KR20070110077A - 혈관 완전성을 조정하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

혈관 완전성을 조정하기 위한 방법 및 조성물

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KR20070110077A
KR20070110077A KR1020077020509A KR20077020509A KR20070110077A KR 20070110077 A KR20070110077 A KR 20070110077A KR 1020077020509 A KR1020077020509 A KR 1020077020509A KR 20077020509 A KR20077020509 A KR 20077020509A KR 20070110077 A KR20070110077 A KR 20070110077A
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vascular
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inflammation
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KR1020077020509A
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한스-페터 게르버
보리스 에이. 헤서
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제넨테크, 인크.
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Abstract

본 발명은 혈관 완전성을 조정하는데 유용한 방법 및 조성물을 제공한다.
다운 증후군 위험 영역 1 (DSCR1), DSCR1 조정제, 혈관계 염증, 혈관 완전성 조정

Description

혈관 완전성을 조정하기 위한 방법 및 조성물 {Methods and Compositions for Modulating Vascular Integrity}
관련 출원
본 출원은 2005년 3월 10일자로 출원된 미국 가특허원 제60/660,172호에 대해 35 USC 119(e) 하에 우선권을 청구하고 있고 그의 전문이 본원에 참고로 도입된, 37 CFR 1.53(b)(1) 하에 출원된 비-가출원이다.
본 발명은 일반적으로, 질병 및 기타 병리학적 질환을 치료하는 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 혈관형성 (angiogenesis)과 연관된 분자 사건과 결과를 조정하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
혈관계는 정상적인 생리적 기능을 유지하는데 있어 중요한 역할을 한다. 예를 들어, 혈관계의 내피 세포는 정상적으로, 유체, 전해질 및 단백질이 조직과 기관 내로 이동하는 것을 조절하는 작용을 하는 세포성 장벽을 형성한다. 내피 장벽 기능 상실을 초래하는 사건들은 다소 복잡하고 완전히 이해되고 있지는 않지만, 혈관계의 완전성을 발달시키고 유지시키는 것에 관한 연구가 광범위하게 이루어져 왔다 [참고: 예를 들어, Kagsbrun & Moses, Chemistry & Biology (1999), 6:R217- R224; Ferrara, Endocrine Reviews (2004), 25(4):581-611].
그럼에도 불구하고, 혈관계의 완전성을 교란 (perturbation)시키는 것이 암에서부터 자가면역 질환과 같은 염증 질환에 이르기까지 다양한 질병과 병리학적 질환의 병인에 매우 밀접한 영향을 미치는 것 만은 분명하다 [참고: 예를 들어, 미국 특허공개공보 제2004/0167198호; Cines et al., Blood (1998), 91(10):3527-3561; Kumar et al., Curr. Opin. In Nephrology and Hypertension (2005), 14:33-37; Carmeliet & Collen Am. J. Physiol. (1997), 273:H2091-H2104]. 한편, 특정의 생리적 상황 하에서는 손상된 (기능저하) 상태의 혈관계를 발생시킬 수 있고/있거나 유지시킬 수 있는 능력이 요망되고, 결핍된 경우에는 그 자체가 병리학적 문제 또는 최적 이하의 치료적 결과를 유발시킬 수 있다는 것을 인지해야 한다.
혈관계와 연관된 염증은 혈관 완전성의 교란과 종종 관련이 있는 세포외 혈관형성성 자극의 하단 (downstream) 사건으로서 확인되었다 [참고: Kirkpatrick et al., Int. J. Microcirc. (1997), 17:231-240]. 예를 들어, 염증 과정이 각종 혈관 관련 장애 (예: 고혈압)의 병리생리학에 있어 중요한 역할을 할 수 있다는 명백한 증거가 점점 증가하고 있다 [참고: 예를 들어, Touyz, Cur. Opin. Nephrology and Hypertension (2005), 14:125-131; Kobayashi & Lin, Frontiers in Bioscience (2005), 10:666-674; Bacon, Curr. Opin. Rheumatol. (2004), 17:49-55; Paleolog, J. Clin. Pathol.: mol. Pathol. (1997), 50-225-233; Mullenix et al., Ann. Vasc. Surg. (2005), 19:130-138]. 토위즈 (Touyz)가 보고한 바와 같이, 염증을 시사하는 사건들, 예를 들어 표면 부착 분자 및 그의 리간드의 발현 증가, 염증성 세포 침윤, 사이토킨 생성, 케모카인 방출, 산화적 스트레스 및 선천 면역의 활성화가 혈관계에서 관찰된다. 내피 세포 교란 또한 내피 세포에 의해서만 발현되는 E-셀렉틴 (selectin) 및 폰 빌레브란트 인자 (von Willebrand factor)의 방출에 의해 반영될 수도 있다 [참고: Kuenen et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. (2002), 22:1500-1505]. 영속적이고/이거나 조절되지 못한 염증으로 인해 조직/혈관 손상이 야기될 수 있다. 염증 반응은 전형적으로, 혈관 투과성 상의 변경, 백혈구 혈관외 유출 (부착, 이주 및 화학주성) 및 조직 복구와 관련이 있다 [Touyz, 상기 참고].
불행하게도 현재까지는, 세포외 혈관형성성 자극과 이와 관련된 하단 사건 (예: 내피 세포 관련 염증) 간의 신호 전달을 매개하는 세포내 분자에 관한 정보가 없었다. 이는 바람직하지 못한 염증으로부터 비롯된 혈관 완전성의 교란을 최소화시키거나 또는 목적하는 경우에는 혈관 완전성의 교란을 유도시키도록 혈관형성성 과정을 미세-조정해줄 수 있는 치료 전략을 개발하고자 하는 노력에 장애가 되었다. 따라서, 신규한 치료적 개입의 촛점이 될 수 있는 "중간" 분자상 표적과 경로를 확인하는 것이 사실상 필요하다. 본원에 기재된 본 발명은 이러한 필요를 충족시켜 주고 기타 이득을 제공한다.
본원에 인용된 모든 참고 문헌 (특허원 및 공개공보 포함)은 그의 전문이 본원에 참고로 도입된다.
발명의 기술
본 발명은 적어도 부분적으로는, 다운 증후군 위험 영역 (Down syndrome critical region) 단백질 계열의 특정 구성원이 혈관 완전성을 조정하는 하단 사건의 세포내 조절과 혈관형성성 인자에 의한 세포외 신호 전달 간의 결정적 중간 분자상 링크라는 사실을 발견한 것에 기초한다. 구체적으로 언급하면, 다운 증후군 위험 영역 1 (본원에서 "DSCR1"로 후술됨)은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)와 같은 혈관형성성 조절인자에 의한 자극 후에 활성화 내피 세포 내에서 유도됨으로써 궁극적으로 DSCR1의 유도가 혈관/내피 세포 염증과 연관된 유전자의 발현을 조정하는 세포내 분자인 것으로 본 발명에서 밝혀졌다. 상기 언급된 바와 같이, 혈관계와 연관된 염증은 다수의 장애에 매우 밀접한 영향을 끼쳐 왔다. 현저하게, DSCR1은 치료적 조정에 특히 유리한 표적인데, 이는 DSCR1이 세포외 혈관형성성 신호와 혈관 염증의 세포내 조절 간을 매개하는데 있어서 역조절성 피드백 루프를 통하여 작용하기 때문이다. 특정 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 세포성/생리적 맥락에 따라서 DSCR1은 역조절성 피드백 루프의 한 구성원으로서의 그의 능력에 있어서, 조절성 피드백 루프와 통상적으로 연관된 분자상 및 신호 전달 밸런스를 변경시키기 위한 양성 또는 음성 (역) 조정 둘 다에 대해 민감한 것으로 예상된다. 이와 부합되게, 본원에 제시된 바와 같이, 내피 세포에 있어서의 증가된 DSCR1 활성과 저하된 DSCR1 활성 둘 다가 세포 생존 결과를 유사하게 조정하는 것으로 실험에 의해 입증되었다. 따라서, 본원에 기재된 데이터를 분석한 결과, 방해될 경우에 혈관형성성 신호 전달과 연관된 주요 하단 사건들 중의 한 가지 사건, 즉 혈관계와 연관된 염증을 조정시켜 주는 중요한 분자상 표적/경로가 밝혀졌다. 특정 상황 하에서는 이러한 염증이 검사하지 않더라도 바람직하지 못한 병리학적 결과를 야기시킬 수 있다. 기타 경우에서는 이러한 염증을 증강시키는 것이 요망될 수도 있다. 본 발명은 혈관 염증을 조정하므로 혈관 완전성을 조정하도록 하기 위해 DSCR1 기능/활성을 방해함으로써 이러한 염증을 조절하는데 유용한 방법, 조성물, 키트 및 제조품을 제공한다.
한 국면에서, 본 발명은 내피 세포에서의 DSCR1 활성을 조정하는 DSCR1 조정제를 제공한다. 한 양태에서, 이러한 DSCR1 조정제는 VEGF 수용체 2 (VEGFR-2)를 통한 신호 전달에 의해 유도된 DSCR1 활성을 조정한다. 본 발명의 DSCR1 조정제는 DSCR1-칼시네우린 (calcineurin) A (CnA) 경로의 한 가지 이상 국면을 조정할 수 있다. 예를 들어, 한 양태에서 본 발명의 DSCR1 조정제는 NFAT 활성과 연관된 한 가지 이상의 세포성 사건들, 예를 들어 NFAT 인산화, NFAT 핵 전위 또는 NFAT 전사 활성 (예를 들어, CnA에 의한 유전자 발현 조절을 매개할 수 있는 NFAT의 능력)을 조정한다.
본 발명의 DSCR1 조정제는 임상용으로 적합한 어떠한 형태로든 제공될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조정제는 핵산 또는 폴리펩티드의 형태로 제공 및/또는 투여될 수 있다. 따라서, 한 양태에서 본 발명의 DSCR1 조정제는 CnA에 의해 유도된 유전자 발현을 길항시킬 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함한다. 예를 들어, 이러한 폴리펩티드는 DSCR1의 적어도 일부를 포함하는 펩티드를 포함할 수 있고, 이 펩티드는 CnA와 상호 작용할 수 있다. 한 양태에서, 상기 폴리펩티드는 완전한 성숙한 DSCR1 단백질을 포함하는 것이 아니라 일부를 포함한다. 한 양태에서, 상기 폴리펩티드는 완전한 길이의 성숙한 DSCR1 단백질을 포함한다. 한 양태에서, 상기 폴리펩티드는 인간 DSCR1의 위치 약 96에서 약 125까지, 또는 위치 약 108에서 약 122까지의 아미노산을 포함하는데, 이러한 아미노산 위치는 서열 1 (도 9)에 제시된 서열을 지칭한다. 한 양태에서, 상기 폴리펩티드는 인간 DSCR1의 위치 약 96에서 약 125까지, 또는 위치 약 108에서 약 122까지의 인간 DSCR1 서열과의 서열 동일률 또는 유사율이 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 이상인 서열을 포함하고, 이러한 아미노산 위치는 서열 1 (도 9)에 제시된 서열을 지칭하는데, 단 상기 폴리펩티드는 CnA에 의해 유도된 유전자 발현을 길항시킬 수 있는 능력을 보유하고 있어야 한다. 한 양태에서, 상기 폴리펩티드는 세린-프롤린 (SP) 서열의 적어도 일부와, 인간 DSCR1의 N 및/또는 C-말단 칼시네우린 결합성 도메인의 적어도 일부를 포함하는데, 이러한 폴리펩티드는 CnA와 결합하여 CnA-조절된 유전자 발현을 억제할 수 있다. 한 양태에서, 상기 폴리펩티드는 (i) 인간 DSCR1의 위치 약 96에서 약 125까지, 또는 위치 약 108에서 약 122까지의 인간 DSCR1 서열 (여기서, 아미노산 위치는 서열 1 (도 9)에 제시된 서열을 지칭한다); (ii) 세린-프롤린 (SP) 서열의 적어도 일부; 및 (iii) 인간 DSCR1의 N 및/또는 C-말단 칼시네우린 결합성 도메인의 적어도 일부를 포함하는데, 이러한 폴리펩티드는 CnA와 결합하여 CnA-조절된 유전자 발현을 억제할 수 있다.
한 국면에서, 본 발명은 DSCR1 활성을 길항시킬 수 있는 DSCR1 조정제를 제공한다. 따라서, 한 양태에서 본 발명의 DSCR1 조정제가 내피 세포 (예: 활성화 내피 세포) 내에 존재하는 경우에 이러한 세포에서의 DSCR1의 활성 (이에는 유전자 발현이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다)을 억제시키는 핵산을 포함한다. 한 양 태에서, 상기 핵산은 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 핵산은 억제성/간섭 RNA를 포함한다. 한 양태에서, 이러한 억제성/간섭 RNA는 소형 억제성/간섭 RNA (siRNA)이다. 예를 들어, siRNA를 포함하는 DSCR1 조정제는 GCUCAGACCUUACACAUAG, GGACAUCACCUUUCAGUAU, GAAAGAAUGAGGAGACCUA 및 GACAUCACCUUUCAGUAUU로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, siRNA를 포함하는 DSCR1 조정제는 AACGUAUGACAAGGACAUCAC, AAGGACAUCACCUUUCAGUAU, AAGUUAUAUUUUGCUCAGACC 및 AAGAUGCGACCCCAGUCAUAA로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다. 한 양태에서, siRNA를 포함하는 DSCR1 조정제는 GCUCAGACCUUACACAUAG, GGACAUCACCUUUCAGUAU, GAAAGAAUGAGGAGACCUA, GACAUCACCUUUCAGUAUU, AACGUAUGACAAGGACAUCAC, AAGGACAUCACCUUUCAGUAU, AAGUUAUAUUUUGCUCAGACC 및 AAGAUGCGACCCCAGUCAUAA로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 서열을 포함한다.
한 양태에서, 상기 핵산은 앱타머 (aptamer)를 포함한다.
한 양태에서, 본 발명의 DSCR1 조정제는 항체를 포함한다. 한 양태에서, 이러한 항체는 이것이 표적 내피 세포 내로 유입되어 이러한 세포 중의 DSCR1을 억제하도록 투여되는데, 즉 상기 항체는 내재화된다. 또 다른 양태에서, 상기 항체는 표적 내피 세포 내로 도입되는 (예를 들어, 형질감염되는) 핵산에 의해 암호화된다.
한 국면에서, 본 발명은 내피 세포와 연합된 염증과 관련된 각종 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 한 국면에서 본 발명은 유효량의 본 발명의 DSCR1 조정제를 대상체에게 투여하여 비정상적인 혈관 염증과 연관된 장애를 치료하는 것을 포함하는, 비정상적인 혈관 염증과 연관된 장애의 치료 방법을 제공한다. 한 양태에서, 본 발명의 조정제는 혈관계와 연관된 염증을 증가시킨다. 한 양태에서, 본 발명의 조정제는 혈관계와 연관된 염증을 억제시킨다.
한 국면에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 DSCR1 조정제를 대상체에게 투여하여 비정상적인 혈관 염증과 연관된 면역학적 장애를 치료하는 것을 포함하는, 비정상적인 혈관 염증과 연관된 면역학적 장애의 치료 방법을 제공한다. 한 양태에서, 본 발명의 조정제는 혈관계와 연관된 염증을 증가시킨다. 한 양태에서, 본 발명의 조정제는 혈관계와 연관된 염증을 억제시킨다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 DSCR1 조정제를 대상체에게 투여하여 혈관 완전성의 교란과 연관된 장애를 치료하는 것을 포함하는, 혈관 완전성의 교란과 연관된 장애의 치료 방법을 제공한다. 한 양태에서, 혈관 완전성의 교란은 혈관/내피 세포-관련 염증과 연관이 있는데, 예를 들어 바람직하지 못하게 높거나 낮은 양의 혈관/내피 세포-관련 염증이 존재한다. 한 양태에서, 본 발명의 조정제는 혈관계와 연관된 염증을 증가시킨다. 한 양태에서, 본 발명의 조정제는 혈관계와 연관된 염증을 억제시킨다.
한 국면에서, 본 발명은 본 발명의 DSCR1 조정제를 소염 요법과 연계해서 대상체에게 투여하여 소염 요법과 연관된 부작용을 개선시키는 것을 포함하는, 소염 요법과 연관된 부작용의 개선 방법을 제공한다. 한 양태에서, DSCR1 조정제는 내피 세포에서의 DSCR1 활성을 억제시킨다. 한 양태에서, 소염 요법은 염증을 저해 시키는 작용제를 포함하는데, 예를 들어 이러한 작용제는 면역 세포 활성을 억제할 수 있다. 한 양태에서, 상기 작용제는 시클로스포린 부류의 염증 저해제, 예를 들어 시클로스포린 A (CsA)이다. 한 양태에서, 본 발명의 조정제는 혈관계와 연관된 염증을 증가시킨다. 한 양태에서, 본 발명의 조정제는 혈관계와 연관된 염증을 억제시킨다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 항혈관형성제와 본 발명의 DSCR1 조정제를 바람직하지 못한 혈관형성과 연관된 장애 (예: 암)가 있는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 이러한 바람직하지 못한 혈관형성과 연관된 장애 (예: 암)의 치료 방법을 제공한다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 유효량의 항암제와 유효량의 본 발명의 DSCR1 조정제를 종양 또는 암 세포에 투여하는 것을 포함하며, 여기서 병용 유효량은 종양 성장 또는 암 세포의 성장을 억제시키는 것인, 종양 성장 또는 암 세포 성장의 억제 방법을 제공한다.
한 양태에서, 항암제는 항혈관형성제, 예를 들어 VEGF 길항제를 포함한다. 한 양태에서, VEGF 길항제는 항-VEGF 항체이다. 한 양태에서, 항-VEGF 항체는 항체 A4.6.1 또는 그의 친화성 성숙된 변이체의 항원 결합성 서열을 포함한다. 한 양태에서, 이러한 항원 결합성 서열은 항체 A4.6.1 또는 그의 친화성 성숙된 변이체의 중쇄의 초가변 영역 중의 적어도 1개, 2개 또는 3개를 포함한다. 한 양태에서, 상기 항원 결합성 서열은 항체 A4.6.1 또는 그의 친화성 성숙된 변이체의 경쇄의 초가변 영역 중의 적어도 1개, 2개 또는 3개를 포함한다. 한 양태에서, 상기 항원 결합성 서열은 항체 A4.6.1 또는 그의 친화성 성숙된 변이체의 중쇄 가변 도메인의 인간화 형태를 포함한다. 한 양태에서, 상기 항원 결합성 서열은 항체 A4.6.1 또는 그의 친화성 성숙된 변이체의 경쇄 가변 도메인의 인간화 형태를 포함한다. 항체 A4.6.1은 ATCC 기탁 번호 HB 10709 (American Type Culture Collection, Manassas, VA) 하에 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 항-VEGF 항체이다. 한 양태에서, 항-VEGF 항체는 베바시주마브 (bevacizumab)이다. 한 양태에서, 항-VEGF 항체는 베바시주마브와 동일한 에피토프의 인간 VEGF와 결합하는 항체이다. 한 양태에서, 항-VEGF 항체는 인간 VEGF와의 결합을 놓고 베바시주마브와 경쟁하는 항체이다. 한 양태에서, 항-VEGF 항체는 VEGF의 수용체, 예를 들어 VEGFR2와 결합한다. 이들 방법의 한 양태에서, 본 발명의 DSCR1 조정제는 항암제 (예: 화학요법제)와 연계해서 대상체에게 투여한다. 한 양태에서, 본 발명의 DSCR1 조정제는 혈관 완전성의 교란과 연관된 부작용을 억제시켜 준다. 예를 들어, 혈관 완전성의 교란은 혈전용해와 연관이 있을 수 있다.
한 국면에서, 본 발명은 혈관형성을 유도시키는 작용제의 유효량과 DSCR1 조정제의 유효량을 특정 장애가 있는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 혈관형성을 증강시킴으로써 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 한 양태에서, 혈관형성을 유도시키는 작용제는 프로-혈관형성 물질, 예를 들어 본원에 기재된 혈관형성성 인자 중의 하나 이상을 포함한다. 한 양태에서는, 혈관형성성 인자가 VEGF이다. 한 양태에서, DSCR1 조정제는 혈관 완전성의 교란을 억제한다. 상기 방법에 의해 치료될 수 있는 장애에는 본원에 기재된 모든 장애, 예를 들어 상처, 허혈증, 심혈관 계 질환, 아테롬성 경화증, 혈관염 등이 포함된다.
한 국면에서, 본 발명은 내피 세포를 DSCR1 조정제와 접촉시키는 것을 포함하는, 이러한 내피 세포의 생존을 조정하는 방법을 제공한다. 한 양태에서, 내피 세포는 활성화된다. 한 양태에서, 내피 세포는 DSCR1 안티센스 서열을 암호화하는 발현 벡터로 형질감염시킨다. 한 양태에서, 내피 세포는 DSCR1 센스 서열을 암호화하는 발현 벡터로 형질감염시킨다. 한 양태에서, DSCR1 조정제는 억제성/간섭 RNA를 포함하고, 이는 한 양태에서 소형 간섭 RNA (siRNA)이다.
본 발명의 DSCR1 조정제를 또 다른 치료제와 연계해서 투여하는 본 발명의 방법에서, 상기 또 다른 치료제의 투여 타이밍과 비교해서 본 발명의 DSCR1 조정제의 투여 타이밍은 실험적으로 및/또는 임상적으로 치료상 이득이 될 것으로 추정되는 시기일 것이다. 예를 들어, 한 양태에서 DSCR1 조정제는 또 다른 치료제를 투여하기에 앞서 투여한다. 한 양태에서, DSCR1 조정제는 또 다른 치료제의 투여에 이어 투여한다. 또 다른 양태에서, DSCR1 조정제는 또 다른 치료제의 투여와 동시에 투여한다. 한 양태에서, 또 다른 치료제는 소염 활성을 지니고 있다. 한 양태에서, 두 작용제는 별개의 조성물로서 투여한다. 한 양태에서, 두 작용제는 단일 조성물로서 투여한다.
한 국면에서, 본 발명은 특정 조직 또는 세포 중에서의 DSCR1 발현 또는 활성 양을 측정하고, 이러한 양을 정상적인 대응물 조직 또는 세포 중에서의 DSCR1 발현 또는 활성 양과 비교하는 것을 포함하는 (이러한 양에 있어서의 차이가 부작용 발생 위험의 지표이다), 혈관형성의 조정을 포함하는 장애 치료와 연관된 부작 용이 발생할 위험이 있는 대상체를 확인 (동정)하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 이러한 부작용은 염증과 연관된 혈관 완전성의 교란 때문이다. 상기 확인 방법은 임상 간섭 과정 동안의 편리하고/하거나 유리한 어떠한 시점에서도 실시할 수 있다. 예를 들어, 이는 문제의 장애를 치료하기 위해 치료제를 투여하기 전, 동안 또는 후에 일어날 수 있다.
한 국면에서, 본 발명은 후보 물질을 DSCR1 (또는 다음에 정의되는 바와 같은 그의 기능적 변이체)과 접촉시키고, 이러한 후보 물질의 존재 및 부재 하에서의 DSCR1 (또는 그의 기능적 변이체)의 양을 결정하는 것을 포함하는 [후보 물질의 존재 및 부재 하에서의 DSCR1 (또는 그의 기능적 변이체)의 양에 있어 차이가 있는 것은 후보 물질이 DSCR1 조정제라는 지표이다], DSCR1 조정제 (예: 혈관 완전성/혈관 염증 상의 교란을 조정하는데 유용한 분자)를 확인하는 방법을 제공한다. DSCR1 양은 당해 분야에 공지된 적합한 모든 정성적 또는 정량적 측정에 의해 결정할 수 있다. 예를 들어, DSCR1 양은 RNA 또는 단백질의 수준으로써 표시될 수 있다. 또 다른 예에서, DSCR1 양은 DSCR1 활성 (예: CnA의 억제)으로써 표시될 수 있다. 본 발명의 방법은 DSCR1 길항제 또는 작동제를 확인하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들어, 한 양태에서 DSCR1 양은 후보 물질의 존재 하에서 더 적다. 또 다른 양태에서, DSCR1 양은 후보 물질의 존재 하에서 더 많다. 본 발명의 방법에 의해 확인된 조정제는 본 발명의 방법에 사용하기 위해 요구되는 특징들 중의 어느 것도 지닐 수 있다. 예를 들어, 내피 세포와 연관된 염증 및/또는 혈관 완전성을 조정할 수 있는 후보물을 선택할 수 있다. 또 다른 한편으론, 후보 물질을 부가적 으로 평가하여 특정의 바람직하지 못한 특징이 결여된 물질을 선별할 수 있다. 예를 들어, 내피 세포 증식을 실질적으로 조정하지 않는 후보 물질을 선택할 수 있다.
상기 인지된 바와 같이, 본 발명의 DSCR1 조정제 및 방법은 혈관 완전성의 부적절한 조절과 연관되는 것으로 추정되거나 또는 이와 연관되는 것으로 공지된 각종 장애를 치료하는데 유용하다. 예를 들어, 이들 장애에는 혈관성 (예를 들어, 심혈관성), 내피, 혈관형성성 (예: 종양/암) 또는 면역학적 (예: 자가면역) 범주 내의 장애가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 그럼에도 불구하고, 몇몇 양태에서 이들 장애는 심혈관성 또는 면역학적 장애가 아니다. 몇몇 양태에서, 이들 장애는 내피 또는 혈관형성성 장애가 아니다. 기타 양태에서, 상기 장애는 조직 염증 (급성 또는 만성)과 연관이 있는데, 예를 들면 자가면역 질환이다. 몇몇 질환은 2가지 이상 범주의 장애 간에 중복되는 특징을 지닐 수도 있다는 것을 인지해야 한다.
일반적으로, 본 발명은 면역 매개된 장애을 치료하는데 유용한 조정제 분자 및 방법을 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 자가면역 질환, 예를 들어 본원에 나타낸 바와 같은 자가면역 질환을 치료하는 것에 관한 것이다. 한 양태에서, 장애는 이식편 거부 또는 이식편 대 숙주 질환에 관한 것이다.
특정 장애를 치료하기 위해 혈관형성/신생혈관증식을 증진시키는 것을 포함하는 본 발명의 치료 방법의 몇몇 양태에서, 상기 장애에는, 예를 들어 혈관 외상, 상처, 열상, 절개, 화상, 궤양 (예: 당뇨병성 궤양, 압력 궤양, 혈우병성 궤양, 정 맥류성 궤양), 조직 성장, 체중 증가, 말초 동맥 질환, 분만 유도, 모발 성장, 수포성 표피박리증, 망막 위축, 뼈 골절, 뼈 척수 융합, 반월판 열창 등이 포함될 수 있지만, 그에 제한되지 않는다.
임상적으로 적당하거나 요망되는 경우, 본 발명의 방법은 부가의 처치 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 한 양태에서 상기 방법은 표적화 세포 및/또는 조직 (예: 암 세포)을 방사선 처치 또는 화학요법제에 노출시키는 단계를 추가로 포함한다.
한 국면에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 DSCR1 조정제와 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 양태에서, 상기 담체는 제약상 허용 가능하다.
한 국면에서, 본 발명은 본 발명의 DSCR1 조정제를 암호화하는 핵산을 제공한다. 한 양태에서, 본 발명의 핵산은 폴리펩티드 (예: 올리고펩티드)이거나 이를 포함하는 DSCR1 조정제를 암호화한다. 한 양태에서, 본 발명의 핵산은 항체 또는 그의 단편이거나 이를 포함하는 DSCR1 조정제를 암호화한다. 한 양태에서, 본 발명의 핵산은 DSCR1 발현/활성 (예: DSCR1 유전자 전사 또는 DSCR1 단백질의 해독)을 억제하는 핵산 서열을 암호화한다.
