MX2007010922A

MX2007010922A - Metodos y composiciones para modular la integridad vascular.

Info

Publication number: MX2007010922A
Application number: MX2007010922A
Authority: MX
Inventors: Hans-Peter Gerber; Boris A Hesser
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2005-03-10
Filing date: 2006-03-09
Publication date: 2007-10-12
Also published as: ZA200707490B; KR20070110077A; EP1869076A2; CA2597325A1; JP2008535796A; WO2006098998A3; US20060281680A1; EP2050763A2; US20080274993A1; AU2006223498A2; NO20075140L; AU2006223498A1; CN101175769A; IL185753A0; BRPI0607985A2; EP2050763A3; WO2006098998A9; WO2006098998A2; RU2007137489A

Abstract

La invencion proporciona metodos y composiciones utiles para modular la integridad vascular.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA MODULAR LA INTEGRIDAD VASCULAR CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención es concerniente en general con los campos de tratamiento de enfermedades y otras condiciones patológicas. Más específicamente, la invención es concerniente con métodos y composiciones para modular eventos moleculares y resultados asociados con angiogénesis.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El sistema vascular juega papeles clave en el mantenimiento de funciones fisiológicas normales. Por ejemplo, células endoteliales de la vasculatura forman normalmente una barrera celular que sirve para regular el movimiento de fluido, electrolitos y proteínas a tejidos y órganos. Aunque los eventos que conducen a pérdida de función de barrera endotelial son más bien complejos y no entendidos completamente, el desarrollo y mantenimiento de integridad de la vasculatura ha sido estudiado extensamente. Véase, por ejemplo, Kagsbrun & Moses, Chemistry & Biology (1999), 6:R217-R224; Ferrara, Endocrine Reviews (2004), 25 ( 4 ): 581-611. No obstante, lo que es claro es que alteraciones de la integridad del sistema vascular están implicadas en la etiología de múltiples enfermedades y condiciones patológicas, que fluctúan de cáncer a enfermedades inflamatorias tales como alteraciones autoinmunes. Véase, por ejemplo, solicitud de patente estadounidense Pub. No. 2004/0167198; Ones et al., Blood (1998), 91(10) .3527-3561; Kumar et al., Curr. Opin. en Nep rology and Hypertension (2005), 14:33-37; Carmeliet & Collen Am. J. Physiol. (1997), 273 : H2091-H2104. Por otra parte, se debe notar que, bajo ciertos ajustes fisiológicos, la habilidad para desarrollar y/o mantener un estado comprometido de vasculatura es deseable y podria, si es deficiente, por si mismo conducir a problemas patológicos o resultados terapéuticos sub-óptimos. La inflamación asociada con la vasculatura ha sido identificada como un evento corriente abajo de estímulos angiogénicos extracelulares que está frecuentemente asociado con la perturbación de la integridad vascular. Kirkpatrick et al., Int. J. Microcirc. (1997), 17:231-240. Por ejemplo, hay evidencia incrementada de que los procesos inflamatorios juegan un papel significativo en la patofisiologia de varias alteraciones vascular-relacionadas, tales como hipertensión. Véase, por ejemplo, Touyz, Cur. Opin. Nephrology and Hypertension (2005), 14:125-131; Kobayashi & Lin, Frontiers in Bioscience (2005), 10:666-674; Bacon, Curr. Opin. Rheumatol. (enero 2005), 17:49-55; Paleolog, J. Clin. Pathol.: mol. Pathol. (1997), 50-225-233; Mullenix et al., Ann. Vasc. Surg. (2005), 19: 130-138. Como se indica en Touyz, se observan eventos indicadores de inflamación en la vasculatura, por ejemplo expresión incrementada de moléculas de adhesión superficial y sus ligandos, infiltración de célula inflamatoria, producción de citocina, liberación de quimiocina, esfuerzo oxidante y activación de la inmunidad innata. La alteración de célula endotelial puede también ser reflejada por la liberación del factor de von illebrand y E-selectina, que es expresada exclusivamente por células endoteliales. Kuenen et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. (2002), 22:1500-1505. La inflamación persistente y/o sin regular puede dar como resultado daños a tejidos/vasculares. La respuesta inflamatoria involucra comúnmente alteraciones en permeabilidad vascular, extravasación de leucocito (adhesión, transmigración y quimiotaxis) y reparación de tejido. Touyz, supra. Desafortunadamente, a la fecha, se ha carecido de información con respecto a moléculas intracelulares que moderan la señalización entre estímulos angiogénicos extracelulares y eventos corriente abajo relacionados (tales como inflamación célula-asociada endotelial). Esto ha impedido esfuerzos por desarrollar estrategias terapéuticas que permitirían el ajuste fino del proceso angiogénico para minimizar alteraciones de integridad vascular resultante de inflamación indeseable o inducir perturbación de integridad vascular en donde se desee. Por consiguiente, hay necesidad real de identificar objetivos moleculares "intermedios" y rutas que podrían ser el foco de nueva interpretación terapéutica. La invención descrita en la presente satisface esta necesidad y proporciona otros beneficios . Todas las referencias citadas en la presente, en las que se incluyen solicitudes de patente y publicaciones, son incorporadas por referencia en su totalidad.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención está basada por lo menos en parte en el descubrimiento de que un miembro de la familia de proteínas de región critica de Síndrome de Down es un enlace molecular intermedio critico entre la señalización extracelular por factores angiogénicos y regulación intracelular de eventos corriente abajo que modula la integridad vascular. Específicamente, la región 1 critica de síndrome de Down (de aqui en adelante en la presente "DSCR1") es mostrado en la presente como una molécula intracelular que es inducida en células endoteliales activadas enseguida de la estimulación mediante reguladores angiogénicos tales como factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , mediante lo cual la inducción de DSCR1 modula a su vez la expresión de genes asociados con la inflamación de célula vascular/endotelial . Como se describe anteriormente, la inflamación asociada con la vasculatura ha sido implicada en una multitud de alteraciones. Notablemente, DSCR1 es un objetivo particularmente ventajoso para modulación terapéutica, puesto que actúa via un ciclo de retroalimentación regulatorio negativo en la moderación entre señales angiogénicas extracelulares y regulación intracelular de inflamación vascular. Sin estar limitados por la teoria, dependiendo del contexto celular/fisiológico, DSCR1, en su capacidad como componente de un ciclo de retroalimentación regulatorio negativo, se espera que sea sensible tanto a la modulación positiva como negativa, para alterar el equilibrio molecular y de señalización normalmente asociado con un ciclo de retroalimentación regulatorio. Consistente con esto, como se muestra en la presente, actividad DSCR1 tanto incrementada como disminuida en células endoteliales son demostradas empíricamente para dar como resultado modulación similar de resultados de sobrevivencia celular. Asi, los datos revelados en la presente revelan un objetivo/ruta molecular importante que, cuando es interferido, da como resultado modulación de uno de los eventos corriente abajo clave asociados con la señalización angiogénica, es decir inflamación asociada con la vasculatura. Bajo ciertas circunstancias, tal inflamación, si se deja sin verificar, puede conducir a efectos patológicos indeseables. Todavía en otras instancias, la mejora de tal inflamación puede ser deseable. La invención proporciona método, composiciones, equipos y artículos de manufactura útiles para la regulación de tal inflamación, a interferir con la función/actividad de DSCR1 para modular la inflamación vascular y por consiguiente integridad vascular. En un aspecto, la invención proporciona un modulador DSCR1 que modula la actividad de DSCR1 en células endoteliales. En una modalidad, el modulador de DSCR1 modula la actividad de DSCR1 inducida por la señalización por medio de receptor 2 de VEGF (VEGFR-2) . Un modulador de DSCR1 de la invención puede modular uno o más aspectos de ruta de DSCRl-calcineurina A (CnA) . Por ejemplo, en una modalidad, un modulador de DSCR1 de la invención