, C₈H). Analytisch berechnet für C₄₉H₅₂N₈O₉-H₂O: C, 64.32; H, 5.95; N; 12:25. Gefunden: C, 64.23; H, 5.82; N, 12.60.
Referenz: BEISPIEL 9
3'-O-(N,N-Diisopropylamino)(β-Cyanoäthoxy)Phosphanyl]-5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-6-O-[2-(4-Nitrophenyl)Äthyl]-N₂-Isobutyryl-N₂-[Imidazol-1-yl(Propyl)]-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)-Guanosin. (9)
Das Substrat von 8 (2,5 g, 2,7 mmol) wurde in trockenem Pyridin (30 ml) aufgelöst und bis zum trockenen Zustand verdunstet. Dieser Vorgang wurde drei Mal wiederholt, um letzte Spuren von Wasser zu entfernen und über Nacht auf fester Natriumhydroxidsubstanz getrocknet. Das getrocknete 8 wurde in trockenem Dichlormethan (30 ml) aufgelöst und unter Argonatmosphäre auf 0°C gekühlt. Dieser kalten gerührten Lösung wurde tropfenweise über einen Zeitraum von 15 Minuten N,N-Diisopropyläthylamin) (0,72 g, 5,6 mmol) und danach (β-Cyanoäthoxy)Chlor(N,N-Diisopropylamin)Phosphat (1,32 g, 5,6 mmol) zugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde lang bei 0°C und dann 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktions gemisch wurde mit Dichlormethan (100 ml) verdünnt und mit Salzlauge (50 ml) gewaschen. Der organische Extrakt wurde über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde durch Blitzlichtchromatographie über Silicagel gereinigt, unter Verwendung von Hexan/Acteon, das 1% Triäthylamin als Elutionsmittel enthielt. Die Hauptfraktionen wurden gesammelt und bis zum trockenen Zustand verdunstet. Der Rückstand wurde in trockenem Dichlormethan (10 ml) aufgelöst und 30 Minuten lang tropfenweise in eine gerührte Lösung aus Hexan (1500 ml) zugefügt. Nach der Zugabe wurde der Rührvorgang weitere 60 Minuten lang bei Raumtemperatur unter Argon fortgesetzt. Die ausgefällte Festsubstanz wurde gefiltert, mit Hexan gewaschen und über festem NaOH über Nacht unter Vakuum getrocknet, um 2,0 g (65%) der im Titel aufgeführten Verbindung als farbloses Pulver zu erhalten.
¹H NMR (Me₂SO-d₆) δ 1.04 (2 m, 18 H, 3 Isobutyryl CH₃), 1.94 (m. 2 H, CH₂), 2.44 (m 3 H, C_2'H und 2 Isobutyryl CH), 2.80 ( 1 H, C_2'H), 3.2 (m, 5 H, 2 CH₂ und Isobutyryl CH), 3.44 – 3.98 (m, 12 H, CH₂, 2 OCH₃ and C_5'CH₂), 4.16 (m, 1 H, C₄H), 4.64 (m, 3 H, C_3'H und CH₂), 6.32 (t, 1 H, J_1',2' = 6.20 Hz, C_1'H), 6.64 – 7.32 (m, 16 H, 3 ImH and ArH), 7.44 (d; 2 H, ArH), 8.16 (d, 3 H, ArH and C₈H).
Referenz: BEISPIEL 10
N2-[Imidazol-1-yl(Propyl)]-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)-2-Amino-Adenosin. (11)
Eine Suspension von 2-Chlor-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)Adenosin (10, 10,68 g, 37,47 mmol) und 1-(3-Aminopropyl)Imidazol (12,5 g, 100 mmol) in 2-Methoxyäthanol (80 ml) wurde 45 Stunden lang in einer Stahlflasche bei 125°C erhitzt. Dann wurde die Stahlflasche auf 0°C gekühlt, vorsichtig geöffnet und bis zum trockenen Zustand verdunstet. Der Rückstand wurde mehrmals zusammen mit einer Mischung aus Äthanol und Toluol verdunstet. Der Rückstand wurde in Äthanol aufgelöst und nach Kühlung ausgefällt. Der Niederschlag wurde gefiltert und getrocknet. Das Filtrat wurde bis zur Trockenheit verdunstet und der Rückstand ohne weitere Reinigung zur nächsten Reaktion weitergeleitet.
¹H NMR (Me₂SO-d₆) δ 1.94 (m, 2 H, CH₂), 2.18 (m, 1 H, C_2'H), 2.36 (m, 1 N, C_2'H), 3.18 (m, 2 H, CH₂), 3.52 (2 m, 2 H, C_5'CH₂), 3.80 (m, 1 H, C_4'H), 4.02 (m, 2 H, CH₂), 4.36 (m, 1 H, C_3'H) , 5.24 (b s, 2 H, C_3'OH und C_5'OH, 6.18 (t, 1 H, J_1',2' = 6.20 Hz, C_1'H), 6.42 (t, 1 H, NH), 6.70 (b s, 2 H NH₂), 6. 96 (s, 1 H, ImH); 7.24 (s; 1 H, ImH), 7.78 (s, 1 H, ImH), 7.90 (s, 1 H, C₈H). Analytisch berechnet für C₁₆H₂₂N₈O₃: C, 51.33; H, 5.92; N, 29.93. Gefunden: C, 51.30; H, 5.92; N, 29.91.
Referenz: BEISPIEL 11
3'-,5'-O-[(Tetraisopropyldisiloxan-1,3-Diyl)-N₂-(Imidazol-1-yl(Propyl)]-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)-Amino-Adenosin. (12)
Das Rohprodukt 11 (14,03 g) wurde in trockenem Dimethylformamid (DMF) (100 ml) und trockenem Pyridin (50 ml) aufgelöst und bis zum trockenen Zustand verdunstet. Dieser Vorgang wurde dreimal wiederholt, um das gesamte Wasser zu entfernen. Das getrocknete Substrat wurde in trockenem DMF (75 ml) aufgelöst und bei Raumtemperatur unter Argonatmosphäre gerührt. Der gerührten Lösung wurde über einen Zeitraum von 15 Minuten trockenes Triäthylamin (10,1 g, 100 mmol) und 1,3-Dichlor-1,1, 3,3-Tetraisopropyldisiloxan (TipSiCl, 15,75 g, 50,00 mmol) zugefügt. Nach der Zugabe von TipSiCl wurde das Reaktionsgemisch über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde bis zum trockenen Zustand verdunstet. Der Rückstand wurde mit Toluol (10 ml) gemischt und ernuet verdunstet. Der Rückstand wurde durch Blitzlichtchromatographie über Sillicagel unter Verwendung von CH₂Cl₂/MeOH als Elutionsmittel gereinigt. Die purifizierten Fraktionen wurden gesammelt und bis zum trockenen Zustand verdunstet, um 12,5 g (54%) von 12 als amorphes Pulver zu erhalten:
¹H NMR (Me₂SO-d₆) δ 1.00 im, 28 H), 1.92 (m, 2 H, CH₂), 2.42 (m, 1 H, C_2'H), 2.80 (m, 1 H, C_2'H), 3.18 (m, 2 H, CH₂), 3.84 (2 m, 3 H, C_5'CH₂ und C_4'H), 4.00 (t, 2 H, CH₂), 4.72 (m, 1 H, C_3'H), 6.10 (m, 1 H, C_1'H), 6.48 (t, 1 H, NH); 6.74 (b s, 2 H, NH₂), 6.88 (s, 1 H, ImH), 7.18 (s, 1 H, ImH), 7.64 (s, 1 H, ImH), 7. 82 (s, 1 H, C₈H). Analytisch berechnet für C₂₈H₅₀N₈O₄Si₂: C, 54.33; H, 8.14 ; N, 18.11. Gefunden: C, 54.29; H, 8.09; N, 18.23.
Referenz: BEISPIEL 12
3',5'-O-(Tetraisopropyldisiloxan-1,3-Diyl)-N₆-Isobutyryl-N₂-[(Imidazol-1-yl)Propyl]-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)-2-Amino-Adenosin. (13)
Eine Lösung von 12 (12,0 g, 19,42 mmol) in Pyridin (100 ml) wurde bei Raumtemperatur mit Triäthylamin (10,1 g, 100 mmol) unter Argonatmosphäre gerührt. Dieser gerührten Lösung wurdeüber einen Zeitraum von 25 Minuten tropfenweise Isobutyrylchlorid (6,26 g, 60 mmol) zugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Stunden lang unter Argonatmosphäre gerührt und bis zum trockenen Zustand verdunstet. Der Rückstand wurde zwischen Dichlormethan/Wasser verteilt und mit Dichlormethan (2 x 150 ml) extrahiert. Der organische Extrakt wurde mit Salzlösung (30 ml) gewaschen und über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt und der Rückstand durch Blitzlichtchromatographie über Silicagel gereinigt, unter Verwendung von CH₂Cl₂/Aceton als Elutionsmittel, um 13 als Schaum zu erhalten:
¹H NMR (Me₂SO-d₆) δ 1.00 (m, 34 H), 1.92 (m, 2 H, CH₂), 2.42 (m, 1 H, C_2'H), 2.92 (m, 2 H, C_2'H und Isobutyryl CH), 3.24 (m, 2 H, CH₂), 3.86 (m, 3 H, C_5'CH₂ und C_4'H), 4.40 (m, 2 H, CH₂), 4.74 (m, 1 H, C_3'H), 6.22 (m, 1 H, J_1',2' = 6.20 Hz, C_1'H), 6.82 (t, 1 H, NH), 6 .92 (s, 1 N, ImH), 7.18 (s, 1 H, ImH), 7. 60 (s, 1 H, ImH), 8.12 (s, 1 H, C₈H), 10. 04 (b s, 1 H, NH). Analytisch berechnet für C₃₂H₅₄N₈O₅Si₂: C, 55.94; H, 7.92; N, 16.31. Gefunden C, 55.89; H, 7.82; N, 16.23.
Referenz: BEISPIEL 13
N₆-3',5'-Tri-O-Isobutyryl-N₂-[Imidazol-1-yl(Propyl)]-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)-2-Amino-Adenosin. (14)
Das Rohprodukt 11 (9,2 g, 24,59 mmol) wurde zusammen mit trockenem DMF/Pyridin (100:50ml) dreimal verdunstet. Der getrocknete Rückstand wurde in trockenem DMF (100 ml) und trockenem Pyridin (100 ml) aufgelöst und auf 0°D abgekühlt. Dieser kalten gerührten Lösung wurde Triäthylamin (20,2 g, 200 mmol) und dann Isobutyrylchlorid (15,9 g, 150 mmol) zugefügt. Nach der Zugabe von IbCl wurde das Reaktionsgemisch 12 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde bis zum trockenen Zustand verdunstet. Der Rückstand wurde mit Dichlormethan (2 × 200 ml) extrahiert, mit 5% NaHCO₃-Lösung (50 ml), Wasser (50 ml) und Salzlösung (50 ml) gewaschen. Der organische Extrakt wurde über MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck abgeführt. Der Rückstand wurde mit der Blitzlichtchromatographiesäule gereinigt, unter Verwendung von CH₂Cl₂/Aceton (7:3) als Elutionsmittel. Die reinen Fraktionen wurden gesammelt und verdunstet, um 7,0g (44%) von 14 als Schaum zu erhalten:
¹H NMR (Me₂SO-d₆) δ 1.00 (m, 18 H, 3 Iaobutyryl CH₃), 1.98 (m, 2 H, CH₂), 2.42 (m, 3 H, C_2'H und ² Isobutyryl CH), 2.92 (m, 2 H, C_2'H and Iaobutyryl CH), 3.24 (m, 2 H, CH₂), 4.04 (m, 2 H, CH₂), 4 .22 (m, 3 H, C_5'CH₂ und C_4'H), 5.42 (m, 1 H C_3'H), 6.24 (t, 1 H, J_1',2' = 6.20 Hz, C_1'H), 7.04 (s, 1 H, ImH), 7.12 (t, 1 H, NH), 7.32 (s, 1 H, ImH), 8.00 (s, 1 H, ImH), 8.12 (s, 1 H, C₈H), 10.14 (b s, 1 H, NH). Analytisch berechnet: C₂₈H₄₀N₆O₆: C, 57.52; H, 6.89; N, 19.17. Gefunden C, 57.49; H, 6.81: N, 19.09.
Referenz: BEISPIEL 14
N₂-Isobutyryl-N₂-[Imidazol-1-yl(Propyl)]-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)-2-Amino-Adenosin. (15)
Verfahren 1: Einer gerührten Lösung von 13 (2,6 g, 3,43 mmol) in trockenem Tetrahydrofuran (60 ml) wurde bei Raumtemperatur Tetrabutylammoniumfluorid (1M Lösung in THF, 17,15 ml, 17,15 mmol) zugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde lanf bei Raumtemperatur gerührt und mit H⁺ Harz gelöscht. Das Harz wurde gefiltert und mit Pyridin (20 ml) und Methanol (50 ml) gewaschen. Das Filtrat wurde bis zum trockenen Zustand verdunstet und der Rückstand ergab nach Reinigung über der Silicasäule unter Verwendung von CH₂Cl₂/MeOH (95:5) die im Titel aufgeführte Verbindung mit einer Ergiebigkeit von 59% (1 g):
¹H NMR (Me₂SO-d₆) δ 1.04 (m, 6 H, Isobutyryl CH₃), 1.98 (m, 2 H, CH₂), 2.22 (m, 1 H, Isobutyryl CH), 2.70 (m, 1H, C_2'H), 2.98 (m, 1H, C_2'H), 3.22 (m, 2 H CH₂), 3.52 (2 m, 2 H, C_5'CH₂), 3.82 (m, 1 H, C_4'H), 4.04 (m, 2 H, CH₂), 4.38 (m, 1 H, C_3'H), 4 .92 (b s, 1 H, OH), 5.42 (b s, 1 H, OH) 6.22 (t, 1 H, J_1',2' = 6.20 Hz, C_1'H), 6.92 (s, 1 H, ImH), 7.06 (t, 1 H, NH), 7.24 (s, 1 H, ImH), 7.74 (s, 1 H, ImH), 8.12 (s, 1 H, C₈H), 10.08 (b s, 1 H, NH). Anal. berechnet für C₂₀H₂₈N₈O₄. H₂O; C, 54.04; H, 6.35; N, 25.21. Gefunden: C, 54.14; H, 6.53; N, 25.06.