한 국면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
한 국면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 벡터는 어떠한 형태일 수 있는데, 예를 들어 재조합 벡터 (예: 발현 벡터)일 수 있다. 각종 숙주 세포를 사용할 수도 있다. 한 양태에서, 숙주 세포는 원핵성 세포, 예를 들어 이. 콜라이 (E. coli)이다. 한 양태에서, 숙주 세포는 진 핵성 세포, 예를 들어 포유류 세포 [예: 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포]이다. 한 양태에서, 본 발명의 핵산 또는 벡터는 내피 세포에서 발현된다.
한 국면에서, 본 발명은 본 발명의 DSCR1 조정제를 제조하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 적합한 숙주 세포에서 특정 항체 (또는 그의 단편)를 암호화하는 본 발명의 재조합 벡터를 발현시키고, 이러한 항체 (또는 그의 단편)를 회수하는 것을 포함하는, 상기 항체 (또는 그의 단편)이거나 또는 이를 포함하는 DSCR1 조정제를 제조하는 방법을 제공한다. 또 다른 예에서, 본 발명은 적합한 숙주 세포에서 특정 폴리펩티드 (예: 올리고펩티드)를 암호화하는 본 발명의 재조합 벡터를 발현시키고, 이러한 폴리펩티드 (예: 올리고펩티드)를 회수하는 것을 포함하는, 상기 폴리펩티드 (예: 올리고펩티드)이거나 또는 이를 포함하는 DSCR1 조정제를 제조하는 방법을 제공한다.
한 국면에서, 본 발명은 특정 용기와, 이러한 용기 내에 본 발명의 하나 이상의 DSCR1 조정제를 포함하는 조성물을 포함하는 제조품을 제공한다. 한 양태에서, 상기 조성물은 본 발명의 핵산을 포함한다. 한 양태에서, DSCR1 조정제를 포함하는 조성물은 담체를 추가로 포함하는데, 몇몇 양태에서는 이러한 담체가 제약상 허용 가능하다. 한 양태에서, 본 발명의 제조품은 본원에 표시된 장애를 치료하기 위해 상기 조성물 (예: DSCR1 조정제)를 투여하는 것에 관한 지시 사항을 추가로 포함한다.
한 국면에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 DSCR1 조정제를 포함하는 조성물을 포함하는 제1 용기와, 완충제를 포함하는 제2 용기를 포함하는 키트를 제공 한다. 한 양태에서는, 상기 완충제가 제약상 허용 가능하다. 한 양태에서, DSCR1 조정제를 포함하는 조성물이 담체를 추가로 포함하는데, 몇몇 양태에서는 이러한 담체가 제약상 허용 가능하다. 한 양태에서, 키트는 본원에 표시된 장애를 치료하기 위해 상기 조성물 (예: DSCR1 조정제)를 투여하는 것에 관한 지시 사항을 추가로 포함한다.
도 1. 유전자콜 (GeneCall) 기술 및 RT-PCR을 이용한 유전자 발현 분석. (A) 일차 HUVEC를 혈청 무함유 배지, 또는 VEGF 또는 5% FCS로 보충시킨 혈청 무함유 배지에 각각 0, 6, 또는 24시간 동안 노출시켰다. 내피 세포를 용해시키고, 총 RNA를 분리한 다음, 유전자콜링을 이용함으로써 유전자 발현에 대해 분석하였다. 각 칼럼은 서로 비교한 일련의 2상 비교물의 산출(량)을 나타낸다. 그러나, "P" (P = 중독) 또는 "I" (I = 분리, 클로닝, 서열 분석 및 중독)이 표시된 유전자를 확인하였다. 도시된 선별된 유전자는 6시간 및 24시간 째에 VEGF에 의해 유도된 것으로 밝혀졌지만, 5% FCS에 의한 자극에 의해서는 그렇치 못하였으며; VEGF에 의한 자극 배수는 각 박스 내의 숫자로써 표시된다. 회색 박스는 6 및 24시간 째의 혈청 대 무혈청에 대한 2상 비교물 중의 유전자에 대해서는 발현 상의 변화가 전혀 관찰되지 않았다는 것을 나타낸다. 확대된 소영상 내의 수직 블랙 막대는 신뢰 수준의 유전자 콜을 나타낸다. (B) 실시간 PCR에 의한 DSCR1 발현 분석21. HUVEC를 혈청 무함유 조건에서 유지시키고, 표시된 시간 동안 5% FCS, b-FGF (10 ng/mL), VEGF (30 ng/mL), PIGF (100 ng/mL), VEGFRl-sel (100 ng/mL), 또는 VEGFR2-sel (30 ng/mL)로 자극하였다. 사용된 돌연변이체 단백질은 VEGFR2-sel (KDR-선택적): VEGF D63S/G65M/L66R 및 Flt-선택적 VEGF I43A/I46A/Q79A/I83이었다25. (C) 실시간 PCR에 의한 DSCR1 발현 분석. HPAECs, HDMECs, 및 HUAECs를 0.5% FCS (NA)의 존재 하에, 또는 VEGFRl (VEGFRl-sel, 100 ng/mL) 또는 VEGFR2 (VEGFR2-sel, 30 ng/mL)26와 결합하는 VEGF 돌연변이체 형태 또는 VEGF (30 ng/mL) 및 0.5% FCS의 존재 하에 4시간 (■), 8시간 (▒) 및 24시간 (□) 동안 항온 배양하였다. 대조군 세포로서, HUPASMCs를 사용하였는데, 이는 상당한 수준의 VEGF 수용체를 발현하지 않는다 (데이터는 제시되지 않음). 제시된 데이터는 총 3가지 독립적인 실험 중에서 대표적인 한 가지 실험 샘플을 세 번 되풀이 한 평균치±SD를 나타낸다. 상대적 RNA 단위 (RRU)는 기준 유전자로서 시클로필린 (cyclophylin)을 사용함으로써 문헌 [참고: Gerber et al3]에 기재된 바와 같이 계산하였다. (D) 실시간 PCR에 의한 DSCR1 발현 분석. HUVEC를 CsA (1 μM)의 존재 하에 2시간 동안 항온 배양한 후, 표시된 바와 같이 VEGF (30 ng/mL), VEGFR2-sel (30 ng/mL), VEGFRl-sel (100 ng/mL), PMA (200 ng/mL), 및 IO (5 μM), 탑시가르긴 (thapsigargin) (50 nM) 또는 TNF-α (10 ng/mL)로 5.5시간 동안 자극하였다. 제시된 데이터는 총 2가지 독립적인 실험 중에서 대표적인 한 가지 실험 샘플을 나란히 두 번 되풀이 하여 수행한 평균치±SD를 나타낸다. (E) 표시된 바와 같이 5시간 동안 0% 혈청, 0.5% BSA 및 5% FCS, hVEGF (30 ng/mL), b-FGF (10 ng/mL), TNF-α (10 ng/mL) 및 PMA 또는 이오노마이 신 (ionomycine) (IO)에서 성장시킨 HUVEC의 완전 세포 추출물의 웨스턴 블롯 분석. 대조군으로서, 100 ng 재조합 DSCR1 단백질을 포함시켰다.
도 2. DSCR1 및 NFATc1 인산화의 세포성 국재. (A) Ad-DSCR1-FLAG 또는 대조군 Ad-LacZ (MOI = 100)으로 형질도입시키고 VEGF (30 ng/mL)에 노출시킨 HUVEC의 IHC 분석. VEGF에 의해 자극한지 20분 후에, 세포를 고정시키고 NFATc1의 세포성 국재를 분석하였다. (B) NFATc1 인산화의 웨스턴 블롯 분석. HUVEC를 표시된 아데노바이러스성 벡터 (MOI = 100)으로 형질도입시키거나 또는 형질도입용 배지에만 노출시켰다 (NA). 형질도입시킨지 2일 후에, CsA (1 μM)를 세포에 가하고 2시간 후에, 세포를 PMA (200 ng/mL)/IO (5 μM)로 4시간 동안 자극시켰다. 총 세포 추출물을 대상으로 하여, 인산화 상태와 독립적으로 NFATc1을 인식하는 항-NFATc1 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅 분석을 수행하였다. 제시된 데이터는 총 3가지 실험 중에서 대표적인 1가지 실험으로부터의 것이다.
도 3. DSCR1은 활성화 내피 세포 내에서의 NFAT의 전사 활성을 방해한다. (A) C-말단적 에피토프 태그화 버젼의 DSCR1 (DSCR1-FLAG)를 암호화하는 CMV-구동된 발현 벡터 또는 등량의 빈 (empty) 벡터를 포함한 혼합물로 형질감염시킨 HUVEC의 루시퍼라제 리포터 (reporter) 유전자 분석. 루시퍼라제 리포터 구조물은 3개의 NFAT-결합 부위 (NFAT-Luc) 또는 AP1 (B) 결합 부위의 3개 카피를 각각 함유하였다. 형질감염시킨지 48시간 후, 세포를 PMA (200 ng/mL), 탑시가르긴 (50 nM), 또는 IO (5 μM)로 6시간 동안 자극시켰다. 세포를 용해시키고 리포터 유전자 발현에 관해 분석하였다. 제시된 데이터는 SV40-RL 활성과 비교한 루시퍼라제 활성 을 나타낸다. 데이터는 4가지 독립적인 실험 중에서 대표적인 한 가지 실험을 세 번 되풀이한 샘플의 평균치±SD를 나타낸다.
도 4. 활성화 내피 세포 상에서 DSCR1에 의한 염증성 마커 유전자 발현의 억제. (A) DSCR1 (Ad-DSCR1-FLAG) 또는 대조군 LacZ (Ad-LacZ)를 암호화하는 아데노바이러스성 벡터 (MOI = 100)로 형질도입시킨 HUVEC의 실시간 RT-PCR 분석. 형질도입한지 2일 후에, 세포를 성장 배지 단독과 함께, 또는 PMA (200 ng/mL) 및 IO (5 μM), VEGF (30 ng/mL), 탑시가르긴 (50 nM), 또는 표시된 바와 같은 그의 조합물로 보충시킨 성장 배지와 함께 5 내지 6시간 동안 항온 배양하였다. 총 RNA를 분리하고, Cox-2 (i), E-셀렉틴 (ii), 및 TF (iii)에 대한 수준을 실시간 RT-PCR 분석에 의해 분석하였다. 제시된 데이터는 총 3가지 독립적인 실험 중에서 대표적인 한 가지 실험을 세 번 되풀이한 샘플의 평균치±SD를 나타낸다. RRU는 기준 유전자로서 GAPDH를 사용함으로써 문헌 [참고: Gerber et al3]에 기재된 바와 같이 계산하였다. (B) 각종 화합물에 의해 자극된, 일시적으로 형질감염시킨 내피 세포의 FACS 분석. CsA (1 μM)을 형질도입시킨 세포에 가한 다음, 2시간 후에 세포를 PBS (NA), PMA (200 ng/mL), IO (5 μM), TNF-α (10 ng/mL), 또는 그의 조합물로 자극시켰다. 자극한지 24시간 후에, 세포를 25 mM EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산)/PBS에서 10분 동안 항온 배양함으로써 배양 디쉬로부터 꺼냈다. 세포를 대상으로 하여, E-셀렉틴, VCAM-1, TF, 및 ICAM-1의 발현에 대해 분석하였다. 크로마토그램 하의 백색 면적은 Ad-DSCR1로 형질도입시킨 세포 상의 발현 수준을 나타 내고; 회색 면적은 LacZ-형질도입시킨 세포 상의 발현 수준을 나타낸다. 제시된 데이터는 총 3가지 독립적인 실험 중에서 대표적인 한 가지 실험으로부터의 것이다. (C) Cox-2 및 TF 각각에 대한 HUVEC의 총 세포 추출물의 웨스턴 블롯팅 분석. 등가 부하를 제어하기 위해, 2γ-어댑틴 (adaptin)을 인식하는 항체를 사용하였다. 제시된 데이터는 3가지 독립적인 실험 중에서 대표적인 한 가지 실험으로부터의 것이다.
도 5. 내피 세포 상에서 VEGF에 의한 염증성 마커 유전자의 일시적 조절. (A) 표시된 시간 동안, 혈청 무함유 조건 하에서 유지시키고 VEGF (30 ng/mL)로 자극시켰거나, 또는 혈청 무함유 배지에서만 유지시킨 HUVEC의 실시간 RT-PCR 분석. 발현 수준을 알아보기 위한 TaqMan 분석을 수행하였다. 제시된 상대적 발현 수준은 VEGF의 존재 하에서의 유전자 발현의 RRU를 비-자극 수준으로 나눔으로써 생성시켰다. (B) CnA 신호 전달을 활성화하는 화합물 또는 VEGF에 의한 자극 후에 칼시네우린 신호 전달의 방해를 유발시키는 활성화 내피 세포에서 DSCR1에 의한 역조절성 피드백 루프를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 6. siRNA에 의한 내인성 DSCR1의 녹다운 (knock down)은 활성화 내피 세포에서의 NFAT 활성을 증강시켜 준다. (A) siRNA 및 PRKN-DSCR1-Flag 발현 벡터로 공동-형질감염시킨 HUVEC의 웨스턴 블롯 분석. 항-FLAG 항체를 사용하여 완전 세포 추출물을 분석하였다. (B) siDSCR1로 형질감염시킨 HUVEC를 대상으로 하여, 인간 DSCR1을 탐지하는 폴리클로날 항혈청을 사용함으로써 DSCR1의 내인성 수준에 대한 분석하였다. (C) NFAT 루시퍼라제 리포터 구조물 및 siRNA 표적화 DSCR1, NFATc1, 또는 대조군으로 일시적으로 형질감염시키고 IO/PMA (6시간) 또는 VEGF (D; 12시간)로 각각 자극시킨 후에 HUVEC로부터의 세포 추출물에서 NFAT 활성에 대한 루시퍼라제 리포터 유전자 검정. 제시된 데이터는 총 3가지 독립적인 실험 중에서 대표적인 한 가지 실험을 세 번 되풀이 하여 수행하여 수득한 것이다. 오차 막대 = SD. *P < .01, **P < .001 [si대조군과 siDSCR1 군을 비교함으로써 평방 편차 (ANOVA)의 분석을 사용함].
도 7. 내인성 DSCR1의 녹 다운은 활성화 내피 세포 상에 염증성 마커의 발현을 유도시킨다. (A) GFP 및 siDSCR1, siNFATcl, 또는 si대조군 siRNA를 암호화하는 발현 벡터로 일시적으로 공동-형질감염시킨 HUVEC의 FACS 분석. 세포를 PMA/IO으로 자극하거나 대조군 처치 (NA)한지 4시간 후에 GFP+ 세포 상에서 TF, VCAM-1, 및 E-셀렉틴의 세포 표면 발현에 대해 분석하였다. (B) VEGF로 자극시키고 TF (4시간), VCAM-1 (20시간) 및 E-셀렉틴 (20시간)의 발현에 대해 분석한, HUVEC의 FACS 분석. 제시된 데이터는 3가지 독립적인 실험 중에서 대표적인 한 가지 실험 결과에 상응한다.
도 8. DSCR1의 조정은 내피 세포의 생존에 영향을 미친다.
혈청 고갈, H2O2 노출 및 PMA/IO 처치를 포함한 스트레스 조건에 노출시킨 내피 세포에서의 Ad-DSCR1에 의한 DSCR1의 과발현은 내피 세포 사멸을 유도시키는데, 이는 DSCR1 안티센스 구조물의 발현에 의해 내인성 DSCR1이 감소되었기 때문이다. (A) 센스 또는 안티센스 DSCR1을 암호화하는 아데노바이러스성 구조물을 포함 하는 DSCR1 조정은 혈청 고갈시킨지 24시간 후에 일차 인간 내피 세포 (HUVEC)의 생존을 저하시켰다. (B) 센스 또는 안티센스 DSCR1을 암호화하는 아데노바이러스성 구조물을 포함하는 DSCR1 조정은 혈청 고갈시킨지 24시간 후에, 카스파제 억제제인 ZVAD의 존재 하에 일차 인간 내피 세포 (HUVEC)의 생존을 저하시켰다.
도 9. 인간 DSCR1의 아미노산 서열의 예시 양태 (서열 1).
발명의 실시 방식
본 발명은 내피 세포에서의 DSCR1을 조정함으로써 각종 장애를 치료하기 위한 방법, 조성물, 키트 및 제조품을 제공한다. 이들 방법, 조성물, 키트 및 제조품에 관한 상세 내역이 본원에 제공된다.
일반적인 기술
본 발명의 실시는 달리 표시되지 않는 한, 당해 분야의 기술 수준 내에 있는 통상적인 분자 생물학 기술 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은, 예를 들어 다음 문헌에 보다 상세히 설명되어 있다 [참고: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, and periodic updates); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., ed., 1994); "A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988)].
정의
본원에 사용된 바와 같은 용어 "혈관(성)" 또는 "혈관계", 및 그의 변수들은 포유류 체내 전반에 걸쳐 혈액 (림프액 포함)을 수반 (운반)하는 혈관계를 지칭한다.
"혈관"은 동맥, 세동맥, 모세혈관, 세정맥, 정맥, 동 및 맥관벽혈관을 포함한, 포유류 혈관계의 모든 관을 지칭한다. 본 발명의 한 국면에서, DSCR1 조정제는 혈액을 심근으로 공급하는 혈관성 도관 (혈관) 내로 직접 도입한다. 이러한 혈관성 도관에는 관상 동맥 뿐만 아니라 복재 정맥 (saphenous veins) 또는 내유 동맥 (internal mammary artery) 이식편과 같은 관이 포함된다. 한 양태에서, 혈관은 활성화 내피 세포를 포함한다.
"동맥"은 심장에서 나가는 혈액을 운반하는 혈관을 지칭한다. 관상 동맥은 심장 자체 조직 (특히, 심근)을 공급하는 반면, 기타 동맥은 나머지 신체 기관을 공급한다. 동맥의 일반적인 구조는 다층 동맥벽에 의해 둘러싸인 관강으로 이루어진다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "혈관형성"은 신생혈관증식을 가져다 주는 세포성 사건을 지칭하는데, 여기서는 혈관 내피 세포가 증식, 제거 및 재구성하여 기존의 혈관망으로부터 새로운 혈관을 형성한다. 혈관형성은 (1) 프로테아제의 방출 후 국부 발생지 (local venue)의 세포외 매트릭스의 분해; (2) 모세관 내피 세포의 증식; 및 (3) 혈관형성성 자극을 향한 모세세관의 이동을 포함하는 과정의 케스케이드이다 [참고: 예를 들어, Ferrara et al., Endocrine Rev. (1992), 13:18-32; Ferrara, Nature Reviews (2002), 2:795-803].
본원에 사용된 바와 같은 "혈관 완전성" 및 그의 변수들은 손상되지 않은 상태의 혈관계를 지칭하는데, 이러한 손상되지 않은 상태에는 분자들이 장벽의 두 구획/측면 사이로 자유롭게 이동하기 위한 장벽으로서 작용할 수 있는 혈관계의 정상적인 생리적 능력을 지니는 것이 포함된다. 보다 구체적으로 언급하면, 상기 두 구획/측면은 일반적으로, 혈관계 관강 및 관강외 공간 (이는 일반적으로 혈관계에 인접한 조직 및/또는 세포를 포함한다)에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 "혈관 완전성의 교란" 및 그의 변수들은 혈관 완전성에 대한 비정상적이고/이거나 바람직하지 못한 변화로 인해, 혈관계가 장벽의 두 구획 사이로 이동하기 위한 장벽으로서 작용할 수 없게 되는 것을 지칭한다. 예를 들어, 혈관계의 염증이 혈관 완전성의 교란과 연관된 통상적인 원인이다. 혈관 완전성의 교란은 한 가지 이상의 조직 및 세포성 질환의 형태로 그 징후를 나타낼 수 있는데, 이에는 내피 세포 괴사, 내피 세포 세포소멸, 내피에 대한 외상, 상해, 혈관 누출, 고혈압 및 혈관 손상과 관련된 질환이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 추가의 예에는 혈관 내피에 영향을 미치는 외상, 예를 들어 동물 (일반적으로 포유류) 또는 인간에게 적용되는 기관의 혈관망을 포함한 혈관에 대한 외상 (예: 상해)이 포함되며; 이러한 외상에는 상처, 절개, 및 궤양 (예: 당뇨병성 궤양), 및 혈관/내피 세포의 상처 또는 열상이 포함될 것이다. 외상에는 내부 사건에 의해 야기된 질환 뿐만 아니라 외부 인자 (예: 병원체)에 의해 야기된 질환이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 "혈관 완전성의 교란과 연관된 장애", "비정상적인 혈관 염증과 연관된 장애" 및 그의 변수들은 일반적으로, 혈관 완전성의 교란 및/또는 비정상적인 혈관 염증과 연관되는 것으로 여겨지고/지거나 공지된 병리학적 질환을 지칭한다. 이들 장애에는 혈관성 (심혈관성) 장애, 내피 세포 장애, 혈관형성성 장애 (예: 암) 및 면역학적 장애 (에: 자가면역 질환을 포함한 염증성 장애)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 이들 장애에는 혈관형성의 조절이상과 연관된 병리학적 질환이 포함된다. 본 발명의 조정제 분자 및 방법에 의해 치료될 수 있는 장애에는 바람직하지 못하거나 이상한 비대증, 관절염, 류마티스성 관절염 (RA), 건선, 건선성 플라크, 사르코이드증 (sarcoidosis), 아테롬성 경화증, 아테롬성 경화성 플라크, 심근 경색으로부터의 부종, 당뇨병성 및 기타 증식성 망막병증 (미숙아 망막병증 포함), 후수정체 섬유증식증, 신생혈관성 녹내장, 연령 관련 황반 변성, 당뇨병성 황반 부종, 각막 신생혈관증식, 각막 이식편 신생혈관증식, 각막 이식편 거부, 망막/융모막 신생혈관증식, 전방각 신생혈관증식 (홍색증), 안구 신생혈관 질환, 혈관성 재발 협착증, 동정맥 기형 (AVM), 수막종, 혈관종, 혈관섬유종, 갑상선 과형성 [그레이브스병 (Grave's disease) 포함], 각막 및 기타 조직 이식, 만성 염증, 폐 염증, 급성 폐 손상/ARDS, 패혈증, 고혈압 (예: 원발성 폐 고혈압), 악성 폐 삼출, 뇌 부종 (예: 급성 발작/폐쇄성 두부 손상/외상과 연관된 부종), 활막 염증, RA에서의 판누스 (pannus) 형성, 골화성 근육염, 비대성 뼈 형성, 골관절염 (OA), 난치성 복수, 다낭성 난소 질환, 자궁내막증, 제3 유체 공간형성 질환 (췌장염, 구획 증후군, 화상, 장 질환), 자궁 근종, 조산, 만성 염증, 예를 들어 IBD [크론병 (Crohn's disease) 및 궤양성 결장염], 신 동종이식편 거부, 염증성 장 질환, 신 증후군, 바람직하지 못하거나 이상한 조직 덩어리 성장 (비-암), 비만, 지방 조직 덩어리 성장, 혈우병성 관절, 비대성 흉터, 모발 성장 억제, 오슬러-웨버 (Osler-Weber) 증후군, 화농성 육아종 후수정체 섬유증식증, 피부 경화증, 트라코마 (trachoma), 혈관 부착, 활막염, 피부염, 자간전증, 복수, 심낭 삼출 (예를 들어, 심막염과 연관된 삼출), 흉막 삼출, 위장 궤양, 만성 기도 염증 및 혈관염이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
혈관형성의 조절이상은 본 발명의 조성물 및 방법에 의해 치료할 수 있는 많은 장애를 유발시킬 수 있다. 이들 장애에는 비-종양성 및 종양성 질환 둘 다가 포함된다. 종양성 질환에는 상기 언급된 질환이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 비-종양성 질환에는 바람직하지 못하거나 이상한 비대증, 관절염, 류마티스성 관절염 (RA), 건선, 건선성 플라크, 사르코이드증, 아테롬성 경화증, 아테롬성 경화성 플라크, 당뇨병성 및 기타 증식성 망막병증 (미숙아 망막병증 포함), 후수정체 섬유증식증, 신생혈관성 녹내장, 연령 관련 황반 변성, 당뇨병성 황반 부종, 각막 신생혈관증식, 각막 이식편 신생혈관증식, 각막 이식편 거부, 망막/융모막 신생혈관증식, 전방각 신생혈관증식 (홍색증), 안과 신생혈관 질환, 혈관성 재발 협착증, 동정맥 기형 (AVM), 수막종, 혈관종, 혈관섬유종, 갑상선 과형성 [그레이브스병 포함], 각막 및 기타 조직 이식, 만성 염증, 폐 염증, 급성 폐 손상/ARDS, 패혈증, 원발성 폐 고혈압, 악성 폐 삼출, 뇌 부종 (예: 급성 발작/폐쇄성 두부 손상/외상과 연관된 부종), 활막 염증, RA에서의 판누스 형성, 골화성 근육염, 비대성 뼈 형성, 골관절염 (OA), 난치성 복수, 다낭성 난소 질환, 자궁내막증, 제3 유체 공간형성 질환 (췌장염, 구획 증후군, 화상, 장 질환), 자궁 근종, 조산, 만성 염증, 예를 들어 IBD [크론병 및 궤양성 결장염], 신 동종이식편 거부, 염증성 장 질환, 신 증후군, 바람직하지 못하거나 이상한 조직 덩어리 성장 (비-암), 혈우병성 관절, 비대성 흉터, 모발 성장 억제, 오슬러-웨버 증후군, 화농성 육아종 후수정체 섬유증식증, 피부 경화증, 트라코마, 혈관 부착, 활막염, 피부염, 자간전증, 복수, 심낭 삼출 (예를 들어, 심막염과 연관된 삼출), 및 흉막 삼출이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
"장애"는 본 발명의 DSCR1 조정제 및/또는 방법을 이용한 처치 (치료)로부터 이득을 얻을 수 있는 모든 질환이다. 이에는 만성 및 급성 장애 또는 질병 (포유류가 문제의 장애에 걸리기 쉬운 병리학적 질환 포함)이 포함된다. 본원에서 치료하고자 하는 장애의 비-제한적 예에는 악성 및 양성 종양; 비-백혈병 및 림프계 악성 종양; 신경원성, 신경교성, 성상세포성, 시상하부 및 기타 선상, 대식세포성, 상피성, 간질성 및 포배강성 장애; 및 염증성 (예: 자가면역), 혈관형성 및 면역학적 장애가 포함된다.