modula uno o más eventos celulares asociados con la actividad de NFAT, en las que se incluyen, por ejemplo, fosforilación de NFAT, translocación nuclear de NFAT o actividad transcripcional NFAT (por ejemplo, habilidad de NFAT para moderar la regulación de expresión genética mediante CnA) . Un modulador de DSCR1 de la invención puede ser provisto en cualquier forma apropiada para uso clínico. Por ejemplo, un modulador de la invención puede ser provisto y/o administrado en forma de un ácido nucleico o polipéptido. Asi, en una modalidad, un modulador de DSCR1 de la invención comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido capaz de antagonizar la expresión genética inducida por CnA. Por ejemplo, el polipéptido puede comprender un péptido que comprende por lo menos una porción de DSCR1, en donde el péptido es capaz de interactuar con CnA. En una modalidad, el polipéptido comprende una porción, pero no la proteina de DSCR1 madura completa. En una modalidad, el polipéptido comprende proteina de DSCR1 madura de plena longitud. En una modalidad, el polipéptido comprende aminoácido de aproximadamente posición 96 a aproximadamente 125 o aproximadamente posición 108 a aproximadamente 122 de DSCRl humano, en donde las posiciones de aminoácido se refieren a la secuencia ilustrada en SEQ ID NO: 1 (figura 9). En una modalidad, el polipéptido comprende una secuencia que tiene por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% de identidad de secuencia o similaridad con la secuencia de DSCRl humano de aproximadamente posición 96 a aproximadamente 125 o aproximadamente 108 a aproximadamente 122 de DSCRl humano, en donde las posiciones de aminoácido se refieren a la secuencia ilustrada en SEQ ID NO: 1 (figura 9), a condición de que el polipéptido retenga la habilidad de antagonizar la expresión inducida por CnA. En una modalidad, el polipéptido comprende por lo menos una porción de la secuencia de serina-prolina (SP) y por lo menos una porción del dominio de enlace de calcinuerina N y/o C-terminal de DSCRl humanos, en donde el polipéptido es capaz de enlace a CnA para inhibir la expresión genética CnA-regulada . En una modalidad, el polipéptido comprende (i) la secuencia de DSCRl humano de aproximadamente posición 96 a aproximadamente 125 o aproximadamente 108 a aproximadamente 122 de DSCRl humano, en donde las posiciones de aminoácido se refieren a la secuencia ilustrada en SEQ ID NO: 1 (figura 9); (ii) por lo menos una porción de la secuencia de serina-prolina (SP); y (iii) por lo menos una porción del dominio de enlace de calcineurina N y/o C-terminal de DSCRl humano, en donde el polipéptido es capaz de enlace a CnA para inhibir la expresión genética CnA-regulada . En un aspecto, la invención proporciona un modulador DSCRl capaz de antagonizar la actividad de DSCRl. Asi, en una modalidad, un modulador de DSCRl de la invención comprende un ácido nucleico que, cuando presente en una célula endotelial (por ejemplo, una célula endotelial activada) inhibe la actividad (en los que se incluyen pero no limitados a expresión genética) de DSCRl en la célula. En una modalidad, el ácido nucleico comprende un oligonucleótido antisentido. En otra modalidad, el ácido nucleico comprende un ARN inhibidor/interférente. En una modalidad, el ARN inhibidor/interferente es un ARN inhibidor/interferente pequeño (siARN) . Por ejemplo, un modulador de DSCRl que comprende siARN puede comprender una o más secuencia seleccionadas del grupo que consiste de GCUCAGACCUUACACAUAG (SEQ ID NO: 2), GGACAUCACCUUUCAGUAU (SEQ ID NO: 3) , GAAAGAAUGAGGAGACCUA (SEQ ID NO: 4) y GACAUCACCUUUCAGUAUU (SEQ ID NO: 5) . En otro ejemplo, un modulador de DSCRl que comprende siARN puede comprender una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste de AACGUAUGACAAGGACAUCAC (SEQ ID NO: 6), AAGGACAUCACCUUUCAGUAU (SEQ ID NO: 7), AAGUUAUAUUUUGCUCAGACC (SEQ ID NO: 8) y AAGAUGCGACCCCAGUCAUAA (SEQ ID NO: 9) . En una modalidad, un modulador de DSCRl que comprende siARN comprende una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste de GCUCAGACCUUACACAUAG (SEQ ID NO: 2), GGACAUCACCUUUCAGUAU (SEQ ID NO: 3), GAAAGAAUGAGGAGACCUA (SEQ ID NO: 4) , GACAUCACCUUUCAGUAUU (SEQ ID NO: 5), AACGUAUGACAAGGACAUCAC (SEQ ID NO: 6), AAGGACAUCACCUUUCAGUAU (SEQ ID NO: 7), AAGUUAUAUUUUGCUCAGACC (SEQ ID NO: 8) y AAGAUGCGACCCCAGUCAUAA (SEQ ID NO: 9) . En una modalidad, el ácido nucleico comprende un aptámero. En una modalidad, un modulador de DSCRl de la invención comprende un anticuerpo. En una modalidad, el anticuerpo es administrado de tal manera que entra a una célula endotelial objetivo para inhibir DSCRl en la célula, esto es, el anticuerpo es internalizado. En otra modalidad, el anticuerpo es codificado por un ácido nucleico que es introducido (por ejemplo, transfectado) a una célula endotelial objetivo. En un aspecto, la invención proporciona métodos para el tratamiento de una variedad de alteraciones asociadas con inflamación asociada con células endoteliales. Por ejemplo, en un aspecto, la invención proporciona un método para el tratamiento de una alteración asociada con inflamación vascular anormal, el método comprende administrar a un sujeto una cantidad efectiva de un modulador de DSCRl de la invención, tratando mediante esto la alteración. En una modalidad, el modulador incrementa la inflamación asociada con la vasculatura. En una modalidad, el modulador inhibe la inflamación asociada con la vasculatura.

En un aspecto, la invención proporciona un método de tratamiento de una alteración inmunológica asociada con inflamación vascular anormal, el método comprende administrar a un sujeto una cantidad efectiva de un modulador de DSCRl de la invención, tratando mediante esto la alteración. En una modalidad, el modulador incrementa la inflamación asociada con la vasculatura. En una modalidad, el modulador inhibe la inflamación asociada con la vasculatura. En todavía otro aspecto, la invención proporciona un método de tratamiento de una alteración asociada con la alteración de la integridad ascular, el método comprende administrar a un sujeto una cantidad efectiva de un modulador de DSCRl de la invención, tratando mediante esto la alteración. En una modalidad, la perturbación de la integridad vascular está asociada con inflamación célula vascular/endotelial-relacionada, por ejemplo en donde hay una cantidad indeseablemente alta o baja de inflamación célula vascular/endotelial-relacionada . En una modalidad, el modulador incrementa la inflamación asociada con la vasculatura. En una modalidad, el modulador inhibe la inflamación asociada con la vasculatura. En un aspecto, la invención proporciona un método para aliviar los efectos secundarios asociados con la terapia antiinflamatoria, que comprende administrar a un sujeto un modulador de DSCRl de la invención, en conjunción con la terapia antiinflamatoria, aliviando mediante esto los efectos secundarios. En una modalidad, el modulador de DSCRl inhibe la actividad de DSCRl en una célula endotelial. En una modalidad, la terapia anti-inflamatoria comprende un agente que suprime la inflamación, por ejemplo el agente podria inhibir la actividad de célula inmune. En una modalidad, el agente es de la clase de ciclosporina de supresores de inflamación, tales como ciclosporina A (CsA) . En una modalidad, el modulador incrementa la inflamación asociada con la vasculatura. En una modalidad, el modulador inhibe la inflamación asociada con la vasculatura. En todavía otro aspecto, la invención proporciona un método de tratamiento de una alteración asociada con angiogénesis indeseable (tal como cáncer) , el método comprende administrar a un sujeto con la alteración un agente anti-angiogénico y un modulador de DSCRl de la invención. En otro aspecto, la invención proporciona un método para inhibir el crecimiento del tumor o crecimiento de una célula de cáncer, el método comprende administrar al tumor o la célula de cáncer una cantidad efectiva de un agente anti-cáncer y una cantidad efectiva de un modulador de DSCRl de la invención, en donde las cantidades efectivas combinadas inhiben el tumor o crecimiento de la célula de cáncer. En una modalidad, un agente anti-cáncer comprende un agente anti-angiogénico, por ejemplo un antagonista de VEGF. En una modalidad, un antagonista