Verfahren 2: Einer eiskalten Lösung (0 bis –5°C) von 14 (7,4 g, 12,65 mmol) in Pyridin:EtOH:H₂O (70:50:10 ml) wurde sofort 1 N KOH-Lösung (0°C, 25 ml, 25 mmol) zugefügt. Nach 10 Minuten langem Rühren wurde die Reaktion mit H⁺ Harz (Pyridiniumform) gelöscht auf einen pH-Wert von 7. Das Harz wurde gefiltert und mit Pyridin (25 ml) und Methanol (100 ml) gewaschen. Das Filtrat wurde bis zum trockenen Zustand verdunstet und der Rückstand durch Blitzlichtchromatographie über Silicagel unter Verwendung von CH₂Cl₂ /MeOH (9:1) als Elutionsmittel gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden zusammengenommen und verdunstet, um 1,8 g (37%) von 15 zu erhalten.
Referenz: BEISPIEL 15
5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-N₆-Isobutyryl-N₂-[Imidazol-1-yl(Propyl)]-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pento-furanosyl)-2-Amino-Adenosin. (16)
Einer gut getrockneten Lösung (3,6 g, 8,11 mmol) von 15 (vor der Verwendung dreimal mit trockenem Pyridin (100 ml) zusammen verdunstet) wurde bei Raumtemperatur trockenes Triäthylamin zugefügt (1,01 g, 10,00 mmol) und danach 4,4'-Dimethoxytritylamin (3,38 g, 10,00 mmol). Das Reaktionsgemisch wurde 10 Stunden lang unter Argonatmosphäre gerührt und mit Methanol (20 ml) gelöscht. Nach 10 Minuten Rührdauer wurde das Lösungsmittel unter reduziertem Druck abgeführt. Der Rückstand wurde in Dichlormethan (250 ml) aufgelöst, mit Wasser (50 ml) und Salzlösung (50 ml) gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Der getrocknete organische Extrakt wurde bis zum trockenen Zustand verdunstet, um einen orangefarbenen Schaum zu erhalten. Der Schaum wurde durch Blitzlichtchromatographie über Silicagel unter Verwendung von CH₂Cl₂/MeOH (95:5) als Elutionsmittel gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden zusammengenommen und verdunstet, um 4,6 g (76%) von 16 als amorphe Festsubstanz zu erhalten:
¹H NMR (Me₂SO-d₆) δ 1.04 (m, 6 H, Isobutyryl CH₃), 1.90 (m, 2 H, CH₂), 2.30 (m, 1 H, C_2'H), 2.82 (m, 1 H, C_2'H), 2.94 (m, 1 H, Isobutyryl CH), 3.14 (m, 4 H, CH₂ und C_5'CH₃), 3.72 (m, 6 H, OCH₃), 3.92 (m, 3 H, CH₂ und C_2'H), 4.44 (m, 1 H, C_3'H), 5.44 (b s, 1 H, C_5'OH), 6.28 (t, 1 H, J_1',2' = 6.20 Hz, C_1'H), 6.72 – 7.32 (m, 18 H, ImH, NH und ArH), 7.64 (s, 1 H ImH), 8.02 (s, 1 H, C₈H), 10.10 (b s, 1 H, NH). Anal. berechnet für C₄₁H₄₆N₈O₆: C, 65.93; H, 6.21; N, 15.00. Gefunden: C, 65.81; H, 6.26; N, 14 .71.
Referenz: BEISPIEL 16
3'-O-[N,N-Diisopropylamin)(β-Cyanoäthoxy)Phosphanyl]-5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl-N₆-Isobutyryl-N₂-[Imidazol-1-yl(Propyl)]-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)-2-Amino-Adenosin. (17)
Das Substrat 16 (4,2 g, 5,6 mmol) wurde zusammen mit trockenem Pyridin (50 ml) dreimal verdunstet. Der resultierende Rückstand wurde in trockenem Dichlormethan (50 ml) aufgelöst und im Eisbad auf 0°C abgekühlt. Dieser kalten gerührten Lösung wurde über einen Zeitraum von 15 Minuten N,N-Diisopropyläthylamin (1,44 g, 11,2 mmol) und danach (β-Cyanoäthoxy)Chlor (N,N-Diisopropylamino)Phosphan (1,32 g, 5,6 mmol) zugefügt. Nach dieser Zugabe wurde das Reaktionsgemisch bei 0°C 1 Stunde lang und bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gerührt. Die Reaktion wurde mit Dichlormethan (150 ml) verdünnt und mit 5% NaHCO₃-Lösung (25 ml) und Salzlösung (25 ml) gewaschen. Der organische Extrakt wurde über MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde durch Blitzlichtchromatographie über Silicagel gereinigt, unter Verwendung von CH₂Cl₂/MeOH (98:2), das 1 % Triäthylamin als Elutionsmittel enthielt, gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden gesammelt und bis zum trockenen Zustand verdunstet, um 3,9 g (73%) von 17 zu erhalten.
Referenz: BEISPIEL 17
N₂-[Imidazol-4-yl(Propyl)]-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)-Guanosin (18)
Ein Gemisch aus 3 und Histamin (4,4 g, 40,00 mmol) in 2-Methoxyäthanol (60 ml) wurde in einer Stahlfllasche bei 110°C 12 Stunden lang erhitzt. Die Stahlflasche wurde auf 0°C abgekühlt, vorsichtig geöffnet und die ausgefällte Festsubstanz wurde gefiltert, mit Aceton gewaschen und getrocknet. Das getrocknete Material wurde zu analytischen Zwecken aus DMF/H₂O rekristallisiert. Ergiebigkeit 6 g (79%):
¹H NMR (Me₂SO-d₆) δ 2.22 (m, 1 H; C_2'H), 2. 64 (m, 1 H, C_2'H), 2. 80 (m, 1 H, CH₂), 3.52 (m, 4 H, CH₂ und C_5'CH₂), 3.80 (m, 1 H, C_4'H), 4.42 (m, 1 H, C_3'H), 4.98 (b s, 1 H, C_5'OH), 5.44 (b s, 1 H, C_3'OH), 6.16 (t, 1 H, J_1',2' = 6 .20 Hz, C_1'H), 6.44 (b s, 1 H, NH), 6.84 (s, 1 H, ImH), 7.56 (s, 1 H, ImH), 7.92 (s, 1 H, C₈H), 10.60 (b s, 1 H, NH), 11.90 (b s, 1 H, NH). Anal.berechnet für C₁₅H₁₉N₇O₄: C, 49.85; H, 5.30; N, 27.13. Gefunden C, 49.61; H, 5.21; N, 26.84.
Referenz: BEISPIEL 18
3',5'-O-(Tetraisopropyldisiloxan-1,3-Diyl)-N₂-(Imidazol-4-yl(Äthyl)-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)-Guanosin (19)
Einer gerührten Suspension von 18 (2,4 g, 6,65 mmol) in trockenem DMF (50 ml) und trockenem Pyridin (20 ml) wurde bei Raumtemperatur Triäthylamin (4,04 g, 40,00 mmol) und danach 1,3-Dichlor-1,1,3,3-Tetraisopropyldisiloxan (4,18 g, 13,3 mmol) zugefügt. Nach der Zugabe von TipSiCl wurde das Reaktionsgemisch über Nacht gerührt und bis zum trockenen Zustand verdunstet. Der Rückstand wurde durch Blitzlichtchromatographie über Silicagel unter Verwendung von CH₂Cl₂/MeOH (9:1) als Elutionsmittel gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden zusammengenommen und bis zum trockenen Zustand verdunstet, um 3,2 g (80%) von 19 zu erhalten. Das reine Produkt wurde aus Aceton/Dichlormethan als farblose Festsubstanz auskristallisiert:
mp 245-247°C: ¹H NMR (Me₂SO-d₆) δ 1. 00 (m, 28 H), 2.46 (m, 1 H, C_2'H), 2.72 (m, 1 H, C_2'H), 2.84 (m, 1 H, CH,), 3.54 (m, 2 H, CH₂), 3.90 (m, 3 H, C_4'H und C_5'CH₂), 4.70 (m, 1 H, C_3'H), 6.12 (t, 1 H, J_1',2' 6.20 Hz, C_1'H), 6.68 (b s, 1 H, NH), 7.20 (s, 1 H, ImH), 7.80 (s, 1 H, ImH), 8.40 (s, 1 H, C₈H) , 10.72 (b s, 1 H, NH). Anal. berechnet für C₂₇H₄₅N₇O₅Si₂: C, 53.70; H, 7.51; N, 16.24. Gefunden: C, 53.38; H, 7.63; N, 15.86.
Referenz: BEISPIEL 19
3'5'-O-(Tetraisopropyldisiloxan-1,3-Diyl)-6-O-Diphenylcarbamoyl-N₂-[N₁-Diphenyicarbamoyl)Imidazol-4-yl(Äthyl)]-9-(-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)-Guanosin (20)
Einer gut gerührten Lösung des Substrats 19 (6,03 g, 10,00 mmol) in trockenem DMF (50 ml) und trockenem Pyridin (50 ml) wurde bei Raumtemperatur N,N-Diisopropyläthylamin (5,16 g, 40,00 mmol) und danach Diphenylcarbamoyl-Chlorid (6,93 g, 30,00 mmol) zugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde 5 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und bis zum trockenen Zustand verdunstet. Der Rückstand wurde in CH₂Cl₂ (400 ml) aufgelöst, mit Wasser (100 ml) und Salzlösung (50 ml) gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und bis zum trockenen Zustand verdunstet. Der Rückstand wurde durch Blitzlichtchromatographie gereinigt, unter Verwendung von Hexan/Aceton (8:2), um die im Titel aufgeführte Verbindung mit einer Ergiebigkeit von 78,5% (7,8 g) zu erhalten:
¹H NMR (Me₂SO-d₆) δ 1.04 (m, 28 H), 2.54 (m, 1 N, C_2'H), 2.65 (m, 1 H, C_2'H), 2.72 (m, 2 H, CH₂), 3.64 (m, 2 H, CH₂), 3.86 (m, 2 H, C_4'H) , 4.00 (m, 2 H, C_5'CH₂), 4 .74 (m, 1 H, C_3'H), 5.30 (b s, 1 H, NH), 6.22 (m, 1 H, C_1'H), 6.72 (s, 1 H, ImH), 7.12 – 7.50 (m, 20 H, ArH), 7.70 (s, 1 H, ImH), 7. 86 (s, 1 H, C₈H). Arial. berechnet für C₅₃H₆₃N₉O₇Si₂: C, 64.02; H, 6.39; N, 12.68. Gefunden: C, 64.13; H, 6.43; N, 12.79.
Referenz: BEISPIEL 20
6-O-Diphenylcarbamoyl-N₂-[(N₁-Diphenylcarbamoyl)Imidazol-4-yl-(Äthyl)]-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)-Guanosin (21)
Einer gerührten Lösung des geschützten Derivats von 20 (1,8 g, 1,81 mmol) in Pyridin/THF (30:20 ml) wurden bei Raumtemperatur 0,5 M Tetrabutyl-Ammonium-Fluorid zugefügt [zubereitet in einem Gemisch aus Tetrahydrofuran-Pyridin-Wasser (8:1:1; vol/vol/vol; 20 ml)]. Das Reaktionsgemisch wurde 15 Minuten lang gerührt und mit H⁺ Harz (Pydiniumform) auf einen pH-Wert von 6-7 gebracht. Das Harz wurde ausgefiltert und mit Pyridin (25 ml) und Methanol (30 ml) gewaschen. Das Filtrat wurde bis zum trockenen Zustand verdunstet und der Rückstand durch Blitzlichtchromatographie gereinigt, unter Verwendung von CH₂Cl₂/MeOH (95:5), um 1,2 g (88%} von 21 als farblosen amorphen Feststoff zu erhalten:
¹H NMR (Me₂SO-d₆) δ 2.32 (m, 1 H, C_2'H), 2.72 (m, 2 H, CH₂), 2.94 (m, 1 H, C_2'H), 3.46 (m, 1 H, C_4'H), 3 .54 – 3.88 (m, 4 H, CH₂ und C_5'CH₂), 4.00 (b s, 1 H, C_3'H), 5.20 (b s, 2 H, OH) , 5.42 (t, 1 H, NH), 6.10 (t, 1 H, J_1',2' = 6.20 Hz C_1'H), 6.80 (s, 1 H, ImH), 7.14 – 7.48 (m, 20 H, ArH), 7.64 (s, 1 H, ImH), 7.74 (s, 1 H, C₈H). Anal. berechnet für C₄₁H₃₇N₉O₆: C, 65.50; H, 4.96; N, 16.77. Gefunden: C, 65.31; H, 5.10; N, 16.40.
Referenz: BEISPIEL 21
5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-6-Diphenylcarbamoyl-N₂-[(N₁-Diphenylcarbamoyl)Imidazol-4-yl(Äthyl)]-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)-Guanosin (22)
Einer gut getrockneten Lösung des Substrats 21 (1,4 g, 1,87 mmol) in getrocknetem Pyridin (70 ml) wurde bei Raumtemperatur Triäthylamin (0,30 g, 3,0 mmol) und danach 4,4'-Dimethoxytrityl-Chlorid (0,85 g, 2,5 mmol) zugefügt. Der Rührvorgang wurde über Nacht unter Argonatmosphäre fortgesetzt. Methanol (10 ml) wurde zugefügt, 10 Minuten lang gerührt und bis zum trockenen Zustand verdunstet. Der Rückstand wurde in CH₂Cl₂ (150 ml) aufgelöst, mit Wasser (20 ml) und Salzlösung (20 ml) gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Das Rohprodukt wurde durch Blitzlichtchromatographie über Silicagel gereinigt, unter Verwendung von CH₂Cl₂-Aceton (7:3), das 1% Triäthylamin enthielt, als Elutionsmittel. Ergiebigkeit 1,4 g (71%):
¹H NMR (Me₂SO-d₆) δ 2.44 (m, 1. H, C_2'H), 2.62 (m, 2 H, CH₂), 2.98 (m, 1 H, C_2'H), 3.26 (m, 4 H, CH₂ und C_5'CH₂), 3.40 (m, 1 H, C_4'H), 3.68 (2 s, 6 H, 2H OCH₃), 4.00 (m, 1 H, C_3'H), 5.34 (t, 1 H, NH), 5.44 (b s, 1 H, C_3'OH), 6.12 (m, 1 H, C_1'H), 6.66 – 7.48 (m, 34 H, ImH and ArH), 7.62 (s, 1 H, ImH), 7.78 (s, 1 H, C₈H). Anal. berechnet für C₆₂H₅₅N₉O₈₄ C, 70.64; H, 5.26; N, 11.96. Gefunden: C, 70.24; H, 5:39; N; 11.66.