본원에서의 "자가면역 질환"은 개개인 자신의 조직으로부터 유발되어 자신의 조직에 대항하여 유도된 비-악성 질환 또는 장애이다. 본원에서의 자가면역 질환에는 구체적으로, 악성 또는 암성 질병 또는 질환이 배제되고, 특히 B 세포 림프종, 급성 림프아구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 모발 세포 백혈병 및 만성 골수아구성 백혈병이 배제된다. 자가면역 질환 또는 장애의 예에는 염증 반응, 예를 들어 염증성 피부 질환, 예를 들면, 건선 및 피부염 (예: 아토피성 피부염); 전신성 피부 경화증 및 경화증; 염증성 장 질환 (예: 크론병 및 궤양성 결장염)과 연관된 반응; 호흡 곤란 증후군 (성인 호흡 곤란 증후군; ARDS 포함); 피부염; 수막염; 뇌염; 포도막염; 결장염; 사구체신염; 알레르기성 질환, 예를 들어 습진 및 천식, 및 T 세포 침윤과 만성 염증 반응과 관련된 기타 질환; 아테롬성 경화증; 백혈구 부착 결핍증; 류마티스성 관절염; 전신성 홍반성 루푸스 (SLE); 당뇨병 (예: 유형 I 당뇨병 또는 인슐린 의존성 당뇨병); 다발성 경화증; 레이노이드 (Reynaud) 증후군; 자가면역성 갑상선염; 알레르기성 뇌척수염; 쇼그렌 증후군 (Sjogren's syndrome); 유년성 발병 당뇨병; 및 결핵, 사르코이드증 , 다발성 근염, 육아종증 및 혈관염에서 전형적으로 발견되는 사이토킨 및 T-림프구에 의해 매개된 급성 및 지연형 과민증과 연관된 면역 반응; 악성 빈혈 [애디송병 (Addison's disease)]; 백혈구 누출과 관련된 질환; 중추 신경계 (CNS) 염증 장애; 다발성 기관 손상 증후군; 용혈성 빈혈 [한랭글로불린혈증 또는 쿠움스 (Coombs) 양성 빈혈 포함]; 중증 근무력증; 항원-항체 복합체 매개된 질환; 항-사구체 기저막 질환; 항-인지질 증후군; 알레르기성 신경염; 그레이브스병; 람버트-이튼 (Lambert-Eaton) 근무력증 증후군; 수포성 유사천포창; 천포창; 자가면역성 다발성 내분비병증; 라이터병 (Reiter's disease); 근육강직 증후군; 베체트병 (Behcet disease); 거세포성 동맥염; 면역 복합 신염; IgA 신병증; IgM 다발신경병증; 면역 혈소판감소성 자반증 (ITP) 또는 자가면역성 저혈소판증 등이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 "혈관형성성 인자" 또는 "혈관형성제"는 혈관 발생을 자극하는, 예를 들어 혈관형성, 내피 세포 성장, 혈관 안정성, 및/또는 혈관생성 등을 증진시키는 분자이다. 한 양태에서, 본 발명의 청구 범위에서 지칭된 혈관형성성 인자는 VEGF 및 VEGF 계열 구성원 (A, B, C, D, 및 E)이다. 한 양태에서, 본 발명의 청구 범위에서 지칭된 혈관형성성 인자는 PIGF 및/또는 PDGF 계열 구성원이다. 한 양태에서, 본 발명의 청구 범위에서 지칭된 혈관형성성 인자는 TIE 리간드 (안지오포이에틴: Angiopoietins)이다. 한 양태에서, 본 발명의 청구 범위에서 지칭된 혈관형성성 인자는 에프린 (ephrin)이다. 한 양태에서, 본 발명의 청구 범위에서 지칭된 혈관형성성 인자는 상처 치유를 촉진시켜 주는 인자인데, 이에는 성장 호르몬, 인슐린-유사 성장 인자-I (IGF-I), VIGF, 표피 성장 인자 (EGF), CTGF 및 그의 계열 구성원, 및 TGF-α 및 TGF-β가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다 [참고: 예를 들어, Klagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991); Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12): 1359-1364 (1999); Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (e.g., Table 1 listing known angiogenic factors); and Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)].
본원에 사용된 바와 같은 "부작용" 또는 그의 변수들은 특정 장애 치료가 진행되고 있는 대상체에서 측정 가능하고/하거나 관찰 가능한 임상적, 의학적, 신체적, 생리적 및/또는 생화학적 효과를 지칭하는데, 이러한 효과는 의도한 치료 결과의 일부가 아니다. 일반적으로, 상기 효과는 치료받는 대상체의 건강 및/또는 위안 상태, 치료받는 대상체에 대한 건강 상의 위험, 및/또는 치료받는 대상체에 대한 치료의 내성 측면에서 보면 바람직하지 못하다.
상기 언급된 바와 같이, 본원에 기재된 염증 질환 (예: 자가면역 질환 또는 자가면역 관련 질환)을 치료하는데 있어서, 특정 대상체를 예를 들어, 다중 약물 섭생에서와 같이 제2 치료제, 예를 들면 면역억제제 (즉, 소염제)와 연계해서 본 발명의 DSCR1 조정제로 치료할 수 있다. 이러한 DSCR1 조정제는 면역억제제와 동시에, 순차적으로 또는 교대로 투여할 수 있다. 면역억제제는 당해 분야에 제시된 바와 동일하거나 그 보다 적은 투여량으로 투여할 수 있다. 바람직한 보조 면역억제제는 치료받고자 하는 장애의 유형 뿐만 아니라 환자의 병력을 포함한 많은 요인들에 의해 좌우될 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 "면역억제제"는 환자의 면역계 및/또는 염증 반응을 억제하거나 은폐시키는 작용을 하는 물질을 지칭한다. 이러한 작용제에는 사이토킨 생성을 억제하거나, 자기 항원 발현을 하향 조절 또는 억제시키거나, 또는 MHC 항원을 은폐시키는 물질이 포함될 것이다. 이러한 작용제의 예에는 스테로이드, 예를 들어 글루코코르티코스테로이드, 예를 들면, 프레드니손, 메틸프레드니솔론 및 덱사메타손; 2-아미노-6-아릴-5-치환된 피리미딘 [참고: 미국 특허 제4,664,077호], 아자티오프린 (또는 아자티오프린에 대한 부작용이 있는 경우에는, 시클로포스파미드); 브로모크립틴; 글루타르알데히드 (이는 미국 특허 제4,120,649호에 기재된 바와 같이, MHC 항원을 은폐시킨다); MHC 항원 및 MHC 단편에 대한 항-개체특이형 (idiotypic) 항체; 시클로스포린 A; 사이토킨 또는 사이토킨 수용체 길항제 (항-인터페론-γ, -β 또는 -α 항체 포함); 항종양 괴사 인자-α 항체; 항종양 괴사 인자-β 항체; 항-인터루킨-2 항체 및 항-IL-2 수용체 항체; 항-L3T4 항체; 이종 항-림프구 글로불린; 범 (pan)-T 항체, 바람직하게는 항-CD3 또는 항-CD4/CD4a 항체; LFA-3 결합성 도메인을 함유하는 가용성 펩티드 [참고: 1990년 7월 26일자로 공개된 WO 90/08187]; 스트렙토키나제; TGF-β; 스트렙토도나제; 숙주로부터의 RNA 또는 DNA; FK506; RS-61443; 데옥시스페르구알린; 라파마이신; T-세포 수용체 [참고: 미국 특허 제5,114,721호]; T-세포 수용체 단편 [참고: Offner et al., Science 251:430-432 (1991); WO 90/11294; and WO 91/01133]; 및 T 세포 수용체 항체 [참고: EP 340,109], 예를 들면 TlOB9가 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "DSCR1"은 야생형 DSCR1과 유사한 방식으로 칼시네우린을 조정 (및 조직 인자, E-셀렉틴, 및 Cox-2와 같은 염증성 마커 유전자를 발현)할 수 있는, 본래 서열 폴리펩티드, 폴리펩티드 변이체, 및 본래 서열 폴리펩티드 및 폴리펩티드 변이체의 단편을 포괄한다. 본원에 기재된 DSCR1 폴리펩티드는 각종 공급원, 예를 들어 인간 조직 유형 또는 또 다른 공급원으로부터 분리되거나, 또는 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조되는 것일 수 있다. 용어 "DSCR1", "DSCR1 폴리펩티드", "DSCR1 단백질" 및 "DSCR1 분자"에는 또한, 본원에 기재된 바와 같은 DSCR1 폴리펩티드의 변이체가 포함된다. 본 발명의 "DSCR1 조정제"는 "DSCR1 폴리펩티드" 또는 "DSCR1 단백질"의 정상적인 생물학적 기능/활성을 조정하는 분자이다.
"본래 서열 DSCR1 폴리펩티드"는 천연으로부터 유래된 상응하는 DSCR1 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 한 양태에서, 본래 서열 DSCR1 폴리펩티드는 서열 1 (도 9)의 단백질 암호화 아미노산 서열을 포함하는데, 여기서 제1 메티오닌이 아미노산 위치 1이다. 이러한 본래 서열 DSCR1 폴리펩티드는 천연으로부터 분리할 수 있거나, 또는 재조합 또는 합성 수단에 의해 생성될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "DSCR1 폴리펩티드" 및 "DSCR1 단백질"에는 구체적으로, 상기 특이적 DSCR1 폴리펩티드의 천연 발생적 절단 또는 해독 후 변형된 형태, 상기 폴리펩티드의 천연 발생적 변이체 형태 (예: 대체 스플라이싱된 형태) 및 천연 발생적 대립유전자성 변이체가 포괄된다.
"DSCR1 폴리펩티드 변이체" 또는 그의 변수들은 본원에 기재된 바와 같은 본래 서열 DSCR1 폴리펩티드 서열과의 아미노산 서열 동일률이 약 80% 이상인, 본원에 정의된 바와 같은 DSCR1 폴리펩티드, 일반적으로 활성 DSCR1 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 DSCR1 폴리펩티드 변이체에는, 예를 들어 하나 이상의 아미노산 잔기가 본래 아미노산 서열의 N- 또는 C-말단에 부가 또는 결실되는 DSCR1 폴리펩티드가 포함된다. 통상적으로, DSCR1 폴리펩티드 변이체는 본원에 기재된 바와 같은 본래 서열 DSCR1 폴리펩티드 서열과의 아미노산 서열 동일률이 약 80% 이상, 또 다른 한편으론 약 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상일 것이다. 통상적으로, DSCR1 폴리펩티드 변이체는 길이가 약 10개 이상 아미노산, 또 다른 한편으론 길이가 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600개 이상 아미노산이다. 임의로, DSCR1 폴리펩티드 변이체는 본래 DSCR1 폴리펩티드 서열과 비교해서 1개 이하의 보존적 아미노산 치환물, 또 다른 한편으론 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이하의 보존적 아미노산 치환물을 가질 것이다.
펩티드 또는 폴리펩티드 서열과 관련한 "아미노산 서열 동일률 (%)"은 서열들을 정렬하고 필요한 경우 갭을 도입하여 최대 서열 동일률을 달성하며, 서열 동일성의 일부로서 보존적 치환물은 전혀 고려하지 않은 후에, 특이적 펩티드 또는 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기 비율 (%)로서 규정된다. 아미노산 서열 동일률 (%)을 결정하기 위한 목적의 정렬은 예를 들어, 공개적으로 입수 가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, 또는 메갈라인 (Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 당해 분야의 기술 수준 내의 각종 방식으로 달성할 수 있다. 당업자는 정렬을 측정하기에 적당한 파라미터를 결정할 수 있는데, 이에는 비교하고자 하는 완전한 길이의 서열 전반에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 모든 알고리즘이 포함된다. 그러나, 본원의 목적상 아미노산 서열 동일률 (%) 값은 미국 특허 제6,828,146호에 기재된 바와 같은 서열 비교용 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성시킨다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "펩티드" 및 "폴리펩티드"는 상호 교환적으로 사용되는데, 단 용어 "펩티드"는 일반적으로 200개 미만의 연속되는 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 이와 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 한 가지 유형의 벡터가 "플라스미드"인데, 이는 부가의 DNA 절편을 연결시킬 수 있는 환상 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 또 다른 유형의 벡터는 파아지 (phage) 벡터이다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스성 벡터인데, 여기서는 부가의 DNA 절편을 바이러스성 게놈 내로 연결할 수 있다. 특정의 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포 내에서 자기 복제할 수 있다 (예를 들어, 세균성 복제 기점을 갖는 세균성 벡터 및 에피솜성 포유류 벡터). 기타 벡터 (예: 비-에피솜성 포유류 벡터)는 숙주 세포 내로의 도입시 이러한 숙주 세포의 게놈 내로 통합됨으로써, 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 더우기, 특정 벡터는 이들이 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터가 본원에서 "재조합 발현 벡터 (또는 간단히, "재조합 벡터")로서 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 상호 교환적으로 사용될 수 있는데, 이는 플라스미드가 가장 흔히 사용되고 있는 벡터 형태이기 때문이다.
본원에서 상호 교환적으로 사용되는 바와 같은 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 어떠한 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하고, 이에는 DNA 및 RNA가 포함된다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 그들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 도입될 수 있는 모든 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어 메틸화 뉴클레오티드 및 그들의 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 어셈블리 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 합성 후에, 예를 들어 표지와의 접합에 의해 추가로 변형시킬 수 있다. 기타 유형의 변형에는, 예를 들어 "캡스 (caps)", 하나 이상의 천연 발생적 뉴클레오티드의 특정 유사체로의 치환, 뉴클레오티드간 변형, 예를 들어 전하를 띠지 않은 연쇄물 (예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카바메이트 등)을 수반한 것 및 전하를 띤 연쇄물 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)을 수반한 것, 펜던트 부분, 예를 들어 단백질 (예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신 등)을 함유하는 것, 삽입제 (예: 아크리딘, 프소랄렌 등)을 수반한 것, 킬레이트제 (예: 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화적 금속 등)를 함유하는 것, 알킬화제를 함유하는 것, 변형된 연쇄물 (예: 알파 아노머성 핵산 등)을 수반하는 것 뿐만 아니라 변형되지 않은 형태의 폴리뉴클레오티드(들)가 포함된다. 추가로, 당에 통상적으로 존재하는 모든 히드록실기는, 예를 들어 포스포네이트기, 포스페이트기로 대체될 수 있거나, 표준 보호기에 의해 보호될 수 있거나, 또는 부가의 뉴클레오티드에 대한 부가의 연쇄물을 제조하도록 활성화될 수 있거나, 또는 고체 또는 반고체 지지체와 접합시킬 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH를 인산화시키거나, 또는 탄소수 1 내지 20의 유기 캡핑기 부분 또는 아민으로 치환시킬 수 있다. 기타 히드록실을 또한 유도체화하여 표준 보호기를 수득할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한, 일반적으로 당해 분야에 공지되어 있는 유사한 형태의 리보스 또는 데옥시리보스 당, 예를 들어 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카복실성 당 유사체, .알파.-아노머성 당, 에피머성 당, 예를 들어 아라비노스, 크실로스 또는 리속스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 아크릴성 유사체 및 아염기성 뉴클레오시드 유사체, 예를 들어 메틸 리보시드를 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 연쇄물을 대체 연결기로 대체시킬 수 있다. 이들 대체 연결기에는 포스페이트를 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2 ("포름아세탈") [여기서, R 또는 R' 각각은 독립적으로, H이거나 또는 임의로 에테르 (-O-) 연쇄를 함유하는 치환되거나 치환되지 않은 알킬 (1-20C), 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아르알킬이다]로 대체시킨 양태들이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 폴리뉴클레오티드 내의 모든 연쇄물이 반드시 동일할 필요는 없다. 앞서의 설명은 본원에 지칭된 모든 폴리뉴클레오티드 (RNA 및 DNA 포함)에 적용된다.
본원에 사용된 바와 같은 "올리고뉴클레오티드"는 일반적으로, 길이가 약 200개 미만 뉴클레오티드이긴 하지만 반드시 그럴 필요가 없는 짧은, 일반적으로 단일 가닥, 일반적으로 합성 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호 배타적이지 않다. 폴리뉴클레오티드에 관한 상기 설명이 올리고뉴클레오티드에도 동등하고도 완전히 적용 가능하다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "숙주 세포" (또는 "재조합 숙주 세포")는 외인성 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 재조합 플라스미드 또는 벡터)를 도입함으로써 유전적으로 변경시킬 수 있거나 또는 유전적으로 변형시킨 세포를 지칭하기 위한 것이다. 이러한 용어는 특정한 대상체 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손을 지칭하고자 한다. 돌연변이 또는 환경 상의 영향으로 인해 다음 세대에서 특정의 변형이 일어날 수 있기 때문에, 이러한 자손은 사실상 모 세포와 동일하지 않을 수도 있지만, 여전히 본원에 사용된 바와 같은 용어 "숙주 세포"의 범주에 포함된다.
"항체" (Ab) 및 "면역글로불린" (Ig)은 동일한 구조적 특징을 지닌 당단백질이다. 항체는 특이적 항원에 대한 결합 특이성을 나타내는 반면, 면역글로불린에는 항체와, 일반적으로 항원 특이성이 결여된 기타 항체-유사 분자 둘 다가 포함된다. 후자 종류의 폴리펩티드는, 예를 들어 림프계에 의해 저 수준으로 생성되고, 골수종에 의해서는 증가 수준으로 생성된다.
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 가장 광범위한 의미로 상호 교환적으로 사용되고, 이에는 모노클로날 항체 (예: 완전한 길이 또는 본래의 모노클로날 항체), 폴리클로날 항체, 1가, 다가 항체, 다중-특이적 항체 (예: 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 이중-특이적 항체)가 포함되고, 이에는 또한 특정의 항체 단편 (본원에 보다 상세히 기재된 바와 같음)이 포함될 수 있다. 항체는 키메라, 인간, 인간화 및/또는 친화성 성숙된 항체일 수 있다.
"항체 단편"은 본래 항체의 단지 일부 만을 포함하는데, 이러한 일부는 바람직하게, 본래 항체 내에 존재하는 경우에 이러한 일부와 통상적으로 연관된 기능들 중의 적어도 한 가지 기능, 바람직하게는 대부분 또는 모든 기능을 보유하고 있다. 한 양태에서는, 항체 단편이 본래 항체의 항원 결합 부위를 포함하므로, 항원과 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있다. 또 다른 양태에서는, 항체 단편, 예를 들어 Fc 영역을 포함하는 항체 단편이, 본래 항체 내에 존재하는 경우에 Fc 영역과 통상적으로 연관된 생물학적 기능들, 예를 들어 FcRn 결합성, 항체 반감기 조정, ADCC 기능 및 보체 결합성 중의 적어도 한 가지 기능을 보유하고 있다. 한 양태에서는, 항체 단편이 본래 항체와 실질적으로 유사한 생체내 반감기를 갖는 1가 항체이다. 예를 들어, 이러한 항체 단편은 단편에 생체내 안정성을 부여해 줄 수 있는 Fc 서열과 연결된 항원 결합성 암 (arm)을 포함할 수 있다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 지칭한다. 이들 도메인은 일반적으로, 항체의 가장 가변 부분이고, 항원 결합 부위를 함유한다.
본원에 사용된 경우의 용어 "초가변 영역", "HVR", 또는 "HV"는 서열 내에 초가변적이고/이거나 구조적으로 한정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 초가변 영역을 포함하는데, VH에 3개가 있고 (Hl, H2, H3), VL에 3개가 있다 (Ll, L2, L3). 서술된 수의 초가변 영역이 사용되고 있고 본원에 포괄된다. 카바트 (Kabat) 상보성 결정 영역 (CDRs)은 서열 가변성에 기초한 것이며, 가장 흔히 사용되고 있다 [참고: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]. 초티아 (Chothia)는 대신 구조적 루프의 위치를 지칭한다 [참고: Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]. AbM 초가변 영역은 카바트 CDRs와 초티아 구조적 루프 간의 절충을 나타내고, 이는 옥스포드 분자 (Oxford Molecular's) AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용되고 있다. "접촉" 초가변 영역은 이용 가능한 복합체 결정 구조의 분석에 기초한 것이다. 이들 초가변 영역 각각으로부터의 잔기가 다음에 제시된다:
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"골격" 또는 "FR" 잔기는 본원에 규정된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동질적 항체 집단, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가, 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이물을 제외하고는 동일한 집단으로부터 수득한 항체를 지칭한다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이고, 단일 항원에 대항하여 유도된다. 더우기, 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대항하여 유도된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 달리, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대항하여 유도된다.
본원에서의 모노클로날 항체에는 구체적으로, 중쇄 및/또는 경쇄 일부가 특별한 종으로부터 유래되거나 특별한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 나머지 쇄(들)는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체 뿐만 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 상기 항체의 단편이 포함된다 [참고: 미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)].
"인간화" 형태의 비-인간 (예: 뮤린) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는, 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하고 있는 비-인간 종 (공여자 항체), 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역으로부터의 잔기로 대체시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 몇몇 경우에는, 인간 면역글로불린의 골격 영역 (FR) 잔기를 상응하는 비-인간 잔기로 대체시킨다. 더우기, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 정련시키기 위해 만들어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FRs는 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 임의로, 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 전형적으로는 인간 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가의 상세 내역에 관해서는 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)]. 다음 참고 문헌 및 이에 인용된 참고 문헌을 또한 참고할 수 있다 [참고: Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23: 1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)].
"인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체의 아미노산 서열에 상응하고/하거나 본원에 기재된 바와 같은 인간 항체를 제조하기 위한 모든 기술을 이용하여 만든 아미노산 서열을 보유하고 있는 항체이다. 인간 항체의 정의에는 구체적으로, 비-인간 항원 결합성 잔기를 포함하는 인간화 항체가 배제된다.
"친화성 성숙된" 항체는 변경(들)을 나타내지 않는 모 항체와 비교해서 항원에 대한 항체의 친화성을 개선시켜 주는, 하나 이상의 CDRs/HVRs에서 한 가지 이상의 변경을 수반한 항체이다. 바람직한 친화성 성숙된 항체는 표적 항원에 대한 나노몰 또는 심지어 피코몰 친화도를 지닐 것이다. 친화성 성숙된 항체는 당해 분야에 공지된 과정에 의해 생성된다. 문헌 [참고: Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)]에는 VH 및 VL 도메인 셔플링 (shuffling)에 의한 친화성 성숙이 기재되어 있다. CDR/HVR 및/또는 골격 잔기의 무작위 돌연변이 유발이 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Barbas et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91:3809-3813 (1994); Schier et al., Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); and Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)].
용어 "Fc 영역"은 본래 항체를 파파인 분해시킴으로써 생성될 수 있는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 규정하기 위해 사용된다. Fc 영역은 본래 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계가 다양할 수도 있긴 하지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상적으로, 위치 약 Cys226 하의 아미노산 잔기 또는 위치 약 Pro230 하의 아미노산 잔기에서부터 Fc 영역의 카복실-말단까지 연장하는 것으로 규정된다. 면역글로불린의 Fc 영역은 일반적으로, 2개의 불변 도메인, 즉 CH2 도메인과 CH3 도메인을 포함하고, 임의로는 CH4 도메인을 포함한다. 본원에서 "Fc 영역 쇄"란 Fc 영역의 2개 폴리펩티드 쇄 중의 하나를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 "실질적으로 유사한" 또는 "실질적으로 등가"란 2가지 수치 간의 상당히 높은 수준의 유사성이 존재하므로, 당업자가 상기 수치에 의해 측정되는 생물학적 특징 맥락에서 보면 2가지 수치 간의 차이는 생물학적 유의성이 거의 또는 전혀 없는 것으로 간주할 수 있다는 것을 의미한다. 이러한 2가지 수치 간의 차이는 바람직하게 약 50% 미만, 바람직하게 약 40% 미만, 바람직하게 약 30% 미만, 바람직하게 약 20% 미만, 바람직하게 약 10% 미만이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방지하고/하거나 세포의 파괴를 유발시키는 물질을 지칭한다. 이 용어에는 방사성 동위원소 (예: At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 및 독소, 예를 들어 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 소분자 독소 (그의 단편 및/또는 변이체 포함)가 포함된다.
"화학요법제"는 암을 치료하는데 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예에는 알킬화제, 예를 들어 티오테파 및 CYTOXAN® 시클로포스파미드; 알킬 설포네이트, 예를 들어 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들어 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민, 예를 들어, 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸롤로멜라민; 아세토게닌 (특히, 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로칸나비놀 (드로나비놀, MARINOL®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜키신; 베툴린산; 캄프토테신 [합성적으로 유사한 토포테칸 (HYCAMTIN®), CPT-11 (이리노테칸, CAMPTOSAR®), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴, 및 9-아미노캄프토테신 포함]; 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신 (합성 유사체 KW-2189 및 CBl-TMl 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예를 들어 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라님무스틴; 항생제, 예를 들어 엔디인 (enediyne) 항생제 [예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메가I1 (참고: Agnew, Chem Intl. Ed. Engl. 33: 183-186 (1994)); 디네미신 (디네미신 A 포함); 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색단백질 엔디인 항생제 발색단], 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르루이신, 독소루비신 [ADRIAMYCIN®, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포솜 주사제 (DOXIL®) 및 데옥시독소루비신 포함], 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 (예: 미토마이신 C), 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사제, 예를 들어 메토트렉세이트, 젬시타빈 (GEMZAR®), 테가푸르 (UFTORAL®), 카페시타빈 (XELODA®), 에포틸론, 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐, 예를 들어 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신제, 예를 들어 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충물, 예를 들어 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 마이탄시노이드, 예를 들어 마이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK® 다당류 복합체 (공급처: JHS Natural Products, Eugene, OR); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신 (ELDISINE®, FILDESIN®); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 (TAXOL®), 파클리탁셀의 알부민-공학 처리시킨 나노입자 제형 (ABRAXANE™), 및 독세탁셀 (TAXOTERE®); 클로란부실; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예를 들어 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴 (VELBAN®); 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴 (ONCOVIN®); 옥살리플라틴; 류코보빈; 비노렐빈 (NAVELBINE®); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드 (예: 레티노산); 및 상기 언급된 제제의 제약상 허용 가능한 염, 산 또는 유도체 뿐만 아니라 상기 제제의 2가지 이상 병용물, 예를 들어 CHOP (이는 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 병용 요법에 대한 약어이다), 및 FOLFOX (이는 5-FU 및 류코보빈과 병용된 옥살리플라틴 (ELOXATIN™)을 이용한 치료 섭생에 대한 약어이다)이 포함된다.
상기 정의에는 또한, 암의 성장을 증진시킬 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 감소, 차단 또는 억제시키는 작용을 하고, 종종 전신성 치료 형태인 항호르몬제가 포함된다. 이들은 호르몬 자체일 수 있다. 이의 예에는 항에스트로겐제 및 선택적 에스트로겐 수용제 조정제 (SERM)가 포함되는데, 예를 들어 타목시펜 (NOLVADEX® 타목시펜 포함), 랄록시펜 (EVISTA®), 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 토레미펜 (FARESTON®); 항프로게스테론제; 에스트로겐 수용체 하향 조절제 (ERD); 에스트로겐 수용체 길항제, 예를 들어 풀베스트란트 (FASLODEX®); 난소를 저해하거나 난소의 활동을 정지시키는 기능을 하는 작용제, 예를 들어 황체형성 호르몬 방출 호르몬 (LHRH) 작동제, 예를 들어 류프롤리드 아세테이트 (LUPRON® 및 ELIGARD®), 고세렐린 아세테이트, 부세렐린 아세테이트 및 트리프테렐린; 기타 항안드로겐제, 예를 들어 플루타미드, 닐루타미드 및 비칼루타미드; 및 부신에서의 에스트로겐 생성을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들어 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메게스트롤 아세테이트 (MEGASE®), 엑세메스탄 (AROMASIN®), 포르메스타니에, 파드로졸, 보로졸 (RIVISOR®), 레트로졸 (FEMARA®) 및 아나스트로졸 (ARIMIDEX®)이 포함된다. 또한, 상기 화학요법제의 정의에는 비스포스포네이트, 예를 들어 클로드로네이트 (예: BONEFOS® 또는 OSTAC®), 에티드로네이트 (DIDROCAL®), NE-58095, 졸레드론산/졸레드로네이트 (ZOMETA®), 알렌드로네이트 (FOSAMAX®), 파미드로네이트 (AREDIA®), 틸루드로네이트 (SKELID®), 또는 리세드로네이트 (ACTONEL®); 뿐만 아니라 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 이상한 세포 증식에 밀접한 영향을 미치는 신호 전달 경로에 있어 유전자, 예를 들어 PKC-알파, Raf, H-Ras 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R)의 발현을 억제시키는 안티센스 올리고뉴클레오티드; 백신, 예를 들어 THERATOPE® 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들면, ALLOVECTIN® 백신, LEUVECTIN® 백신 및 VAXID® 백신; 토포이소머라제 1 억제제 (예: LURTOTECAN®); rmRH (예: ABARELIX®); 라파티니브 디토실레이트 (GW572016으로서 공지되기도 한 ErbB-2 및 EGFR 이중 티로신 키나제 소분자 억제제); COX-2 억제제, 예를 들어 셀레콕시브 (CELEBREX®, 4-(5-(4-메틸페닐)-3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)벤젠설폰아미드; 및 이들의 제약상 허용 가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
"차단성" 항체 또는 "길항제" 항체는 이와 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제 또는 저하시키는 것이다. 이러한 차단성은 모든 수단, 예를 들어 단백질-단백질 상호 작용, 예를 들면 수용체에 대한 리간드 결합을 방해함으로써 일어날 수 있다. 한 양태에서, 차단성 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 억제시킨다.