de VEGF es un anticuerpo anti-VEGF. En una modalidad, un anticuerpo anti-VEGF comprende un antígeno una secuencia de enlace de antigeno del anticuerpo A4.6.1 o variantes maduradas por afinidad variantes del mismo. En una modalidad, la secuencia de enlace de antígeno comprende por lo menos una, dos o tres de las regiones hipervariables de la cadena pesada del anticuerpo A4.6.1 o variantes maduradas por afinidad del mismo. En una modalidad, la secuencia de enlace de antigeno comprende por lo menos una, dos o tres de las regiones hipervariables de la cadena ligera del anticuerpo A4.6.1 o variantes maduradas por afinidad del mismo. En una modalidad, la secuencia de enlace de antígeno comprende una forma humanizada del dominio variable de cadena pesada de anticuerpo A .6.1 o variantes maduradas por afinidad del mismo. En una modalidad, la secuencia de enlace de antígeno comprende una forma humanizada del dominio variable de cadena ligera del anticuerpo A4.6.1 o variantes maduradas por afinidad del mismo. El anticuerpo A4.6.1 es una anticuerpo anti-VEGF producido por la linea de célula de hibridoma depositada bajo el depósito ATCC no. HB 10709 (American Type Culture Collection, Manassas, VA). En una modalidad, el anticuerpo anti-VEGF es bevacizumab. En una modalidad, el anticuerpo anti-VEGF es un anticuerpo que se enlaza al mismo epitopo de VEGF humano como bevacizumab. En una modalidad, el anticuerpo anti-VEGF es un anticuerpo que compite con bevacizumab por el enlace a VEGF humano. En una modalidad, el anticuerpo anti-VEGF se enlaza a un receptor de VEGF, por ejemplo VEGFR2. En una modalidad de estos métodos, un modulador de DSCRl de la invención es administrado a un sujeto en conjunción con un agente anti-cáncer tal como un agente quimioterapéutico. En una modalidad, el modulador de DSCRl inhibe los efectos laterales asociados con la alteración de la integridad vascular. Por ejemplo, la alteración de la integridad vascular puede ser asociada con trombólisis. En un aspecto, la invención proporciona un método de tratamiento de una alteración al mejorar la angiogénesis, el método comprende administrar a un sujeto con la alteración una cantidad efectiva de un agente que induce angiogénesis y una cantidad efectiva de un modulador de DSCRl, mediante lo cual la alteración es tratada. En una modalidad, el agente que induce angiogénesis comprende una substancia pro-angiogénica, por ejemplo uno o más de los factores angiogénicos revelados en la presente. En una modalidad, el factor angiogénico es VEGF. En una modalidad, el modulador de DSCRl inhibe la perturbación de integridad vascular. Una alteración que puede ser tratada mediante este método incluye cualquiera de aquellas descritas en la presente, en las que se incluyen por ejemplo una herida, isquemia, una alteración cardiovascular, aterosclerosis, vasculitis, etc. En un aspecto, la invención proporciona un método de modulación de la sobrevivencia de una célula endotelial que comprende poner en contacto la célula con un modulador de DSCRl. En una modalidad, la célula endotelial es activada. En una modalidad, la célula endotelial es transfectada con un vector de expresión que codifica una secuencia antisentido de DSCRl. En una modalidad, la célula endotelial es transfectada con un vector de expresión que codifica una secuencia de sentido de DSCRl. En una modalidad, el modulador de DSCRl comprende un ARN inhibitorio/interferente, que en una modalidad es un ARN interferente pequeño (siARN) . En métodos de la invención en donde un modulador de DSCRl de la invención es administrado en conjunción con otro agente terapéutico, la sincronización de administración de modulador de DSCRl en relación con la sincronización de administración del otro agente terapéutico seria aquella que se considera empírica y/o clínicamente benéfica terapéuticamente. Por ejemplo, en una modalidad, el modulador de DSCRl es administrado antes de la administración del otro agente terapéutico. En una modalidad, el modulador de DSCRl es administrado subsecuente a la administración del otro agente terapéutico. En otra modalidad, el modulador de DSCRl es administrado concurrentemente con la administración del otro agente terapéutico. En una modalidad, el otro agente terapéutico tiene actividad anti-inflamatoria. En una modalidad, los dos agentes son administrados como composiciones separadas. En una modalidad, los dos agentes son administrados como una sola composición. En un aspecto, la invención proporciona un método para identificar un sujeto en riesgo de desarrollar efectos secundarios asociados con el tratamiento de una alteración que comprende modulación de angiogénesis, el método comprende medir la cantidad de expresión o actividad de DSCRl en un tejido o célula y comparar la cantidad con aquella de un ejemplo o célula de contraparte normal, en donde una diferencia en cantidad indica riesgo de desarrollar los efectos secundarios. En general, los efectos secundarios son debidos a alteración de integridad vascular asociada con inflamación. El método de identificación se puede llevar a la práctica en cualquier punto en el tiempo conveniente y/o benéfico durante el proceso de intervención clínica. Por ejemplo, puede ocurrir antes, durante o después de la administración de un agente terapéutico para tratar la alteración en cuestión. En un aspecto, la invención proporciona un método para identificar un modulador de DSCRl (tal como una molécula útil para modular alteraciones de integridad vascular/inflamación vascular) , el método comprende poner en contacto una substancia candidata con DSCRl (o variante funcional de la misma como se define posteriormente en la presente) y determinar la cantidad del DSCRl (o variante funcional del mismo) en presencia y ausencia de la sustancia candidata, en donde cantidades diferenciales del DSCRl (o variante funcional del mismo) en presencia y ausencia de la substancia candidato indica que la substancia candidato es un modulador de DSCRl. La cantidad de DSCRl puede ser determinada mediante cualquier medición cualitativa o cuantitativa apropiada conocida en el arte. Por ejemplo, la cantidad de DSCRl puede ser indicada por el nivel de ARN o proteína. En otro ejemplo, la cantidad de DSCRl es indicada por la actividad de DSCRl (por ejemplo, inhibición de CnA) . Los métodos de la invención pueden ser usados ya sea para identificar antagonistas o agonistas de DSCRl. Por ejemplo, en una modalidad, la cantidad de DSCRl es más baja en presencia de la substancia candidata. En otra modalidad, la cantidad de DSCRl es más alta en presencia de la substancia candidata. Un modulador identificado por un método de la invención puede tener cualquiera de las características requeridas para uso en los métodos de la invención. Por ejemplo, un candidato puede ser seleccionado que es capaz de modular la integridad vascular y/o inflamación asociada con células endoteliales. Alternativamente, una substancia candidato puede ser evaluada adicionalmente para seleccionar una substancia que carece de ciertas características indeseables. Por ejemplo, una substancia candidata puede ser seleccionada que no modula sustancialmente la proliferación de célula endotelial. Como se indica anteriormente, los moduladores de DSCRl y métodos de la invención son útiles en el tratamiento de una variedad de alteraciones que se sospecha o son conocidos que están asociados con la regulación inapropiada de integridad vascular. Por ejemplo, estos alteraciones incluyen, pero no están limitadas a, aquellas que están en las categorías vasculares (tales como cardiovasculares), endoteliales, angiogénicas (tales como tumor/cáncer) o categorías inmunológicas (tales como autoinmunes) de alteraciones. No obstante, en algunas modalidades, estas alteraciones no son cardiovasculares o inmunológicas. En algunas modalidades, estas alteraciones no son endoteliales o angiogénicas. Todavía en otras modalidades, las alteraciones están asociadas con inflamación de tejido (aguda o crónica), por ejemplo alteraciones autoinmunes. También se debe notar que algunas enfermedades pueden tener características que se superponen entre dos o más categorías de alteraciones. En general, la invención proporciona moléculas moduladoras y métodos que son útiles para tratamiento de alteraciones