Referenz: BEISPIEL 22
3'-O-[(N,N-Diisopropylamino)(β-Cyanoäthoxy)phosphanyl]-5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-6-O-Diphenylcarbamoyl-N₂-[N₂-Diphenylcarbamoyl) Imidazol-4-yl-(Äthyl)[-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)-Guanosin (23)
Gut getrocknetes 22 wurde in trockenem Dichlormethan (30 ml) aufgelöst und unter Argonatmosphäre auf 0°C abgekühlt. Dieser kalt gerührten Lösung wurde über einen Zeitraum von 10 Minuten N,N-Diisopropyläthylamin (0,39 g, 3,00 mmol) und danach (β-Cyanoäthoxy)Chloro (N,N-Diisopropylamin)-Phosphan (0,71 g, 3,0 mmol) zugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und mit CH₂Cl₂ (120 ml) verdünnt. Die organische Schicht wurde mit 5% NaHCO₃ (25 ml), Wasser (25 ml) und Salzlösung (25 ml) gewaschen. Der Extrakt wurde über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und bis zum trockenen Zustand verdunstet. Der Rückstand wurde durch Blitzlichtchromatographie gereinigt, unter Verwendung von Hexan/-Äthylacetat (7:3), das 1 % Triäthylamin enthielt, als Elutionsmittel. Die reinen Fraktionen wurden gesammelt und bis zum trockenen Zustand konzentriert, um 1,0 g (70%) von 23 als Schaum zu erhalten:
¹H NMR (Me₂SO-d₆) δ 1.12 (m, 12 H, 2 Isobutyryl CH₃), 2.52 (m, 5 H, C_2'H, CH₂ und Iaobutyryl CH), 2.62 (m, 2 H), 3.06 (m, 1 H, C_2'H), 3.24 (m, 2 H, CH₂) 3.40 (m, 2 H, CH₂), 3.50 – 3.80 (m, 10 H, 2 OCH₃ CH₂ and C_5'CH₂), 4.08 (m, 1 H, C_4'H), 4.82 (m, 1 H, C_3'H) ; 5.74 (b s, 1 H, NH), 6.24 (m, 1 H, C_1'H), 6.64 – 7.52 (m, 34 H, ImH und ArH), 7.62 (s, 1 H, ImH), 7.94 (s, 1 H, C₈H).
Referenz: BEISPIEL 23
N₂-Nonyl-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)-Guanosin (24)
Ein Gemisch aus 2-Chloro-2'-Desoxyinosin und Verbindung 3 (9,5 g, 33,22 mmol) und nonylamin (9,58 g, 67,00 mmol) in 2-Methoxyäthanol (60 ml) wurde 12 Stunden lang bei 120°C in einer Stahlflasche erhitzt. Die Stahl flasche wurde auf 0°C abgekühlt, dann vorsichtig geöffnet und das Lösungsmittel bei reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde zusammen mit einem Gemisch aus trockenem Pyridin/trockenem Toluol (je 50 ml) verdunstet. Dieser Vorgang wurde dreimal wiederholt und der resultierende Rückstand wurde ohne weitere Reinigung in die nächste Reaktion übergeführt. Eine kleine Materialmenge wurde aus der Lösung ausgefällt, die gefiltert und getrocknet wurde:
¹H NMR (Me₂SO-d₆) δ 0.82 (t, 3 H, CH₃), 1.24 (m, 12 H, 6 CH₂), 1.48 (m, 2 H, CH₂), 2.18 (m, 1 H, C_2'H), 2.62 (m, 1 H, C_2'H), 3.22 (m, 2 H, CH₂), 3.50 (m, 2 H, C_5'CH₂), 3.78 (m, 1 H, C_4'H), 4.32 (m, 1 H, C_3'H), 4 .84 (t, 1 H, C_5'OH), 5.24 (m, 1 H, C_3'OH), 6.12 (m, 1 H, C_1'H), 6.44 (b s, 1 H, NH), 7.86 (s, 1 H, C₈H), 10.52 (b s, 1 H, NH). Anal. berechnet für C₂₉H₃₁N₅O₄. H₂O: C, 55.45; H, 8.08; N, 17.00. Gefunden: C, 55.96; H, 7.87; N, 16.59.
Referenz: BEISPIEL 24
N₂,3',5'-Tri-O-Isobutyryl-N₂-Nonyl-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)-Guanosin (25)
Das Rohprodukt von 24 (18 g, 32,91 mmol) wurde dreimal zusammen mit einem Gemisch aus trockenem DMF/Pyridin (je 50 ml) verdunstet. Der Rückstand wurde in trockenem Pyridin (150 ml) aufgelöst und auf 0°C abgekühlt. Dieser kalten, gerührten Lösung wurde über einen Zeitraum von 30 Minuten Triäthylamin (30,3 g, 300 mmol) und danach Isobutyryl-Chlorid (21,2 g, 200 mmol) zugefügt. Nach der Zugabe von IbCl wurde das Reaktionsgemisch 10 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und dann bis zur Trokkenheit verdunstet. Der Rückstand wurde zwischen CH₂Cl₂ und Wasser (300:150 ml) verteilt und in CH₂Cl₂ extrahiert. Der organische Extrakt wurde mit 5% NaHCO₃ (50 ml), Wasser (50 ml) und Salzlösung (50 ml) gewaschen, über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und bis zur Trockenheit verdunstet. Der Rückstand wurde durch Blitzlichtchromatographie über Silicagel gereinigt, unter Verwendung von CH₂Cl₂/ETOAc (6:4) als Elutionsmittel. Die rei nen Fraktionen wurden zusammengenommen und verdunstet, um 10 g (40%) von 25 als Schaum zu erhalten:
¹H NMR (Me₂SO-d₆) δ 0.82 (t, 3 H, CH₃), 1.12 (m, 30 H, 3 Isobutyryl CH₃ und 6 CH₂), 1.44 (m, 2 H, CH₂), 2.54 (m, 4 H, C_2'H und 3 Isobutyryl CH), 3.00 (m, 1 H, C_2'H), 3.62 (m, 2 H, CH₃), 4.20 (m, 3 H, C_5'CH₂ und C_4'H), 5.32 (m, 1 K, C_3'H), 6.24 (t, 1 H, J_1',2' = 6.20 Hz, C_2'H), 8.28 (s, 1 H, C₈H), 12.82 (b s, 1 H, NH) . Anal. berechnet für C₃₁N₄₉N₅O₇: C, 61.67; H, 8,18; N, 11.60. Gefunden: C, 61.59; H, 8.23; N, 11.34.
Referenz: BEISPIEL 25
3',5'-O-(Tetraisopropyldisiloxan-1,3-Diyl)-N₂-Nonyl-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)-Guanosin (26)
Einer gut getrockneten Lösung des Rohproduktes von 24 (16,4 g, 30,00 mmol) in trockenem DMF (100 ml) und trockenem Pyridin (100 ml) wurde über einen Zeitraum von 30 Minuten Triäthylamin (10,1 g, 100 mmol) und 1,3-Dichlor-1,1,3,3-Tetraisopropyldisiloxan (15,75 g, 50 mmol) zugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und dann bis zur Trockenheit verdunstet. Das Rohprodukt wurde in CH₂Cl₂ (300 ml) aufgelöst und mit Wasser (100 ml) und Salzlösung (50 ml) gewaschen. Der Extrakt wurde über MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel bei reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde über einer Silicasäule gereinigt, unter Verwendung von CH₂Cl_2/Aceton (7:3) gereinigt, um 14 g (59%) von 26 als farblosen Schaum zu erhalten. Die Rekristallisation mit dem gleichen Lösungsmittel ergab einen kristallinen Feststoff.
¹H NMR (Me₂SO-d₆) δ 0.82 (m, 3 H, CH₂), 1.02 (m, 28 H), 1.24 (m, 12 H, 6 CH₂), 1.50 (m, 2 H, CH₂), 2.42 (m, 1 H, C_2'H), 2.84 (m; 1 H, C_2'H), 3.24 (m, 2 H, CH₂), 3 82 (m, 2 H, C_5'CH₂), 3.92 (m, 1 H, C_4'H), 4.72 (m, 1 H, C_3'H), 6.12 (t, 1 H, J_1',2' = 6.20 Hz, C_1'H), 6.36 (b s, 1 H, NH), 7.78 (s, 1 H, C₈H), 10.38 (b s, 1 H, NH). Anal. berechnet for C₃₁H₅₇N₅O₅Si₂: C, 58.54; H, 9.03; N, 11.01. Gefunden: C, 58.64; H, 9.09; N, 10.89.
Referenz: BEISPIEL 26
N₂-Isobutyryl-3',5'-O-(Tetraisopropyldisiloxan-1,3-Diyl)-N₂-Nonyl-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)-Guanosin (27)
Einer Lösung aus 26 (14,0 g, 17,72 mmol) in trockenem DMF (50 ml) und trockenem Pyridin (150 ml) wurde Triäthylamin (3,54 g, 35,00 mmol) und Isobutyryl-Chlorid (3,71 g, 3,5 mmol) zugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und bis zur Trockenheit verdunstet. Der Rückstand wurde in CH₂Cl₂ (250 ml) aufgelöst, mit 5% NaHCO₃ (50 ml), Wasser (50 ml) und Salzlösung (50 ml) gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel bei reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde durch Blitzlichtchromatographie über Silicagel gereinigt, unter Verwendung von CH₂Cl₂/Aceton (9:1) als Elutionsmittel. Die reinen Fraktionen wurden zusammengenommen und verdunstet, um 12,0 g (77%) der im Titel aufgeführten Verbindung als Schaum zu erhalten:
¹H NMR (Me₂SO-d₆) δ 0.80 (m, 3 H, CH₃), 0.98 (m, 34 H), 1.20 (m, 12 H, 6 CH₂), 1.42 (m, 2 H, CH₂), 2.52 (m, 2 H, C_2'H und Isobutyryl CH), 2.82 (m, 1 H, C_2'H), 3.62 (m, 2 H, CH₂), 3.84 (m, 3 , H, C_5'CH₂ und C_4'H), 4.72 (m, 1 H, C_3'H), 6.22 (t, 1 H, J_1',2' = 6,20 Hz, C_1'H), 8.18 (s, 1 H, C₈H), 12.80 (b s, 1 H, NH).
Referenz: BEISPIEL 27
N₂-Isobutyryl-N₂-Nonyl-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)-Guanosin (28)
Verfahren 1: Das Substrat von 25 (5,00 g, 6,6 mmol) wurde in Methanol (100 ml) aufgelöst und mit konzentriertem NH₄OH (100 ml) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde 4 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und bis zur Trockenheit verdunstet. Der Rückstand wurde durch Blitzlichtchromatographie gereinigt, unter Verwendung von CH₂Cl₂/MeOH (95:5) als Elutionsmittel. Die erforderli-chen Fraktionen wurden zusammengefasst und bis zum trockenen Zustand verdunstet. Der Rückstand der Kristallisation aus CH₂Cl₂/-Aceton ergab eine farblose kristalline Festsubstanz. Ergiebigkeit 2 g (66%): Schmelzpunkt 113-115°C.
Verfahren 2: Eine gerührte Lösung von 27 (4,29 g, 4,99 mmol) in trockenem Tetrahydrofuran (50 ml) wurde mit einer1M Lösung aus Tetrahydrofuranfluorid (20 ml, 20,00 mmol) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde 4 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und bis zum trockenen Zustand verdunstet. Der Rückstand wurde durch Blitzlichtchromatographie gereinigt, unter Verwendung von CH₂Cl₂/MeOH (95:5), um 1,59 g (69%) von 28 zu erhalten:
(69%) of 28: ¹H NMR (Me₂SO-d₆) δ 0.80 (m, 3 H, CH₂), 0.98 (m, 6 H, Isobutyryl CH₂), 1.16 (m, 12 H, 6 CH₂), 1.42 (m, 2 H, CH₂), 2.24 (m, 1 H, C_2'H), 2.52 (m, 2 H, C_2'H und Isobutyryl CN), 3.50 (m, 2 H, C_5'CH₂), 3.62 (m, 2 H, CH₂), 3.82 (m, 1 H, C_4'H), 4 .36 (m, 1 N, C_3'H) , 4. 94 (t, 1 H, C_5'OH) , 5.34 (m, 1 H, C_3'OH), 6.22 (t, 1 H, J_1',2' = 6.20 Hz, C_1'H), 8.28 (s, 1 H, C₈H, 12.78 (b s, 1 H, NH). Anal. berechnet für C₂₃H₃₇N₅O₅: C, 59.59; H, 8.05; N, 15.11. Gefunden: C, 59.50; H, 8.08; N, 15.06.
Referenz: BEISPIEL 28
5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-N₂-Isobutyryl-N₂-Nonyl-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)-Guanosin (29)
Einer gerührten Lösung von 28 (2,00 g, 4,32 mmol) in trockenem Pyridin (75 ml) wurde bei Raumtemperatur Triäthylamin (0,61 g, 6,00 mmol) zugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde 6 Stunden lang unter Argonatmosphäre ge rührt und mit Methanol (10 ml) gelöscht. Das Lösungsmittel wurde bei reduziertem Druck entfernt und der Rückstand in CH₂Cl₂ (150 ml) aufgelöst. Der organische Extrakt wurde mit Wasser (25 ml) und Salzlösung (25 ml) gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und bis zum trockenen Zustand verdunstet. Der Rückstand wurde durch Blitzlichtchromatographie über Silicagel gereinigt, unter Verwendung von CH₂Cl₂/Aceton (7:3) als Elutionsmittel. Die reinen Fraktionen wurden zusammengefasst und verdunstet, um 2 g (60%) von 29 als Schaum zu erhalten:
¹H NMR (Me₂SO-d₆) δ 0. 80 (m, 3 H, CH₃), 0.96 (m, 6 H, Isobutyryl CH₃), 1.16 (m, 12 H, 6 CH₂), 1.36 (m, 2 H, CH₂), 2.32 (m, 1 H, C_2'H), 2.60 (m, 1 H, Isobutyryl CH), 2.72 (m, 1 H, C_2'H), 3.12 (m, 2 H, CH₂), 3.52 (m, 2 H, C_5'CH₂), 3.70 (2 d, 6 H, 2 OCH₃), 3.90 (m, 1 H, C_4'H), 4.34 (m, 1 H, C_3'H), 5.36 (m, 1 H, C_3'OH), 6.26 (t, 1 H, J_1',2' = 6.20 H₂, C_1'H), 6.70 – 7.36 (m, 13 H, ArH), 8.18 (s, 1 H, C₈H). Anal. berechnet für C₄₄H₅₆N₅O₇: C, 68.90; H, 7.36; N, 9.31. Gefunden: C, 68.76; H, 7.47; N, 9.09.