용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장/증식을 특징적으로 나타내는 포유류의 생리적 상태를 지칭하거나 이를 서술한다. 암의 예에는 암종, 림프종 [예: 호지킨 (Hodgkin) 및 비호지킨 림프종], 모세포종, 육종 및 백혈병이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예에는 편평 세포암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평 암종, 복막암, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선 암, 간 암종 및 각종 유형의 두경부암이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 "치료 (처치)"는 치료하고자 하는 개개인 또는 세포의 천연 과정을 변경시키기 위해 임상적으로 개입하는 것을 지칭하고, 이는 임상 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위해 수행할 수 있다. 목적하는 치료 효과에는 질병의 발생 또는 재발을 예방하고, 증상을 완화시키며, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 저하시키며, 전이를 예방하고, 질병 진행 속도를 감소시키며, 질병 상태를 경감 또는 일시적 완화시키며, 차도시키거나 예후를 개선시키는 것이 포함된다. 몇몇 양태에서는, 본 발명의 조정제 분자 및 방법을 사용하여 질병 또는 장애 발생을 지연시킨다.
"유효량"은 필요한 시간 동안 및 투여량에서, 목적하는 치료적 또는 예방적 결과를 달성하는데 유효한 양을 지칭한다. 치료제의 "치료상 유효량"은 개개인의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개개인에게서 목적하는 반응을 유도시킬 수 있는 항체의 능력과 같은 요인들에 따라서 다양할 수 있다. 치료상 유효량은 또한, 치료상 이로운 효과가 치료제의 어떠한 독성이나 해로운 효과도 능가하는 양이다. "예방상 유효량"은 필요한 시간 동안 및 투여량에서, 목적하는 예방적 결과를 달성하는데 유효한 양을 지칭한다. 반드시 그런 것은 아니지만 전형적으로, 예방적 용량은 질병이 발생하기에 앞서 또는 질병의 초기 단계에서 대상체에게 사용되기 때문에, 예방상 유효량은 치료상 유효량 보다 적을 것이다.
II. 본 발명의 조성물 및 방법
A. DSCR1 조정제 항체
한 양태에서, 본 발명은 본원에서 치료제 및/또는 진단제로서 사용할 수 있는 DSCR1 조정제 항체를 제공한다. 예시되는 항체에는 폴리클로날, 모노클로날, 인간화, 이중-특이적, 및 이종-접합체 항체가 포함된다. 항체를 생성, 확인, 성상 확인, 변형 및 생성시키는 국면들은 당해 분야에 널리 확립되어 있고, 예를 들어 문헌 [참고: 미국 공개특허공보 제2005/0042216호의 문단 522 내지 563, 604 내지 608, 및 617 내지 688]에 기재된 바와 같다.
본원에 기재된 DSCR1 조정제 항체는 표적 세포/조직으로 전달하는데 적합한 어떠한 형태로든 제형화할 수 있다. 예를 들어, 상기 항체를 면역리포솜으로서 제형화할 수도 있다. "리포솜"은 약물을 포유류에게 전달하는데 유용한, 각종 유형의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제로 구성된 작은 소포이다. 리포솜의 구성분은 생체 막의 지질 배열과 유사한, 이층 형성으로 통상 배열된다. 항체를 함유하는 리포솜은 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들어 문헌 [참고: Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및 WO 97/38731 (1997년 10월 23일자로 공개됨)]에 기재된 방법에 의해 제조한다. 순환 시간이 증강된 리포솜이 미국 특허 제5,013,556호에 기재되어 있다.
특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용하는 역상 증발 방법에 의해 생성시킬 수 있다. 리포솜은 한정된 공극 크기의 필터를 통하여 압출시켜 목적하는 직경을 갖는 리포솜을 수득한다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편을 디설파이드 쇄간 반응을 통하여 문헌 [참고: Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 리포솜에 접합시킬 수 있다. 화학요법제가 리포솜 내에 임의로 함유된다 [참고: Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19): 1484 (1989)].
B. DSCR1 조정제 폴리펩티드
한 국면에서, 본 발명의 DSCR1 조정제는 폴리펩티드를 포함한다. 한 양태에서, 이러한 조정제 폴리펩티드는 내피 세포에서의 NFAT 활성을 길항시킨다. 한 양태에서, 상기 조정제 폴리펩티드는 내피 세포에서의 CnA 활성을 길항시킨다. 한 양태에서, 상기 폴리펩티드는 DSCR1과 바람직하게는 특이적으로 결합하거나, 또는 DSCR1 또는 CnA와 상호 작용하는 세포내 분자와 바람직하게는 특이적으로 결합한다. 상기 폴리펩티드는 공지된 펩티드 합성 방법론을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있거나, 또는 재조합 기술을 사용하여 제조 및 정제할 수 있다. 한 양태에서, DSCR1 조정제 폴리펩티드는 길이가 약 5개 이상 아미노산이고, 또 다른 한편으론 길이가 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100개 이상 아미노산인데, 이러한 폴리펩티드는 DSCR1 활성을 조정할 수 있다. 이들 폴리펩티드는 널리 공지된 기술을 사용하여 과도한 실험없이 확인할 수 있다. 이와 관련하여, 폴리펩티드 표적과 특이적으로 결합할 수 있는 올리고펩티드를 알아보기 위해 올리고펩티드 라이브러리를 스크리닝하는 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있는 것으로 인지된다 [참고: 미국 특허 제5,556,762호, 제5,750,373호, 제4,708,871호, 제4,833,092호, 제5,223,409호, 제5,403,484호, 제5,571,689호, 제5,663,143호; PCT 공개공보 WO 84/03506 및 WO84/03564; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 178-182 (1985); Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987); Schoofs et al., J. Immunol., 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378; Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363, and Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol, 2:668].
이와 관련하여, 폴리펩티드 표적과 특이적으로 결합할 수 있는 라이브러리 구성원을 확인하기 위해 큰 올리고펩티드 라이브러리를 스크리닝할 수 있게 해주는 널리 공지된 기술 중의 한 가지가 박테리오파아지 (파아지) 디스플레이이다. 파아지 디스플레이는 변이체 폴리펩티드를 박테리오파아지 입자 표면 상의 외피 단백질에 대한 융합 단백질로서 디스플레이시키는 기술이다 [참고: Scott, J.K. and Smith, G. P. (1990) Science, 249: 386]. 파아지 디스플레이의 유용성은 표적 분자와 고 친화성으로 결합하는 서열을 알아보기 위해, 선택적으로 무작위된 단백질 변이체 (또는 무작위로 클로닝된 cDNAs)의 큰 라이브러리를 신속하고도 효율적으로 분류할 수 있다는 사실에 있다. 파아지 상에 펩티드 라이브러리 [참고: Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378] 또는 단백질 라이브러리 [참고: Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30: 10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363]를 디스플레이하는 것은, 특이적 결합 특성을 지닌 것을 알아보기 위해 수 백만개의 폴리펩티드 또는 올리고펩티드를 스크리닝하는데 사용되어 왔다 [참고: Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668]. 무작위 돌연변이체의 파아지 라이브러리를 분류하기 위해서는, 다수의 변이체를 구축 및 증식시키기 위한 전략, 표적 수용체를 이용하여 친화 정제하기 위한 과정, 및 결합성 강화 결과를 평가하기 위한 수단이 요구된다 [참고: 미국 특허 제5,223,409호, 제5,403,484호, 제5,571,689호 및 제5,663,143호].
대부분의 파아지 디스플레이 방법에 필라멘트상 파아지를 사용하긴 하였지만, 람다 (lambdoid) 파아지 디스플레이 시스템 [참고: WO 95/34683; 미국 특허 제5,627,024호], T4 파아지 디스플레이 시스템 [참고: Ren et al., Gene. 215: 439 (1998); Zhu et al., Cancer Research, 58(15): 3209-3214 (1998); Jiang et al., Infection & Immunity, 65(11): 4770-4777 (1997); Ren et al., Gene, 195(2):303-311 (1997); Ren, Protein Sci., 5: 1833 (1996); Efimov et al., Virus Genes, 10: 173 (1995)] 및 T7 파아지 디스플레이 시스템 [참고: Smith and Scott, Methods in Enzymology, 217: 228-257 (1993); 미국 특허 제5,766,905호] 또한 공지되어 있다.
기본 파아지 디스플레이 개념 상의 기타 많은 개선책과 변수들이 현재 개발되고 있다. 이들 개선책은 선택된 표적 분자와의 결합을 알아보기 위해 펩티드 라이브러리를 스크리닝할 수 있는 파아지 시스템의 능력과, 목적하는 특성을 알아보기 위해 이들 단백질을 스크리닝할 수 있는 잠재력을 지닌 기능적 단백질을 디스플레이할 수 있는 능력을 증강시켜 준다.
파아지 디스플레이 반응을 위한 조합 반응 장치가 개발되었고 [참고: WO 98/14277], 파아지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 이분자 (bimolecular) 상호 작용 [참고: WO 98/20169; WO 98/20159] 및 제한된 나선 펩티드의 특성 [참고: WO 98/20036]을 분석 및 제어하였다. WO 97/35196에는 파아지 디스플레이 라이브러리를 하나의 용액 (여기서, 리간드는 표적 분자와 결합할 것이다) 및 제2 용액 (여기서는 친화성 리간드가 표적 분자와 결합하지 않을 것이다)와 접촉시켜 결합성 리간드를 선택적으로 분리시키는, 친화성 리간드를 분리하는 방법이 기재되어 있다. WO 97/46251에는 친화성 정제된 항체를 사용하여 무작위 파아지 디스플레이 라이브러리를 바이오패닝 (biopanning)한 다음 결합성 파아지를 분리한 후, 미세판 웰을 사용하여 마이크로패닝 과정을 수행하여 고 친화성 결합성 파아지를 분리시키는 방법이 기재되어 있다. 친화성 태그로서 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 단백질 A를 사용하는 방법이 또한 보고되었다 [참고: Li et al. (1998) Mol Biotech., 9:187]. WO 97/47314에는 파아지 디스플레이 라이브러리일 수 있는 조합 라이브러리를 사용하여 효소 특이성을 구별하기 위해 기질 감산 라이브러리를 사용하는 것이 기재되어 있다. 파아지 디스플레이를 사용하여 세정제에 사용하기 적합한 효소를 선별하는 방법이 WO 97/09446에 기재되어 있다. 특이적 결합성 단백질을 선별하기 위한 부가의 방법이 미국 특허 제5,498,538호, 제5,432,018호, 및 WO 98/15833에 기재되어 있다.
펩티드 라이브러리를 생성시키고 이들 라이브러리를 스크리닝하는 방법이 또한 미국 특허 제5,723,286호, 제5,432,018호, 제5,580,717호, 제5,427,908호, 제5,498,530호, 제5,770,434호, 제5,734,018호, 제5,698,426호, 제5,763,192호, 및 제5,723,323호에 기재되어 있다.
조정제 폴리펩티드를 생성, 확인, 성상 확인, 변형 및 생성시키는 방법들은 당해 분야에 널리 확립되어 있고, 예를 들어 문헌 [참고: 미국 공개특허공보 제2005/0042216호의 문단 606 내지 608, 614 내지 688]에 기재된 바와 같다.
한 양태에서, DSCR1-의존성 CnA 활성을 길항시키기 위한 폴리펩티드는, 예를 들어 문헌 [참고: Rothermel et al., Trends Cardiovascular Med. (2003), 13(1):15-21; Vega et al., J. Biol. Chem. (2002), 277(33):30401-30407]에 기재된 바와 같이 DSCR1 도메인 구조에 기초하여 고안할 수 있다. 예를 들어, 상기 폴리펩티드는 인간 DSCR1의 위치 약 96에서부터 약 125까지, 또는 약 108에서부터 약 122까지의 아미노산을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 상기 폴리펩티드는 세린-프롤린 (SP) 서열의 적어도 일부, 및 인간 DSCR1의 N 및/또는 C-말단 칼시네우린 결합성 도메인의 적어도 일부를 포함하는데, 이러한 폴리펩티드는 CnA와 결합하여 CnA-조절된 유전자 발현을 억제할 수 있다.
C. DSCR1 조정제 소분자
한 양태에서, DSCR1 조정제 소분자는 DSCR1 활성을 조정하는 본원에 정의된 바와 같은 올리고펩티드 또는 항체 이외의 유기 분자이다. DSCR1 조정제 소분자는 공지된 방법론을 사용하여 확인하고 화학적으로 합성할 수 있다 [참고: PCT 공개공보 WO00/00823 및 WO00/39585]. DSCR1 조정제 유기 소분자는 크기가 통상적으로 약 2000 달톤 미만, 또 다른 한편으론 크기가 약 1500, 750, 500, 250 또는 200 달톤 미만인데, 이러한 유기 소분자는 널리 공지된 기술을 사용하여 과도한 실험없이 확인할 수 있다. 이와 관련하여, 폴리펩티드 표적과 결합할 수 있는 분자를 알아보기 위해 유기 소분자 라이브러리를 스크리닝하는 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있는 것으로 인지된다 [참고: PCT 공개공보 WO00/00823 및 WOOO/39585]. DSCR1 조정제 유기 소분자는, 예를 들어 알데히드, 케톤, 옥심, 히드라존, 세미카바존, 카바지드, 1급 아민, 2급 아민, 3급 아민, N-치환된 히드라진, 히드라지드, 알코올, 에테르, 티올, 티오에테르, 디설파이드, 카복실산, 에스테르, 아미드, 우레아, 카바메이트, 카보네이트, 케탈, 티오케탈, 아세탈, 티오아세탈, 아릴 할라이드, 아릴 설포네이트, 알킬 할라이드, 알킬 설포네이트, 방향족 화합물, 헤테로사이클릭 화합물, 아닐린, 알켄, 알킨, 디올, 아미노 알코올, 옥사졸리딘, 옥사졸린, 티아졸리딘, 티아졸린, 에나민, 설폰아미드, 에폭시드, 아지리딘, 이소시아네이트, 설포닐 클로라이드, 디아조 화합물, 산 클로라이드 등일 수 있다.
D. 핵산을 포함하는 DSCR1 조정제
한 국면에서, 본 발명의 DSCR1 조정제는 핵산 분자를 포함한다. 예를 들어, 이러한 핵산 분자는 센스/안티센스 올리고뉴클레오티드, 억제성/간섭 RNA [예를 들어, 소형 억제성/간섭 RNA (siRNA)], 또는 앱타머를 포함할 수 있다. 이들 핵산 조정제를 확인 및 제조하기 위해 스크리닝하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
예를 들어, siRNAs은 전통적인 길항제 (예: 소분자 또는 항체)가 실패한 유전자 발현을 조정할 수 있는 것으로 입증되었다 [참고: Shi Y., Trends in Genetics 19(1):9-12 (2003)]. 길이가 30개 미만 뉴클레오티드 (예를 들어, 약 15 내지 25개, 17 내지 20개, 18 내지 20개, 19 내지 20개, 또는 21 내지 23개 뉴클레오티드)인 시험관내 합성된 이중 가닥 RNAs는 간섭 RNAs (iRNAs)로서 작용할 수 있고, 유전자 발현을 특이적으로 억제할 수 있다 [참고: 예를 들어, Fire A., Trends in Genetics (1999), 391; 806-810; 미국 특허원 제09/821832호, 제09/215257호; 미국 특허 제6,506,559호; PCT/USOl/10188; 유럽 특허원 제00126325호]. 이들 iRNAs는 적어도 부분적으로는, 그들의 표적 RNAs의 분해를 매개함으로써 작용하는 것으로 여겨진다. 그러나, 이들은 길이가 30개 아래 뉴클레오티드이기 때문에, 세포 항바이러스성 방어 기전을 촉발시키지 못한다. 이러한 기전에는 인터페론 생성, 및 숙주 세포 단백질 합성의 일반적 활동 정지가 포함된다. 실제적으로는, siRNAs를 합성한 다음, 이를 DNA 벡터 내로 클로닝할 수 있다. 이러한 벡터를 형질감염시켜 siRNA를 고 수준으로 발현하도록 만들 수 있다. 이러한 고 수준의 siRNA 발현을 이용하여, 세포 내에 생성된 단백질을 "녹다운"시키거나 또는 그의 양을 상당히 감소시킬 수 있으므로, 이는 단백질의 과발현이 병리학적 장애와 관련이 있는 것으로 여겨지는 세포성 환경에 유용하다.
앱타머는 표적 분자, 예를 들어, DSCR1 단백질과 결합할 수 있는 핵산 분자이다. 앱타머의 일반적 및 치료적 용도는 당해 분야에 널리 확립되어 있다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제5,475,096호, 및 연령 관련 황반 변성을 치료하기 위한 Macugen® (Eyetech, New York)의 치료 효능].
안티센스 기술은 당해 분야에 널리 확립되어 있다. 이러한 기술에 관한 추가의 상세 내역이 다음에 제공된다.
E. 제약 제형 (제제)
본 발명에 따라서 사용된 DSCR1 조정제의 치료적 제형은, 목적하는 순도를 지닌 DSCR1 조정제를 임의의 제약상 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제 [참고: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]와 혼합하여, 동결건조된 제형 또는 수성 용제 형태로 저장하기 위해 제조한다. 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 이용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이고, 이에는 완충제, 예를 들어 아세테이트, 트리스 (Tris), 인산염, 시트레이트 및 기타 유기 산; 항산화제, 예를 들면 아스코르브산 및 메티오닌; 방부제 (예: 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들면 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량 (약 10개 미만 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이트제, 예를 들어 EDTA; 등장화제, 예를 들어 트레할로스 및 염화나트륨; 당, 예를 들어 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 계면활성제, 예를 들어 폴리솔베이트; 염 형성 반대-이온, 예를 들어 나트륨; 금속 착물 (예: Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEEN®, PLURONICS® 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 포함된다.
본원의 제형은 치료하고자 하는 특정한 적응증에 대해 필요한 만큼의 한 가지 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에게 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 지닌 한 가지 이상의 활성 화합물을 함유할 수도 있다. 예를 들어, DSCR1 조정제 이외에도, 부가의 조정제, 예를 들어 DSCR1 단백질 상의 상이한 에피토프와 결합하는 제2의 항체; 또는 몇몇 기타 표적에 대한 항체를 하나의 제형 내에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 또 다른 한편, 또는 부가적으로, 조성물은 화학요법제, 세포독성제, 사이토킨, 성장 억제제, 항호르몬제, 및/또는 심장보호제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도한 목적에 유효한 양으로 병용해서 존재하는 것이 적합하다.
활성 성분을, 예를 들어 액적형성 (coacervation) 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 미소캡슐, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴 미소캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미소캡슐; 콜로이드상 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포솜, 알부민 미소구, 마이크로에멀션, 나노-입자 및 나노-캡슐); 또는 매크로에멀션 내에 포착시킬 수도 있다. 이러한 기술은 문헌 [참고: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재되어 있다.
지속 방출 제제를 제조할 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예에는 본 발명의 항체를 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되는데, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 미소캡슐 형태이다. 지속 방출 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 히드로겔 [예를 들면, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)], 폴리락티드 [참고: 미국 특허 제3,773,919호], L-글루탐산과 γ에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT® (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다.
생체내 투여에 사용하고자 하는 제형은 멸균성이어야만 한다. 이는 멸균성 여과 막을 통하여 여과시킴으로써 용이하게 달성된다.
F. 본 발명의 DSCR1 조정제를 이용한 치료
본 발명의 DSCR1 조정제는 각종의 비-치료적으로 적용된다. 본 발명의 조정제는 DSCR1-발현성 질병의 병기를 알아보거나 이러한 질병을 탐지하는데 (예를 들어, 방사성영상화하는데) 유용할 수 있다. 상기 항체, 올리고펩티드 및 유기 소분자는 또한, 세포로부터 DSCR1을 정제 또는 면역침전시키고, 예를 들어 ELISA 또는 웨스턴 블롯에서 DSCR1을 시험관 내에서 탐지 및 정량화하여, 특정 세포 집단에서의 세포성 사건을 조정하는데 유용하다.
현재에는, 암의 병기에 따라서, 암 치료법이 다음 요법들 중의 한 가지 또는 병용 요법을 포함한다: 암성 조직을 제거하기 위한 수술, 방사선 요법 및 화학요법. DSCR1 조정제를 포함하는 요법은 화학요법의 독성과 부작용을 잘 견디지 못하는 나이 많은 환자에게 특히 유용할 수 있고, 방사선 요법의 유용성이 제한된 전이성 질환에 특히 유용할 수 있다. 치료적으로 적용하기 위해, 본 발명의 DSCR1 조정제를 단독으로 사용하거나, 또는 예를 들어, 호르몬, 항혈관형성제, 방사성 표지된 화합물과의 병용 요법, 또는 수술, 한랭요법 및/또는 방사선 요법과의 병용 요법으로 사용할 수 있다. DSCR1 조정제는 기타 형태의 통상적 요법과 연계해서 투여할 수 있는데, 통상적 요법과 연속해서, 통상적 요법 전 또는 후에 투여한다. TAXOTERE® (도세탁셀), TAXOL® (파클리탁셀), 에스트라무스틴 및 미톡산트론 등의 화학요법제는 특히 위험이 적은 환자에게서 암을 치료하는데 사용된다. DSCR1 조정제는 일반적으로, 치료상 유효 용량의 화학요법제와 함께 투여할 것이다. 또 다른 양태에서는, DSCR1 조정제를 화학요법과 연계해서 투여하여 화학요법제 (예: 파클리탁셀)로부터 비롯되는 부작용을 저하시킨다. 의사용 탁상 편람 (PDR)에는 각종 암 치료에 사용되어 온 이들 작용제의 투여량이 기재되어 있다. 치료상 유효한 이들 전술된 화학요법제의 투약 (투여) 섭생과 투여량은 치료하고자 하는 특정 암, 질병의 정도 및 당해 분야의 전문의에게 친숙한 기타 요인들에 의해 좌우될 것이고, 이는 전문의에 의해 결정될 수 있다.
DSCR1 조정제를 공지된 방법, 예를 들어 정맥내 투여 (예: 거환으로서)에 따라서, 또는 일정 기간에 걸친 연속적 주입에 의해, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활막내, 수막강내, 경구, 국부 또는 흡입 경로에 의해 인간 환자에게 투여한다. 항체, 올리고펩티드 또는 유기 소분자를 정맥내 또는 피하 투여하는 것이 본 발명의 바람직한 한 양태이다.
기타 치료적 섭생을 DSCR1 조정제의 투여와 병용할 수 있다. 병용 투여에는 별개의 제형 또는 단일 제약 제형을 사용하여 동시-투여하는 것과, 어느 한 순서로 연속해서 투여하는 것 [2개 (또는 모든) 활성제가 그들의 생물학적 활성을 동시에 발휘하는 데에는 일정 시간이 소요된다]이 포함된다. 바람직하게는, 이러한 병용 요법으로 인해 상승적 치료 효과 및/또는 불필요한 부작용 감소가 발생한다.
DSCR1 조정제의 투여를, 특정한 병리학적 질환과 연관된 또 다른 항원에 대항하여 유도된 치료제의 투여와 병용하는 것이 바람직할 수도 있다.
또 다른 양태에서는, 본 발명의 치료적 처치법이 DSCR1 조정제 분자와, 한 가지 이상의 화학요법제 또는 성장 억제제를 병용 투여 (이에는 상이한 화학요법제의 칵테일을 동시-투여하는 것이 포함된다)하는 것을 포함한다. 화학요법제에는 에스트라무스틴 포스페이트, 프레드니무스틴, 시스플라틴, 5-플루오로우라실, 멜팔란, 시클로포스파미드, 히드록시우레아 및 히드록시우레아탁산 (예: 파클리탁셀 및 도세탁셀) 및/또는 안트라사이클린 항생제가 포함된다. 이러한 화학요법제에 대한 제조 및 투여 스케쥴은 제조업자의 지시에 따라서 또는 전문의에 의해 실험적으로 결정된 바와 같이 사용할 수 있다. 상기 화학요법에 대한 제조 및 투여 스케쥴은 또한 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Chemotherapy Service, Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)].
DSCR1 조정제를 항호르몬 화합물, 예를 들어 항에스트로겐 화합물, 예를 들면, 타목시펜; 항프로게스테론제, 예를 들어 오나프리스톤 (onapristone) [참고: EP 616 812]; 또는 항안드로겐제, 예를 들어 플루타미드와, 이러한 분자에 대해 공지된 투여량으로 병용할 수 있다. 치료하고자 하는 암이 안드로겐-비의존성 암인 경우에는, 환자에게 이미 항안드로겐 요법을 적용했었을 수 있고, 암이 안드로겐 비의존성이 된 후에, DSCR1 조정제를 환자에게 투여할 수 있다.
종종, 심장 보호제 (상기 요법과 연관된 심근 기능이상을 예방하거나 저하시키기 위함) 또는 하나 이상의 사이토킨을 환자에게 동시 투여하는 것이 유익할 수 있다. 상기 치료적 섭생 이외에도, 환자에게 암 세포의 외과적 제거 및/또는 방사선 요법을, DSCR1 조정제 요법 전, 동시에 또는 후에 적용할 수 있다. 상기 동시 투여되는 작용제에 대한 적합한 투여량은 현재 사용되고 있는 양이며, 이는 상기 작용제와 DSCR1 조정제의 병용 작용 (상승 작용)으로 인해 낮아질 수 있다.
질병을 예방 또는 치료하기 위한 투여량 및 투여 방식은 공지된 기준에 따라서 전문의에 의해 선택될 것이다. DSCR1 조정제의 적당한 투여량은 상기 규정된 바와 같은 치료하고자 하는 질병 유형, DSCR1 조정제가 예방 목적으로 투여되는지 아니면 치료 목적으로 투여되든지 간에 질병의 중중도 및 과정, 기존의 요법, 환자의 임상 병력 및 DSCR1 조정제에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 의해 좌우될 것이다. DSCR1 조정제는 환자에게 1회 투여하거나 치료 전 기간에 걸쳐 투여하는 것이 적합하다. 한 양태에서는, DSCR1 조정제를 정맥내 주입 또는 피하 주사에 의해 투여한다. 질병의 유형과 중증도에 따라서, 예를 들어 1회 이상의 별개 투여에 의해서든 아니면 연속식 주입에 의해서든지 간에, 약 1 ㎍/체중 kg 내지 약 50 mg/kg (예를 들어, 1회분당 약 0.1 내지 15 mg/kg)의 항체가 환자에게 투여하기 위한 초기 투여량 후보일 수 있다. 투여 섭생은 DSCR1 조정제 항체 약 4 mg/kg의 초기 부하 용량을 투여한 다음, 매주 약 2 mg/kg의 유지 용량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 그러나, 기타 투여 섭생도 유용할 수 있다. 전형적인 1일 투여량 범위는 상기 언급된 요인들에 따라서 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 이상일 수 있다. 상태에 따라서 수 일에 걸쳐 반복 투여하는 경우의 치료는 질병 증상이 목적하는 수준으로 억제될 때까지 지속한다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 방법 및 검정에 의해 전문의 또는 기타 당업자에게 공지된 기준에 의거하여 용이하게 모니터링할 수 있다.
폴리펩티드 조정제 (예: 폴리펩티드, 항체 등)를 환자에게 투여하는 것 이외에도, 본 발명은 조정제를 유전자 요법에 의해 투여하는 것을 고려한다. 이와 같이 DSCR1 조정제를 암호화/포함하는 핵산을 투여하는 것은 "치료상 유효량의 DSCR1 조정제 투여"란 표현으로써 포괄된다. 예를 들어, 세포내 항체를 생성시키기 위한 유전자 요법의 사용에 관한 WO 96/07321 (1996년 3월 14일자로 공개됨)을 참고할 수 있다.