inmune-moderadas . En una modalidad, la invención es concerniente con el tratamiento de alteraciones autoinmunes, tales como aquellas indicadas en la presente. En una modalidad, una alteración es concerniente con el rechazo de injerto o enfermedad del huésped contra injerto. En algunas modalidades de métodos de la invención en donde un método de tratamiento comprende promover la angiogénesis / neovascularización con el fin de tratar una alteración, la alteración puede ser, pero no está limitada a, por ejemplo, trauma vascular, heridas, laceraciones, incisiones, quemaduras, úlceras (por ejemplo, úlceras diabéticas, úlceras de presión, úlceras hemofílicas, úlceras varicosas), crecimiento de tejido, ganancia de peso, enfermedad arterial periférica, inducción de labor, crecimiento de vello, epidermolisis bulosa, atrofia retinal, fracturas de hueso, fusiones espinales de hueso, desgarres de meniscos, etc. En donde sea clínicamente apropiado o deseado, los métodos de la invención pueden comprender además etapas de tratamiento adicional. Por ejemplo, en una modalidad, un método comprende además una etapa en donde una célula y/o tejido apuntado (por ejemplo, una célula de cáncer) es expuesto a tratamiento de radiación o un agente quimioterapéutico. En un aspecto, la invención proporciona composiciones que comprenden uno o más moduladores de DSCRl de la invención y un portador. En una modalidad, el portador es aceptable farmacéuticamente . En un aspecto, la invención proporciona ácidos nucleicos que codifican un modulador de DSCRl de la invención. En una modalidad, un ácido nucleico de la invención codifica un modulador de DSCRl que es o comprende un polipéptido (por ejemplo, un oligopéptido) . En una modalidad, un ácido nucleico de la invención codifica un modulador de DSCRl que es o comprende un anticuerpo o fragmento del mismo. En una modalidad, un ácido nucleico de la invención codifica una secuencia de ácido nucleico que inhibe la expresión/actividad de DSCRl (por ejemplo, transcripción de gen de DSCRl o traducción de proteina DSCRl). En un aspecto, la invención proporciona vectores que comprenden un ácido nucleico de la invención. En un aspecto, la invención proporciona células huésped que comprenden un ácido nucleico o un vector de la invención. Un vector puede ser de cualquier tipo, por ejemplo un vector recombinante tal como un vector de expresión. Cualquiera de una variedad de células huésped pueden ser usadas. En una modalidad, una célula huésped es una célula procarióntica, por ejemplo, E. coli. En una modalidad, una célula huésped es una célula eucarióntica, por ejemplo una célula mamífera tal como célula de ovario de hámster chino (CHO) . En una modalidad, un ácido nucleico o vector de la invención es expresado en una célula endotelial. En un aspecto, la invención proporciona métodos para la fabricación de un modulador de DSCRl de la invención. Por ejemplo, la invención proporciona un método de fabricación de un modulador de DSCRl que es o comprende un anticuerpo (o fragmento del mismo) , el método comprende expresar en una célula huésped apropiada un vector recombinante de la invención que codifica el anticuerpo (o fragmento del mismo) y recuperar el anticuerpo (o fragmento del mismo) . En otro ejemplo, la invención proporciona un método de fabricación de un modulador de DSCRl que es o comprende un polipéptido (tal como un oligopéptido) , el método comprende expresar en una célula huésped apropiada un vector recombinante de la invención que codifica el polipéptido (tal como un oligopéptido) y recuperar el polipéptido (tal como un oligopéptido) . En un aspecto, la invención proporciona un artículo de manufactura que comprende un recipiente; y una composición contenida dentro del recipiente, en donde la composición comprende uno o más modulador de DSCRl de la invención. En una modalidad, la composición comprende un ácido nucleico de la invención. En una modalidad, una composición que comprende un modulador de DSCRl comprende además un portador, que en algunas modalidades es aceptable farmacéuticamente. En una modalidad, un articulo de manufactura de la invención comprende además instrucciones para administrar la composición (por ejemplo, el modulador de DSCRl) para tratar una alteración indicada en la presente . En un aspecto, la invención proporciona un equipo que comprende un primer recipiente que comprende una composición que comprende uno o más moduladores de DSCRl de la invención; y un segundo recipiente que comprende una solución reguladora del pH . En una modalidad, la solución reguladora del pH es aceptable farmacéuticamente. En una modalidad, una composición que comprende un modulador de DSCRl comprende además un portador, que en algunas modalidades es aceptable farmacéuticamente. En una modalidad, un equipo comprende además instrucciones para administración la composición (por ejemplo, el modulador de DSCRl) para tratar una alteración indicada en la presente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1A a 1E Análisis de expresión genética utilizando tecnología de GeneCall y RT-PCR. (A) HUVEC primarios fueron expuestos durante 0, 6 ó 24 horas ya sea a medio libre de suero o medio libre de suero complementado con VEGF o FCS al 5%, respectivamente. Células endoteliales fueron sometidas a lisis y el ARN total fue aislado y analizado en cuanto expresión genética al utilizar GeneCalling. Cada columna representa el resultado de una serie de comparación binarias que han sido comparadas entre sí. Sin embargo, los genes marcados con "P" (P = envenenamiento) o "I" (I = Aislamiento, clonación, secuenciación y envenenamiento) fueron confirmados. Se mostró que los genes seleccionados fueron inducidos por VEGF a 6 y 24 horas, pero no por estimulación mediante FCS al 5%; las veces de estimulación mediante VEGF son indicadas por un número en cada bloque. Los bloques grises indican que no se observó ningún cambio de expresión para los genes en las comparaciones binarias para suero a 6 y 24 horas contra no suero. Las barras negras verticales en las vistas en miniatura ampliadas indican el nivel de confianza del llamado de gen. (B) análisis de expresión de DSCRl mediante PCR en tiempo real. 21 HUVEC fueron mantenidos en condiciones libres de suero y estimulados ya sea con FCS al 5%, b-FGF (10 ng/mL), VEGF (30 ng/mL), PIGF (100 ng/mL), VEGFRl-sel (100 ng/mL) o VEGFR2-sel (30 ng/mL) durante la cantidad de tiempo indicada. Las proteínas mutantes usadas fueron VEGFR2-sel (KDR-selectiva) : VEGF D63S/G65M/L66R y Fit-selectivo VEGF 143A/146A/Q79A/I83.25 (C) Análisis de expresión de DSCRl mediante PCR en tiempo real. HPAEC, HDMEC y HUAEC fueron incubados en presencia de FCS al 0.5% (NA) o en presencia de FCS al 0.5% y VEGF (30 ng/mL) o formas mutantes de VEGF, que se enlazan ya sea a VEGFR1 (VEGFRl-sel, 100 ng/mL) o VEGFR2 (VEGFR2-sel, 30 ng/mL) durante 4 (B, ) 8 ( ) y 24 (D) horas. Como células de control, se usaron HUPASMC, que no expresan niveles significativos de receptores de VEGF (datos no mostrados) . Los datos mostrados representan ± SD promedio de muestras por triplicado de un representativo de 3 experimentos independientes totales. Las unidades de ARN relativas (RRU) fueron calculadas como se describe por Gerber et al3 al usar ciclofilina como gen de referencia. (D) análisis de expresión de DSCRl mediante PCR en tiempo real. HUVEC fueron incubados durante 2 horas en presencia de CsA (1 µM) antes de la estimulación con VEGF (30 ng/mL), VEGFR2-sel (30 ng/mL), VEGFRl-sel (100 ng/mL), PMA (200 ng/mL) e 10 (5 µM) , tapsigargina (50 nM) o TNF-a (10 ng/mL) durante 5.5 horas, como se indica. Los datos mostrados representan la ± SD promedio de muestras por duplicado corridas en paralelo de un representativo de 2 experimentos independientes totales. (E) análisis de Western blot de extractos de célula entera de HUVEC cultivados en suero al 0%, BSA AL 0.5% y FCS al 5%, hVEGF (30 ng/mL), b-FGF (10 ng/mL), TNF-a (10 ng/mL) y PMA o ionomicina (10) durante 5 horas como se indica. Como control, 100 ng de proteína DSCRl recombinante fue incluido. Figura 2A a 2B Localización celular de DSCRl y fosforilación de NFATcl. (A) análisis de IHC de HUVEC transducidos con Ad-DSCRl-FLAG o Ad-LacZ de control (MOI = 100) y expuestos a VEGF (30 ng/mL) . Después 20 minutos de estimulación mediante VEGF, las células se fijaron y se analizó la localización celular de NFATcl. (B) Análisis de Western blot de fosforilación de NFATcl. HUVEC fueron transducidos con los vectores adenovirales indicados (MOI = 100) o expuestos a medios de transducción solamente (NA) . Dos días después de la transducción, CsA (1 µM) fue agregado a las células y 2 horas más tarde, las células fueron estimuladas con PMA (200 ng/mL) /IO (5 µM) por 4 horas. Los Extractos celulares totales fueron sometidos a análisis de Western blot utilizando un anticuerpo anti-NFATcl, que reconoce NFATcl independientemente del estatus de fosforilación. Los datos mostrados son de 1 representativo de 3 experimentos totales. Figura 3A a 3B DSCRl interfiere con la actividad transcripcional de NFAT en células endoteliales activadas. (A) Análisis de gen reportero de luciferasa de HUVEC transfectados con una mezcla que incluye vectores de expresión CMV-impulsados que codifican una versión marcada con epitopo C-terminal de DSCRl (DSCR1-FLAG) o cantidades iguales de un vector vacío. Constructos de reportero de luciferasa contenían ya sea 3 sitios de enlace de NFAT (NFAT-Luc) o 3 copias de sitios de enlace de API respectivamente. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células fueron estimuladas con PMA (200 ng/mL), tapsigargina (50 nM) o 10 (5 µM) durante 6 horas. Las células fueron sometidas a lisis y analizadas en cuanto a expresión de gen reportero. Los datos mostrados representan la actividad de luciferasa en relación con la actividad de SV40-RL . Los datos representan las medias de muestras por triplicado ± SD de un representativo de 4 experimentos independientes. Figura 4A A 4C Representación de expresión genética de gen inflamatorio mediante DSCRl sobre células endoteliales activadas. (A) Análisis de RT-PCR en tiempo real de HUVEC transducidos con vectores adenovirales (MOI = 100) que codifican para DSCRl (Ad-DSCRl-FLAG) o LacZ de control (Ad-LacZ). Dos días después de la transducción, las células fueron incubadas durante 5 a 6 horas con medio de cultivo solo o con medio de cultivo complementado con PMA (200 ng/mL) y 10 (5 µM) , VEGF (30 ng/mL), tapsigargina (50 nM) , o una combinación de los mismos como se indica. ARN total fue aislado y los niveles para Cox-2 (i), E-selectina (ii) y TF (iii) fueron analizados mediante análisis de RT-PCR en tiempo real. Los datos mostrados representan el promedio ± SD de muestras por triplicado de un representativo de 3 experimentos totales independientes. Las RRU fueron calculadas como se describe por Gerber et al3 al utilizar GAPDH como gen de referencia. (B) Análisis de FACS de células endoteliales transfectadas transitoriamente estimuladas por varios compuestos. CsA (1 µM) fue agregado a células transducidas 2 horas antes de estimular a las células ya sea con PBS (NA), PMA (200 ng/mL), 10 (5 µM) , TNF-a (10 ng/mL), o una combinación de los mismos. A 24 horas después de la estimulación, las células fueron removidas de la caja de cultivo mediante incubación en EDTA 25 mM (ácido etilendiamintetraacético) /PBS durante 10 minutos. Las células fueron analizadas en cuanto a expresión de E-selectina, VCAM-I, TF y ICAM-1. Las áreas blancas debajo de los Blanco áreas bajo los cromatogramas representan los niveles de expresión sobre células transducidas con Ad-DSCRl; las áreas grises representan niveles de expresión de células LacZ-transducidas . Los datos mostrados son de un representativo de 3 experimentos independientes totales. (C) Análisis de Western blot de extractos de célula totales de HUVEC para Cox-2 y TF, respectivamente. Para controlar la carga igual, se usó un anticuerpo que reconoce 2?-adaptina. Los datos mostrados son de un experimento representativo de 3 experimentos independientes. Figura 5A a 5B. Relación transitoria de genes marcadores inflamatorios mediante VEGF sobre células endoteliales. (A) Análisis de RT-PCR en tiempo real de HUVEC mantenidos en condiciones libres de suero y estimulados con VEGF (30 ng/mL) o medio libre de suero solamente, durante la cantidad de tiempo indicada. Se llevó a cabo el análisis de TaqMan en cuanto a niveles de expresión. Los niveles de expresión relativos mostrados fueron generados al dividir las RRU de expresión genética en presencia de VEGF con los niveles sin estimular. (B) Representación esquemática del ciclo regulatorio de retroalimentación negativo mediante DSCRl en células endoteliales activadas conduce a interferencia con señalización de calcineurina después de estimulación mediante VEGF o compuestos que activan la señalización de CnA. Figura 6A a 6D. La expulsión de DSCRl endógeno mediante siARN mejora la actividad de NFAT en células endoteliales activadas. (A) Análisis de Western blot de HUVEC cotransfectados con siARN y vector de expresión de PRKN-DSCR1-Flag. Extractos de célula entera fueron analizados utilizando un anticuerpo anti-FLAG. (B) HUVEC transfectados con siDSCRl fueron analizados en cuanto niveles endógenos de DSCRl al utilizar un antisuero policlonal que detecta DSCRl humano. (C) Análisis de gen reportero de luciferasa en cuanto a actividad de NFAT en extractos celulares de HUVEC después de transfección transitoria con constructos de reportero de luciferasa de NFAT y el apuntamiento de siARN de DSCRl, NFATcl o control y estimulado con IO/PMA (6 horas) o VEGF (D; 12 horas), respectivamente. Los datos mostrados son de un representativo total de 3 experimentos independientes corridos por triplicado. Barras de error = SD. *P <.01, **P <0.001, utilizando análisis de varianza (ANOVA) al comparar los grupos de control de siControl y siDSCRl. Figura 7A A 7B. Expulsión de DSCRl endógeno induce la expresión de marcadores inflamatorios sobre células endoteliales activadas. (A) Análisis de FACS de HUVEC cotransfectados transitoriamente con un vector de expresión que codifica para GFP y siDSCRl, siNFATcl o siControl siARN. Las células fueron analizadas en cuanto a expresión en superficie celular de TF, VCAM-1 y E-selectina sobre células GFP+ 4 horas después de estimulación con PMA/IO o tratamiento de control (NA) . (B) Análisis de FACS de HUVEC estimulados con VEGF y analizados en cuanto a expresión de TF (4 horas), VCAM-1 (20 horas) y E-selectina (20 horas). Los datos mostrados corresponden a un conjunto representativo de 3 experimentos independientes . Figura 8A A 8B. La modulación de DSCRl afecta la sobrevivencia de células endoteliales. La sobreexpresión de DSCRl mediante Ad-DSCRl en células endoteliales expuestas a condiciones de esfuerzo, en los que se incluyen escasez de suero, exposición a H202 y tratamiento de PMA/IO induce la muerte de célula endotelial como la reducción de DSCRl endógeno mediante expresión del constructo antisentido de DSCRl. (A) Modulación de DSCRl que comprende constructos adenovirales que codifican ya sea por DSCRl sentido o antisentido disminuye la sobrevivencia de células endoteliales humanas primarias (HUVEC) 24 horas después de la escasez de suero. (B) Modulación de DSCRl que comprende constructos adenovirales que codifican ya sea DSCRl sentido o antisentido disminuye la sobrevivencia de células endoteliales humanas primarias (HUVEC) en presencia de ZVAD, un inhibidor de caspasa, a 24 horas después de la escasez de suero. Figura 9. Una modalidad ilustrativa de una secuencia de aminoácidos de DSCRl humano (SEQ ID NO: 1) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención proporciona métodos, composiciones, equipos y artículos de manufactura para el tratamiento de una variedad de alteraciones mediante la modulación de DSCRl en células endoteliales. Detalles de estos métodos, composiciones, equipos y artículos de manufactura son proporcionados en la presente .

Técnicas generales La práctica de la presente invención empleará a no ser que se indique de otra manera, técnicas convencionales de biología molecular (en las que se incluyen técnicas recombinante), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están dentro de la habilidad del arte. Tales técnicas son explicadas plenamente en la literatura tales como "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, and periodic updates) ; "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullís et al., ed., 1994); "A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988).