Referenz: BEISPIEL 29
3'-O-[(N,N-Diisopropylamin)(β-Cyanoäthoxy)phosphanyl]-5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-N₂-Isobutyryl-N₂-Nonyl-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)-Guanosin. (30)
Eine gut getrocknete Lösung von 29 (1,7 g, 2,22 mmol) in trockenem Dichlormethan (30 ml) wurde auf 0°C abgekühlt. Dieser kalten Lösung wurde unter Argonatmosphäre N,N-Diisopropylamin (0,57 g, 4,4 mmol) und (β-Cyanoäthoxy)Chlor(N,N-Diisopropylamin)Phosphan (0,94 g, 4,0 mmol) zugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und mit CH₂Cl₂ (170 ml) verdünnt. Der organische Extrakt wurde mit 5% NaHCO₃ (25 ml), Wasser (25 ml) und Salzlösung (25 ml) gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und bis zum trockenen Zustand verdunstet. Der Rückstand wurde auf einer Silicasäule gereinigt, unter Verwendung von CH₂Cl₂/-Aceton (9:1), das 1% Triäthylamin enthielt, als Elutionsmittel. Die reinen Fraktionen wurden zusammengefasst und bis zum trockenen Zustand verdunstet, um 1,5 g (53%) von 30 zu erhalten.
Referenz: BEISPIEL 30
3'-5'-O-(Tetraisopropyldisiloxan-1,3-Diyl)-2-Chlor-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)-Guanosin (31)
Die Verbindung 31 wurde unter Verwendung des Verfahrens für 12 aus der Verbindung 10 zubereitet. Verwendetes Ausgangsmaterial: 10 (4,30 g, 15,09 mmol), 1,3-Dichlor-1,1,3,3-Tetraisopropyldisiloxan (4,74 g, 15,1 mmol), trokkenes TEA (3,05 g, 30,2 mmol) und trockenes Pyridin (100 ml). Das Rohprodukt wurde durch Blitzlichtchromatographie unter Verwendung von CH₂Cl₂/-Aceton (7:3) als Elutionsmittel gereinigt, um 7,3 g (92%) von 31 zu erhalten. Das reine Produkt wurde aus Äthylacetat/Hexan als farblose Festsubstanz kristallisiert. Schmelzpunkt 183-185°C:
¹H NMR (Me₂SO-d₆) δ 1.00 (m, 28 H), 2.54 (m, 1 H, C_2'H), 2.82 (m, 1 H, C_2'H), 3.76 (m, 1 H, C_4'H), 3.86 (m, 2 H, C_3'CH₂), 5.08 (m, 1 H, C_3'H), 6.22 (t, 1 H, J_1',2' = 6.20 Hz, C_1'H), 7.82 (b s, 2 H, NH₂), 8.22 (s, 1 H, C₈H. Anal. berechnet für C₂₂H₃₈ClN₅O₄Si₂: C, 50.02; H, 7.25; N, 13.26, Cl, 6.72. Gefunden: C, 50.24; H, 7.28; N, 13.07, Cl, 6.63.
Referenz: BEISPIEL 31
3', 5'-O-(Tetraisopropyldisiloxan-1,3-Diyl)-2-Chlor-N₂-Benzoyl-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)-Guanosin. (32)
Eine gut getrocknete Lösung von 31 (8 g, 15,00 mmol) in trockenem Pyridin (150 ml) ließ man 12 Stunden lang bei Raumtemperatur mit Triäthylamin (4,55 g, 45,00 mmol) und Benzoylchlorid (6,3 g, 45,00 mmol) unter Argonatmosphäre reagieren. Das Reaktionsgemisch wurde bis zum trockenen Zustand verdunstet. Der Rückstand wurde zwischen CH₂Cl₂ und Wasser verteilt und in CH₂Cl₂ extrahiert (2 × 150 ml). Der organische Extrakt wurde mit Salzlösung (60 ml) gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und bis zur Trockenheit verdunstet. Der Rückstand wurde auf einer Silicasäule gereinigt, unter Verwendung von CH₂Cl₂/Aceton als Elutionsmittel und die Kristallisation aus dem gleichen Lösungsmittel ergab 8,2 g (86%) von 32. Schmelzpunkt 167-170°C:
¹H NMR (Me₂SO-d₆) δ 1.00 (m, 28 H), 2.60 (m, 1 H, C_2'H), 3.02 (m, 1 H, C_3'H), 3.84 (m, 3 H, C_5'CH₂ and C_5'H), 5.04 (m, 1 H, C_3'H), 6.34 (d, 1 H, C_1'H), 7.42 –7. 84 (m, 5 H, ArH), 8.70 (s, 1 H, C₈H). Anal. berechnet für C₂₉H₄₂ClN₅O₅Si₂: C, 55.08; H, 6.69; N, 11.08, Cl, 5.61. Gefunden: C, 55.21; N, 6.79; N, 11.19, Cl, 5.70.
Referenz: BEISPIEL 32
N₆-Benzoyl-2-Chlor-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)-Adenosin (33)
Einer gerührten Lösung von 32 (7,9 g, 12,5 mmol) in trockenem THF (100 ml) wurde 1 M Lösung aus Tetrabutylammoniumfluorid (50 ml, 50,00 mmol) bei Raumtemperatur langsam über einen Zeitraum von 15 Minuten zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 6 Stunden lang gerührt und bis zur Trockenheit verdunstet. Der Rückstand wurde durch Blitzlichtchromatographie gereinigt, unter Verwendung von CH₂Cl₂/Aceton (7:3) als Elutionsmittel, um 3,88 g (80%) von 33 zu erhalten. Schmelzpunkt >275°C:
¹H NMR (Me₂SO-d₆) δ 2.34 (m, 1 H, C_2'H), 2.72 (m, 1 H, C_2'H, 3.58 (m; 2 H, C_5'CH₂), 3.88 (m, 1 H, C_4'H), 4.42 (m, 1 H, C_3'H), 4.96 (t, 1H, C_5'OH), 5.38 (d, 1 H, C_3'OH), 6.40 (t, 1 H, J_1',2' = 6.20 Hz, C_1'H), 7.52 (m, 2 H, ArH), 7. 64 (m, 1 H, ArH), 8.04 (d, 2 H, ArH), 8.70 (s, 1 H, C₈H), 11.52 (b s, 1 H, NH). Anal. berechnet für C₁₇H₁₆ClN₅O₄: C, 52.37; H, 4.14; N, 17,97; Cl, 9.11. Gefunden: C, 52.31; H, 4.07; N, 17.94; Cl, 9.03.
Referenz: BEISPIEL 33
5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-N₆-Benzoyl-2-Chlor-9-(2'-Desoxy-β-D-Etythro-Pentofuranosyl)-Adenosin (34)
Die Verbindung wurde nach dem Verfahren für die Herstellung von 8 aus 33 zubereitet. Verwendetes Ausgangsmaterial: 33 (2,5 g, 6,43 mmol), 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (2,37 g, 7,0 mmol), trockenes TEA (0,7 g, 7,0 mmol) und trockenes Pyridin (100 ml). Das Rohprodukt wurde durch Blitzlichtchromatographie gereinigt, unter Verwendung von CH₂Cl₂/EtOAc (7:3), das 1% Triäthylamin enthielt, als Elutionsmittel, um 3 g (68%) von 34 als Schaum zu erhalten:
¹H NMR (Me₂SO-d₆) δ 2.34 (m, 1 H, C_2'H), 2.82 (m, 1 H, C_2'H) 3.18 (m, 2 H, C_5'CH₂), 3.64 (2d, 6 H, OCH₃), 3.98 (m, 1 H, C_4'H), 4.44 (m, 1 H, C_3'H), 5.40 (d, 1 H, OH), 6.42 (t, 1 H, J_1',2' = 6.20 Hz, C_1'H), 6.74 (m, 4 H, ArH), 7.16 (m, 7 H, ArH), 7.32 (m, 2 H, ArH), 7.52 (m, 7 H, ArH), 7.64 (m, 1 H, ArH), 8.04 (m, 2 H, ArH), 8.58 (s, 1 H, C₈H), 11.50 (b s, 1 H, NH) . Anal. berechnet für C₃₈H₃₄ClN₅O₆: C, 65.93; H, 4.95; N, 10.12; Cl, 5.13 . Gefunden: C, 65.55; H, 5.16; N, 9.73; Cl, 5.10.
Referenz: BEISPIEL 34
3' -O-[(N,N-Diisopropylamin) (β-Cyanoäthoxy)phosphanyl]-5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-N₆-Benzoyl-2-Chlor-9-(2'-Desoxy-R-D-Erythro-Pentofuranosyl)-Adenosin. (35)
Die im Titel aufgeführte Verbindung wurde aus 34 nach dem Verfahren für die Zubereitung von 9 hergestellt. Verwendetes Ausgangsmaterial: Verbindung 34 (2,4 g, 3,47 mmol), N,N-Diisopropyläthylamin (1,22 ml, 7,00 mmol), (β-Cyanoäthoxy)Chlor(N,N-Diisopropylamin)Phosphen (1,65 g, 7,00 mmol) und trockenes CH₂Cl₂ 30 ml). Das Rohprodukt wurde durch Blitzlichtchromatographie gereinigt, unter Verwendung von Hexan-Äthylacetat (1:1), das 1 % Triäthylamin enthielt, als Elutionsmittel. Die reinen Fraktionen wurden zusammengenommen und bis zur Trockenheit verdunstet, um 1,8 g (58% von 35 zu erhalten. Der Schaum wurde in trockenem Dichlormethan (10 ml) aufgelöst und unter Argonatmosphäre tropfenweise in gut gerührtes Hexan (1500 ml) zugegeben. Nach dieser Zugabe wurde der Rührvorgang eine weitere Stunde lang fortgesetzt und die ausgefällte Festsubstanz wurde gefiltert, mit Hexan gewaschen und über festem NaOH 3 Stunden lang getrocknet. Das getrocknete Pulver zeigte im ³¹p-Spektrum keine Spuren von Verunreinigungen:
¹H NMR (Me₂SO-d₆) δ 1.18 (m, 12 H, Isobutyryl CH₃), 2.58 (m, 3 H, C_2'H und Isobutyryl CH), 2.98 (m, 1 H, C_2'H), 3.34 (d, 2 H, CH₂), 3.64 (m, 2 H, C_5'CH₂), 3.72 (m, 8 H, 2 OCHS und CH₂), 4.24 (m, 1 H, C_4'H), 4.82 (m, 1 H, C_3'H), 6.36 (t, 1 H, J_1',2' = 6.20 Hz, C_1'H), 6.76 (m, 4 H, ArH), 7,22 (m, 7 H, ArH), 7.38 (m, 2 H, ArH), 7.52 (m, 2 N, ArH), 7.64 (m, 1 H, ArH), 7. 98 (m, 2 H, ArH), 8.24 (s, 1 N, C₈H), 9.34 (b s, 1 H, NH).
Referenz: BEISPIEL 35
3'-5'-O-(Tetraisopropyldisiloxan-1,3-Diyl)-N₂-Äthyl-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)-Guanosin (36)
Eine Lösung von 3'-5'-O-(Tetraisopropyldisiloxan-1,3-Diyl)-2-Chlor-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)-Inosin (5,0 g, 9,45 mmol) in 2-Methoxyäthanol (30 ml) wurde in eine Stahlflasche verbracht und auf 0°C abgekühlt. Frisch kondensiertes Äthylamin (7,0 ml) wurde rasch zugefügt. Die Stahlflasche wurde versiegelt und das Reaktionsgemisch wurde 16 Stunden lang bei 90°C gerührt. Das Gefäß wurde abgekühlt und vorsichtig geöffnet. Die ausgefällte weiße Festsubstanz wurde gefiltert und aus Methanol auskristallisiert. Das Filtrat ergab nach der Verdunstung eine Festsubstanz, die ebenfalls aus Methanol auskristallisiert wurde. Gesamte Ergiebigkeit 3 g (65%). Schmelzpunkt >250°C.
¹H NMR (Me₂SO-d₆) δ 1.06 (m, 31 H), 2.32 (m, 1 H, C_2'H), 2.84 (m, 1 H, C_2'H), 3.26 (m, 2 H, CH₂), 4.12 (m, 2 H, C_5'CH₂), 4.22 (m, 1 H, C_4'H), 4.70 (m, 1 H, C_3'H), 6.23 (t, 1 H, J_1',2'= 6,20 Hz, C_2'H), 6.42 (m, 1 H, NH), 7.87 (s, 1 H, C₈H), 10.58 (b s, 1 H, NH). Anal. berechnet für C₂₄H₄₃N₅O₅Si₂. C, 53.59; H, 8.06; N, 13.02. Gefunden: C, 53.44; H, 8.24; N, 1291.
Referenz: BEISPIEL 36
3',5'-O-(Tetraisopropyldisiloxan-1,3-Diyl)-6-0-Diphenylcarbamoyl-Nr-Äthyl-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)-Guanosin (37)
Die Verbindung 36 (2,40 g, 4,46 mmol) wurde bei Raumtemperatur in wasserfreiem Pyridin (30 ml) aufgelöst. Dieser Lösung wurde N,N-Diisopropyläthylamin (1,60 ml, 8,93 mmol) und danach Diphenylcarbamoylchlorid (2,07 g, 8,93 mmol) zugefügt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur unter Argonatmosphäre 10 Stunden lang gerührt. Es ergab sich eine dunkelrote Lösung, die bis zur Trockenheit verdunstet wurde. Der Rückstand wurde durch Blitzlichtchromatographie über einer Silicasäule gereinigt, unter Verwendung von CH₂Cl₂/EtoAc als Elutionsmittel. Die reinen Fraktionen wurden zusammengenommen und verdunstet, um einen bräunlichen Schaum zu erhalten (3,25 g, 99%).
¹H NMR (Me₂SO-d₆) δ 1.14 (t, 31 H), 2.52 (m, 1 H, C_2'H), 3.04 (m, 1 H, C_2'H), 3.34 (m, 2 H, CH₂), 3.87 (m, 3 H, C_5'CH₂ & C_4'H), 4.83 (m, 1 H, C_3'H), 6.23 (m, 1 H, C_2'H), 7.36 (m, 11 H, ArH & NH) , 8.17 (s, 1 H, C₈H). Anal. berechnet für C₃₇H₅₂N₆O₆Si₂. C, 60.71; H, 7.16; N, 11.48. Gefunden: C, 60.33; H, 7.18; N, 11.21.