핵산 (임의로 벡터 내에 함유됨)를 생체내 및 생체 외에서 환자의 세포 내로 유입시키기 위한 2가지 주요 접근법이 있다. 생체내 전달하는 경우에는, 핵산을 통상적으로 DSCR1 조정제를 요구하는 부위에서 환자에게 직접 주사한다. 생체외 처치하는 경우에는, 환자의 세포를 제거하고, 핵산을 이들 분리된 세포 내로 도입하며, 이와 같이 변형시킨 세포를 환자에게 직접 투여하거나, 또는 예를 들어, 다공성 막 내에 피막 형성시켜 이를 환자에게 이식한다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제4,892,538호 및 제5,283,187호]. 핵산을 살아 있는 세포 내로 도입하는데 이용 가능한 각종 기술이 있다. 이러한 기술은 핵산이 시험관내 배양 세포 내로 전이되는지, 아니면 의도한 숙주의 세포에 생체내 전이되는지에 따라서 다양하다. 핵산을 시험관 내에서 포유류 세포 내로 전이하는데 적합한 기술에는 리포솜의 사용, 전기천공, 미세주사, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전법 등이 포함된다. 유전자를 생체외 전달하기 위해 흔히 사용되는 벡터는 레트로바이러스성 벡터이다.
한 양태에서, 생체내 핵산 전이 기술에는 바이러스성 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스, 단순 포진 I 바이러스, 또는 아데노 관련 바이러스)를 이용한 형질감염, 및 지질에 의거한 시스템 (유전자를 지질 매개된 전이시키는데 유용한 지질은, 예를 들어 DOTMA, DOPE 및 DC-Chol이다)이 포함된다. 현재 공지된 유전자 제조 및 유전자 요법 프로토콜에 관한 고찰은 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Anderson et al., Science 256:808-813 (1992); WO 93/25673 및 이에 인용된 참고 문헌].
본 발명의 DSCR1 조정제 항체는 본원의 "항체" 정의에 포괄된 상이한 형태일 수 있다. 따라서, 이러한 항체에는 완전한 길이 또는 본래 항체, 항체 단편, 본래 서열 항체 또는 아미노산 변이체, 인간화, 키메라 또는 융합 항체, 및 그의 기능적 단편이 포함된다.
본 발명은 DSCR1 조정제와 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 추가 양태에서는, 조성물이 DSCR1 조정제를 기타 치료제, 예를 들어 세포독성제 또는 성장 억제제 (화학요법제 포함)와 병용하여 포함할 수 있다. 본 발명은 또한, DSCR1 조정제와 담체를 포함하는 제형을 제공한다. 한 양태에서는, 이러한 제형이 제약상 허용 가능한 담체를 포함하는 치료적 제형이다.
G. 제조품 및 키트
본 발명의 또 다른 양태는 DSCR1 조정제를 사용하여 특정 장애를 치료하는데 유용한 물질을 함유하는 제조품이다. 본 발명의 제조품은 용기, 및 이러한 용기와 연합되거나 그 위의 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기에는, 예를 들어 병, 바이알, 주사기 등이 포함된다. 용기는 각종 재료, 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로부터 형성할 수 있다. 용기는 상기 질환을 치료하는데 유효한 조성물을 보유하고 있고 멸균성 유입 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 상기 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용제 봉지 또는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 한 가지 이상 활성제는 본 발명의 DSCR1 조정제이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 해당 조성물이 특정한 장애를 치료하는데 사용된다는 것을 표시한다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 본 발명의 조성물을 상기 환자에게 투여하는 것에 관한 지시사항을 추가로 포함할 것이다. 부가적으로, 본 발명의 제조품은 제약상 허용 가능한 완충제, 예를 들어 제균성 주사용 수 (BWFI), 인산염 완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상업적 및 사용자 측면에서 바람직한 기타 재료, 예를 들어 기타 완충제, 희석제, 충진제, 바늘 및 주사기를 추가로 포함할 수 있다.
각종 목적에 유용한 키트가 또한 제공된다. DSCR1을 시험관 내에서, 예를 들어 ELISA 또는 웨스턴 블롯에서 탐지 및 정량화하기 위해 본 발명의 DSCR1 조정제를 함유하는 키트를 제공할 수 있다. 제조품의 경우 처럼, 키트는 용기, 및 이러한 용기와 연합되거나 그 위에 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 상기 용기는 본 발명의 하나 이상의 DSCR1 조정제를 포함하는 조성물을 보유하고 있다. 예를 들어, 희석제, 완충액, 대조군 항체를 함유하는 부가의 용기가 포함될 수 있다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물에 관한 기재 사항 뿐만 아니라 의도한 시험관내 용도 또는 탐지 용도에 관한 지시사항을 제공해줄 수 있다.
H. 폴리펩티드 또는 핵산을 포함하는 DSCR1 조정제 - 구체적 형태 및 적용
한 양태에서, 본 발명의 핵산에는 내인성 DSCR1 핵산과 결합할 수 있거나 또는 DSCR1 폴리펩티드를 암호화하는 단일 가닥 핵산 서열 (RNA 또는 DNA)을 포함하는 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드/폴리뉴클레오티드가 포함된다. 본 발명에 따르는 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드는 적어도, DSCR1 DNA의 암호화 영역 단편을 포함한다. 이러한 단편은 일반적으로, 약 14개 이상 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 14 내지 30개 뉴클레오티드를 포함한다. 소정의 단백질을 암호화하는 cDNA 서열에 의거하여 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 유도시킬 수 있는 능력이, 예를 들어 문헌 [참고: Stein and Cohen (Cancer Res. 48:2659, 1988) and van der Krol et al. (BioTechniques 6:958, 1988)]에 기재되어 있다.
안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 표적 핵산 서열과 결합시키면, 이중체의 분해 증강, 전사 또는 해독의 미성숙한 종결을 포함한 여러 수단 중의 한 가지 수단에 의해, 또는 기타 수단에 의해 표적 서열의 전사 또는 해독을 차단시키는 이중체가 형성된다. 이러한 방법이 본 발명에 포괄된다. 따라서, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하여 내피 세포에서의 DSCR1 단백질의 발현을 차단시킬 수 있다. 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드는 변형된 당-포스포디에스테르 주쇄 (또는 예를 들어, WO 91/06629에 기재된 바와 같은 기타 당 연쇄)를 갖는 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 이러한 당 연쇄는 내인성 뉴클레아제에 대해 저항성이다. 이와 같이 저항성 당 연쇄를 수반한 올리고뉴클레오티드는 생체 내에서 안정적이지만 (즉, 효소적 분해에 대해 저항할 수 있다), 표적 뉴클레오티드 서열과 결합할 수 있는 서열 특이성을 보유하고 있다.
안티센스 결합을 위해 바람직한 유전자내 부위에는 해당 유전자의 개방 판독 프레임 (ORF)의 해독 개시/출발 코돈 (5'-AUG / 5'-ATG) 또는 종결/정지 코돈 (5'-UAA, 5'-UAG 및 5-UGA / 5'-TAA, 5'-TAG 및 5'-TGA)이 혼입된 영역이 포함된다. 이들 영역은 해독 개시 또는 종결 코돈으로부터의 어느 한 방향 (즉, 5' 또는 3')에서 약 25개 내지 약 50개의 연속되는 뉴클레오티드를 포괄하는 유전자 또는 mRNA의 특정 부분을 지칭한다. 안티센스 결합을 위한 기타 예시 영역에는 다음이 포함된다: 인트론; 엑손; 인트론-엑손 연접부; 해독 개시 코돈과 해독 종결 코돈 사이의 영역인 개방 판독 프레임 (ORF) 또는 "암호화 영역"; 5'-5' 트리포스페이트 연쇄를 통하여 mRNA의 5'-대부분 잔기와 연결된 N7-메틸화 구아노신 잔기를 포함하고 5' 캡 구조 자체 뿐만 아니라 이러한 캡에 인접한 처음 50개 뉴클레오티드가 포함되는 mRNA의 5' 캡; 해독 개시 코돈으로부터 5' 방향에서 mRNA의 일부이므로, 5' 캡 부위와 유전자 상의 상응하는 뉴클레오티드 또는 mRNA의 해독 개시 코돈 사이의 뉴클레오티드를 포함하는, 5' 비해독 영역 (5'UTR); 및 해독 종결 코돈으로부터 3' 방향에서 mRNA의 일부이므로, 해독 종결 코돈과 유전자 상의 상응하는 뉴클레오티드 또는 mRNA의 3' 말단 사이의 뉴클레오티드를 포함하는, 3' 비해독 영역 (3'UTR).
DSCR1 폴리펩티드의 발현을 억제하는데 유용한 안티센스 화합물의 구체적인 예에는 변형된 주쇄 또는 비-천연 뉴클레오티드간 연쇄를 함유하는 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 변형된 주쇄를 갖는 올리고뉴클레오티드에는 주쇄에 인 원자를 보유하고 있는 것과, 주쇄에 인 원자를 갖지 않는 것이 포함된다. 본 명세서의 목적상, 및 당해 분야에 종종 인용된 바와 같이, 그들의 뉴클레오시드간 주쇄에 인 원자를 갖지 않는 변형된 올리고뉴클레오티드는 또한, 올리고뉴클레오시드인 것으로 간주될 수 있다. 예시되는 변형된 올리고뉴클레오티드 주쇄에는, 예를 들어 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 기타 알킬 포스포네이트, 예를 들어 3'-알킬렌 포스포네이트, 5'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포르아미데이트, 예를 들어 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 셀레노포스페이트 및 보라노-포스페이트 (정상적인 3'-5' 연쇄를 갖는다), 이들의 2'-5' 연결된 유사체, 및 역위 (inverted) 극성을 지닌 것 (여기서, 하나 이상의 뉴클레오티드간 연쇄는 3'-3', 5'-5' 또는 2'-2' 연쇄이다)이 포함된다. 역위 극성을 지닌 것으로 예시되는 올리고뉴클레오티드는 3'-대부분 뉴클레오티드간 연쇄에 단일 3'-3' 연쇄를 포함하는데, 즉 단일 역위 뉴클레오시 잔기는 탈염기성일 수 있다 (뉴클레오염기가 결여되거나 그 대신 히드록실기를 갖는다). 각종 염, 혼합 염 및 자유 산 형태가 또한 포함된다. 인 함유 연쇄의 제조 방법을 교시하고 있는 대표적인 미국 특허에는 미국 특허 제3,687,808호; 제4,469,863호; 제4,476,301호; 제5,023,243호; 제5,177,196호; 제5,188,897호; 제5,264,423호; 제5,276,019호; 제5,278,302호; 제5,286,717호; 제5,321,131호; 제5,399,676호; 제5,405,939호; 제5,453,496호; 제5,455,233호; 제5,466,677호; 제5,476,925호; 제5,519,126호; 제5,536,821호; 제5,541,306호; 제5,550,111호; 제5,563,253호; 제5,571,799호; 제5,587,361호; 제5,194,599호; 제5,565,555호; 제5,527,899호; 제5,721,218호; 제5,672,697호 및 제5,625,050호 (이들 각각이 본원에 참고로 도입된다)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
내부에 인 원자를 포함하지 않는 변형된 올리고뉴클레오티드 주쇄의 예는 단쇄 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 연쇄, 혼합 헤테로원자 및 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 연쇄, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로사이클릭 뉴클레오시드간 연쇄에 의해 형성되는 주쇄를 갖는다. 이들에는 모르폴리노 연쇄 (뉴클레오시드의 당 부분으로부터 부분적으로 형성됨)를 갖는 주쇄; 실록산 주쇄; 설파이드, 설폭시드 및 설폰 주쇄; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 주쇄; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 주쇄; 리보아세틸 주쇄; 알켄 함유 주쇄; 설파메이트 주쇄; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 주쇄; 설포네이트 및 설폰아미드 주쇄; 아미드 주쇄; 및 혼합 N, O, S 및 CH2 성분을 갖는 기타 주쇄가 포함된다. 이러한 올리고뉴클레오시드의 제조 방법을 교시하고 있는 대표적인 미국 특허에는 미국 특허 제5,034,506호; 제5,166,315호; 제5,185,444호; 제5,214,134호; 제5,216,141호; 제5,235,033호; 제5,264,562호; 제5,264,564호; 제5,405,938호; 제5,434,257호; 제5,466,677호; 제5,470,967호; 제5,489,677호; 제5,541,307호; 제5,561,225호; 제5,596,086호; 제5,602,240호; 제5,610,289호; 제5,602,240호; 제5,608,046호; 제5,610,289호; 제5,618,704호; 제5,623,070호; 제5,663,312호; 제5,633,360호; 제5,677,437호; 제5,792,608호; 제5,646,269호 및 제5,677,439호 (이들 각각이 본원에 참고로 도입된다)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
안티센스 올리고뉴클레오티드의 기타 예에서는, 뉴클레오티드 단위의 당과 뉴클레오시드간 연쇄, 즉 주쇄 둘 다를 신규한 기로 대체시킨다. 적당한 핵산 표적 화합물과의 혼성화를 위해 염기 단위를 유지시킨다. 탁월한 혼성화 특성을 지닌 것으로 밝혀진 올리고뉴클레오티드 모방체인 상기 하나의 올리고머성 화합물이 펩티드 핵산 (PNA)으로서 지칭된다. PNA 화합물에서는, 올리고뉴클레오티드의 당-주쇄를 아미드 함유 주쇄, 특히 아미노에틸글리신 주쇄로 대체시킨다. 뉴클레오염기를 유지시키고, 이를 상기 주쇄의 아미드 부분의 아자 질소 원소에 직접 또는 간접적으로 결합시킨다. PNA 화합물의 제조 방법을 교시하고 있는 대표적인 미국 특허에는 미국 특허 제5,539,082호; 제5,714,331호; 및 제5,719,262호 (이들 각각이 본원에 참고로 도입된다)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. PNA 화합물의 추가의 교시는 문헌 [참고: Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500]에 보고되었다.
안티센스 올리고뉴클레오티드의 예에는 포스포로티오에이트 주쇄 및/또는 헤테로원자 주쇄, 및 특히 상기 참고된 미국 특허 제5,489,677호에 기재된 -CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2- [메틸렌 (메틸이미노) 또는 MMI 주쇄로서 공지됨], -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- 및 -O-N(CH3)-CH2-CH2- [여기서, 본래 포스포디에스테르 주쇄는 -0-P-O-CH2-로서 나타낸다], 및 상기 참고된 미국 특허 제5,602,240호에 기재된 아미드 주쇄가 혼입된다. 부가의 예는 상기 참고된 미국 특허 제5,034,506호의 모르폴리노 주쇄 구조를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
변형된 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 치환된 당 부분을 함유할 수도 있다. 예시되는 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에 다음 중의 어느 하나를 포함한다: OH; F; O-알킬, S-알킬 또는 N-알킬; O-알케닐, S-알케닐 또는 N-알케닐; O-알키닐, S-알키닐 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬 [여기서, 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환되거나 치환되지 않은 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐일 수 있다]. 특히 바람직한 것은 O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, 및 O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2 [여기서, n 및 m은 1 내지 약 10이다]이다. 기타 예시되는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에 다음 중의 어느 하나를 포함한다: C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알케닐, 알키닐, 알카릴, 아르알킬, O-알카릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2 CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단기, 리포터기, 삽입제, 올리고뉴클레오티드의 약동학적 특성을 개선시키기 위한 기, 또는 올리고뉴클레오티드의 약력학적 특성을 개선시키기 위한 기, 및 유사한 특성을 지닌 기타 치환체. 한 가지 가능한 변형물에는 2'-메톡시에톡시 [2'-0-CH2CH2OCH3; 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로서 공지되기도 함] [참고: Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504], 즉 알콕시알콕시기가 포함된다. 추가의 바람직한 변형물에는 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 즉 O(CH2)2ON(CH3)2 기 (2'-DMAOE로서 공지되기도 함), 및 2'-디메틸아미노에톡시에톡시 (2'-O-디메틸아미노에톡시 에틸 또는 2'-DMAEOE로서 당해 분야에 공지되기도 함), 즉 2'-0-CH2-O-CH2-N(CH2)가 포함된다.
추가의 변형물에는 2'-히드록실기를 당 환의 3' 또는 4' 탄소 원자에 연결시킴으로써 바이사이클릭 당 부분을 형성시킨 고정 핵산 [Locked Nucleic Acids (LNAs)]이 포함된다. 이러한 연쇄는 2' 산소 원자와 4' 탄소 원자를 브릿징하는 메틸렌 (-CH2-)n 기 (여기서, n은 1 또는 2이다)일 수 있다. LNAs 및 그의 제조 방법은 WO 98/39352 및 WO 99/14226에 기재되어 있다.
기타 변형물에는 2'-메톡시 (2'-0-CH3), 2'-아미노프로폭시 (2'- OCH2CH2CH2NH2), 2'-알릴 (2'-CH2-CH=CH2), 2'-0-알릴 (2'-0-CH2-CH=CH2) 및 2'-플루오로 (2'-F)가 포함된다. 이러한 2'-변형물은 아라비노 (상단) 위치 또는 리보 (하단) 위치에 존재할 수 있다. 한 가지 2'-아라비노 변형물은 2'-F이다. 유사한 변형물은 올리고뉴클레오티드 상의 기타 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오티드 상의 또는 2'-5' 연결된 올리고뉴클레오티드 내의 당의 3' 위치, 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서 만들어질 수도 있다. 올리고뉴클레오티드는 펜토푸라노실 당 대신에 시클로부틸 부분과 같은 당 모방체를 가질 수도 있다. 이러한 변형된 당 구조물의 제조 방법을 교시하고 있는 대표적인 미국 특허에는 미국 특허 제4,981,957호; 제5,118,800호; 제5,319,080호; 제5,359,044호; 제5,393,878호; 제5,446,137호; 제5,466,786호; 제5,514,785호; 제5,519,134호; 제5,567,811호; 제5,576,427호; 제5,591,722호; 제5,597,909호; 제5,610,300호; 제5,627,053호; 제5,639,873호; 제5,646,265호; 제5,658,873호; 제5,670,633호; 제5,792,747호; 및 제5,700,920호 (이들 각각이 본원에 참고로 도입된다)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
올리고뉴클레오티드에는 뉴클레오염기 (당해 분야에서 종종 간단히 "염기"로서 지칭되기도 함) 변형물 또는 치환물이 포함될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "변형되지 않은" 또는 "천연" 뉴클레오염기에는 퓨린 염기 아데닌 (A) 및 구아닌 (G), 및 피리미딘 염기 티민 (T), 시토신 (C) 및 우라실 (U)이 포함된다. 변형된 뉴클레오염기에는 기타 합성 및 천연 뉴클레오염기, 예를 들어 5-메틸시토신 (5-me-C), 5-히드록시메틸 시토신, 크산틴, 히포크산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 기타 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 기타 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 피리미딘 염기의 5-프로피닐 (-C≡C-CH3 또는 -CH2-C≡CH) 우라실 및 시토신 및 기타 알키닐 유도체, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 기타 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 기타 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌, 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌이 포함된다. 추가의 변형된 뉴클레오염기에는 트리사이클릭 피리미딘, 예를 들어 페녹사진 시티딘 (lH-피리미도[5,4-b][l,4]벤족사진-2(3H)-온), 페노티아진 시티딘 (lH-피리미도[5,4-b][l,4]벤조티아진-2(3H)-온), G-클램프, 예를 들어 치환된 페녹사진 시티딘 [예: 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도[5,4-b][l,4]벤족사진-2(3H)-온], 카바졸 시티딘 (2H-피리미도[4,5-b]인돌-2-온), 피리도인돌 시티딘 (H-피리도[3',2':4,5]피롤로[2,3-d]피리미딘-2-온)이 포함된다. 변형된 뉴클레오염기에는 퓨린 또는 피리미딘 염기를 기타 헤테로사이클로 대체시킨 것, 예를 들어 7-데아자아데닌, 7-데아자구아닌, 2-아미노피리딘 및 2-피리돈이 포함될 수도 있다. 추가의 뉴클레오염기에는 미국 특허 제3,687,808호에 기재된 것, 문헌 [참고: The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990]에 기재된 것, 및 문헌 [참고: Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613]에 기재된 것이 포함된다. 이들 뉴클레오염기 중의 특정의 것이 본 발명의 올리고머성 화합물의 결합 친화성을 증가시키는데 특히 유용하다. 이에는 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘, 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린, 예를 들어 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신이 포함된다. 5-메틸시토신 치환물이 핵산 이중체 안정성을 0.6 내지 1.2℃ 증가시키는 것으로 밝혀졌고 [참고: Sanghvi et al, Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278], 예를 들어 2'-O-메톡시에틸 당 변형물과 조합된 경우에 예시되는 염기 치환물이다. 변형된 뉴클레오염기의 제조 방법을 교시하는 대표적인 미국 특허에는 미국 특허 제3,687,808호 뿐만 아니라 미국 특허 제4,845,205호; 제5,130,302호; 제5,134,066호; 제5,175,273호; 제5,367,066호; 제5,432,272호; 제5,457,187호; 제5,459,255호; 제5,484,908호; 제5,502,177호; 제5,525,711호; 제5,552,540호; 제5,587,469호; 제5,594,121호; 제5,596,091호; 제5,614,617호; 제5,645,985호; 제5,830,653호; 제5,763,588호; 제6,005,096호; 제5,681,941호 및 제5,750,692호 (이들 각각이 본원에 참고로 도입된다)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
안티센스 올리고뉴클레오티드의 또 다른 변형은 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포성 분포도 또는 세포성 섭취를 증강시키는 하나 이상의 부분 또는 접합체를, 올리고뉴클레오티드에 화학적으로 연결시키는 것을 포함한다. 본 발명의 화합물에는 1급 또는 2급 히드록실기 등의 관능기에 공유적으로 결합된 공액군 (conjugate group)이 포함될 수 있다. 본 발명의 공액군에는 삽입제, 리포터 분자, 폴리아민, 폴리아미드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에테르, 올리고머의 약력학적 특성을 증강시키는 기, 및 올리고머의 약동학적 특성을 증강시키는 기가 포함된다. 전형적인 공액군에는 콜레스테롤, 지질, 양이온 지질, 인지질, 양이온성 인지질, 바이오틴, 페나진, 폴레이트, 페난트리딘, 안트라퀴논, 아크리딘, 플루오레세인, 로다민, 쿠마린, 및 염료가 포함된다. 본 발명과 관련하여 약력학적 특성을 증강시키는 기에는 올리고머 섭취를 개선시키고/시키거나 올리고머 내분해성을 증강시키고/시키거나 RNA와의 서열-특이적 혼성화를 강화시키는 기가 포함된다. 본 발명과 관련하여 약동학적 특성을 증강시키는 기에는 올리고머 섭취, 분포, 대사 또는 배출을 개선시키는 기가 포함된다. 공액 부분에는 지질 부분, 예를 들어 콜레스테롤 부분 [참고: Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556], 콜산 [참고: Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060], 티오에테르, 예를 들어 헥실-S-트리틸티올 [참고: Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770], 티오콜레스테롤 [참고: Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538], 지방족 쇄, 예를 들어 도데칸디올 또는 운데실 잔기 [참고: Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54], 인지질, 예를 들어 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸-암모늄 l,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트 [참고: Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783], 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄 [참고: Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973], 또는 아다만탄 아세트산 [참고: Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654], 팔미틸 부분 [참고: Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237], 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카보닐-옥시콜레스테롤 부분이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 또한, 활성 약물 물질, 예를 들어 아스프린, 와르파린, 페닐부타존, 이부프로펜, 수프로펜, 펜부펜, 케토프로펜, (S)-(+)-프라노프로펜, 카르프로펜, 단실사르코신, 2,3,5-트리요오도벤조산, 플루페남산, 폴린산, 벤조티아디아지드, 클로로티아지드, 디아제핀, 인도메티신, 바르비투레이트, 세팔로스포린, 설파 약물, 항당뇨병제, 항균제 또는 항생제와 접합시킬 수도 있다. 올리고뉴클레오티드-약물 접합체 및 그들의 제조 방법이 미국 특허원 제09/334,130호 (1999년 6월 15일자로 출원됨) 및 미국 특허 제4,828,979호; 제4,948,882호; 제5,218,105호; 제5,525,465호; 제5,541,313호; 제5,545,730호; 제5,552,538호; 제5,578,717호; 제5,580,731호; 제5,580,731호; 제5,591,584호; 제5,109,124호; 제5,118,802호; 제5,138,045호; 제5,414,077호; 제5,486,603호; 제5,512,439호; 제5,578,718호; 제5,608,046호; 제4,587,044호; 제4,605,735호; 제4,667,025호; 제4,762,779호; 제4,789,737호; 제4,824,941호; 제4,835,263호; 제4,876,335호; 제4,904,582호; 제4,958,013호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,245,022호; 제5,254,469호; 제5,258,506호; 제5,262,536호; 제5,272,250호; 제5,292,873호; 제5,317,098호; 제5,371,241호; 제5,391,723호; 제5,416,203호; 제5,451,463호; 제5,510,475호; 제5,512,667호; 제5,514,785호; 제5,565,552호; 제5,567,810호; 제5,574,142호; 제5,585,481호; 제5,587,371호; 제5,595,726호; 제5,597,696호; 제5,599,923호; 제5,599,928호 및 제5,688,941호 (이들 각각이 본원에 참고로 도입된다)에 기재되어 있다.