Definiciones Como se usa en la presente, el término "vascular" o "vasculatura" y variaciones de los mismos, se refieren al sistema de bazos que portan sangre (en los que se incluyen fluidos linfáticos) en todo el cuerpo del mamífero. "Vaso sanguíneo" se refiere a cualquiera de los bazos del sistema vascular mamífero, en las que se incluyen bacterias, arteriolas, capilares, vénulas, venas, y vassa vasorum. En un aspecto de la invención, un modulador de DSCRl es introducido directamente a conductos vasculares que suministran sangre al miocardio. Tales conductos vasculares incluyen las arterias coronarias también como vasos tales como venas, o injertos de arterias mamarias internas. En una modalidad, un vaso sanguíneo comprende células endoteliales activadas . "Arteria" se refiere a un vaso sanguíneo a través del cual la sangre pasa a lo lejos del corazón. Las arterias coronarias suministran los tejidos del corazón mismo (particularmente el miocardio) , en tanto que otras arterias suministran a los órganos restantes del cuerpo. La estructura general de una arteria consiste de un lumen rodeado por una pared arterial en multicapas. El término "angiogénesis" como se usa en la presente, se refiere a un evento celular resultante en la neovascularización, en la cual las células endoteliales vasculares proliferan, cortan y se organizan para formar nuevos vasos a partir de redes vasculares pre-existentes. La angiogénesis es una cascada de procesos que incluyen (1) degradación de la matriz extracelular de un sitio local después de la liberación de una proteasa; (2) proliferación de células endoteliales capilares, y (3) migración de túbulos capilares hacia el estímulo angiogénico. Véase, por ejemplo Ferrara et al., Endocrine Rev. (1992), 13:18-32; Ferrara, Nature Reviews (2002), 2:795-803. Como se usa en la presente, la frase "integridad vascular" y variaciones de los mismos, se refiere a un estado sin deteriorar de la vasculatura, en donde un estado sin deteriorar incluye tener una habilidad fisiológica normal de la vasculatura para actuar como una barrera para el movimiento libre de moléculas entre dos compartimientos/lados de la barrera. Más específicamente, los dos compartimientos/lados son concernientes en general con el lumen de la vasculatura y el espacio extralumenal (que comprende en general tejidos y/o células adyacentes a la vasculatura) . Como se usa en la presente, la frase "perturbaciones de integridad vascular" y variaciones de la misma, se refiere un cambio anormal y/o indeseable a la integridad vascular que da como resultado la incapacidad de la vasculatura para actuar como barrera para movimiento entre los dos compartimientos de la barrera. Por ejemplo, la inflamación de la vasculatura es una causa común asociada con perturbaciones de integridad vascular. Perturbaciones de integridad vascular pueden ser manifestadas en forma de una o más condiciones de tejido y celulares, en las que se incluyen pero no limitadas a aquellas asociadas con necrosis celular endotelial, apóptosis de célula endotelial, trauma al endotelio, lesión, fuga vascular, hipertensión y daños vasculares. Un ejemplo adicional incluye trauma que afecta el endotelio vascular, por ejemplo trauma (tales como lesiones) a los vasos sanguíneos, que incluye la red vascular de órganos, a la cual un animal (en general un mamífero) o humano es sometido; tal trauma incluirla heridas, incisiones y úlceras (por ejemplo, úlceras diabéticas) y heridas o laceraciones de los vasos sanguíneos/células endoteliales. Trauma incluye condiciones provocadas por eventos también internos también como aquellos que son impuestos por un agente extrínseco tal como un patógeno. Como se usa en la presente, "alteración asociada con perturbación de integridad vascular", "alteración asociada con inflamación vascular anormal" y variaciones de los mismos, se refieren en general a condiciones patológicas que se piensa o que se sabe que están asociadas con perturbación de integridad vascular y/o inflamación vascular anormal. Estas alteraciones incluyen, pero no están limitadas a, alteración vascular (tal como cardiovascular) , alteración de célula endotelial, alteración angiogénica (por ejemplo, cáncer) y alteración inmunológica (por ejemplo, alteración inflamatoria, en las que se incluyen enfermedad autoinmune) . Por ejemplo, estas alteraciones incluyen condiciones patológicas asociadas con la desregulación de angiogénesis. Las alteraciones que pueden ser tratadas mediante moléculas moduladoras y métodos de la invención incluyen, pero no están limitadas a, hipertrofia indeseable o aberrante, artritis, artritis reumatoide (RA) , psoriasis, placas psoriáticas, sarcoidosis, aterosclerosis, placas ateroscleróticas, edema de infarto al miocardio, retinopatías diabéticas y otras retinopatías proliferativas, en las que se incluyen retinopatia de premadurez, fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular, degeneración macular relacionada con la edad, edema macular diabético, neovascularización corneal, neovascularización de injerto corneal, rechazo de injerto corneal, neovascularización retinal/coroidal, neovascularización del ángulo (rubeosis), enfermedad neovascular ocular, restenosis vascular, malformaciones arteriovenosas (AVM) , meningioma, hemangioma, angiofibroma, hiperplasias de tiroides (en las que se incluyen enfermedad de Grave) , transplante corneal y otro transplante de tejido, inflamación crónica, inflamación de pulmón, lesión de pulmón aguda/ARDS, sepsis, hipertensión (por ejemplo, hipertensión pulmonar primaria) , efusiones pulmonares malignas, edema cerebral (por ejemplo, asociada con accidente cerebrovascular agudo/ lesión de cabeza cerrada/ trauma) , enfermedad sinovial, formación de pannus en RA, myositis ossificans, formación de hueso hipertrópico, osteoartritis (OA) , ascites refractorio, enfermedad de ovario policisticos, endometriosis, espaciamiento tercero de enfermedades de fluidos (pancreatitis, síndrome de compartimiento, ardores, enfermedad de intestino) , fibroides uterinos, labor prematura, inflamación crónica tal como IBD (enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa), rechazo de aloinjerto renal, enfermedad de intestino inflamatorio, síndrome nefrótico, crecimiento de masa de tejido indeseable o aberrante (sin cáncer), obesidad, crecimiento de masa de tejido adiposo, articulaciones hemofílicas, cicatrices hipertróficas, inhibición de crecimiento de vello, Síndrome de Osler-Weber, fibroplasias retrolentales de granuloma piogénico, escleroderma, tracoma, adhesiones vasculares, sinovitis, dermatitis, preeclampsia, ascites, efusión pericardial (tal como aquella asociada con pericarditis), efusión pleural, ulceración gastrointestinal, inflamación de via aérea crónica y vasculitis. La desregulación de angiogénesis puede conducir a muchas alteraciones que pueden ser tratadas mediante las composiciones y métodos de la invención. Estas alteraciones incluyen tanto condiciones no neoplásicas como neoplásicas. Las alteraciones neoplásicas incluyen pero no están limitadas a aquellas descritas anteriormente. Las alteraciones no neoplásicas incluyen pero no están limitadas hipertrofia indeseable o aberrante, artritis, artritis reumatoide (RA) , psoriasis, placas psoriáticas, sarcoidosis, aterosclerosis, placas ateroscleróticas, retinopatías diabéticas y otras retinopatías proliferativas en las que se incluyen retinopatía de premadurez, fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular, degeneración macular relacionada con la edad, edema macular diabético, neovascularización corneal, neovascularización de injerto corneal, rechazo de injerto corneal, neovascularización