Referenz: BEISPIEL 37
6-O-Diphenylcarbamoyl-N₂-Äthyl-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)-Guanosin (38)
Einer gerührten Lösung von 37 (3,25 g, 4,47 mmol) in Pyridin (25 ml) wurde sofort 0,5 M Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid (zubereitet in Pyridin/-THF/Wasser, 4/1/1,36 ml, 17,88 mmol) zugefügt. Die Lösung ließ man 10 Minuten unter Rühren reagieren und brachte sie dann mit H⁺ Harz (Amberlite IRC 50) auf einen pH-Wert von 7. Das Harz wurde gefiltert und mit Pyridin (20 ml) und McOH (20 ml) gewaschen. Das Filtrat wurde bis zur Trockenheit verdunstet. Der Rückstand wurde durch Blitzlichtchromatographie über einer Silicasäule gereinigt, unter Verwendung von Methylenchlorid/Aceton als Elutionsmittel, um 1 84 g (84%) des reinen Produktes als Schaum zu erhalten.
¹H NMR (Me₂SO-d₆) δ 1.14 (t, 3 H, CH₂CH₃), 2.22 n, 1 H, C_2'H), 2.76 (m, 1 H, C_2'H), 3.34 (m, 2 H, CH₂), 3.57 (m, 2 H, C_5'CH₂), 3.84 (m, 1 H, C_4'H), 4 .42 (m, 1 H, C_3'H), 4,91 (t, 2 H, C_5'ON), 5.32 (d, 1 H, C_3'ON), 6.27 (t, 1 H, J_1',2' = 6.20 Hz C_1'H), 7.29 (m, 1 H, NH), 7.46 (m, 10 H, ArH), 8.27 (s, 1 H, C₈H). Anal. berechnet für C₂₅N₂₆N₆O₅·3/4H₂O. C: 59.61; H, 5.35; N, 16.68. Gefunden: C, 59.83; H, 5.48; N, 16.21.
Referenz: BEISPIEL 38
N₂-Äthyl-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofura-nosyl)-Guanosin (39)
Die Zwischenstufe von 38 (0,25 g, 0,51 mmol) wurde in Methanol/Ammonia (bei 0°C gesättigt) in einer Stahlflasche 40 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Gefäß wurde auf 0°C abgekühlt, vorsichtig geöffnet und das Lösungsmittel bis zur Trockenheit verdunstet. Die so erhaltene Festsubstanz wurde aus Methanol auskristallisiert zu einem weißem Pulver (0,95 g, 63%): Schmelzpunkt 234-238°C.
¹H NMR (Me₂SO-d₆) δ 1.14 (t, 3 H, CH₂CH₃), 2.18 (m, 1 H, C_2'H), 2.67 (m, 1 H, C_2'H), 3.34 (m, 2 H, CH₂), 3.52 (m, 2 H, C_5'CH₂), 3.82 (m, I H, C_4'H), 4.36 (m, 1 H, C_3'H), 4.89 (t, 2 H, C_5'OH), 5.30 (d, 1 H, C_3'OH), 6.16 (t, 1 H, J_1',2' = 6.20 Hz C_1'H), 6.44 (m, 1 H, NH), 7.91 (s, 1 H, C₈H), 10.58 (b s, 1 H, NH).
Referenz: BEISPIEL 39
5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-6-O-Diphenylcarbamoyl-N₂-[N₁-Diphenylcarbamoyl)-N2-Äthyl-9-(-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)-Guanosin (40)
Die Verbindung 38 (1,6 g, 3,26 mmol) wurde durch Verdunstung zusammen mit trockenem Pyridin (3 × 50 ml) gut getrocknet. Das getrocknete Material wurde in wasserfreiem Pyridin (25 ml) aufgelöst und unter Argonatmosphäre gerührt. Der gerührten Lösung wurde Triäthylamin (0,59 ml, 4,24 mmol) und danach DMTCL (1,44 g, 4,24 mmol) zugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde 14 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und dann mit Methanol (10 ml) gelöscht. Nach einem Rührvorgang von 15 Minuten Dauer wurde das Lösungsmittel entfernt und der Rückstand in Methylenchlorid (150 ml) aufgelöst. Der organische Extrakt wurde mit gesättigter NaHCO₃ Lösung (30 ml), Wasser (30 ml) und Salzlösung (30 ml) gewaschen. Der Methylenchlorid-Extrakt wurde getrocknet und bis zur Trockenheit verdunstet. Der Rückstand wurde durch Blitzlichtchromatographie über Silicagel unter Verwendung von Methylenchlorid/Aceton als Elutionsmittel gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden gesammelt und zusammen verdunstet, um einen Schaum zu erhalten (2,24 g, 87%).
¹H NMR (Me₂SO-d₆) δ 1.10 (t, 3 H, CH₂CH₂), 2.32 (m, 1 H, C_2'H), 2.82 (m, 1 H, C_2'H), 3.15 (m, 2 H, CH₂); 3.34 (s, 6 H, 2 OCH₃), 3,67 (m, 2 H, C₅CH₂), 3.96 (m, 1 H, C_4'H), 4.42 (m, 1 H, C_3'H), 5.36 (d, 1 H, C_3'OH), 6.30 (t, F H, J_1',2' = 6. 20 Hz, C_1'H), 6.83 (m, 4 H, ArH), 7.23 (m, 10 H, ArH & NH), 8,17 (s, 1 H, C₈H) . Anal berechnet für C₄₅H₄₄N₆O₇. 1/4 CH₃OH. 1/4 H₂O. C, 68.50; H, 5.78; N, 10.60: Gefunden: C, 68.72; H, 5.42; N, 10.40.
Referenz: BEISPIEL 40
3'-O-[(N,N-Diisopropylamino)(β-Cyanoäthoxy)phosphanyl]-5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-6-O-Diphenylcarbamoyl-N₂-Äthyl-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)-Guanosin (41)
Das DMT-Derivat von 40 wurde über Nacht im Vakuum gut getrocknet und in trockenem Methylenchlorid (25 ml) aufgelöst. Dieser kalt zu rührenden Lösung wurde N,N-Diisopropylamin-Tetrazoliumsalz (0,24 g, 1,41 mmol) und danach ein Phosphorylierungsmittel (1,71 ml, 5,66 mmol) zugefügt. Das Gemisch wurde 12 Stunden lang bei Raumtemperatur unter Argonatmosphäre gerührt. Die Lösung wurde mit zusätzlichem Methylenchlorid verdünnt und mit gesättigter NaHCO₃ Lösung (50 ml), Wasser (50 ml) und Salzlösung (50 ml) gewaschen. Der organische Extrakt wurde getrocknet und bis zu einem trockenen Zustand vedunstet. Das Rohprodukt wurde mit einer Flash-Säule über Silicagel gereinigt, unter Verwendung von Methylenchlorid/ Äthylacetat, das 1 % Triäthylamin enthielt, als Elutionsmittel. Die reinen Fraktionen wurden zusammengefasst und verdunstet, um 2,5 g von 41 zu erhalten.
Referenz: BEISPIEL 41
N₂-3',5'-Tri-0-Acetyl-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)-Guanosin (42)
Desoxyguanosin (26,10 g, 96,77 mmol) wurde zusammen mit trockenem Pyridin/DMF (je 50 ml) dreimal verdunstet. Der Rückstand wurde in trockenem DMF (50 ml) und trockenem Pyridin (50 ml) bei Raumtemperatur in Suspension gebracht. Diesem Gemisch wurde unter Rühren langsam N,N-Dimethylaminopyridin (1,18 g, 9,67 mmol) und danach Essigsäureanhydrid (109,6 ml, 116 mmol) zugefügt, wobei die Temperatur unter 35°C gehalten wurde. Nach der Zugabe von Ac₂O ließ man die Reaktion 4 Stunden lang bei 80°C unter Argonatmosphäre ablaufen. Es folgte eine Abkühlung auf Raumtemperatur und die Neutralisierung mit 1 N NaCO₃ Lösung. Das Gemisch wurde in CH₂Cl₂ (2 × 250 ml) extrahiert. Der organische Extrakt wurde mit Wasser (50 ml) und Salzlösung (50 ml) gewaschen, getrocknet und bis zum trockenen Zustand verdunstet. Der Rückstand wurde aus MeOH auskristallisiert, um 29,1 g (76%) zu erhalten: Schmelzpunkt 217-219°C.
¹H NMR (Me₂SO-d₆) δ 2,09 (s, 3 H, COCH₃), 2.09 (s, 3 H, COCH₃), 2.19 (s, 3 H, COCH₂), 2.60 (m, 1 H, C_2'H), 3.02 (m, 1 H, C_2'H), 4.19 (m, 3 H, C_4'H & C_5'CH₂), 5.31 (m, 1 H, C_3'H), 6.21 (t, 1 H, J_1',2' = 6.00 Hz, C_1'H), 8.27 (s, 1 H, C₈H), 11.72 (b s, 1 H, NH), 12.02 (b s, 1 H, NH).
Referenz: BEISPIEL 42
6-O-Benzyl-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)-Guanosin (43)
N₂, 3' ,5' -Tri-O-Acetyldesoxyguanosin 42 (1,18 g, 3 mmol) wurde in trockenem Dioxan (50 ml) unter Argonatmosphäre zur Suspension gebracht. Der gerührten Suspension wurde trockener Benzylalkohol (0,81 g, 7,5 mmol) und danach Triphenylphosphin (1,96 g, 7,5 mmol) zugefügt. Nach einem Rührvorgang von 15 Minuten Dauer wurde über einen Zeitraum von 15 Minuten bei Raumtemperatur tropfenweise Diäthylazodicarboxylat (1,30 g, 7,5 mmol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Argonatmosphäre gerührt. Das Lösungsmittel wurde entfernt und der Rückstand mit 0,1 M Natriummethoxid (75 ml) behandelt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Eisessigsäure (0,45 ml) wurde zugefügt, die Lösungsmittel wurden verdunstet und der Rückstand zwischen Wasser und Äthylacetat verteilt. Die Äthylacetat-Extrakte wurden getrocknet, verdunstet und der Rückstand wurde über Silicagel chromatographiert, unter Verwendung des Gemisches aus CH₂Cl₂-MeOH. Das nach Pulverisierung mit Äther resultierende Produkt (0,5 g, 75%) war eine amorphe weiße feste Substanz.
¹H NMR (Me₂SO-d₆) δ 2.22 (m, 1 H, C_2'H), 2.60 (m, 1 H, C_2'H), 3.56 (m, 2 H, C_5'CN₂), 3.80 (m, 1 H, C_4'H), 4.37 (m, 1 H, C_3'H), 5.01 (t, 1 H, C_5'OH), 5.29 (b s, 1 H, C_3'OH), 5.52 (s, 2 H, ArCH₂), 6.23 (t, 1 H, J_1',2' = 6.66 Hz, C_1'H), 6.52 (b s, 2 H, NH₂), 7.40 (m, 2 H, ArH), 7.50 (m, 2 H, ArH), 8.11 (s, 1 H, C₈H). Anal. berechnet für C₁₇H₁₉N₅O₄. C, 57.13; H, 5.36; N, 19.59. Gefunden: C, 57.09; H, 5.42; N, 19.61.
Referenz: BEISPIEL 43
6-O-Benzyl-2-Fluor-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)-Purin (44)
Einer gerührten Suspension des Substrats von 43 (5,0 g, 14 mmol) in trockenem Pyridin (20 ml) bei –40°C wurde unter Argonatmosphäre in zwei Portionen (2 × 10 ml) HF/Pyridin (Aldrich 18, 422-5 70%) zugefügt. Nach Zugabe von HF/Pyridinwurde das Gemisch auf –10°C aufgewärmt und während dieser Zeit ging die ganze Festsubstanz in Lösung. Tertiäres Butylnitrit (4,0 ml) wurde im Verlauf von 10 Minuten unter Aufrechterhaltung einer Temperatur zwischen –20°C und –10°C langsam zugegeben. In Intervallen wurde das Reaktionsgemisch aus dem Kühlbad genommen und kräftig geschüttelt, um einen gründlichen Mischvorgang sicher zu stellen. Nach der vollständigen Umwandlung des Ausgangsmaterials (in Intervallen von 15 Minuten vom TCL kontrolliert) wurde das Reaktionsgemisch auf eine kräftig gerührte eiskalte alkaline Lösung (70 g K₂CO₃ in 150 ml Wasser) gegossen. Die gummiartig klebrige Suspension wurde mit Methylenchlorid (2 × 200 ml) extrahiert. Der organische Extrakt wurde mit Salzlösung (2 × 200 ml) gewaschen, getrocknet und bis zum trockenen Zustand verdunstet. Der Rückstand wurde durch Blitzlichtchromatographie über Silicagel unter Verwendung von CH₂Cl₂ MeOH als Elutionsmittel gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden kombiniert und verdunstet, um 4,0 g (79%) von 44 als Schaum zu erhalten. Eine kleine Menge wurde in Form von orangefarbenen Kristallen aus Methanol auskristallisiert. Schmelzpunkt: 165-167°C.
¹H NMR (Me₂SO-d₆) δ 2.36 (m, 1 H, C_2'H), 2.66 (m, 1 H, C_3'H), 3.60 (m, 2 H, C_5'CH₂), 3.87 (m, 1 H, C_4'H), 4.42 (m, 1 H, C_3'H), 4.95 (t, 1 H, C_5'OH), 5.36 (d, 1 H, C_3'OH), 5.62 (s, 2 H, ArCH₂), 6.34 (t, 1 H, J_1',2' = 6.67 Hz, C_1'H), 6.46 (m, 4 H, ArH), 8.61 (s, 1 H, C₈H). Anal. berechnet für C₁₇H₁₇FN₄O₄. C, 56.66; H, 4.7.6; N, 15.55. Gefunden: C, 56.62; H, 4.69; N, 15.50.
Referenz: BEISPIEL 44
5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-2-Fluor-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)-inosin. (45)
Die Verbindung 44 (5,00 g, 13,89 mmol) wurde in Methanol (100 ml) aufgelöst und in eine Parr-Flasche gegeben. Dieser Lösung wurde Pd/C (5%, 1,00 g) zugeführt und 2 Stunden lang bei einem Druck von 3,16 bar hydriert. Die Suspension wurde gefiltert, mit Methanol (50 ml) gewaschen und das kombinierte Filtrat bis zur Trockenheit verdunstet. Der Rückstand wurde in Pyridin (50 ml) aufgelöst und bis zur Trockenheit verdunstet. Dieser Vorgang wurde dreimal wiederholt und der resultierende Rückstand (gewogen: 4,00 g) wurde in trockenem Pyridin (100 ml) unter Argonatmosphäre aufgelöst. Der gerührten Lösung wurde Triäthylamin (1,52 g, 15,0 mmol) und 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (5,07 g, 15,0 mmol) bei Raumtemperatur zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Argonatmosphäre gerührt. Danach wurde das Reaktionsgemisch mit Methanol (20 ml) gelöscht und bis zur Trockenheit verdunstet. Der Rückstand wurde in Methylenchlorid (200 ml) aufgelöst und mit 5% NaHCO₃ Lösung (50 ml), Wasser (50 ml) und Salzlösung (50 ml) gewaschen. Der organische Extrakt wurde getrocknet und bis zu einem trockenen Zustand verdunstet. Der Rückstand wurde in Dichlormethan in Suspension gebracht und die unlösliche Festsubstanz gefiltert. Das Filtrat wurde durch Flashchromatographie über Silicagel gereinigt, unter Verwendung von CH₂Cl₂ MeOH als Elutionsmittel. Die reinen Fraktionen wurden gesammelt und verdunstet, um 7,0 g (88%) der im Titel aufgeführten Verbindung zu erhalten. Die unlösliche Festsubstanz erwies sich als DMT-Derivat. Schmelzpunkt >220°C.