소정의 화합물 내의 모든 위치를 균일하게 변형시킬 필요는 없으며, 사실상 전술된 변형물들 중의 하나 이상이 단일 화합물 내에 혼입되거나 심지어 올리고뉴클레오티드 내의 단일 뉴클레오시드에 혼입될 수 있다. 본 발명은 또한, 키메라 화합물인 안티센스 화합물을 포함한다. 본 발명와 관련하여, "키메라" 안티센스 화합물 또는 "키메라"는 2가지 이상의 화학적으로 별개의 영역 (각각은 하나 이상의 단량체 단위, 즉 올리고뉴클레오티드 화합물의 경우에는 뉴클레오티드로 구성된다)을 함유하는 안티센스 화합물, 특히 올리고뉴클레오티드이다. 이들 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 하나 이상의 영역을 함유하는데, 이러한 올리고뉴클레오티드에 뉴클레아제 분해에 대한 저항성 증가, 세포성 섭취 증가, 및/또는 표적 핵산에 대한 결합 친화성 증가를 부여해 주도록 올리고뉴클레오티드를 변형시킨다. 올리고뉴클레오티드의 부가 영역은 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 하이브리드를 절단할 수 있는 효소에 대한 기질로서 제공될 수 있다. 예를 들어, RNase H는 RNA:DNA 이중체의 RNA 가닥을 절단시키는 세포성 엔도뉴클레아제이다. 따라서, RNase H를 활성화시키면, RNA 표적이 절단되고, 이로써 유전자 발현의 올리고뉴클레오티드 억제 효율이 상당히 증강된다. 결과적으로, 키메라 올리고뉴클레오티드를 사용하는 경우에는, 동일한 표적 영역과 혼성화하는 포스포로티오에이트 데옥시올리고뉴클레오티드와 비교해서 보다 짧은 올리고뉴클레오티드를 사용하여도 필적하는 결과가 종종 수득될 수 있다. 본 발명의 키메라 안티센스 화합물은 상기 언급된 바와 같은, 2개 이상의 올리고뉴클레오티드, 변형된 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드 및/또는 올리고뉴클레오티드 모방체의 복합 구조물로서 형성될 수 있다. 예시되는 키메라 안티센스 올리고뉴클레오티드에는 뉴클레아제 저항성을 부여하기 위해 3' 말단에 하나 이상의 2' 변형된 당 (바람직하게는, 2'-O-(CH2)2-O-CH3)이 혼입되고, RNase H 활성을 부여하기 위해 4개 이상의 연속되는 2'-H 당을 수반한 영역이 혼입되어 있다. 이러한 화합물은 당해 분야에서 하이브리드 또는 갭머 (gapmer)로서 지칭되기도 하였다. 예시되는 갭머는 3' 말단에 2' 변형된 당 (바람직하게는, 2'-O-(CH2)2-O-CH3) 영역을 갖고 있고, 5' 말단에서는 4개 이상의 연속되는 2'-H 당을 갖는 하나 이상의 영역에 의해 격리되어 있으며, 포스포로티오에이트 주쇄 연쇄가 혼입될 수 있다. 이러한 하이브리드 구조물의 제조 방법을 교시하고 있는 대표적인 미국 특허에는 미국 특허 제5,013,830호; 제5,149,797호; 제5,220,007호; 제5,256,775호; 제5,366,878호; 제5,403,711호; 제5,491,133호; 제5,565,350호; 제5,623,065호; 제5,652,355호; 제5,652,356호; 및 제5,700,922호 (이들 각각이 본원에 참고로 도입된다)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따라서 사용된 안티센스 화합물은 널리 공지된 고체 상 합성 기술을 통하여 편리하고도 통상적으로 만들 수 있다. 이러한 합성을 위한 장비는 여러 판매인 [예: Applied Biosystems (Foster City, Calif.)]이 판매하고 있다. 당해 분야에 공지된 상기 합성을 위한 기타 모든 수단이 부가적으로 또는 대안적으로 이용될 수 있다. 포스포로티오에이트 및 알킬화 유도체 등의 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위해 유사한 기술을 사용하는 것은 널리 공지되어 있다. 본 발명의 화합물은 또한, 섭취, 분포 및/또는 흡수를 촉진시키기 위해, 기타 분자, 분자 구조물 또는 화합물의 혼합물, 예를 들어 리포솜, 수용체 표적화 분자, 경구, 직장, 국소 또는 기타 제형과 혼합하거나, 피막 형성시키거나, 접합시키거나 또는 연합시킬 수 있다. 이러한 섭취, 분포 및/또는 흡수 촉진성 제형의 제조 방법을 교시하고 있는 대표적인 미국 특허에는 미국 특허 제5,108,921호; 제5,354,844호; 제5,416,016호; 제5,459,127호; 제5,521,291호; 제5,543,158호; 제5,547,932호; 제5,583,020호; 제5,591,721호; 제4,426,330호; 제4,534,899호; 제5,013,556호; 제5,108,921호; 제5,213,804호; 제5,227,170호; 제5,264,221호; 제5,356,633호; 제5,395,619호; 제5,416,016호; 제5,417,978호; 제5,462,854호; 제5,469,854호; 제5,512,295호; 제5,527,528호; 제5,534,259호; 제5,543,152호; 제5,556,948호; 제5,580,575호; 및 제5,595,756호 (이들 각각이 본원에 참고로 도입된다)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 기타 예에는 유기 부분, 예를 들어 WO 90/10048에 기재된 것, 및 표적 핵산 서열에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화성을 증가시키는 기타 부분, 예를 들어 폴리-(L-리신)과 공유적으로 연결되는 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 추가로, 삽입제, 예를 들어 엘리프티신, 및 알킬화제 또는 금속 착물을 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 부착시켜 표적 뉴클레오티드 서열에 대한 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드의 결합 특이성을 변형시킬 수 있다.
안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를, 모든 유전자 전이 방법, 예를 들어 CaPO4-매개된 DNA 형질감염, 전기천공에 의해, 또는 유전자 전이 벡터, 예를 들어 엡슈타인-바르 (Epstein-Barr) 바이러스를 사용함으로써, 표적 핵산 서열을 함유하는 세포 내로 도입할 수 있다. 예시 과정에서는, 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 적합한 레트로바이러스성 벡터 내로 삽입한다. 표적 핵산 서열을 함유하는 세포를 재조합 레트로바이러스성 벡터와 생체내 또는 생체외에서 접촉시킨다. 적합한 레트로바이러스성 벡터에는 뮤린 레트로바이러스 M-MuLV, N2 (M-MuLV로부터 유래된 레트로바이러스)로부터 유래된 벡터, 또는 DCT5A, DCT5B 및 DCT5C로 명명된 이중 카피 벡터가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다 [참고: WO 90/13641].
센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 또한, WO 91/04753에 기재된 바와 같이, 리간드 결합성 분자와 접합체를 형성함으로써 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 세포 내로 도입할 수도 있다. 적합한 리간드 결합성 분자에는 세포 표면 수용체, 성장 인자, 기타 사이토킨, 또는 세포 표면 수용체와 결합하는 기타 리간드가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, 리간드 결합성 분자의 접합은 리간드 결합성 분자가 그의 상응하는 분자 또는 수용체와 결합할 수 있는 능력, 또는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 그의 접합된 버젼이 세포 내로 유입되는 것을 차단시킬 수 있는 능력을 실질적으로 방해하지 않는다.
또 다른 한편, 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 WO 90/10448에 기재된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드-지질 복합체를 형성함으로써 표적 핵산 서열을 함유하는 세포 내로 도입할 수 있다. 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드-지질 복합체는 내인성 리파제에 의해 세포 내에서 해리되는 것이 바람직하다.
안티센스 또는 센스 RNA 또는 DNA 분자는 일반적으로, 길이가 약 5개 이상 뉴클레오티드, 또 다른 한편으론 길이가 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 또는 1000개 이상 뉴클레오티드인데, 이와 관련하여 용어 "약"은 상기 기준된 뉴클레오티드 서열 길이 +/- 10%를 의미한다.
DSCR1 조정제 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 유전자 요법에 사용할 수도 있다. 유전자 요법 적용에서는, 치료상 유효한 유전적 생성물의 생체내 합성을 달성하기 위해, 예를 들어 결함있는 유전자를 교체시키기 위해, 유전자를 세포 내로 도입한다. "유전자 요법"에는 지속적인 효과가 단일 치료법에 의해 달성되는 통상적인 유전자 요법과, 치료상 유효한 DNA 또는 mRNA를 1회 투여하거나 반복 투여하는 것을 포함하는 유전자 치료제의 투여법이 포함된다. 안티센스 RNAs 및 DNAs를, 생체 내에서 특정 유전자의 발현을 차단시키기 위한 치료제로서 사용할 수 있다. 짧은 안티센스 올리고뉴클레오티드를 세포 내로 유입하면, 이들은 세포 막에 의해 그들의 섭취가 제한됨으로써 세포내 농도가 낮음에도 불구하고, 억제제로서 작용할 수 있다는 사실이 이미 밝혀졌다 [참고: Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4143-4146 (1986)]. 이러한 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 그들의 음 전하를 띤 포스포디에스테르기를 전하를 띠지 않은 기로 치환시킴으로써, 그들의 섭취를 증강시키도록 변형시킬 수 있다.
핵산을 살아 있는 세포 내로 도입하는데 이용 가능한 각종 기술이 있다. 이러한 기술은 핵산이 시험관 내에서 배양된 세포 내로 전이되는지 아니면 의도한 숙주의 생체내 세포에 전이되는지에 따라서 다양하다. 핵산을 시험관 내에서 포유류 세포 내로 전이시키는데 적합한 기술에는 리포솜의 사용, 전기천공, 미소주사, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전법 등이 포함된다. 현재 바람직한 생체내 유전자 전이 기술에는 바이러스성 (전형적으로, 레트로바이러스성) 벡터로의 형질감염 및 바이러스성 외피 단백질-리포솜 매개된 형질감염이 포함된다 [참고: Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205-210 (1993)]. 몇몇 상황 하에서는, 핵산 공급원에, 표적 세포를 표적으로 하는 작용제, 예를 들어 세포 표면 막 단백질 또는 표적 세포에 대해 특이적인 항체, 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드 등을 제공하는 것이 요망된다. 리포솜을 이용하는 경우에는, 세포내 이입과 연관된 세포 표면 막 단백질과 결합하는 단백질, 예를 들어 특정한 세포 유형에 대해 지향성인 캡시드 단백질 또는 그의 단편, 순환시 내재화를 진행하는 단백질에 대한 항체, 세포내 국재화를 표적으로 하고 세포내 반감기를 증강시키는 단백질을 사용하여 표적화하고/하거나 섭취를 촉진시킬 수 있다. 수용체-매개된 세포내 이입 기술은, 예를 들어 문헌 [참고: Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); and Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)]에 기재되어 있다. 유전자 제조 및 유전자 요법 프로토콜에 대한 고찰은 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Anderson et al., Science 256, 808-813 (1992)].
본 발명의 DSCR1 조정제 폴리펩티드 및 핵산 분자는 조직 형별 검사를 위해 진단적으로 사용될 수 있는데, DSCR1 폴리펩티드는 동일한 조직 유형의 정상 조직과 비교해서 바람직하게는 병든 조직에서 서로 비교되는 바와 같이 한 조직에서 시차적으로 발현될 수 있다.
본 발명은 DSCR1을 조정하는 것을 확인하기 위해 화합물을 스크리닝하는 방법을 포괄한다. 길항제 약물 후보에 대한 스크리닝 검정은 DSCR1 폴리펩티드와 결합하거나 이와 복합체를 형성하거나, 또는 그 밖에 DSCR1 폴리펩티드와 기타 세포성 단백질과의 상호 작용을 방해하는, 예를 들어 세포로부터의 DSCR1 폴리펩티드의 발현을 억제하는 화합물을 확인하도록 고안된다. 이러한 스크리닝 검정에는 소분자 약물 후보를 확인하는데 특히 적합하도록 만드는, 화학적 라이브러리를 고-처리능력 스크리닝할 수 있는 검정이 포함될 것이다.
이러한 검정은 각종 포맷, 예를 들어 당해 분야에 널리 성상 확인된 단백질-단백질 결합 검정, 생화학적 스크리닝 검정, 면역검정 및 세포에 의거한 검정으로 수행할 수 있다.
길항제에 대한 모든 검정은 약물 후보와 DSCR1 폴리펩티드간의 접촉을, 이들 두 성분이 상호 작용하기에 충분한 조건 및 시간 하에 수행한다는 점에서 통상적인 것이다.
결합 검정에서는, 이러한 상호 작용이 결합이고, 형성된 복합체는 반응 혼합물에서 분리 또는 탐지할 수 있다. 특정한 양태에서는, DSCR1 폴리펩티드 또는 약물 후보를 공유 또는 비-공유 부착에 의해 고체 상, 예를 들어 미세역가 판 상에 고정화시킨다. 비-공유 부착은 일반적으로, 고체 표면을 DSCR1 폴리펩티드의 용액으로 피복시킨 다음 건조시킴으로써 달성한다. 또 다른 한편, 고정화시키고자 하는 DSCR1 폴리펩티드에 대해 특이적인 고정화 항체, 예를 들어 모노클로날 항체를 사용하여 이를 고체 표면에 고정시킬 수 있다. 탐지 가능한 표지에 의해 표지될 수 있는 비-고정화 성분을 고정화 성분, 예를 들어 고정된 성분을 함유하는 피복된 표면에 부가함으로써 검정을 수행한다. 반응이 완료되면, 반응되지 않은 성분들을, 예를 들어 세척에 의해 제거하고, 고체 표면 상에 고정된 복합체를 탐지한다. 본래의 비-고정화 성분이 탐지 가능한 표지를 수반하는 경우에는, 표면 상에 고정화된 표지가 탐지된다는 것은 복합체 형성이 이루어졌다는 지표이다. 본래의 비-고정화 성분이 표지를 수반하지 않는 경우에는, 예를 들어 고정화 복합체와 특이적으로 결합하는 표지된 항체를 사용함으로써 복합체 형성을 탐지할 수 있다.
후보 화합물이 DSCR1 폴리펩티드와 상호 작용은 하지만 이와 결합되지 않는 경우에는, 이러한 화합물과 DSCR1과의 상호 작용은 단백질-단백질 상호 작용을 탐지하는 것으로 널리 공지된 방법에 의해 검정할 수 있다. 이러한 검정에는 전통적인 접근법, 예를 들어 가교 결합, 공동-면역침전, 및 구배 또는 크로마토그래피 칼럼을 통한 공동-정제가 포함된다. 또한, 단백질-단백질 상호 작용은 문헌 [참고: Fields and Song, Nature (London), 340:245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:9578-9582 (1991); Chevray and Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 5789-5793 (1991)]에 기재된 바와 같은, 효모에 의거한 유전 시스템을 사용함으로써 모니터링할 수 있다. 많은 전사 활성인자, 예를 들어 효모 GAL4는 2개의 물리적으로 별개의 모듈상 도메인으로 이루어지는데, 하나는 DNA-결합성 도메인으로서 작용하고, 다른 하나는 전사-활성화 도메인으로서 기능한다. 전술된 공개문헌에 기재된 효모 발현 시스템 (일반적으로, "2-하이브리드 시스템"으로서 지칭됨)은 이러한 특성을 활용하고, 2-하이브리드 단백질을 이용하는데, 하나에서는 표적 단백질이 GAL4의 DNA-결합성 도메인과 융합되고, 다른 하나에서는 후보 활성화 단백질이 활성화 도메인과 융합된다. GAL4-활성화 프로모터의 제어 하에 GALl-lacZ 리포터 유전자의 발현은 단백질-단백질 상호 작용을 통한 GAL4 활성의 재구성에 좌우된다. 상호 작용하는 폴리펩티드를 함유하는 집락은 β-갈락토시다제에 대한 발색 기질을 이용하여 탐지한다. 2-하이브리드 기술을 사용하여 2개의 특이적 단백질 간의 단백질-단백질 상호 작용을 확인하기 위한 완전한 키트 (MATCHMAKER™)는 공급처 (Clontech)로부터 시판되고 있다. 이러한 시스템은 특이적 단백질 상호 작용에 관여하는 단백질 도메인을 지도화하도록 연장시킬 수 있을 뿐만 아니라 이들 상호 작용에 있어 결정적인 아미노산 잔기의 위치를 정확히 지적하기 위해 연장시킬 수 있다.
DSCR1과 기타 세포내 또는 세포외 구성분과의 상호 작용을 방해하는 화합물은 다음과 같이 시험할 수 있다: 통상적으로, DSCR1과 세포내 또는 세포외 구성분을 함유하는 반응 혼합물을, 이들 두 생성물의 상호 작용과 결합을 허용해 주는 조건 및 시간 하에 제조한다. 결합을 억제할 수 있는 후보 화합물의 능력을 시험하기 위해, 반응을 시험 화합물의 부재 및 존재 하에 수행한다. 또한, 플라시보를 제3 반응 혼합물에 가하여 양성 대조군으로서 작용하도록 할 수 있다. 시험 화합물과, 혼합물에 존재하는 세포내 또는 세포외 구성분 간의 결합 (복합체 형성)을 상기 언급된 바와 같이 모니터링한다. 대조군 반응물에서는 복합체를 형성하지만, 시험 화합물을 함유하는 반응 혼합물에서는 그렇치 못한 것은, 시험 화합물이 그의 반응 파트너와 상호 작용하는 것을 시험 화합물이 방해한다는 지표이다.
길항제에 대해 검정하기 위해, DSCR1 폴리펩티드를, 특정한 활성을 알아보기 위해 스크리닝하고자 하는 화합물과 함께 세포에 가할 수 있고, DSCR1 폴리펩티드의 존재 하에 관심있는 활성을 억제할 수 있는 상기 화합물의 능력은, 이러한 화합물이 DSCR1 폴리펩티드에 대한 길항제라는 지표이다. DSCR1 폴리펩티드를, 예를 들어 방사능에 의해 표지시켜, 수용체 분자와 결합된 DSCR1 폴리펩티드 분자 수를 이용하여 잠재적 길항제의 효능을 결정할 수 있다.
잠재적 DSCR1 길항제는 안티센스 기술을 사용하여 제조된 안티센스 RNA 또는 DNA 구조물인데, 이러한 기술에서는, 예를 들어 안티센스 RNA 또는 DNA 분자가 표적화 mRNA와 혼성화하고 단백질 해독을 방지함으로써 mRNA의 해독을 직접적으로 차단시키는 작용을 한다. 안티센스 기술을 사용하여 삼중-나선 형성 또는 안티센스 DNA 또는 RNA를 통하여 유전자 발현을 제어할 수 있는데, 이들 방법 둘 다는 DNA 또는 RNA에 대한 폴리뉴클레오티드의 결합에 기초한다. 예를 들어, 성숙한 DSCR1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 암호화 부분을 사용하여, 길이가 약 10 내지 40개 염기 쌍인 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 고안할 수 있다. DNA 올리고뉴클레오티드는 전사에 관여하는 유전자 영역에 대해 상보적이 되도록 고안함으로써 [삼중 나선 - 참고: Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 (1988); Dervan et al., Science, 251:1360 (1991)], DSCR1 폴리펩티드의 전사와 생성을 방지시킨다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 생체 내에서 mRNA와 혼성화하고, 이러한 mRNA 분자가 DSCR1 폴리펩티드로 해독되는 것을 차단시킨다 [안티센스 - 참고: Okano, Neurochem., 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988)]. 상기 언급된 올리고뉴클레오티드를 또한 세포에 전달하여, 안티센스 RNA 또는 DNA가 생체 내에서 발현되어 DSCR1 폴리펩티드의 생성을 억제하도록 할 수 있다. 안티센스 DNA를 사용하는 경우에는, 해독-개시 부위, 예를 들어 표적 유전자 뉴클레오티드 서열의 약 -10 내지 +10 위치로부터 유래된 올리고데옥시리보뉴클레오티드가 바람직하다.
잠재적 길항제에는 DSCR1 폴리펩티드의 활성 부위, 단백질 상호 작용 부위, 또는 기타 관련된 결합 부위와 결합함으로써 DSCR1 폴리펩티드의 정상적인 생물학적 활성을 차단시키는 소분자가 포함된다. 소분자의 예에는 소형 펩티드 또는 펩티드-유사 분자, 바람직하게는 가용성 펩티드, 및 합성 비-펩티딜 유기 또는 무기 화합물이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
리보자임은 RNA의 특이적 절단을 촉매할 수 있는 효소적 RNA 분자이다. 리보자임은 상보적 표적 RNA와의 서열-특이적 혼성화에 이어, 엔도핵산 분해성 절단에 의해 작용한다. 잠재적 RNA 표적 내의 특이적 리보자임 절단 부위는 공지된 기술에 의해 확인할 수 있다. 추가의 상세 내역은 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994), 및 PCT 공개공보 WO 97/33551 (1997년 9월 18일자로 공개됨)].
전사를 억제하기 위해 사용된 삼중-나선 형성에 있어서의 핵산 분자는 단일 가닥이어야 하고 데옥시뉴클레오티드로 구성되어야 한다. 이들 올리고뉴클레오티드의 염기 조성은, 이것이 호그슈텐 (Hoogsteen) 염기쌍 형성 규칙 (이는 일반적으로, 이중체의 한 가닥 상에 퓨린 또는 피리미딘의 꽤 큰 연장물을 필요로 한다)을 통하여 삼중-나선 형성을 증진시키도록 고안한다. 추가의 상세 내역에 관해서는, 예를 들어 PCT 공개공보 WO 97/33551을 참고할 수 있다 (상기 참고).
이들 소분자는 본원에서 앞서 논의된 스크리닝 검정들 중의 한 가지 이상에 의해 및/또는 당업자에게 널리 공지된 기타 스크리닝 기술에 의해 확인할 수 있다.
한 양태에서는, 내재화 항체가 바람직하다. 항체는 세포 내로의 항체 전달을 증강시켜 주는 특정의 특징을 보유할 수 있거나 이러한 특징을 보유하도록 변형시킬 수 있다. 이를 달성하기 위한 기술은 당해 분야에 공지되어 있다. 또 다른 양태에서는, 항체를 발현할 수 있는 핵산을 표적화 세포 내로 도입함으로써, 이러한 항체를 표적 세포에서 발현시킬 수 있다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제6,703,019호; 제6,329,173호; 및 PCT 공개공보 2003/077945]. 리포펙션 (lipofection) 또는 리포솜을 또한 사용하여 항체를 세포 내로 전달할 수 있다. 항체 단편을 사용하는 경우에는, 표적 단백질의 결합성 도메인과 특이적으로 결합하는 가장 작은 억제성 단편이 일반적으로 유리하다. 예를 들어, 항체의 가변 영역 서열을 근거로 하여, 표적 단백질 서열과 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있는 펩티드 분자를 고안할 수 있다. 이러한 펩티드는 화학적으로 합성할 수 있고/있거나 재조합 DNA 기술에 의해 생성시킬 수 있다 [참고: 예를 들어, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)].
조정제 폴리펩티드를 표적 세포 내로 유입하는 것은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 증강시킬 수 있다. 예를 들어, 특정의 서열, 예를 들면 HIV Tat 또는 안테나페디아 호메오도메인 (Antennapedia homeodomain) 단백질로부터 유래된 특정 서열은 이종 단백질이 세포막을 가로질러 효율적으로 흡수되는 것을 지시할 수 있다 [참고: 예를 들어, Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), 96:4325-4329].
본원에서의 제형은 치료하고자 하는 특정한 적응증에 필요한 바와 같은 한 가지 이상 활성 화합물, 바람직하게는 서로 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 지닌 화합물을 함유할 수도 있다. 또 다른 한편, 또는 또한, 본 발명의 조성물은 그의 기능을 증강시키는 작용제, 예를 들어 세포독성제, 사이토킨, 화학요법제 또는 성장 억제제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도한 목적에 유효한 양으로 병용해서 존재하는 것이 적합하다.
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기 제공된 총체적인 설명에 제시된다면, 각종의 기타 양태들이 실시될 수 있다는 것은 명백할 것이다. 다음 실시예는 단지 예시 목적을 위해 제공된 것이며, 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
본 발명자들은 내피 세포에서 혈관형성성 인자에 의해 조절되는 유전자를 게놈 규모에서 분석한 결과, DSCR1이 가장 중요하게 유도된 유전자들 중의 하나란 사실을 확인하였다. 칼시네우린 (CnA) 신호 전달에 대한 길항적 기능과 일치하게, 내피 세포에서의 DSCR1의 발현은 CnA 신호 전달을 매개하는데 관여하는 전사 인자인 활성화 T 세포의 핵 인자 (NFAT)의 활성, 탈인산화 및 핵 전위를 차단시켰다. DSCR1은 VEGF에 의해 유도되었을 뿐만 아니라 CnA 신호 전달을 활성화하는 기타 화합물에 의해서도 유도되었는데, 이는 활성화 내피 세포에서의 DSCR1에 대한 보다 일반적인 역할을 제시해준다. 본원에 제시된 바와 같이, DSCR1의 일시적인 발현은 각종 염증성 마커 유전자를 약독화시켰는데, 이는 활성화 내피 세포에서의 DSCR1에 대한 기존의 공지되지 않은 조절성 역할을 확인시켜 준다. 내인성 DSCR1을 녹다운시키면, NFAT 활성이 증가하였고 활성화 내피 세포 상에서의 염증 유전자의 발현이 자극되었다. 따라서, 이와 같이 확인된 내피 세포에서의 DSCR1과 CnA 신호 전달 간의 역조절성 피드백 루프는 내피 세포의 활성화, 예를 들어 VEGFR2를 통한 VEGF에 의한 활성화 후에 염증 유전자의 발현을 진행하는 잠재적 분자 기전을 나타낸다.
혈관 내피 성장 인자 (VEGF)는 포스포리파제 C-γ, 포스파티딜이노시톨 3 (PI-3) 키나제/AKT, Ras 구아노신 트리포스파타제-활성화 단백질, 및 Src 계열을 포함한 다양한 신호 변환 경로를 조절해 줌으로써 각종 혈관 기능을 제어하는 2개의 막관통 티로신 키나제 수용체 (VEGFR-1 및 -2로 명명됨)와 결합한다 [참고: Ferrara and Gerber1]. VEGF는 종양 성장, 만성 염증 및 당뇨병성 망막병증을 포함한 각종 질환과 연관된 생리적 및 병리학적 혈관형성의 주요 조절인자를 나타낸다. 일반적으로, 질병 진행을 자주 느리게 하는 병리학적 혈관형성과 연관된 악성 종양에 있어서 VEGF 활성을 방해하는 것은 널리 관용되고 있고, 이는 건강하고 성숙한 혈관계에 대해서는 상당한 (나쁜) 영향을 미치지 않았다 [참고: Ferrara et al2]. VEGF는 혈관 완전성을 교란시키고 혈관 누출을 유도시킬 수 있는 그의 능력에 근거하여 VPF - 혈관 투과성 인자로서 공지되기도 한다36,37. VEGFR-2와 선택적으로 결 합하는 VEGF 돌연변이체는 내피 세포 분열촉진물질 및 투과성 증강제로서 작용하는 반면, VEGFR-1 선택적 VEGF 돌연변이체는 이들 활성을 지니고 있는 것으로 여겨지지 않는다. VEGFR-2를 통한 VEGF 신호 전달과 혈관 교란은, VEGF를 치료적 혈관형성 환경 하에 일부 사용하는 것과 연관되는 것으로 사료되는 혈관 누출 증가에 대한 주요 경로인 것으로 여겨진다. 내피 세포에서 VEGF에 의해 구체적으로 조절된 신규한 유전자를 확인 (동정)하는 것이, 정상적인 혈관계에 비해 병리학적 혈관계에서 시차적으로 발현된 유전자를 확인할 수 있게 해주었다.
본 발명자들은 널리 확립된 시험관내 내피 세포 생존 검정을 사용하였는데, 여기서는 VEGF를 부가하는 것이 혈청 고갈에 의해 유도된 내피 세포 세포소멸을 강력하게 저해시켰다. 이 검정은 내피 세포에서 신호 전달 경로의 분자성 성분을 확인하는데 특히 유용하였다. 예를 들어, 상기 검정 시스템은 PI-3 키나제/Akt 신호 변환 경로의 결정적인 역할 확인과, 내피 세포 생존을 위한 Bcl2의 중요성에 도움을 주었다3,4. 현 연구를 위해 유사한 조건을 선택하였는데, 이는 이들이 생체내 전-임상 연구에서 관찰된 바와 같이 신생혈관형성 동안 VEGF에 대한 내피 세포의 현저한 수준의 의존성을 모방하고 있기 때문이다. 유전자콜링 기술 (CuraGen, Branford, CT)을 사용하여, 본 발명자들은 완전한 인간 내피 트랜스크립톰 (transcriptome)에서의 VEGF 표적 유전자를 탐지하고자 하였다.
본원에서 본 발명자들은 DSCR1을 신규한 VEGF 표적 유전자로서 확인하였고, DSCR1을 내피 세포에서 소염 신호 전달 분자로서 기능적으로 성상 확인하였다고 기 재하였다. 인간 유전자 (DSCR1)는 인간 염색체 21 (HC21) 상의 최소 영역 내에 거주하는 50 내지 100개 유전자들 중의 하나인데, 이것이 2개 이상의 카피로 존재하는 경우에는 정신 지체 [이는 집합적으로 다운 증후군 (DS)으로서 공지된다]를 유발시킨다6. DSCR1은 공통적으로 칼시네우린과 결합할 수 있는 능력을 공유하고 있는 인간 내의 3개의 구성원, 즉 DSCR1/MCIPl, ZAKI-4/DSCR1L1/MCIP2, 및 DSCR1L2/MCIP3을 포함하는 조정성 칼시네우린-상호 작용성 단백질 (MCIPs) 또는 칼시프레신 (calcipressins)38,39,40으로 명명되기도 하는 보존된 단백질 계열에 속한다. DSCR1은 Ca2+/칼모둘린 (calmodulin)-의존성 세린/트레오닌 단백질 포스파타제 2B (PP2B) 또는 칼시네우린 A (CnA)에 의해 조절된 세포질성 신호 전달 소분자로서 기능한다. 역조절성 피드백 루프와 일치하게, CnA 활성은 DSCR1과의 연합에 의해 저해된다. DSCR1은 발생중인 중추 신경계 및 심장에서 고도로 발현되는 반면, 성인에게서는 수 많은 조직과 세포 유형 [이에는 선조 (줄무늬) 근육 세포 및 심근 세포가 포함된다]에서 적당한 수준의 발현이 탐지되었다6. 이들 중에서, DSCR1은 선조 근육 세포에서 CnA 신호 전달을 방해하는 것으로 밝혀졌고7, 생체내 동물 모델에서 심장 비대증을 억제시키는 것으로 밝혀졌다8. 문헌 [참고: Minami et al (J. Biol. Chem. (2004), 279(48) :50537-50554)에는 또한, DSCR1이 트롬빈에 의해 유도될 수 있다고 보고되었다. DSCR1의 만성 과발현은 또한, 알츠하이머병 (Alzheimer's disease)과 같은 질환과 혈관 염증에 관련이 있었으며, 혈관 교란은 알츠하이머병, 혈관 치매, 혼합 치매 등에 밀접한 영향을 끼쳤다 [참고: Ermak et al., J. Biol. Chem. (2001), 276(42):38787-3879441,43; Townsend et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. (2002) 977:65-76; and Iadecola et al., Stroke, (2003) 34;335-337].