retinal/coroidal, neovascularización del ángulo (rubeosis), enfermedad neovascular ocular, restenosis vascular, malformaciones arteriovenosas (AVM) , meningioma, hemangioma, angiofibroma, hiperplasias de tiroides (en las que se incluyen enfermedad de Grave) , transplante corneal y otro transplante de tejido, inflamación crónica, inflamación de pulmón, lesión de pulmón aguda/ARDS, sepsis, hipertensión pulmonar primaria, efusiones pulmonares malignas, edema cerebral (por ejemplo, asociada con accidente cerebrovascular agudo/ lesión de cabeza cerrada/ trauma) , inflamación sinovial, formación de pannus en RA, myositis ossificans, formación de hueso hipertrópico, osteoartritis (OA) , ascites refractarios, enfermedad de ovario policistico, endometriosis, tercer espaciamiento de enfermedades de fluidos (pancreatitis, síndrome de compartimiento, ardores, enfermedad de intestino), fibroides uterinos, labor prematura, inflamación crónica tal como IBD (enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa) , rechazo de aloinjerto renal, enfermedad del intestino inflamatorio, síndrome nefrótico, crecimiento en masa de tejido indeseable o aberrante (sin cáncer), articulaciones hemofilicas, cicatrices hipertróficas, inhibición de crecimiento de vello, síndrome de Osler-Weber, fibroplasias retrolentales de granuloma piogénico, escleroderma, tracoma, adhesiones vasculares, sinovitis, dermatitis, preeclampsia, ascites, efusión pericardial (tal como aquella asociada con pericarditis) y efusión pleural. Una "alteración" es cualquier condición que se beneficiaría del tratamiento con un modulador de DSCRl y/o método de la invención. Estas incluyen alteraciones o enfermedades crónicas y agudas en las que se incluyen aquellas condiciones patológicas que predisponen el mamífero a la alteración en cuestión. Ejemplos no limitantes de alteraciones a ser tratadas en la presente incluyen tumores malignos y benignos; malignidades sin leucemia y linfoides; alteraciones neuronales, guales, astrocitales, hipotalámicas y otras alteraciones glandulares, macrofagales, epiteliales, estromales y blastocólicas; y alteraciones inflamatorias (por ejemplo, autoinmune), angiogénicas e inmunológicas. Una "enfermedad autoinmune" en la presente es una enfermedad o alteración no maligna que surge de y es dirigida contra los propios tejidos del individuo. Las enfermedades autoinmunes en la presente excluyen específicamente enfermedades o condiciones malignas o cancerosas, excluyen especialmente linfoma de célula B, leucemia linfoblástica aguda (ALL) , leucemia linfocitica crónica (CLL) , leucemia de célula vellosa y leucemia mieloblástica crónica. Ejemplos de enfermedad o alteraciones autoinmunes incluyen pero no están limitadas a, respuestas inflamatorias tales como enfermedades de la piel inflamatoria en las que se incluyen psoriasis y dermatitis (por ejemplo, dermatitis atópica); escleroderma sistémico y esclerosis; respuestas asociadas con enfermedad de intestino inflamatorio (tal como enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa) ; síndrome de disfunción respiratoria (en las que se incluyen síndrome de dificultad respiratoria adulta; ARDS) ; dermatitis; meningitis; encefalitis; uveitis; colitis; glomerulonefritis; condiciones alérgicas tales como eczema y asma y otras condiciones que involucran infiltración de células T y respuestas inflamatorias crónicas; aterosclerosis; deficiencia de adhesión de leucocito; artritis reumatoide; lupus erimatoso sistémico (SLE); diabetes mellitus (por ejemplo, diabetes mellitus Tipo I o diabetes mellitis dependiente de insulina) ; esclerosis múltiple; síndrome de Reynaud; tiroiditis autoinmune; encefalomielitis alérgica; síndrome de Sjorgen; diabetes de inicio juvenil; y respuestas inmunes asociadas con hipersensibilidad aguda y retardada moderada por citocinas y T-linfocitos encontrados comúnmente en tuberculosis, sarcoidosis, polimiositis, granulomatosis y vasculitis; anemia perniciosa (enfermedad de Addison) ; enfermedades que involucran diapedesis de leucocito; alteración inflamatoria del sistema nervioso central (CNS) ; síndrome de lesión de órganos múltiples; anemia hemolítica (en las que se incluyen, pero no limitadas a crioglobinemia o anemia positiva de Coombs); miastenia gravis; enfermedades moderadas por complejo antígeno-anticuerpo; enfermedad de membrana de base anti-glomerular; síndrome antifosfolípido; neuritis alérgica; enfermedad de Grave; Síndrome miasténico de Lambert-Eaton; penfigoide bulloso; pénfigo; poliendocrinopatías autoinmunes; enfermedad de Reiter; síndrome de stiff-man; enfermedad de Behcet; arteritis de célula gigante; nefritis compleja inmune; nefropatía de IgA; polineuropatías de IgM; púrpura trombocitopénica inmune (ITP) o trombocitopenia autoinmune, etc.

Un "factor angiogénico" o "agente angiogénico", como se usa en la presente, es una molécula que estimula el desarrollo de vasos sanguíneos, por ejemplo, promueve angiogénesis, crecimiento de célula endotelial, estabilidad de vasos sanguíneos y/o vasculogénesis, etc. En una modalidad, un factor angiogénico al que se hace referencia en la invención reivindicada es VEGF y miembros de la familia de VEGF (A, B, C, D y E) . En una modalidad, un factor angiogénico al que se hace referencia en la invención reivindicada es un miembro de la familia de P1GF y/o PDGF. En una modalidad, un factor angiogénico al que se hace referencia en la invención reivindicada es un ligando de TIE (angiopoyetina) . En una modalidad, un factor angiogénico al que se hace referencia en la invención reivindicada es eferina. En una modalidad, un factor angiogénico al que se hace referencia en la invención reivindicada es un factor que acelera la cicatrización de heridas, en las que se incluye pero no limitados a uno o más de hormona de crecimiento, factor-I de crecimiento semejante a insulina (IGF-I), VIGF, factor de crecimiento epidérmico (EGF) , CTGF y miembros de su familia y TGF-cc y TGF-ß. Véase, por ejemplo, Klagsbrun y D'Amore, Annu. Rev. Physiol, 53:217-39 (1991); Streit y Detmar, Oncogen, 22:3172-3179 (2003); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12): 1359-1364 (1999); Tonini et al., Oncogen, 22:6549-6556 (2003) (por ejemplo, Tabla 1 lista factores angiogénicos conocidos); y Sato Int. J. Clin. Oncol, 8:200-206 (2003). La frase "efectos secundarios" o variaciones de la misma, como se usa en la presente se refiere a efectos clínicos, médicos, físicos, fisiológicos y/o bioquímicos que son mensurables y/u observables en un sujeto que sufre el tratamiento de una alteración, en donde los efectos no son parte del resultado de tratamiento propuesto. En general, los efectos son indeseables con respecto al estado de salud y/o confort del sujeto tratado, riesgos de salud para el sujeto tratado y/o tolerabilidad del tratamiento para el sujeto tratado. Como se describe anteriormente, en el tratamiento de enfermedades inflamatorias (por ejemplo, enfermedad autoinmunes o condiciones autoinmune relacionadas) descritas en la presente, un sujeto puede ser tratado con un modulador de DSCRl de la invención, en conjunción con un segundo agente terapéutico, tal como un agente inmunosupresor (esto es, un agente antiinflamatorio) , tal como en un régimen de multifármacos. El modulador de DSCRl puede ser administrado concurrentemente, secuencialmente o alternante con el agente inmunosupresor. El agente inmunosupresor puede ser administrado a las mismas dosis o menos dosis que como se resume en el arte. El agente inmunosupresor adjunto preferido dependerá de muchos factores, en los que se incluyen el tipo de alteración que es tratada también como la historia del paciente.