¹H NMR (Me₂SO-d₆) δ 2.22 (m, 1 H, C_2'H), 2.70 (m, 1 H, C_2'H), 3.16 (m, 2 H, C_5'CH₂), 3.90 (m, 1 H, C_4'H), 4.38 (m, 1 H, C_3'H), 5.32 (d, 1 H, C_3'OH), 6.16 (t, 1 H, J_1',2' = 6.20 Hz, C_1'H , 6 . 82 (m, 4 H, ArH), 7.25 (m, 9 H, ArH), 7.79 (8, 1 H, C₈H).
Referenz: BEISPIEL 45
3'-O-[(N,N-Diisopropylamino)(β-Cyanoäthoxy)phosphanyl]-5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-2-Fluor-9-(2'-Desoxy-β-D-Erythro-Pentofuranosyl)-Inosin. (46)
Die im Titel aufgeführte Verbindung wurde unter Anwendung des Verfahrens für die Herstellung von 9 aus 45 zubereitet. Verwendetes Ausgangsmaterial: 45 (7,0 g, 12,24 mmol), N,N'Diisopropyläthylamin (5,2 ml, 30,00 mmol), (β-Cyanoäthoxy)Chloro(N,N'-Diisopropylamino)Phosphan (5,9 g, 25 mmol) und trockenes CH₂Cl₂ (100 ml). Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie gereinigt, unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (95:5), das 1 % Triäthylamin enthielt, als Elutionsmittel. Die reinen Fraktionen wurden zusammengenommen und bis zur Trockenheit verdunstet, um 7,00 g (75,5%) von 46 zu erhalten. Der Schaum wurde in trockenem Dichlormethan (30 ml) aufgelöst und unter Argonatmosphäre tropfenweise in gut gerührtes Hexan (2500 ml) gegeben. Nach der Zugabe wurde der Rührvorgang eine weitere Stunde fortgesetzt und die ausgefällte Festsubstanz wurde gefiltert, mit Hexan gewaschen und drei Stunden lang über festem NaOH getrocknet. Das getrocknete Pulver zeigte im ³¹p-Spektrum keine Spuren von Verunreinigungen.
Referenz: BEISPIEL 46
N-[N-(tertiäres Butyloxycarbonyl)-3-Aminopropyl]Benzylamin (47)
Eine Lösung aus N-(3-AminopropylBenzylamin (38 g, 231,71 mmol) in trockenem Tetrahydrofuran (300 ml) wurde in einem Bad aus Eis und Alkohol auf 5°C abgekühlt. Dieser kalt gerührten Lösung wurde über einen Zeitraum von 6 Stunden langsam 2-[[(tertiäres Butyloxycarbonyl)oxy]imino]-2-Phenylaceto-nitril (BOCON) (56,58 g, 230 mmol) in trockenem Tetrahydrofuran (300 ml) zugefügt. Nach der Zugabe von BOCON wurde das Reaktionsgemisch weite-re 6 Stunden lang bei Raumtemperatur unter Argonatmosphäre gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde bis zur Trockenheit verdunstet und der Rückstand in Äther (750 ml) aufgelöst. Der Ätherextrakt wurde mit Natriumhydroxid 5%-Lösung (4 × 100 ml) gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bis zum trockenen Zustand konzentriert. Der Rückstand wurde über die Flashsäule gereinigt, unter Anwendung einer chromatographischen Behand-lung über einen Silica-Dichlormethan → Methanol-Gradienten. Die reinen Fraktionen wurden zusammengenommen und vedunstet, um 49,5 g (81 %) des Produktes in Form von Öl zu erhalten:
¹H (deuteriochloroform): δ 1.42 (s, 9H, t-Boc), 1.65 (m, 2H, CH₂CH₂CH₂), 2.70 (t, 2H, CH₂NHCH₂), 3.20 (m,.2H, BocNHCH₂), 3.78 (s, 2H, ArCH₂), 5.32 (br s, 1H, BocNH), 7.30 (m, 5H, ArH).
Referenz: BEISPIEL 47
10-Cyano-9-(Phenylmethyl)-2,2-Dimethyl-3-Oxa-4-Oxo-5,9-Diazodecan (48).
Einer gerührten Lösung der Verbindung 47 (24 g, 91 mmol) in trockenem Acetonitril (500 ml) wurden bei Raumtemperatur Kalium/Celit (50 g) und Chloracetonitril (27,3 g, 364 mmol) zugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde in ein vorgewärmtes Ölbad bei 85°C gebracht und bei dieser Temperatur unter Argonatmosphäre 12 Stunden lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde gekühlt, gefiltert und mit Dichlormethan (100 ml) gewaschen. Das kombinierte Filtrat wurde bis zur Trockenheit verdunstet. Der Rückstand wurde in Dichlormethan (100 ml) aufgelöst und mit Natriumbicarbonatlösung, 5%, (100 ml), Wasser (100 ml) und Salzlösung (100 ml) gewaschen. Der organische Extrakt wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und konzentriert, um eine feste Substanz zu erhalten. Die feste Substanz wurde aus Dichlormethan/Hexan auskristallisiert, um 24 g (87%) in Form von farblosen Nadeln zu erhalten. Schmelzpunkt 70-73°C;
¹H nmr (deuteziochloroform): δ 1.44 (s, 9H, t-Boc), 1.71 (m, 2H, CH₂CH₂CH₂), 2.67 (t, 2H, J=6.4Hz, CH₂NHCH₂), 3.23 (m, 2H,BocNHCH₂), 3.46 (s, 2H, CH₂CN), 3.65 (s, 2H, ArCH₂), 4.85 (br s, 1H, BocNH), 7.33 (s, 5H, ArH).
Anal. berechnet für C₁₇H₂₅N₃O₂: C, 67.29; H, 8.31; N, 13.85, Gefunden: C, 67.34; H, 8.45; N, 13.85.
Referenz: BEISPIEL 48
9, 12-Di(Phenylmethyl)-2, 2-Dimethyl-3-Oxa-4-Oxo-5, 9, 12-Triazododecan (49 zu erhalten. (49)
Die Nitrilverbindung von Beispiel 47 (34 g, 112,21 mmol) wurde in Äthanol (100 ml) aufgelöst und in eine Parrflasche verbracht. Natriumhydroxid (7g) wurde in Wasser (20 ml) aufgelöst, mit Äthanol (180 ml) gemischt und in die Parrflasche verbracht. Ra/Ni (5 g, nass) wurde zugefügt und 12 Stunden lang in einem Parrgerät über Wasserstoff (3,16 bar) geschüttelt. Der Katalysator wurde gefiltert und mit 100 ml Äthanollösung (95%) gewaschen. Das kombinierte Filtrat wurde auf 100 ml konzentriert und in einem Bad aus Eis und Alkohol auf 5°C abgekühlt. Die kalte Lösung wurde mit Dichlotmethan (3 × 200 ml) extrahiert. Der über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknete kombinierte Extrakt wurde verdunstet, um 32 g (92%) eines Ölproduktes zu erhalten. Das Produkt wurde so für die nächste Reaktion verwendet.
¹H nmr (deuteziochloroform): δ 1.32 (br s, 2H, NH₂), 1.42 (s, 9H, t-Boc), 1.67 (m, 2H, CH₂CH₂CH₂), 2.48 (m, 4H, CH₂CH₂NH₃), 2.75 (t, 2H, J=6.4Hz, CH₂NHCH₂), 3.15 (m, 2H, BocNHCH₂), 3.55 (s, 2H, ArCH₂), 5.48 (br s, 1H, BocNH), 7.31 (m, 5H, ArH).
Das obige Amin (33 g, 107,5 mmol) in trockenem Methanol (100 ml) wurde mit wasserfreiem Magnesiumsulfat (30 g) gemischt und bei Raumtemperatur unter Argonatmosphäre gerührt. Dieser Lösung wurde nach diesem Rührvorgang Benzaldehyd (13,2 g, 125 mmol) zugefügt und der Rührvorgang unter Argonatmosphäre weitere 4 Stunden lang fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde mit 150 ml Methanol verdünnt und in einem Eis-Salzbad auf –5°C abgekühlt. Dann wurde über einen Zeitraum von 2 Stunden festes Natriumborhydrid (30 g) in Portionen von jeweils 1 g zugefügt, wobei die Reaktionstemperatur unter 0°C gehalten wurde. Dieses Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und über Celit gefiltert. Das Filtrat wurde bis zur Trockenheit verdunstet. Der Rückstand wurde zwischen Wasser (350 ml) und Äther (500 ml) verteilt und in Äther extrahiert. Der Ätherextrakt wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bis zu einem trockenen Zustand verdunstet. Der Rückstand wurde auf einer Silicagelsäule gereinigt, unter Verwendung von Dichlormethan → Methanol als Elutionsmittel. Die reinen Fraktionen wurden kombiniert und verdunstet, um 35 g (82%) in Form von Öl zu erhalten:
¹H nmr (deuteziochloroform): δ 1.42 (a, 9H, t-Hoc), 1.65 (m, 2H, CH₂CH₂CH₂), 1.75 (br s, 1H, ArCH₂NH), 2.55 (m, 4H, CH₂CH₂, 2.70 (t, 2H, J=6.4Hz, CH₂NHCH₂), 3.15 (m, 2H, SocNHCH₂), 3.52 (s, 2H, ArCH₂), 3.72 (s, 2H, ArCH₂), 5.55 (br s, 1H, HocNH), 7.28 (m, 10H, ArH).
Anal. berechnet für C₂₄H₃₅N₃O₂: C, 72.51; H, 8.87; N, 10.57. Gefunden: C, 72.39; H, 8.77; H, 10.72.
Referenz: BEISPIEL 49
13-Cyano-9, 12-Di-(Phenylmethyl)-2, 2-Dimethyl-3-Oxa-4-Oxo-5,9,12-Triazotridecan (50)
Die unter diesem Titel aufgeführte Verbindung wurde nach dem Verfahren für die Herstellung der Verbindung von Beispiel 47 aus Verbindung 49 zuberei tet. Verwendetes Material: Substrat 49 (4,55 g, 11,46 mmol); Chloracetonitril (2,6 g, 34,38 mmol); Kaliumfluorid/Celit (9,0 g) und trockenes Acetonitril (100 ml). Das rohe Produkt wurde durch Flashchromatographie über Silicagel gereinigt, unter Verwendung von Dichlormethan → Aceton als Elutionsmittel, um 4,8 g (96%) zu erhalten;
¹H nmr (deuteziochloroform): δ 1.42 (s, 9H, t-Boc), 1.68 (m, 2H, CH₂CH₂CH₂), 2.52 (m, 4H, CH₂CH₂), 2.68 (t, 2H, J=6.2Hz, CH₂NHCH₂), 3.22 (m, 2H, BocNHCH₂), 3.36 (s, 2H, CNCH₂), 3.50 (s, 2H, ArCH₂), 3.62 (s, 2H, ArCH₂), 5.72 (br s, 1H, BocNH), 7.32 (m, 10H, ArH).
Anal. berechnet für C₂₆H₃₆H₂O₂: C, 71.52; H, 8.31; H, 12.83. Gefunden: C, 71.17; H, 8.14; N, 12.82.
Referenz: BEISPIEL 50
9, 12, 15-Tri(Phenylmethyl)2,2-Dimethyl-3-Oxa-4-Oxo-5, 9, 12, 15-Tetraazapentadecan (51)
Die Verbindung unter diesem Titel wurde aus der Verbindung 50 nach dem in Beispiel 48 beschriebenen Zweistufenverfahren zubereitet. Im ersten Schritt verwendetes Material: Das Substrat 50 (25 g, 57,34 mmol); Ra/NI (5 g); Natriumhydroxid in Äthanol (200 ml, 7 g Natriumhydroxid wurden in 20 ml Wasser aufgelöst und mit Äthanol gemischt und das Äthanol diente zur Auflösung des Substrats (100 ml). Das Rohprodukt wurde in Dichlormethan extrahiert und bei der Verdunstung ergaben sich 22 g (87%) eines öligen Produkts;
¹H nmr (deuteziochloroform): δ 1.40 (s, 9H, t-Boc), 1.50 (m, 4H, CH₂CH₂CH₂ & NH₂), 2.48 (m, BH, 2 CH₂CH₂) , 2.66 (t, 2H, J=6.2Hz, CH₂NHCH₂), 3.24 (m, 2H, BocNHCH₂), 3.50 (s, 2H, ArCH₂), 3.56 (s, 2H, ArCH₂), 5.48 (br s, 1H, BocNH), 7.28 (m, 10H, ArH).
Im zweiten Schritt verwendetes Material: Das vorstehend aufgeführte Amin (24,4 g, 55,33 mmol); Banzaldehyd (6,36 g, 60,00 mmol); Magnesiumsulfat (20 g) und trockenes Methanol (200 ml). Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie über Silicagel gereinigt, unter Verwendung von Dichlormethan → Methanol als Elutionsmittel, um 20,0 g (68%) der Verbindung 51 als Öl zu erhalten;
¹H nmr (deuteziochloroform): δ 1.40 (s, 9H, t-Boc), 1.52 (m, 2H, CH₂CH₂CH₂), 1.84 (br s, 1H, ArCH₂NH), 2.38 (t, 2H, J=6.2Hz, CH₂NHCH₂), 2.54 (m, 8H 2 CH₂CH₂), 3.08 (m, 2H, BocNHCH₂), 3.42 (s, 2N, ArCH₂), 3.50 (s, 2H, ArCH₂), 3.65 (s, 2H, ArCH₂), 3.65 (s, 2H, ArCH₂) , 5.45 (br s, 1H, BocNH), 7.28 (m, 15H, ArH).
Anal . berechnet für C₃₃H₄₆N₄O₂ : C, 74.67; H, 8.74; N, 10.56. Gefunden: C, 74.92; H, 8.39; N, 10.71.