CnA는 각종 세포외 신호와 환경 상의 스트레스에 대한 세포성 반응 동안 결정적인 역할을 하고, 이는 세포소멸, 기억 과정, 및 골격근 및 심근 성장 및 분화의 조절에 있어 중요하다 [참고: Rothermel et al9 and Crabtree and Olson10]. 활성화 T 세포 전사 인자의 핵 인자 (NFATc1)를 CnA에 의해 탈인산화시키면, 핵으로의 그의 전이가 증진되는데, 이는 API, cMAF, GATA, 또는 MEF2 계열 구성원을 포함한 기타 전사 인자와 협력하여 작용한다11. 이러한 유전자 계열의 4개 구성원 (NFATcl-c4)은 많은 조직에서 발현되고, 이는 신경세포 유도, 골격근 및 심근 비대증, 및 심장 판막 발생 동안 결정적인 역할을 나타낸다 [참고: Hill-Eubanks et al12]. 염증 세포에 있어서의 그들의 조절성 역할 이외에도, 마우스에서 수행한 최근의 유전자 절제 실험은 NFAT 전사 인자 계열의 몇몇 구성원에 대한 독립적인 혈관 기능을 제안하였다. 이러한 발견은 NFAT 전사 인자가 내피 세포 생존을 위해 요구될 수 없긴 하지만, 혈관 성숙 동안 정확한 혈관 어셈블리에 있어 중요한 역할을 한다는 것을 제안하였다13-15.
이전의 연구는 CnA 신호 전달을 자극하는 작용제, 예를 들어 포르볼 (phorbol)12-미리스테이트13-아세테이트 (PMA) 및 이오노마이신 (IO)16,17에 노출시킨 내피 세포에서의 NFAT의 인산화와 핵 전위를 증명하였다. 시클로스포린 A (CsA)는 CnA의 강력한 억제제이고, 유전자 발현에 대한 CsA의 억제 효과에 기초하여, 몇 가지 잠재적 CnA 표적 유전자가 활성화 내피 세포, 예를 들어 과립구-대식세포 집락 자극 인자 (GM-CSF)16, Cox-218, 인터루킨 8 (IL-8)19 및 조직 인자 (TF)20에 묘사되었다. 따라서, 몇 가지 잠재적 CnA 표적 유전자가 내피 세포에서 확인되었고 CnA 신호 전달에 대한 DSCR1의 길항 활성이 림프구와 심근 세포에 묘사되긴 하였지만, 내피 세포에서 CnA 신호 전달에 있어서의 DSCR1의 역할은 공지되지 않았다.
본 연구는 DSCR1을 활성화 내피 세포에서 CnA의 신규한 내인성 억제인자로서 확인하였고, 내피 세포에서의 염증성 마커 유전자 발현에 대한 DSCR1 수준 조정에 따른 생물학적 결과를 묘사하였다. 예를 들어, 본원에 제시된 바와 같이 내인성 DSCR1을 방해하면 NFAT 활성이 증가하였고, 몇 가지 염증 마커의 발현이 자극되었는데, 이는 내인성 수준의 DSCR1을 조정하는 것이 혈관 염증에 영향을 미치는데 충분하다는 것을 입증해준다.
재료 및 방법
인간 DSCR1의 클로닝
5' 말단에 ClaI 부위를 도입하고 (DSCR1-5'ClaI) 3' 말단에 EcoRI 부위를 도입하도록 (DSCR1-3'EcoRI) 고안된 프라이머를 이용하고 시판중인 발현 서열 태그화 (EST) 클론 (공급처: Incyte, Palo Alto, CA)을 사용하여, DSCR1을 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 클로닝하였다. 이러한 PCR 단편을 ClaI 및 EcoRI로 절단시킨 시토메갈로바이러스 (CMV)-구동된 발현 벡터 PRKN (공급처: Genentech, South San Francisco, CA) 내로 클로닝하고, 추가로 실험하기 전에 삽입물을 서열 분석함으로써 확증하였다. C-말단에서 FLAG 에피토프를 부가적으로 도입하였다 (DSCR1-Flag).
시약. 달리 표시되지 않는 한, 모든 일차 항체는 공급처 [BD Pharmingen (San Diego, CA)]로부터 수득하였고, 재조합 인간 VEGF (rhVEGF)는 공급처 [Genentech]로부터 수득하였으며, 염기성 섬유아세포 성장 인자 (b-FGF) 및 종양 괴사 인자 α (TNF-α)는 공급처 [R&D Systems (Minneapolis, MN)]로부터 구입하였다.
세포 및 세포 검정. 일차 인간 내피 세포를 공급처 [Clonetics (Santa Rosa, CA)]로부터 구입하고 제조업자의 지시에 따라서 배양하였다. 유전자 콜링 실험을 위해, 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)를 공급처 [Clonetics (BioWhittaker, Walkersville, MD)]로부터 구입하고, 제조업자의 지시에 따라서 5% 태내 송아지 혈청 (FCS)을 보충시킨 내피 성장 배지 (EBM-2)에서 유지시켰다. 세포 (1 X 107)를 세포 밀도 19,000개 세포/㎠로 분할하고, 각 조건에 대해 세 번 되풀이한 실험을 병행해서 수행하였다. 세포를 도말한지 24시간 후, 세포를 인산염 완충 식염수 (PBS), 및 0.1% 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 0.1% BSA + VEGF (30 ng/mL) 또는 5% FCS를 함유하는 배지 (공급처: Clonetics)로 3회 세척하였다. RNA 분리와 역전사-PCR (RT-PCR) 분석을 당해 분야의 문헌에 보고된 바와 같이 수행하였다21. 세포 배양 실험을 위해 다음 조건을 사용하였다: 인간 (h) VEGF, 30 ng/mL; hTNF-α, 10 ng/mL; PMA, 200 ng/mL (공급처: Calbiochem, LaJolla, CA); CsA, 1 μM (공급처: Calbiochem); IO, 5 μM (공급처: Sigma, St Louis, MO); 탑시가르긴, 50 nM (공급처: Sigma). 한 가지 경우에는, 각각의 유전자의 완전한 길이의 cDNAs에 의거하고 "스마트-풀 (smart-pool)" 서비스 (공급처: Dharmacon, Lafayette, CO)를 이용하여 상기 다르마콘 (Dharmacon; Lafayette, CO)에 의해 억제성 (si) RNAs를 생성시켰다. 아데노바이러스성 형질도입 생존 실험의 경우에는, 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)를 제조업자의 지시에 따라서 5% FCS를 보충시킨 내피 성장 배지 (EBM-2)에 유지시켰다. 3 x 105개 세포를 6 웰 판 (공급처: Primaria, BD Biosciences, Bedford, MA)의 웰에 따라 분할하였고, 각 조건에 대해 두 번 되풀이한 실험을 병행해서 수행하였다. 세포를, gD 펩티드 (Ad-대조군), DSCR1 (Ad-DSCR1) 또는 역위된 암호화 서열을 수반한 안티센스 구조물 (Ad-DSCR1-AS)을 암호화하는 아데노바이러스 (MOI=100)로, 실온에서 수직 진탕기 상에서 10 mM CaC12 및 1O nM MgC12를 함유하는 혈청 무함유 배지에서 2시간 동안 감염시켰다. 그 후, 5% FCS를 함유하는 통상의 성장 배지 용적의 5배를 가하고, 세포를 CO2 항온 배양기 내에서 1일 동안 유지시켰다. 그 후, 세포를 PBS로 3회 세척하고, 0.1% BSA를 함유하는 기본 배지 (공급처: Clonetics, Santa Rosa, CA)를 부가하고 표시된 바와 같이 PMA/IO, H2O2, 및 ZVAD를 가하였다. 혈청 고갈 및 투여한지 24시간 후에, 세포를 코울터 (Coulter) 브랜드 스타일 세포 계수기 상에서 계수하였다. 세포 배양 실험을 위해, 다음 조건을 사용하였다: PMA: 200 ng/ml (공급처: Calbiochem, LaJolla, CA), 이오노마이신: 5 μM (공급처: Sigma, St. Louis, MO), 기본 배지에서 1:300으로 희석시킨 3% H2O2 용액, 0.01% H2O2 용액을 생성시키는 0.1% BSA, ZVAD 5 μM.
아데노바이러스성 벡터의 생성 및 내피 세포의 형질도입
본질적으로 제조업자에 의해 기재된 바와 같이, NotI-NotI cDNA 삽입물을 Ad-easy 벡터 구축용 키트의 폴리링커 부위 [공급처: Stratagene (La Jolla, CA)] 내로 클로닝함으로써 Ad-DSCR1-Flag 및 Ad-LacZ를 구축하였다.
유전자콜링 (GeneCalling)
시차적으로 발현되는 신규한 유전자를 확인하기 위해, "개방" 기술론, 예를 들어 일련의 유전자 발현 분석 (SAGE) 및 유전자콜링을 사용하였다. 유전자콜링은 그 밖의 문헌에도 보고되었다5,22.
각 처리군으로부터의 샘플을 역전사시키고, 이를 대상으로 하여 정량적 발현 분석 (QEA)을 수행하였다5. 분석은 2배 이상 조절된 유전자의 확인에 초점을 맞추었다. 조건-의존적 유전자 발현 프로파일을 이용하는 초기 분석은 기존에 보고된 바와 같이5, QEA 또는 유전자콜링에 의해 수행하였다.
웨스턴 블롯팅 및 면역침전
10-cm 디쉬에서 배양한 세포를 트리스 (Tris) (트리스(히드록시메틸)아미노메탄)-완충 식염수, 및 0.6 mL RIPA 완충액 [10 mM PBS, 1% 노니데트 (Nonidet) P-40, 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1% 나트륨 도데실 설페이트 (SDS), 100 mg/mL 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 30 ㎍/mL 아프로티닌 (aprotinin), 1 mM 나트륨 오르토바나데이트]에서 2회 세척하고, 프로테아제 억제제 (공급처: Roche Pharmaceuticals, Gaithersburg, MD)를 가하였다. 인간 NFATc1, c2, 및 c3에 대항하여 유도된 마우스 모노클로날 항체 (mAb)를 공급처 [Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)]로부터 구입하였다. 인간 E-셀렉틴, 혈관 세포 부착 분자-1 (VCAM-1), 세포내 부착 분자-1 (ICAM-1), 및 Cox-2에 대항한 친화성-정제된 염소 폴리클로날 항체는 공급처 [BD Pharmingen]로부터 구입하였다. 산타 크루즈 바이오테크놀로지 (Santa Cruz Biotechnology) 프로토콜에 따라서, 총 내피 세포 추출, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE), 블롯팅, 및 면역탐지를 수행하였다. 총 60 mg의 완전 세포 추출물을 4% 내지 16% 폴리아크릴아미드 겔의 각 레인 상에 부하하였다. 증강된 화학발광 (ECL) 반응용 키트를 공급처 [Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ)]로부터 구입하고, 서양고추냉이 퍼옥시다제 스트렙타비딘 [공급처: Vector Laboratories (Burlingame, CA)]을 사용하였다. NFATc1 실험을 위해, 등량의 세포 추출물을 부하하여 NFATc1 (mAb 7A6; 1:500; 공급처: Santa Cruz Biotechnology) 및 부하 대조군 α-투불린 (ICN, Santa Ana, CA로부터의 mAb; 1:5000)을 가시화하였다. Cox-2 및 TF 면역블롯 분석을 위해서는, 등량의 세포 용해물을 6% 내지 12% 구배 SDS-PAGE 상에 부하하였다. Cox-2는 항-Cox2 mAb (공급처: RDI, 1:500)로 분석하였고, 항-hTF mAb (클론 7Gl1)로 TF를 분석하는 것은 제넨테크 (Genentech)에서 이루어졌고, 이는 1:500 희석 하에 사용하였다. 샘플을 겔 상에 부하하기 전에, 단백질 양을 정량화하고, 이에 따라 조정하였다. 부하 대조군으로서, 항-γ-어댑틴 mAb를 4% 내지 20% 폴리아크릴아미드 겔 상에 사용하였다 (1:1000).
내피 세포 세포소멸의 분석
형광-활성화 세포 분류 (FACS) 분석을 위해, 세포를 문헌 [참고: Gerber et al. J Biol Chem. 1998; 273: 30336-30343]에 본질적으로 기재된 바와 같이, 플루오레세인 이소티오시아네이트-접합된 아넥신 V 및 형광성 염료 프로디늄 요오다이드 (PI)에 의해 염색하였다.
일차 인간 내피 세포의 일시적 형질감염 및 루시퍼라제 검정
HUVEC 및 인간 미세혈관 내피 세포 (HMVECs) 일시적 형질감염을 위해, 세포 (7.5 X 104)를 3 mL 성장 배지 (공급처: Primaria; BD Biosciences, Bedford, MA)에서 6-웰 디쉬의 웰당 도말하였다. 총 3개 웰의 형질감염에 대해, 리포펙션 혼합물에 사용된 플라스미드 DNA의 양을 계산하였다. 이어서, 1.25 ㎍ 발현 벡터, 3.75 ㎍ 루시퍼라제 리포터, 및 2.0 ㎍ SV-레닐라 (Renilla) 기준 리포터를 혼합하고, 14 ㎕ Fl 리포펙틴 시약 (공급처: Targeting Systems, Santee, CA)을 가하였다. 이어서, 4.5 mL 고-글루코스 둘벡터 변형 이글 배지 (DMEM)를 상기 혼합물에 가하였다. 제조업자가 권장하는 바 대로 일시적 형질감염을 수행하였다. 리포터 유전자 발현 실험을 위해, 세포를 제조업자의 권장에 따라서 300 ㎕의 1 x 수동 용해 완충액 중에서 듀얼 루시퍼라제 리포터 키트 (공급처: Promega, San Luis Obispo, CA)를 사용함으로써 용해시켰다.
siRNA를 포함한 일시적 형질감염 실험을 위해, HUVEC를 일시적 형질감염 실험에 대해 기재된 바와 같이 6-웰 판에 도말하였다. 6개 레플리카 (replica)에 대해, 600 pmol siRNA (공급처: Dharmacon, Lafayette, CO), 7.5 ㎍ 루시퍼라제, 및 4 ㎍ 레닐라 리포터 구조물을 6 mL 고-글루코스 DMEM에서 혼합하였다. FACS 및 면역조직화학 (IHC) 실험을 위해, 11.5 ㎍ 증강된 그린 형광성 단백질 (EGFP) 플라스미드를 루시퍼라제 플라스미드 대신 가하였다. 37℃에서 25 내지 30분 동안 항온 배양하기에 앞서, 30 ㎕ Targefect 용액 A 및 60 ㎕ Targefect 용액 B (공급처: Targeting Systems)를 상기 혼합물에 가하였는데; 이 용액의 1 mL를 기재된 바와 같이 리포펙션을 위해 사용하였다. 세포를 PBS로 2회 세척한 후, 혈청 무함유 배지를 부가하고 표시된 시간 동안 투여하였다.
DSCR1 및 NFATCl 의 siRNA 길항제
Figure 112007065134235-PCT00002
주: 열거된 모든 siRNAs는 각 가닥 상에 3'-오버행 (overhang)으로서 UU를 갖고 있고, 안티센스 가닥에만 5'-포스페이트를 갖고 있다.
면역형광 현미경 검사
일차 인간 내피 세포 (7 X 103개 세포/㎠)를 염색하기 24시간 전에 8-챔버 현미경 슬라이드 (공급처: Nalgene Nunc, Naperville, IL)의 각 웰 내로 시딩하였다. 세포를, LacZ 또는 DSCR1을 암호화하는 아데노바이러스 (감염 다중도 [MOI] = 100)로, 실온에서 수직 진탕기 상에서 10 mM CaC12 및 1O nM MgC12를 함유하는 혈청 무함유 배지에서 2시간 동안 감염시켰다. 그 후, 통상의 성장 배지 용적의 5배를 가하고, 세포를 CO2 항온 배양기 내에서 2일 동안 유지시켰다. 배지를 대체시킨 후, 세포를 30 ng/mL 농도의 hVEGF로 20분 동안 처리하였다. 각종 항체와 함께 항온 배양하기에 앞서, 세포를 -20℃ 하에 4분 동안 메탄올로 고정시키고, 실온에서 PBS로 세척하였다. 세포를 실온에서 1시간 동안, 일차 마우스 항-인간 NFATc1 항체 (sc7294, Santa Cruz Biotechnology)를 함유하는 PBS에서 항온 배양하였다. 이어서, 세포를 PBS로 3회 세척하고, 알렉사 플루오르 (Alexa Fluor) 488 항-마우스 IgG (공급처: Molecular Probes, Eugene, OR)를 함유하는 PBS에서 항온 배양하였다. 세포를 최종적으로 PBS로 3회 세척하고, 벡타쉴드 (Vectashield) 배지 (공급처: Vector Laboratories) 중의 커버슬립 아래에 고정시켜 두었다. x 63 오일 대물렌즈를 사용하여 악시오캠 (AxiCam) MR 단색 카메라가 장착된 자이쓰 악시오베르트 (Zeiss Axiovert) 200 형광 현미경 (공급처: Zeiss, Thornwood, NY)을 사용하여, 현미경 검사와 사진 촬영을 수행하였다.
토끼에게서 인간 DSCR1에 대한 폴리클로날 항체의 생성 및 웨스턴 블롯 분석
주형으로서 DSCR1 cDNA를 사용함으로써, 여분의 프롤린과 DSCR1-Stop-XhoI 3'를 부가하면서 프라이머 DSCR1-ECoRI-Pro 5'로 DSCR1을 PCR 증폭시키고, 이를 pGEX-KG 내로 클로닝하였다. GST-DSCR1을 기존에 보고된 바와 같이23 발현 및 정제하였다. 재조합 GST-DSCR1로 면역시킴으로써 폴리클로날 토끼 항-GST-DSCR1을 제조하였다. 여과시킨 조 혈청을 웨스턴 블롯에 사용하였다 (1:400). 올리고 및 TaqMan 프로브 프라이머 세트가 표 1에 제시되었다.
Figure 112007065134235-PCT00003
결과
신규한 VEGF 표적 유전자의 확인
혈청의 부재 하에 VEGF에 의해 특이적으로 조절된 유전자는, 기본 조건 (부가하지 않음 [NA])과 비교해서 VEGF (30 ng/mL) 또는 5% FCS로 각각 자극시킨 HUVEC로부터 유래된 유전자 발현 프로파일을 시차 전자 감산함으로써 확인하였다. 이러한 분석의 가시적 디스플레이가 도 1A에 도시되었는데, 이는 VEGF가 HUVEC에서의 DSCR1 mRNA 발현을, 자극한지 6시간 후에는 4.8배 유도시켰고, 자극한지 24시간 후에는 2.9배 유도시켰다는 것을 입증해준다. 5% FCS의 존재는 DSCR1의 발현 수준을 상당히 변경시키지 못하였다. 전반적으로, 본 발명자들은 각각 6시간 및 24시간 후에 FCS-자극된 세포에서의 유전자 발현 상의 변경을 나타내는 자취의 1.8% 및 4.4%에서 변화를 탐지하였다. VEGF-자극된 세포의 경우에, 본 발명자들은 각각 6시간 및 24시간 후에 유전자의 1.7% 및 3.4%에서 변화를 관찰하였다. FCS에 의해서가 아니라 VEGF에 의해 특이적으로 유도된 46개 cDNA 단편의 실체를 기존에 보고된 바와 같이5 결정하였다. 28개 cDNAs가 공지된 유전자 또는 ESTs에 상응하였는데, 이들 중에서 DSCR1이 가장 강력하게 유도되었다. 나머지 18개 cDNA 단편은 공개 데이터베이스 내의 공지된 어떠한 서열과도 일치하지 않았다. 28개 공지된 유전자 중의 13개 (46%)가 분비된 인자 부류에 속하는데, 이는 분비성 조직으로서의 내피의 결정적인 역할을 추가로 강조하였다24. 총 6개의 유전자 (21%)가, 잠재적으로 신호 전달 (변환)에 관여하는 세포질성 단백질 부류 (이에는 DSCR1이 포함된다)에 속하였다. 3개는 리보솜성이고, 2개는 미토콘드리아성이며, 2개는 전사 인자이고, 1개는 세포 주기 조절 유전자이고, 1개는 해독 조절에 관여하는 유전자인, 나머지 9개 유전자 (37%)는 대사 및 세포 주기 제어에 관여하는 유전자 부류를 나타내었다.
활성화 내피 세포를 유발시키는 조건은 DSCR1 발현을 유도시킨다
유전자콜링 기술론으로부터 수득한 결과를 확증하기 위해, 본 발명자들은 VEGF 또는 기타 내피 세포 분열촉진물질로 자극한 각종 인간 내피 세포 내에서의 RNA 수준을 실시간 RT-PCR 분석 (TaqMan)에 의해 분석하였다. 본 발명자들의 앞서의 연구를 확인한 결과 (도 1A), FCS 또는 b-FGF를 혈청-고갈된 HUVEC에 부가한 것은 DSCR1 수준을 상당히 변경시키지 않은 반면, VEGF를 부가한 것은 36시간에 걸쳐 HUVEC에서 DSCR1의 장기간 발현을 유도시켰다 (도 1B). 이러한 발견들은 유전자콜링 실험으로부터의 데이터를 확인시켜 주었고, DSCR1이 유사분열 내피 세포에서 발현된 일반적인 마커가 아니라는 사실을 제안하였다.
2개의 VEGFRs 각각이 DSCR1의 유도를 매개하는 정도를 평가하기 위해, 본 발명자들은 기존에 보고된 바와 같이25,26, 배타적 방식으로 각 VEGFR을 활성화시키는 돌연변이체 VEGF 형태를 시험하였다. VEGFR-2 선택적 돌연변이체 형태 (VEGFR2-sel)는 DSCR1 발현을 유도하는데 있어서 VEGF와 동등한 수준으로 강력하였다. 이와는 달리, VEGFR-1 선택적 리간드 (VEGFRl-sel 및 PlGF)는 DSCR1 발현 상의 변경을 유도시키지 못하였는데, 이는 VEGFR-2가 DSCR1 발현을 유도시키는데 충분하다는 지표이다 (도 1B-C).
상이한 조직으로부터 분리한 내피 세포는 그들의 VEGFR 발현 수준 측면에서 또는 그들의 신호 변환 경로 측면에서 다양할 수 있는데, 이는 그들의 VEGF 표적 유전자 발현 프로파일에 영향을 미칠 수도 있다. 이러한 잠재적 세포 유형-특이적 차이를 시험하기 위해, 본 발명자들은 인간 폐 대동맥 내피 세포 (HPAECs), 인간 피내 미세혈관 내피 세포 (HMVECs), 및 인간 대동맥 내피 세포 (HUAECs)를 VEGF 또는 수용체 선택적 돌연변이체 형태로 자극하고, 실시간 RT-PCR에 의해 DSCR1 발현을 분석하였다. 음성 대조군으로서, 본 발명자들은 상당한 수준의 VEGF 수용체를 발현하지 않는 (데이터는 제시되지 않음) 인간 폐 대동맥 평활근 세포 (HPASMCs)를 시험하였다. 시험된 모든 내피 세포는 VEGF 및 VEGFR2-sel에 의한 자극에 반응하여 증가 수준의 DSCR1 발현을 나타내었지만, VEGFRl-sel의 경우에는 그렇치 못하였는데, 이는 VEGFR-2가 각종 내피 세포에서 DSCR1을 유도하는데 필요하고 충분하였다는 지표이다 (도 1C 및 데이터는 제시되지 않음). 일반적으로, 대부분의 세포 유형은 HUVEC와 비교한 경우에 VEGF에 의한 장기간의 자극 후에 DSCR1 발현에 있어서 덜 두드러진 증가를 나타내었다 (도 1B).
일반적으로 활성화 내피 세포를 유발시키는 조건이 DSCR1 발현을 유도시키는 지의 여부와, CnA가 DSCR1의 조절에 관여하는 지의 여부를 평가하기 위해, 본 발명자들은 HUVEC를 TNF-α로 자극시키거나 또는 CnA 신호 전달을 활성화시키는 화합물, 예를 들어 칼슘 이오노포어 A23187 [GenBank] (IO) 단독으로 또는 CnA 신호 전달의 또 다른 활성화제인 탑시가르긴 및 PMA와 병용해서 자극시켰다. 모든 화합물은 5.5시간 (도 1D) 및 18시간 (데이터는 제시되지 않음) 후에 DSCR1 mRNA 수준을 상당히 증가시켰고, 이러한 유도는 CnA 신호 전달의 억제제인 CsA의 존재 하에 강력하게 억제되었다. 흥미롭게도, TNF-α는 VEGF에 대해 관찰된 바와 유사한 수준으로 DSCR1을 유도시켰다. HUVEC로부터 제조된 완전 세포 추출물을 웨스턴 블롯 분석한 결과, VEGF, PMA/IO, 및 탑시가르긴에 의해 자극시킨지 6시간 후에 DSCR1이 유도되었다는 사실을 확인하였다 (도 1E). mRNA 수준에 대한 발견과 유사하게, b-FGF 또는 5% FCS로 자극시킨 후에는 DSCR1 단백질 수준 상의 상당한 증가가 전혀 관찰되지 않았다. mRNA 수준에 대한 발견과는 달리, 본 발명자들은 TNF-α로 자극시킨 세포에서는 증가된 DSCR1 단백질 수준을 탐지할 수 없었는데, 이는 VEGF 및 TNF-α에 의한 DSCR1 발현의 상이한 조절 기전을 제안하고 있다. 활성화 내피 세포 상의 DSCR1 수준에 대한 CsA의 억제 효과에 기초하여, 본 발명자들은 상기 유도가 대부분 CnA에 의해 매개되었다고 결론지었다. 그러나, TNF-α로 자극시킨 후 CsA에 의한 mRNA 발현의 불완전한 억제는 내피 세포에 공지되지 않은 부가의 조절성 기전이 존재한다는 것을 제안하고 있다.
DSCR1은 NFAT의 핵 전위를 방지시킨다
VEGF를 인간 폐 정맥 내피 세포 (HPVECs)에 부가할 경우, 이는 자극 후 20분 정도로 초기에 NFATc1의 핵 전위를 유도시켰다. 따라서, 본 발명자들은 HUVEC에서 NFATc1의 핵 전위 역학을 분석하고자 하였고 DSCR1이 이러한 과정을 방해할 수 있는 정도를 분석하고자 하였다. 내피 세포를 IHC 분석한 결과, VEGF에 의해 자극시킨 세포에서 현저한 NFATc1의 핵 국재화가 나타났는데, 이는 자극한지 20분 후에 (도 2A) 그리고 또한 60분 및 120분 동안 장기간 항온 배양한 후에 (데이터는 제시되지 않음) DSCR1을 발현하는 세포에는 부재하였다. 본 발명자들이 알기로는, 이것이 NFATc1의 핵 전위를 방지시키면서, 활성화된 일차 인간 내피 세포에서 DSCR1과 NFATc1 간의 기능적 방해를 처음으로 입증한 것이다. 부가적으로, 본 발명자들은 에피토프-태그화 DSCR1을 암호화하는 벡터 (Ad-DSCR1-FLAG) 또는 대조군 벡터 (Ad- LacZ)로 아데노바이러스성 형질도입시킨 후 내피 세포에서의 DSCR1의 세포하 국재화를 IHC 방법에 의해 연구하였다. 기존의 보고서와 일치하게7,28,41, 본 발명자들은 Ad-DSCR1-FLAG로의 형질도입 후에 DSCR1의 세포질성 및 핵 국재화를 탐지하였는데, 이는 VEGF 또는 IO/PMA의 존재 하에서도 변경되지 않았다 (데이터는 제시되지 않음).