Referenz: BEISPIEL 51
16-Cyano-9, 12, 15-Tri(Phenylmethyl)-2, 2-Dimethyl-3-Oxa-Oxo-5, 9, 12, 15-Tetraazahexadecan (52).
Die im Titel aufgeführte Verbindung wurde aus der Verbindung 51 nach dem in Beispiel 47 verwendeten Verfahren hergestellt. Verwendetes Material: Substrat (Beispiel 50, Verbindung 51, 8,30 g, 15,66 mmol); Chloracetonitril (3,52 g, 46,98 mmol); Kaliumfluorid/Celit (10,0 g und trockenes Acetonitril (150 ml). Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie über Silicagel gereinigt, unter Verwendung von Dichlormethan → Äthylacetat als Elutionsmittel, um 7,6 g (85%) der Verbindung zu erhalten
¹H nmr (deuteziochloroform): δ 1.42 (s, 9H, t-Hoc), 1.60 (m,2H, CH₂CH₂CH₂), 2,42 (t, 2H, J=6.2Hz, CH₂NHCH₂), 2.60 (m, 8H, 2CH₂CH₂), 3.14 (m, 2H, BocNHCH₂), 3.38 (s, 2H, CNCH₂), 3.48 (s, 2H, ArCH₂), 3.54 (s, 2H, ArCH₂), 3.60 (s, 2H, ArCH₂), 5.42 (br s, 1H, BocNH), 7.26 (m, 15H, ArH).
Anal. berechnet für C₃₅H₄₇N₅O₂: C, 73, 77; H, 8 .32 ; N, 12.29. Gefunden: C, 73.69; H, 8.19; N, 12.31.
Referenz: BEISPIEL 52
9,12,15,18-Tetra(Phenylmethyl)-2,2-Dimethyl-3-Oxa-4-Oxo-5,9,12,15,18-Petaazooctadecan (53)
Die im Titel aufgeführte Verbindung wurde aus der Verbindung 52 nach dem zweistufigen Verfahren zur Herstellung der Verbindung 49 von Beispiel 48 zubereitet. In der ersten Stufe verwendetes Material: Das Substrat (Verbindung 52, 7 g, 12,30 mmol); Ra/Ni (2 g); Natriumhydroxid in Äthanol (160 ml, 3,5 g Natriumhydroxid wurden in 10 ml Wasser aufgelöst und mit Äthanol gemischt) und Äthanol wurde verwendet, um das Substrat aufzulösen (100 ml). Das Rohprodukt wurde in Dichlormethan extrahiert und aus der Verdunstung ergaben sich 5,6 g (79%) der Verbindung als Öl:
¹H nmr (deuteziochloroform): δ 1.40 (s, 9H, t-Hoc), 1.50 (m, 4H, CH₂CH₂CH₂ & NH₂), 2 .48 (m, 12H, 3 CH₂CH₂), 2. 66 (m, 2H, CH₂NHCH₂), 3 .24 (m, 2H, BocNHCH₂), 3 .50 (s, 2H, ArCH₂), 3.56 (s, 4H, 2 ArCH₂), 3.62 (s, 2H, ArCH₂), 5.48 (br s, 1H, BocNH), 7.28 (m, 15H, ArH).
Für die zweite Stufe verwendetes Material: das vorstehend aufgeführte Amin (21,2 g, 36,74 mmol); Benzaldehyd (4,24 g, 40,00 mmol; Magnesiumsulfat (10,0 g); trockenes Methanol (200 ml) und Natriumborhydrid (Boronat) (4,85 g, 128,45 mmol). Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie über Silicagel gereinigt, unter Verwendung von Dichlormethan → Methanol als Elutionsmittel, um 18,67 g (77%) der Verbindung 53 als Öl zu erhalten:
¹H nmr (deuteziochloroform): δ 1.40 (s, 9H, t-Boc) , 1.52 (m, 2H, CH₂CH₂CH₂), 2.05 (br s, 1H, ArCH₂NH), 2.38 (t, 2H, J=6.0Hz, CH₂NHCH₂) , 2.54 (m, 12H, 2 CH₂CH₂), 3.08 (m, 2H, BocNHCH₂), 3.40 (s, 2H, ArCH₂), 3.50 (s, 4H, 2 ArCH₂), 3.64 (s, 2H, ArCH₂), 5.55 (br s, 1H, BocNH), 7.28 (m, 20H, ArH).
Anal. berechnet für C₄₂H₅₇N₅O₂: C, 75.98; H, 8.65; N, 10.55. Gefunden:. C, 75.72; H, 8.67; N, 10.39.
Referenz: BEISPIEL 53
13-Amino-1,4,7,10-Tetra(Phenylmethyl)-1,4,7,10-Tetraazatridecan (54)
Einer gerührten Lösung der Verbindung 53 (2,65 g, 4 mmol) in Dichlormethan (10 ml) wurde bei Raumtemperatur Trifluoressigsäure (10 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt und bis zur Trockenheit verdunstet. Der Rückstand wurde in Dichlormethan (100 ml) aufgelöst und mit 150 ml Natriumbicarbonatlösung (5%), pH-Wert 8, und Salzlösung gewaschen. Der organische Extrakt wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bis zum trockenen Zustand aufkonzentriert. Den so erhaltenen öligen Rückstand benützte man für die nächste Reaktion.
¹H nmr (deuteziochloroform): δ 1.50 (m, 5H, CH₂CHCH₂, NH₂, & ArCH₂NH), 2.38 (t, 2H, J=6.4Hz, CH₂NHCH₂), 2.54 (m, 14H, 7 CH₂), 3.52, (s, 2H, ArCH₂), 3.56 (s, 4H, 2 ArCH₂), 3.62 (s, 2H, ArCH₂), 7.28 (m, 20H, ArH).
Referenz: BEISPIEL 54
3',5'-O-(Tetraisopropyldisiloxan-13-Diyl)-N-[4,7,10,13-Tetrakis-(Phenylmethyl)-4,7,10,13-Tetraazatridec-1-yl]-2' -Desoxyguanosin (56).
Ein Gemisch aus 2-Chlorinosin (55 im Reaktionsschema 3) (2,12 g, 4 mmol) und Verbindung 54 (2,5 g, 4,4 mmol) in 2-Methoxyäthanol (50 ml) wurde 12 Stunden lang bei 80°C erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde bis zum trokkenen Zustand verdunstet und der Rückstand nach der Flashchromatographie über Silicagel unter Verwendung von Dichlormethan und Methanol (9:1) ergab 2,55 g (60%) der im Titel aufgeführten Verbindung als Schaum.
¹H nmr (deuteziochloroform): δ 1.00 (m, 24H, 4 Iaobutyl-H), 1.62 (m, 1H, C_2'H), 1.80 (m, 4H, CH₂CH₂CH₂, C_2'H, & ArCH₂NH), 2.52 (m, 14H, 7 CH₂), 3.20 (s, 2H, ArCH₂), 3.32 (s, 2H, ArCH₂), 3.42 (s, 2H, ArCH₂), 3.48 (s, 4H, ArCH₂ & CH₂), 3.78 (m; 1H, C_4'H), 4.05 (m, 2H, C_5'CH₂), 4.72 (m, 1H, C_3'H), 6.22 (m, 1H, C_1'H), 6.94 (m, 1H, N₂H), 7.26 (m, 20H, ArH), 7.72 (s, 1H, C₈H), 10.52 (br s, 1H, NH).
Anal. berechnet für C₅₉H₈₅N₉O₅Si₂: C, 67.07; H, 8.11; N, 12.93. Gefunden: C, 67.22; H, 8.24; N, 11,81.
Referenz: BEISPIEL 55
3',5'-O-(Tetraisopropyldisiloxan-13-Diyl)-6-O-(Phenylmethyl)-N-[15-Methyl-14-Oxo-4,7,10,13-Tetrakis(Phenylmethyl)-4,7,10,13-Tetraazahexadec-1-yl]-2'-Desoxyguanosin (57).
Die Verbindung von Beispiel 54 (2,00 g, 1,89 mmol) wurde zusammen mit trockenem Pyridin (30 ml) zweimal verdunstet. Das resultierende Gemisch wurde in trockenem Pyridin (50 ml) aufgelöst und in einem Eisbadgemisch auf 0°C abgekühlt. Dieser kalten gerührten Lösung wurde unter Argonatmosphäre langsam Triäthylamin (0,61 g, 6 mmol) und danach Isobutyrylchlorid (0,64 g, 6 mmol) zugegeben. Nach der Zugabe von Isobutyrylchlorid wurde das Reaktionsgemisch 12 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und bis zum trockenen Zustand verdunstet. Der Rückstand wurde in Dichlormethan (150 ml) aufgelöst, mit 50 ml Natriumbicarbonat (5%), Wasser (50 ml) und Salzlösung (50 ml) gewaschen. Der organische Extrakt wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bis zum trockenen Zustand verdunstet.
Der Rückstand ergab nach Reinigung über Silicagel unter Verwendung von Dichlormethan / Methanol (95:5) 1,88 g (88%) der im Titel aufgeführten Verbindung in Form von Schaum.
Dieser Schaum (1,8 g, 1,61 mmol) wurde über Phosphorpentaoxyd 12 Stunden lang im Vakuum getrocknet. Der getrocknete Rückstand wurde in trokkenem Dioxan (50 ml) aufgelöst und mit Triphenylphosphin (0,83 g, 3,2 mmol), Benzylalkohol (0,35 g, 3,2 mmol) und Diäthylazodicarboxylat (0,54 g, 3,2 mmol) bei Raumtemperatur unter Argonatmosphäre behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde nach 10 Stunden langem Rühren bis zum trockenen Zustand verdunstet. Der Rückstand wurde in Dichlormethan (150 ml) aufgelöst und mit 50 ml Natriumbicarbonat (5%), Wasser (50 ml) und Salzlösung (50 ml) gewaschen. Der organische Rückstand wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bis zum trockenen Zustand verdunstet. Der Rückstand wurde durch Flashchromatographie über Silicagel gereinigt, unter Verwendung von Dichlormethan / Aceton (7:3) als Elutionsmittel. Die reinen Fraktionen wurden gesammelt und verdunstet, um 1,7 g (74%) Schaum zu erhalten:
¹H nmr (deuteziochloroform): δ 1.04 (m, 30H, 5 Isobutyl-CH₃), 1.68 (m, 2H, CH₂CH₂CH₂), 2.55 (m, 16H; 7 CH₂, C_2'H, & Isobutyl-CH), 3.08 (m, 1H, C_2'H), 3.36 (m, 2H, CH₂), 3.52 (m, 8H, 4 ArCH₂), 3.84 (m, 1H, C_4'H), 4.00 (m, 2H, C_5'CH₂), 4.72 (m, 1H, C_3'H), 5.50 (s, 2H, ArCH₂), 6.18 (m, 1H, C_1'H), 7.04 (m, 1H, N₂H), 7.26 (m, 25H, ArH), 7:76 (s, 1H, C₈H).
Anal. berechnet für C₇₀H₉₇N₉O₆Si₂: C, 69.09; H, 8.04; N, 10.36. Gefunden: C, 69.12; H, 8.23; N, 10.19.
Referenz: BEISPIEL 56
6-O-(Phenylmethyl)-N-[15-Methyl-14-Oxo4,7,10,13-Tetrakis(Phenylmethyl)-4,7,10,13-Tetraazahexadec-1-yl]-2'-Desoxyguanosin (58).
Einer gerührten Lösung der Verbindung 57 (5,0 g, 4,11 mmol) in Pyridin (50 ml) wurde eine frisch zubereitete 1 N-Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid (20 ml, 20 mmol, zubereitet in einem Gemisch aus Pyridin:Tetrahydrofuran:Wasser im Verhältnis 5:4:1) bei Raumtemperatur zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten lang gerührt und mit H⁺ Harz (Pyridiniumform) auf einen pH-Wert von 6-7 gebracht. Das Harz wurde gefiltert, mit Methanol (50 ml) gewaschen und das kombinierte Filtrat bis zum trockenen Zustand verdunstet. Der Rückstand wurde in Dichlormethan (200 ml) aufgelöst, mit Wasser (50 ml) und Salzlösung (50 ml) gewaschen. Der organische Extrakt wurde über Natriumsulfat getrocknet und bis zur Trockenheit aufkonzentriert. Der so erhaltene Schaum wurde durch Flashchromatographie über einer Silicagelsäule gereinigt, unter Verwendung von Dichlormethan / Methanol (95:5) als Elutionsmittel. Die erforderlichen Fraktionen wurden gesammelt und zusammen verdunstet, um 3,5 g (87%) der im Titel aufgeführten Verbindung in Form von Schaum zu erhalten.
¹H nmr (deuteziochloroform): δ 1.04 (m, 30H, 5 isobutyryl CH₃), 1.68 (m, 2H, CH₂CH₂CH₂), 2.55 (m, 16H, 7 CH₂, C_2'H, & isobutyryl CH), 3.08 (m, 1H, C_2'H), 3.36 (m, 2H, CH₂), 3,52 (m, 8H, 4 ArCH₂), 3.84 (m, 1H, C_4'H), 4.00 (m, 2H, C_5'CH₂), 4.72 (m, 1H, C_3'H), 5.50 (s, 2H, ArCH₂), 6.18 (m, 1H, C_1'H), 7.04 (m, 1H, N₂H), 7.26 (m, 25H, ArH), 7.76 (s, 1H, C₈H).
Anal. berechnet für C₇₀H₉₇N₉O₆Si₂: C, 69.09; H, 8.04; N, 10.36. Gefunden: C, 69.12; H, 8.23; N, 10.19.
Referenz: BEISPIEL 57
Die Amidite 9, 17, 23, 30, 35, 41 und 46 werden, wie in der ausführlichen Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen erörtert, über das automatische Protokoll der DNA-Synthese in die Oligonukleotidsequenzen aufgenommen. (Das Standardprotokoll unter Verwendung eines Synthesegeräts ABI 380B DNA Synthesizer wurde modifiziert durch Verlängerung des Warteschritts nach dem Impuls für die Zugabe von Tetrazol auf 900 Sekunden. Die Bedingungen für die Aufhebung des Schutzes sind bei Himmelsbach et al., Tetrahedron 1984, 40, 59 erörtert). Der enzymatische Abbau und die nachfolgende HPLC-Analyse (Hochdruckflüssigkeitschromatographie) weisen auf die erwarteten Verhältnisse der Nukleosid-Komponenten hin. (Die Oligonukleotide wurden mit einem Gemisch aus Phosphodiesterase der Milz, Phosphodiesterase von Schlangengift und bakterieller alkaliner Phosphatase aufgeschlossen, um die einzelnen Nukleoside zu erhalten, die der HPLC-Analyse unterzogen wurden).
Ein 21-mer Oligonukleotid [5' d-(GCCGAGGTCCATGTCGTACGC)] wurde mit einem, drei oder sieben N²-[3-(1H-Imidazol-1-yl)Propyl)Desoxyguanosin (dG) oder einem oder drei N²-[3-(1H-Imidazol-1-yl)Propyl]-2-NH₂,Desoxyadenosin (dA) modifiziert und zu komplementärer DNA oder RNA hybridisiert. Siehe Freier et al., Gene Regulation: Biology of Antisense RNA and DNA, (Erickson et al., Raven Press, New York, 1992), Seiten 95-107; Breslauer et al.; Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 1991, 8, 3746. Im Vergleich zur nicht modifizierten DNA lag die durchschnitt-liche Änderung T_m/mod für die mit dG modifizierten und mit DNA, bzw. mit RNA hybridisierten Oligonukleotide bei +2,0 und +0,3; für die mit dA modifizierten und mit DNA, bzw. mit RNA hybridisierten Oligonukleotide lag die durchschnittliche Änderung T_m/mod bei +2,7 und +0,6. Die durchschnittliche Erhöhung der Bindungsaffinität mehrerer verschiedener mit N²-Imidazolpropyl dG und mit N²-Imidazolpropyl-2-Amino-dA modifizierter und DNA hybridisierter Oligonukleotide liegt bei 2,7°C/mod (3 verschiedene Sequenzen, 16 Mal eingebaut) beziehungsweise 2,5°C/mod (3 verschiedene Sequenzen, 12 Mal eingebaut). Die rela tive Spezifität der Hybridisierung von dG oder N²-Imidazolpropyl dG für Cytidin gegen A, G und U(T) Fehlanpassungen eines RNA oder DNA Komplements zeigt, dass das mit N² modifizierte dG spezifischer für sein Komplement Cytidin ist, als das entsprechende nicht modifizierte dG; mit N²-Imidazolpropyl-2-NN₂ dA ist genau so spezifisch gegen RNA oder DNA wie dA. Der Einbau von drei N²-Imidazolpropyl-2-NH₂ dG oder 2-NH₂ dA in den Positionen n-1, n-2 und n-3 am 3' Ende eines 15-mer ergab eine Erhöhung der Stabilität (T_1/2 = 9h bzw. 16h) gegen den nukleolytischen Abbau im Kalbsfötenserum, im Vergleich zum nicht modifizierten Oligomer (T_1/2 = 1 h). Siehe Hoke et al., Nucleic acids Res., 1991, 8, 3746). Die mit Cap-N² modifizierte dG-Sequenz wurde um 2,8°C/mod gegen DNA stabilisiert und die 2-NH₂-dA-Sequenz wurde um 2,6°C/mod gegen DNA und um 1,5°C gegen RNA stabilisiert.
Molekulare Modellsimulationen von Oligomeren, welche die N²-Imidazolpropyl-Funktionalität enthalten, lassen darauf schließen, dass sich das Imidazol in der kleinen Furche nahe an der Phosphat-Hauptkette anbindet und den DNA-DNA-Duplex stabilisiert. (Studien der molekularen Minimierung und Dynamik wurden unter Verwendung des Amber Kraftfeldes mit den Programmen Insight und Discover (Biosys Inc., San Diego, CA) durchgeführt. Viertausend Schritte der Minimierung des Konjugationsgradienten wurden angewandt, gefolgt von 1000 Äquilibrierungszyklen bei 300°C und 4000 Dynamikschritte in Zeitintervallen von 10 psec). Im Fall des RNA-DNA-Duplex heftet sich die Imidazolpropylgruppe nicht spezifisch an, weil die kleine Furche breit ist und die Phosphate abgewandt sind. Dagegen sind andere Donatoren und Akzeptoren in der kleinen Furche zugänglich, die für die erhöhte Stabilität des modifizierten Duplex zuständig sein können.
Ein 21-mer, das in 7 Positionen (1,4,6,7,13,16 und 20) ein mit Imidazolpropyl modifiziertes dG aufweist und ein anderes 21-mer, das in 5 Positionen (1,5,8,11 und 18) ein mit Imidazolpropyl modifiziertes 2-NH₂-dA aufweist, unterstützt die von HeLa-Zellextrakt RNase N abhängige Spaltung. Siehe Agrawal et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 1989, 87, 1401. Ferner hat ein 17-mer Phosphorthioat, das ein modifiziertes dG an der primären Spaltungs stelle von HeLa Zellextrakt RNase H enthielt, die Spaltung durch das Enzym nicht verhindert. Monia et al., Biol. Chem., eingereicht 1992. Diese Daten lassen vermuten, dass die zwischen den mit N²-Imidazolpropyl dG oder 2-NH₂-dA modifizierten Oligonukleotiden und der RNA gebildeten Heteroduplexe von RNase N erkannt werden. Die folgende Tabelle 1 veranschaulicht diese Studien.
Referenz: BEISPIEL 58
Chromatographie und Reinigung
Als Silicagel für die Flashchromatographie wurde das Produkt ICN 60 (Costa Mesa, CA) 32-63 mesh, verwendet. Stoffe, die in dem für die Flashchromatographie (FC) verwendeten Lösungssystem nicht löslich waren, wurden zusammen mit Silicagel 100 von E. Merck (Darmstadt, Bundesrepublik Deutschland) 70-230 mesh, unter Verwendung eines geeigneten Lösungsmittels verdunstet. Das trockene Material wurde dann oben an einer FC-Säule untergebracht. Die Dünnschichtchromatographie wurde auf vorbewerteten Kieselgel 60 F₂₅₄-Platten von E. Merck durchgeführt. Die Betrachtung der Verbindungen erfolgte durch Beleuchtung der TLC-Platten im UV-Licht (254 nm) und/oder durch Besprühen mit 10 Methanol-H₂SO₄ und nachfolgender Erhitzung. Die Verdunstung erfolgte jeweils bei 40-50°C unter Verwendung eines Eindampfgerätes und einer Vakuumpumpe mit Anschluss an einen Vakuumregler. ¹H-NMR-Spektren wurden bei 400 mHz in dmso-d₆ erzielt, wenn nicht anders angegeben. Wo dies angebracht war, erfolgte die Behandlung der Proben mit D₂O-registrrierten austauschbaren Protonen. Die Infrarotspektren wurden auf einem Perkin-Elmer Spektrophotometer 16PC FT-IR aufgezeichnet. Das Lösungsmittelsystem A = Äthylacetat-Hexan 3:2; B = Äthylacetat-Methanol 9:1, v/v kam zum Einsatz.
Referenz: BEISPIEL 59
Verfahren zur Anlagerung von modifizierten 5'-Dimethoxytriphenylmethyl-Ribonukleosiden am 5'-Hydroxyl der am CPG-Träger gebundenen Nukleoside.
Die modifizierten Nukleoside, die sich in der Endstellung 3' bestimmter Antisense Oligonukleotide befinden, sind geschützt, ihr 5'-DMT (die exocyklischen Aminogruppen Cytosin und Adenin sind benzoyliert und die Guanin Aminogruppe ist Isobutyriert) und sie werden 5 Stunden lang bei 50°C behandelt mit einem mit Trifluoressigsäure /Bromessigsäure gemischten Anhydrid in Pyridin und Dimethylaminopyridin. Die Lösung wird unter redu ziertem Druck zu einem dünnen Sirup vedunstet, der in Äthylacetat aufgelöst und durch eine Silicagelsäule geschickt wird. Die homogenen Frak-tionen wurden gesammelt und bis zu einem trockenen Zustand verdunstet. Eine Lösung aus 10 ml Acetonitril, 10 Mikromol der mit 3'-O-Bromäthylester modifizierten Pyrimidin-Nukleoside und 1 ml Pyridin/Dimethylaminopyridin (1:1) wird langsam mit einer Kolbenbürette durch eine Säule mit 1 Mikromol CPG-Thymidin (Applied Biosystems, Inc.) gedrückt, die vorher mit Säure auf Standardbedingungen gebracht wurde, um die freie 5'-Hydroxylgruppe zu erhalten. Weitere in CPG-Säulen gebundene Nukleoside könnten verwendet werden. Das Elutionsmittel wird aufgefangen und erneut durch die Säule geschickt. Dieser Vorgang wird dreimal wiederholt. Die CPG-Säule mit 10 ml Acetonnitril wird dann an ein Nukleinsäure-Synthesegerät ABI 380B angeschlossen. Dann wird die Oligonukleotidsynthese eingeleitet. Die Standardbedingungen zum Entzug des Schutzes mit konzentriertem Ammoniumhydroxid, mit denen die Thymidinesterbindung vom CPG-Träger gespalten wird, spaltet auch die 3' ,5'-Esterbindung, die das mit Pyrimidin modifizierte Nukleosid mit dem Thymidin verbindet, das anfangs am CPG-Nukleosid gebunden war. Auf diese Weise lässt sich jedes modifizierte Nukleosid oder allgemein jedes Nukleosid mit Modifikationen im Heterocyklus und/oder Zucker am 3'-Ende einer Oligonukleotidsequenz anlagern.
Referenz: BEISPIEL 60
Verfahren zur Umsetzung von modifiziertem Nukleosid-5'-DMT-3'-Phosphoramidit in Oligonukleotide
Das Verfahren für die Synthese der Feststoffphase von Polyribonukleotiden, siehe Sproat et al., 1989, Nucleic Acids Res., 17, 3373-3386, wird für die Zubereitung der modifizierten Oligonukleotide angewandt.
Referenz: BEISPIEL 61
Zubereitung von modifizierten Phosphorthioat-Oligonukleotiden
Die wie in den vorstehenden Beispielen beschrieben hergestellten substituierten 5'-DMT-Nukleoside 3'-Phosphoramidite werden in sequenzspezifi schen Oligonukleotid-Phosphorthioat eingebaut, wie von Sproat, siehe oben, in 3373-3386 und von Beaucage et al., in J.Am. Chem. Soc'y, 1989, 112, 1253-1255 beschrieben.

Claims

Oligonukleotid zur therapeutischen Verwendung, das mindestens eine Verbindung der Formel 1 aufweist:
in der: G CH oder N ist, X NH₂ oder OH ist, Y NHRQ oder N(C(O)CH(CH₃)₂)RQ ist, wobei R eine zweiwertige Nydrocarbylgruppe mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen und Q ein Stickstoff enthaltender Heterozyklus, eine Alkylgruppe mit 5 bis 20 Kohlenstoffatomen, ein Amin, eine Thiolgruppe, ein Aldehyd, ein Keton, ein Akohol, eine Alkoxygruppe oder ein Halogen ist, mit der Maßgabe, dass Q nicht Imidazol oder Bipyridin ist, Z ein Zuckerrest ist.
Oligonukleotid zur Beeinflussung der Spaltung von RNA durch RNase H, aufweisend: eine erste Oligonukleotidregion und eine zweite Nukleotidregion, wobei die erste und die zweite Region zusammen eine Nukleotidsequenz haben, die im wesentlichen komplementär zu mindestens einem Teil der RNA ist, wobei die erste Region mindestens ein Nukleotid aufweist, das einer Verbindung mit der Formel I entspricht:
in der: G CH oder N ist, X NH₂ oder OH ist, Y NHRQ oder N(C(O)CH(CH₃)₂)RQ ist, wobei R eine zweiwertige Hydrocarbylgruppe mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen und Q ein Stickstoff enthaltender Heterozyklus, eine Alkylgruppe mit 5 bis 20 Kohlenstoffatomen, ein Amin, eine Thiolgruppe, ein Aldehyd, ein Keton, ein Akohol, eine Alkoxygruppe oder ein Halogen ist, mit der Maßgabe, dass Q nicht Imidazol oder Bipyridin ist, Z ein Zuckerrest ist, die zweite Region eine Vielzahl von aufeinanderfolgenden Phosphorothioat-verknüpften Nukleotiden mit einem 2'-Dioxy-erythropentofuranosyl-Zuckerrest umfasst.
Oligonukleotid nach Anspruch 2, das außerdem aufweist: eine dritte Region des Nukleotids, wobei die dritte Region mindestens ein Nukleotid aufweist, das einer Verbindung mit der folgenden Formel entspricht:
in der: G CH oder N ist, X NH₂ oder OH ist, Y NHRQ oder N(C(O)CH(CH₃)₂)RQ ist, wobei R eine zweiwertige Hydrocarbylgruppe mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen und Q ein Stickstoff enthaltender Heterozyklus, eine Alkylgruppe mit 5 bis 20 Kohlenstoffatomen, ein Amin, eine Thiolgruppe, ein Aldehyd, ein Keton, ein Akohol, eine Alkoxygruppe oder ein Halogen ist, mit der Maßgabe, das Q nicht Imidazol oder Bipyridin ist, Z H, eine Stickstoffschutzgruppe oder ein Zuckerrest ist.
Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei Z Ribose oder Deoxyribose ist.
Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei G N, X NH₂ oder OH, Y NHRQ ist und R und Q zusammen eine Alkylgruppe mit 5 bis 20 Kohlenstoffatomen sind.
Oligonukleotid nach Anspruch 5, wobei R und Q zusammen Nonyl oder Isobutyrylnonan sind.
Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei Y NHRQ ist, wobei das R ein Alkylen mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, Q ein Amin ist, wobei das Amin NH₂, Polyalkylamin, Aminoalkylamin, Hydrazin (-NH-NH-), Hydroxylamin (-NH-OH), Semicarbazid (-NH-C(O)-NH-NH₂), Thiosemicarbazid (-NH-C(S)-NH-NH₂), Hydrazon (-NH=NH) oder Hydrazid (-C(O)-NH-NH₂) umfasst.
Oligonukleotid nach Anspruch 7, wobei R Hexylen und Q NH₂ ist.
Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei Y NHRQ ist, wobei Q eine Thiolgruppe, ein Aldehyd, ein Keton, ein Alkohol, eine Alkoxygruppe oder ein Halogen ist.
Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 9, das außerdem eine Phosphatgruppe an der 3'-Position des Zuckerrestes aufweist, wobei die Phosphatgruppe ein natives Phosphat oder ein modifiziertes Phosphat sein kann.
Oligonukleotid nach Anspruch 10, wobei der Zuckerrest eine Ribose oder eine Deoxyribose ist.
Oligonukleotid nach Anspruch 10, wobei der Zuckerrest Ribose oder Deoxyribose ist und das modifizierte Phosphat ein Methylphosphonat, Phosphorothioat, Phosphoramidit oder Phosphorotriester ist.