NFATc1을 세린 트레오닌 포스파타제 CnA에 의해 탈인산화시키면, 핵을 유입시킬 수 있고 전사를 자극할 수 있는 상기 전사 인자의 활성화 형태가 생성된다28. 따라서, 본 발명자들은 내피 세포에서 NFATc1의 인산화 상태에 대한 DSCR1의 효과를, CsA에 의해 유도된 효과와 비교하고자 하였다. 문헌 [참고: Johnson et al27]에 보고된 발견과 유사하게, 활성화 내피 세포의 세포 추출물을 분석한 결과, DSCR1 (도 2B에서 "P"로 표지됨)에 반응하여 NFATc1의 탈인산화 형태에서 인산화 형태로 이동한 것이 입증되었다. 이들 변화는 CsA에 의해 유도된 효과에 필적하였고, CnA의 포스파타제 활성이 차단되었다는 것을 제안하였다. 또한, 전반적인 NFATc1 단백질 수준은 DSCR1에 의해 증가하였는데, 이는 DSCR1 발현이 NFATc1 단백질 안정성에 영향을 미칠 수 있다는 지표이다. 이와는 달리, CsA는 NFATc1 단백질 수준을 상당히 변경시키지 못하였는데, 이는 CnA 활성과 NFATc1 인산화를 조절하는 DSCR1과 CsA 간에는 잠재적으로 상이한 작용 기전이 있다는 것을 제안하고 있다.
DSCR1은 NFAT의 전사 활성을 약화시킨다
형질전환된 종양 세포를 이용한 실험 결과, CnA를 자극하는 화합물, 예를 들어 IO 및 PMA에 노출시킨 세포에서는 DSCR1과 NFAT 전사 활성이 기능적으로 방해된 것으로 입증되었다28. 이러한 기전이 내피 세포에 존재하였는지를 시험하기 위해, 본 발명자들은 DSCR1에 대한 발현 벡터를 일시적으로 공동-형질감염시키고 내피 세포에서의 루시퍼라제 리포터 유전자 발현을 분석함으로써 NFAT 활성 수준을 정량화하였다. CsA에 의해 유도된 효과와 유사하게, DSCR1의 발현은 PMA, 탑시가르긴, TNF-α 또는 칼슘 이오노포어 A23187 [GenBank]로 자극시킨 내피 세포에서 NFAT-구동된 전사를 억제하였다 (도 3A). DSCR1은 AP1 활성을 상당히 방해하지 않았는데 (도 3B), 이는 상기 효과가 NFAT에 대해 특이적이었다는 사실을 입증해준다.
DSCR1은 활성화 내피 세포 상의 염증성 마커 유전자의 발현을 저해한다
CnA 표적 유전자 발현에 대한 DSCR1의 발현 증가 효과를 연구하기 위해, 본 발명자들은 DSCR1을 암호화하는 아데노바이러스성 벡터로 내피 세포를 형질도입하였고, 활성화 후에 CnA 표적 유전자 발현 수준을 분석하였다. 시험된 조건에는 VEGF, PMA/IO 또는 탑시가르긴, 및 이들의 조합물과 함께 4시간 동안 항온 배양하는 것이 포함되었다. mRNA 수준을 실시간 RT-PCR에 의해 분석한 결과, COX2, E-셀렉틴, 및 TF가 활성화 내피 세포에서 상당히 유도된 것으로 밝혀졌다 (도 4A). 기존의 보고서와 일치하게, VEGF에 의한 자극에 반응한 2 내지 3배 증가는 IO/PMA에 의해 유도된 유전자 발현에 있어서의 10 내지 20배 증가 보다 현저하게 낮았다20. 이들 차이는 세포 내적으로 작용하는 PMA가, 세포외적으로 발현된 VEGFR2와 결합하는 VEGF와 비교해서 CnA 신호 전달의 보다 강력한 유도인자란 사실을 반영하는 것으로 추정된다. 본원에서 최초로 입증된 바와 같이, DSCR1의 발현은 VEGF 또는 IO/PMA에 의해 자극시킨 내피 세포에서의 염증성 마커 유전자 발현을 억제시켰다.
이러한 RNA 수준 상의 변화가 단백질 수준 상의 변경과 상관이 있는지를 확증하기 위해, 본 발명자들은 일련의 FACS 및 웨스턴 블롯팅 실험을 수행하였다. 도 4B-C에 제시된 데이터는 E-셀렉틴, VCAM-1, TF, 및 Cox-2가 DSCR1에 의해 하향 조절되었다는 것을 입증시켜 준다. TF 및 Cox-2 단백질 수준 상의 감소는 CsA 단독에 의해 유도된 효과와 비교한 경우에 DSCR1 발현에 반응하여 보다 두드러졌다 (도 4C, 레인 4 및 7을 4 및 5와 비교하고, 6 및 9를 6 및 5로 각각 비교한다). 이들 발견은 DSCR1이 활성화 인간 내피 세포에서 CsA 보다 더 강력하게 몇 가지 염증성 마커 유전자의 발현을 저하시킨다는 것을 입증시켜 준다.
그 다음, 본 발명자들은 VEGF 자극에 반응하여, DSCR1을 포함한 VEGF 표적 유전자의 발현 역학을 모니터링하였다. 예상한 바와 같이, GM-CSF, TF, COX-2, VCAM-1, 및 E-셀렉틴 RNA 수준은 VEGF 투여 후 0시간과 2시간 사이에 증가하였다 (도 5A). 그러나, 이러한 유도는 일시적이었고 처리하지 않은 대조군 세포와 비교해서 자극 후 6시간 내지 36시간에 다시 억제되었다. 대조군으로서, 본 발명자들은 VEGF 자극에 반응한 Bcl-2의 발현을 분석하였는데, 이는 전 실험 시간 내내 일관되게 발현되었다 (도 5A 및 Gerber et al3). 결론적으로, VEGF 표적 유전자의 발현 저하는 VEGF 자극에 반응하여 DSCR1 발현 수준 증가와 동시에 발생하였다. 조합된 데이터가 본 발명자들의 모델을 지지하였는데, 여기서는 DSCR1이 활성화 내피 세포에서 CnA 신호 전달을 방해하는 역조절성 피드백 루프에서 작용할 수 있다 (도 5B).
아데노바이러스 DSCR1을 이용한 교란이 내피 세포의 생존을 조정시켜 준다
스트레스 조건에 노출된 내피 세포에서 Ad-DSCR1에 의한 DSCR1의 과발현은, DSCR1 안티센스 구조물의 발현에 의한 내인성 DSCR1의 감소와 마찬가지로 내피 세포 사멸을 유도시켰다. 이는 혈청 고갈, H2O2 노출 및 PMA/IO 처리 하에 관찰되었고 구체적으로는 카스파제 억제제, 예를 들어 ZVAD의 존재 하에서도 관찰되었다.
DSCR1의 녹다운은 활성화 내피 세포 상에서의 염증성 마커 유전자의 발현과 NFAT 활성을 유도시켰다
내피 세포를 siRNA로 형질감염시킨 효과를 시험하기 위해, 본 발명자들은 항-Flag 항체를 사용하여 DSCR1의 에피토프-태그화 형태를 암호화하는 발현 벡터 (DSCR1-FLAG)로 공동-형질감염시킨 세포를 웨스번 블롯 분석하였다. 또 다른 한편, 본 발명자들은 토끼 폴리클로날 항혈청을 사용함으로써 내인성 수준의 DSCR1을 평가하였다. 본 발명자들은 FLAG-태그화 버젼을 암호화하는 발현 벡터 (PRKN-DSCR1-FLAG)을 공동-형질감염시킨 경우에는 DSCR1 단백질 발현이 전혀 없었다는 사실을 밝혀냈는데 (도 6A), 이는 DSCR1을 표적화하는 siRNA가 DSCR1 발현을 강력히 저하시켰다는 지표이다. 예상한 바와 같이, 본 발명자들은 내인성 DSCR1 수준이 50 내지 70% 감소되었다는 사실을 밝혀냈는데, 이는 세포 공동-형질감염시킨 GFP 발현 벡터를 형광 현미경검사함으로써 평가한 바와 유사한 형질감염 효율 (데이터는 제시되지 않음)과 일치하였다. 이들 데이터는 내피 세포를 siDSCR1로 일시적으로 형질감염시키면 내피 세포에서의 단백질 수준이 효율적으로 감소되었다는 것을 제안하였다.
이어서, 본 발명자들은 이들 조건을 적용하여 CnA 하단 신호 전달 사건에 대한 내인성 DSCR1 수준 감소 효과를 연구 조사하였다. 본 발명자들은 siRNA을 NFAT-결합 부위를 함유하는 루시퍼라제 리포터 구조물로 일시적으로 공동-형질감염시키고, 활성화 형질감염시킨 내피 세포를 VEGF 또는 PMA/IO로 일시적으로 공동-형질감염시켰다. 세포를 IO/PMA (도 6C) 또는 VEGF (도 6D) 둘 다의 존재 하에, 대조군 형질감염된 세포 (si대조군)과 비교해서 siDSCR1로 형질감염시킨 경우에는 NFAT 활성이 2배 및 3배 증가하였다. siDSCR1-형질감염시킨 세포와는 대조적으로, siNFATcl-형질감염시킨 세포에서는 NFAT 활성이 저하되었는데, 이는 siRNA 공동-형질감염 방법이 일차 인간 내피 세포에 대해 효력이 있다는 것을 확인시켜 주었다 (도 6C-D).
최종적으로, 본 발명자들은 활성화 내피 세포에서의 CnA 표적 유전자 발현에 대한, 내인성 DSCR1 발현을 녹다운시킨 효과를 분석하고자 하였다. siRNA로 형질감염시킨 세포를 선별하기 위해, 본 발명자들은 GFP 발현 벡터를 상기 형질감염 혼합물에 가하였다. GFP+ 세포를 FACS 분석한 결과, siDSCR1의 존재 하에서는 TF, E-셀렉틴 및 VCAM-1을 포함한 몇 가지 염증성 마커 유전자의 발현 수준이 증가한 반면 (도 7A), ICAM-1 발현은 상당한 영향을 받지 않은 것으로 (데이터는 제시되지 않음) 밝혀졌다. 이와는 달리, 세포를 siNFATcl로 공동-형질감염시키면 유전자 발현이 차단되었는데, 이는 이러한 전사 인자가 활성화 내피 세포에서의 E-셀렉틴, VCAM-1, 및 TF 발현에 있어 중요한 역할을 한다는 것을 제안하고 있다. 흥미롭게도, 기본 수준 및 활성화 수준의 VCAM-1은 둘 다 siNFATcl에 의해 억제되었는데, 이는 NFATc1이 VCAM-1의 기본 발현에 특정 역할을 한다는 사실을 입증해주었다. VEGF에 의해 자극된 세포에서 siDSCR1에 의한 염증 유전자 발현 유도 크기 (정도)는 PMA/IO로 자극시킨 세포에 대해 관찰된 수준 보다 명백히 낮았다 (도 7A-B). 기타 보고서20와 유사하게, 이들 발견은 칼시네우린 신호 전달을 유도시킬 수 있는 VEGF의 능력이 PMA/IO와 같은 약리학적 화합물과 비교해서 저하된다는 사실을 추가로 입증시켜 준다. 요약하면, 본 발명자들의 발견은 내인성 수준의 DSCR1이 VEGF 또는 CnA 신호 전달의 기타 활성화제에 의해 자극된 내피 세포 상에서의 염증 유전자의 발현을 억제시키기에 충분하다는 사실을 입증시켜 준다.
토의
CsA와 DSCR1 간의 작용 기전 상의 차이
DSCR1과 CsA 둘 다가 CnA 활성을 방해하긴 하지만, 이들은 그들의 분자성 표적과 그들의 방해 기전에 있어 상이하다. CsA 및 기타 면역억제제 (예: FK506)는 특이적 세포성 면역필린 (각각 FKB12 및 시클로필린 A)과 복합체를 형성함으로써 칼시네우린을 억제하고, 이 복합체는 칼시네우린의 여러 부위와 결합한다. 이와는 달리, DSCR1은 NFAT 단백질에서 최초로 확인된 칼시네우린 상호 작용성 도메인과 닮은 구조 모티프를 통하여 CnA와 직접 결합한다. 이와 같이 DSCR1 내에 보존된 모티프들은 기능적으로 중요한 것으로 여겨지는데, 이는 이들 영역이 결여된 절단된 형태의 DSCR1은 CnA에 대한 결합성에 결함이 있기 때문이다7 [참고: Rothermel et al9). 따라서, DSCR1은 아마도 NFAT와 기타 인단백질 기질의 접근을 억제함으로써, 칼시네우린의 활성 부위와 직접적으로 접촉하는 것으로 여겨진다.
본 발명자들은 그들의 작용 기전 상의 차이가 상이한 약리학적 효과로 해석될 수 있는지를 분석하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, DSCR1 및 PMA/IO는 VEGF, 탑시가르긴 또는 PMA/IO로 자극시킨 내피 세포에서의, E-셀렉틴, TF, 및 Cox-2를 포함한 몇 가지 NFAT 표적 유전자의 발현을 상당히 저하시켰다. 그러나, 이러한 유전자 발현 상의 저하와, DSCR1에 의해 유도된 NFATc1의 고인산화는 일반적으로, CsA에 의해 유도된 효과와 비교할 경우에 보다 현저하였다 (도 4C). 결론적으로, CsA와 비교해서 염증 유전자의 발현에 대한 DSCR1의 억제성 효과 증가는 내피 세포에서 염증성 사건을 조절하는 기타 신호 변환 경로로 DSCR1을 방해함으로써 유발된 것으로 여겨진다. 또 다른 한편, 상기 세포에서 DSCR1을 발현하는 아데노바이러스성 벡터와는 달리 배양 배지에 부가되는 CsA의 약리학적 특성 상의 차이로 인해 차별적 반응이 유발될 수도 있다.
DSCR1 및 활성화 내피 세포 상에서의 염증 유전자의 조절
CnA 및 하단 전사 인자 NFAT는 발생적 혈관형성 동안 특정 역할을 하는 것으로 추정된다. 양 NFATc1 대립 유전자에 있어 결함이 있는 마우스는 결함있는 대동맥 및 폐 판막 발생을 나타내어, 울혈성 심부전증에 따른 결과로서 대략 배아 발생 14.5일에 사망하게 된다13,15. NFATc3과 NFATc4가 결여된 마우스에서의 이중 녹아웃 실험은 판막 발생에 손상을 입히지는 않았지만, 혈관 어셈블리에 있어서의 전신성 결함으로 인해 대략 배아 발생 11일에 배아 치사성을 야기시켰다14. 양 CnA 대립 유전자에 결함이 있는 배아에서 유사한 혈관 표현형이 관찰되었다. 이러한 발견들은 CnA 신호 변환 경로가 내피 세포 생존을 직접적으로 제어하지는 않지만, 혈관 성숙에 중요하다는 사실을 제안하였다29. 이러한 견해를 뒷받침하기 위해, 본 발명자들은 DSCR1 수준 상의 변경에 반응하여 내피 세포 생존에 있어서의 어떠한 상당한 변화도 탐지하지 못하였다 (데이터는 제시되지 않음).
내피 세포에서 DSCR1에 의한 역 피드백 루프
내피 세포에서는, CsA에 의해 억제된 많은 유전자들이16,18-20 독립적으로, VEGF에 의해 조절되는 것으로 기재되었다16,18-20,30-33. 이들 발견은 VEGF가 CnA를 통하여 상기 부류의 유전자를 조절할 수 있다는 사실을 암시하였다. 이러한 이론을 뒷받침하기 위해, VEGF로 자극시킨 내피 세포에 CsA를 부가하면 IL-8, GM-CSF, 및 Cox-2의 발현 수준이 약화되었다18,32-34. 이들 유전자 모두는 일시적 방식으로 VEGF에 의해 상향 조절되었고, VEGF와 함께 장기간 항온 배양하면 그들이 하향 조절되었다. 내피 세포에서의 본 발명자들의 연구 작업은 CnA 신호 전달을 매개하는 전사 인자인 NFATc1과, 억제성 단백질 DSCR1 [여기서, DSCR1은 내피 세포에서 역 피드백 루프 (도 5B)를 생성시킨다]의 동시 상향 조절을 지적하고 있다. 이러한 신호 전달 경로를 뒷받침하기 위해, 본 발명자들은 VEGF 자극한지 2시간 후에 가장 높은 수준의 E-셀렉틴, TF, COX-2, 및 VCAM-1 발현을 밝혀내었다. 이와는 달리, 처리한지 6시간 후에는 이들 유전자의 발현 수준이 처리하지 않은 대조군 세포의 발현 수준과 동등하였거나 더 낮았다. 실험 기간 동안, DSCR1 수준은 자극 후 처음 6시간 동안에 증가하였고, 그 후에는 안정 수준에 도달하였다 (도 5A). 역 피드백과 일치하게, VEGF 표적 유전자의 발현은 DSCR1 발현과 반비례하였다.
역 피드백 루프 모델은 억제성 성분을 녹다운시키면 내피 세포 상에서의 염증성 마커 유전자 수준이 증가할 수도 있다는 것을 추가로 예측하게 하였다 (도 5B). 이러한 예상과 일치하게, 내인성 DSCR1을 표적화하는 siRNA 실험은 활성화 내피 세포 상에서 TF, VCAM-1, 및 E-셀렉틴을 포함한 CnA 표적 유전자의 발현 증가 (도 7A)와 NFAT 전사 활성 증가 (도 6C)를 나타내었다. VEGF로 처리한 내피 세포를 분석하는 경우에는, 내인성 DSCR1을 siRNA에 의해 녹다운시키면 NFAT의 활성이 증가하였고 (도 6D) TF, E-셀렉틴, 및 VE-카드헤린 (cadherin)의 발현 수준이 증가하였다 (도 7B). 전반적으로, VEGF-자극시킨 세포에서의 유도 크기는 PMA/IO 처리와 비교한 경우에 덜 현저하였는데, 이는 CnA 활성을 자극할 수 있는 후자 화합물의 탁월한 효력으로써 설명할 수 있다.
사이토킨 자극에 반응하여 자극성 신호 전달 사건과 억제성 신호 전달 사건을 동시에 유도시키는 것이 기타 생물학적 시스템에 대해 보고된 바 있다. 역 피드백 루프는 TNF-α 또는 IL-1에 의한 장기간의 자극 효과를 제한하기 위해 림프구에서 묘사되었다. 양 사이토킨은 각종 세포 유형에서 TNF-α 신호 전달을 음성적으로 방해하는 세포내 적응인자 분자인 A20을 유도시킨다35. 따라서, TNF-α 신호 전달에 있어서의 A20의 보호 역할과 유사하게, 본 발명자들은 DSCR1이 혈관형성성 인자 (예: VEGF) 또는 기타 자극에 의한 장기간의 내피 세포 활성화 동안 혈관 손상을 방지시켜줄 수 있었다고 믿고 있다.
결론적으로, 본 발명자들은 프로-염증성 화합물로 자극시킨 내피 세포 상에서 염증 유전자의 억제에 있어서의 DSCR1의 역할에 대한 직접적인 명백한 증거를 최초로 본원에 제공하였다. Cox-2 및 TF를 포함한 이들 유전자 중의 몇몇이 치료제로서 탁월한 역할을 한다면, 본 발명자들의 발견은 혈관계 상에서의 염증 사건의 발현을 제어하고 혈관 완전성의 교란에 영향을 미치기 위한 신규한 치료적 표적으로서 DSCR1을 지적하고 있다.
참고 문헌에 관한 부분 목록
Figure 112007065134235-PCT00004
Figure 112007065134235-PCT00005
Figure 112007065134235-PCT00006
Figure 112007065134235-PCT00007
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Cys Glu Ser Asp Gln 155 160 165 Glu Lys Glu Glu Glu Glu Glu Met Glu Arg Met Arg Arg Pro Lys 170 175 180 Pro Lys Ile Ile Gln Thr Arg Arg Pro Glu Tyr Thr Pro Ile His 185 190 195 Leu Ser <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 2 gcucagaccu uacacauag 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 3 ggacaucacc uuucaguau 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 4 gaaagaauga ggagaccua 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 5 gacaucaccu uucaguauu 19 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 6 aacguaugac aaggacauca c 21 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 7 aaggacauca ccuuucagua u 21 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 8 aaguuauauu uugcucagac c 21 <210> 9 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 9 aagaugcgac cccagucaua a 21 <210> 10 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 10 cguaugagcu ucggauuga 19 <210> 11 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 11 gcagagcacg gacagcua 18 <210> 12 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 12 ucagaaacuc cgacauuga 19 <210> 13 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 13 gccggaaucc ugaaacuca 19 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 14 aggttgtgaa aacagcagca atgcaatgt 29 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 15 ccacaggaag ccgcctagt 19 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 16 tgagggaaga aaggaaacgc t 21 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 17 aggtccaggc cactcccacc gt 22 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 18 gtcatcttgg agggaccaa 19 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 19 ttctgccatg cctgtatca 19 <210> 20 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 20 ttaactgact taagtggcat taaacatttg agagctaagt 40 <210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 21 cagcttccta atatgcttta caatct 26 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 22 caatgtcaac catagaagct ttaagta 27 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 23 cctggctacc tgcatgctgt tccgt 25 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 24 cagtaggtgc attggaatca a 21 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 25 tcttagcaaa atggctaaaa gaag 24 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 26 atccctgctc aacccctctg gagt 24 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 27 cccaggtcct tgtttgct 18 <210> 28 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 28 tccaaccgtc attgaaacc 19 <210> 29 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 29 cgaagtttgt tcatcagact cctgtgcgt 29 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 30 gcatggtacg gagatgtttc 20 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 31 ggccacattg ggaaagtt 18 <210> 32 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 32 ccgaattccc atgcatttta gaaactttaa ctacag 36 <210> 33 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 33 gggctcgagc tagctgaggt ggatcggcgt gtactcc 37

Claims (35)

  1. 내피 세포에서의 DSCR1 활성을 조정하는 DSCR1 조정제.
  2. 제1항에 있어서, VEGF 수용체 2 (VEGFR-2)를 통한 신호 전달에 의해 유도된 DSCR1 활성을 조정하는 DSCR1 조정제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, DSCR1-칼시네우린 (calcineurin) A (CnA) 경로를 조정하는 DSCR1 조정제.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, NFAT 활성과 연관된 세포성 사건을 조정하는 DSCR1 조정제.
  5. 제4항에 있어서, 세포성 사건이 NFAT 인산화, NFAT 핵 전위 또는 NFAT 전사 활성인 DSCR1 조정제.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, CnA에 의해 유도된 유전자 발현을 길항시킬 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 DSCR1 조정제.
  7. 제6항에 있어서, 폴리펩티드가 DSCR1의 적어도 일부를 포함하는 펩티드를 포 함하며, 여기서 상기 펩티드는 CnA와 상호 작용할 수 있는 것인 DSCR1 조정제.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 폴리펩티드가 인간 DSCR1의 위치 약 96에서부터 약 125까지, 또는 위치 약 108에서부터 약 122까지의 아미노산을 포함하는 것인 DSCR1 조정제.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, DSCR1 기능을 길항시킬 수 있는 DSCR1 조정제.
  10. 제9항에 있어서, 내피 세포 내에 존재하는 경우에 이러한 세포에서의 DSCR1의 활성을 억제시키는 핵산을 포함하는 DSCR1 조정제.
  11. 제10항에 있어서, 핵산이 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 DSCR1 조정제.
  12. 제10항에 있어서, 핵산이 억제성/간섭 RNA를 포함하는 DSCR1 조정제.
  13. 제12항에 있어서, 억제성/간섭 RNA가 소형 억제성/간섭 RNA (siRNA)인 DSCR1 조정제.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 핵산이 GCUCAGACCUUACACAUAG, GGACAUCACCUUUCAGUAU, GAAAGAAUGAGGAGACCUA, GACAUCACCUUUCAGUAUU, AACGUAUGACAAGGACAUCAC, AAGGACAUCACCUUUCAGUAU, AAGUUAUAUUUUGCUCAGACC 및 AAGAUGCGACCCCAGUCAUAA로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 것인 DSCR1 조정제.
  15. 제10항에 있어서, 핵산이 앱타머 (aptamer)를 포함하는 것인 DSCR1 조정제.
  16. 유효량의 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항의 DSCR1 조정제를 대상체에게 투여하여 비정상적인 혈관 염증과 연관된 장애를 치료하는 것을 포함하는, 비정상적인 혈관 염증과 연관된 장애의 치료 방법.
  17. 제16항에 있어서, 조정제가 혈관계와 연관된 염증을 증가시키는 것인 방법.
  18. 제16항에 있어서, 조정제가 혈관계와 연관된 염증을 억제시키는 것인 방법.
  19. 유효량의 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항의 DSCR1 조정제를 대상체에게 투여하여 비정상적인 혈관 염증과 연관된 면역학적 장애를 치료하는 것을 포함하는, 비정상적인 혈관 염증과 연관된 면역학적 장애의 치료 방법.
  20. 제19항에 있어서, 조정제가 혈관계와 연관된 염증을 증가시키는 것인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 조정제가 혈관계와 연관된 염증을 억제시키는 것인 방법.
  22. 유효량의 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항의 DSCR1 조정제를 대상체에게 투여하여 혈관 완전성의 교란과 연관된 장애를 치료하는 것을 포함하는, 혈관 완전성의 교란과 연관된 장애의 치료 방법.
  23. 제22항에 있어서, 혈관 완전성의 교란이 혈관/내피 세포-관련 염증과 연관되는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 조정제가 혈관계와 연관된 염증을 증가시키는 것인 방법.
  25. 제23항에 있어서, 조정제가 혈관계와 연관된 염증을 억제시키는 것인 방법.
  26. 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항의 DSCR1 조정제를 소염 요법과 연계해서 대상체에게 투여하여 소염 요법과 연관된 부작용을 개선시키는 것을 포함하는, 소염 요법과 연관된 부작용의 개선 방법.
  27. 제26항에 있어서, DSCR1 조정제가 내피 세포에서의 DSCR1 활성을 억제시키는 것인 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 소염 요법이 염증을 저해시키는 작용제를 포함하는 것인 방법.
  29. 제26항에 있어서, 조정제가 혈관계와 연관된 염증을 증가시키는 것인 방법.
  30. 제26항에 있어서, 조정제가 혈관계와 연관된 염증을 억제시키는 것인 방법.
  31. 항혈관형성제와 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항의 DSCR1 조정제를 바람직하지 못한 혈관형성과 연관된 장애가 있는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 바람직하지 못한 혈관형성과 연관된 장애의 치료 방법.
  32. 유효량의 항암제와 유효량의 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항의 DSCR1 조정제를 종양 또는 암 세포에 투여하는 것을 포함하며, 여기서 병용 유효량은 종양 성장 또는 암 세포의 성장을 억제시키는 것인, 종양 성장 또는 암 세포 성장의 억제 방법.
  33. 제32항에 있어서, 항암제가 항혈관형성제를 포함하는 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 항혈관형성제가 VEGF 길항제를 포함하는 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, VEGF 길항제가 항-VEGF 항체인 방법.
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