"Agente inmunosupresor", como se usa en la presente, se refiere a substancias que actúan para suprimir o enmascarar la respuesta del sistema inmune y/o inflamatoria de un paciente. Tales agentes incluirían substancias que suprimen la producción de citocina, regulan descendentemente o suprimen la expresión de auto-antígeno o enmascaran los antígenos de MHC. Ejemplos de tales agentes incluyen esteroides tales como glucocorticosteroides, por ejemplo, prednisona, metilprednisolona y dexametasona; pirimidinas 2-amino-6-aril-5-sustituidas (véase patente estadounidense No. 4,665,077), azatioprina (o ciclofosfamida, si hay una reacción adversa a la azatioprina) ; bromocriptina; glutaraldehido (que enmascara los antígenos MHC, como se describe en la patente estadounidense No. 4,120,649); anticuerpos anti-idiotípicos para antígenos MHC y fragmentos de MHC; ciclosporina A; antagonistas de citocina o receptor de citocina en los que se incluyen anticuerpos de anti-interferón-?, -ß o -a; anticuerpos de factor a de necrosis de anti-factor; anticuerpos de factor ß de necrosis anti-tumor; anticuerpos de anti-interleucina-2 y anticuerpos de receptor anti-IL-2; anticuerpos anti-L3T4; anti-linfocito globulina heteróloga; anticuerpos pan-T, preferiblemente anticuerpos anti-CD3 o anti-CD4 /CD4a; péptido soluble que contiene un dominio de enlace de LFA-3 (WO 90/08187 publicado 7/26/90); estreptocinasa; TGF-ß; estreptodornasa; ARN o ANA del huésped; FK506; RS-61443; desoxiespergualina; rapamicina; receptor de célula T (patente estadounidense No. 5,114,721); fragmentos de receptor de célula T (Offner et al., Science 251:430-432 (1991); WO 90/11294; y WO 91/01133); y anticuerpos de receptor de célula T (EP 340, 109) tal como T10B9. El término "DSCRl" como se usa en la presente abarca polipéptidos de secuencia natural, variantes de polipéptido y fragmentos de un polipéptido de secuencia natural y variantes de polipéptido (que son definidos adicionalmente en la presente) que es apto de modular calcineurina (y por ejemplo, expresión de genes marcadores inflamatorios tales como factor de tejido, E-selectina y Cox-2) de manera similar al DSCRl tipo silvestre. El polipéptido de DSCRl descrito en la presente puede ser aquel que es aislado de una variedad de fuentes, tales como de tipos de tejido humano o de otra fuente o preparado mediante métodos recombinantes o sintéticos. Los términos "DSCRl", "polipéptido de DSCRl", "proteína de DSCRl" y "molécula de DSCRl" también incluyen variantes de un polipéptido de DSCRl como se revela en la presente. Un "modulador de DSCRl" de la invención es una molécula que modula la función/actividad biológica normal de un "polipéptido de DSCRl" o "proteína de DSCRl". Un "polipéptido de DSCRl de secuencia natural" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos como el polipéptido de DSCRl correspondiente derivado de la naturaleza. En una modalidad, un polipéptido de DSCRl de secuencia natural comprende la proteina que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (véase figura 9) , en donde la primera metionina está en posición de aminoácido 1. Tal polipéptido de DSCRl de secuencia natural puede ser aislado de la naturaleza o puede ser producido mediante medios recombinantes o sintéticos. Los términos "polipéptido de DSCRl" y "proteína de DSCRl", como se usan en la presente, abarcan específicamente formas truncadas que se presentan de manera estable en la naturaleza o de otra manera formas modificadas post-traduccionalmente del polipéptido de DSCRl especifico, formas variantes que se presentan de manera estable en la naturaleza (por ejemplo, formas empalmadas alternativamente) y variantes alélicas que se presentan de manera estable en la naturaleza del polipéptido. "Variante de polipéptido de DSCRl", o variaciones del mismo, significa un polipéptido de DSCRl, en general un polipéptido de DSCRl activo, como se define en la presente que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de polipéptido de DSCRl de secuencia natural como se revela en la presente. Tales variantes de polipéptido de DSCRl incluyen, por ejemplo, polipéptido de DSCRl en donde uno o más residuos de aminoácido son agregados o cancelados, en el término N o C de una secuencia de aminoácido natural. Ordinariamente, una variante de polipéptido de DSCRl tendrá por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos, con una secuencia de polipéptido de DSCRl de secuencia natural como se revela en la presente. Ordinariamente, los polipéptidos de variante de DSCRl son de por lo menos aproximadamente 10 aminoácidos de longitud, alternativamente por lo menos aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600 aminoácidos de longitud o más. Opcionalmente, los polipéptidos variantes de DSCRl no tendrán más de una sustitución de aminoácido conservadora en comparación con una secuencia de polipéptido de DSCRl natural, alternativamente no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 sustituciones de aminoácidos conservadoras en comparación con la secuencia de polipéptido de DSCRl natural. "Por ciento (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia de péptidos o polipéptidos es definido como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos con los residuos de aminoácidos en la secuencia de péptidos o polipéptidos especifica, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para obtener el por ciento máximo de identidad de secuencia y no considerando ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación por propósitos de determinar el por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos puede ser obtenida de varios maneras que están dentro de la habilidad en el arte, Por ejemplo, utilizando elementos de programación de computadora disponibles públicamente tales como elementos de programación BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR) . Aquellos experimentados en el arte pueden determinar parámetros apropiados para medir la alineación, en los que se incluyen cualquier algoritmos necesarios para obtener la alineación con respecto a la plena longitud de las secuencias que son comparadas. Por propósitos de la presente, sin embargo, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos son generados utilizando el programa de computadora de comparación de secuencia ALIGN-2, como se describe en la patente estadounidense No. 6,828,146. Como se usa en la presente, los términos "péptido" y "polipéptido" son usados intercambiablemente, excepto que el término "péptido" se refiere en general a un polipéptido que comprende menos de 200 aminoácidos contiguos. El término "vector," como se usa en la presente, se propone referirse a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN de doble hebra circular al cual segmentos de ADN adicionales pueden ser ligados. Otro tipo de vector es un vector de fago. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde segmentos de ADN adicionales pueden ser ligados al genoma viral. Ciertos vectores son aptos de replicación autónoma en una célula huésped a la cual son introducidos (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores mamíferos episomales). Otros vectores (por ejemplo, vectores mamíferos no episomales) pueden ser integrados al genoma de una célula huésped después de la introducción a la célula huésped y mediante esto son replicados junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales son enlazados operativamente. Tales vectores son denominados en la presente como "vectores de expresión recombinante" (o simplemente, "vectores recombinantes"). En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinantes están frecuentemente en forma de plásmidos. En la presente especificación, "plásmido" y "vector" pueden ser usados intercambiablemente ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente usada. "Polinucleótido", o "ácido nucleico" como se usan intercambiablemente en la presente, ser refieren a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxiribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos o bases modificados y/o sus análogos o cualquier sustrato que puede ser incorporado a un polímero mediante ADN o ARN polimerasa o mediante una reacción sintética. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. Si está presente, la modificación a la estructura de nucleótido puede ser impartida antes o después del ensamble del polímero. La secuencia de nucleótidos puede ser interrumpida por componentes no nucleótidos. Un polinucleótido puede ser modificado adicionalmente después de la síntesis, tal como mediante conjugación con un marcador. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, "coronas", sustitución de uno o más de los nucleótidos que se presentan de manera estable en la naturaleza con un análogo, modificaciones internucleótido tal como, por ejemplo, aquellos con enlaces sin cargar (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquellos que contienen porciones pendientes, tales como por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señal, ply-L-lisina, etc.), aquellos con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoralen, etc.), aquellos que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidantes, etc.), aquellos que contienen alquilantes, aquellos con enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), también como formas sin modificar del (los) polinucleótido (s) . Además, cualquiera de los grupos hidroxilo ordinariamente presentes en los azúcares pueden ser reemplazados, por ejemplo, mediante grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos mediante grupos protectores estándar o activados para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales o pueden ser conjugados a soportes sólidos o semisólidos. El OH 5' y 3' terminal puede ser fosforilado o sustituido con aminas o porciones de grupo de coronación orgánicos de 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos pueden también ser derivados a grupos protectores estándar. Los polinucleótidos pueden también contener formas análogas de azúcares de ribosa o desoxiribosa que son en general conocidos en el arte, en los que se incluyen por ejemplo, 2 ' -O-metil-, 2'-0-alilo, 2-fluoro- o 2 ' -azido-ribosa, análogos de azúcar carbocíclico, azúcares alfa, -anoméricos, azúcares epiméricos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, psedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos de nucleósido abásicos tales como riboside de metilo. Uno o más enlaces de fosfodiéster pueden ser reemplazados por grupos enlazantes alternativos. Estos grupos enlazantes alternativos incluyen, pero no están limitados a, modalidades en donde fosfato es reemplazado por P (O) S ("tioato") , P(S)S ("ditioato") , "(0)NR.sub.2 ("amidato"), P(0)R, P(0)OR', CO o CH.sub.2 ("formacetal") , en los cuales cada R o R' es independientemente H o alquilo (1-20 C) sustituido o sin sustituir. Que contiene opcionalmente un enlace de éter (-0-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No todos los enlaces en un polinucleótido necesitan ser idénticos. La descripción precedente se aplica a todas los polinucleótidos a los que se hace referencia en la presente, en los que se incluyen ARN y ADN. "Oligonucleótido", como se usa en la presente, se refiere en genera a polinucleótidos en general sintéticos, cortos, en general de una sola hebra que son en general aunque no necesariamente menores de aproximadamente 200 nucleótidos de longitud. Los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido" no son mutuamente exclusivos. La descripción anterior para polinucleótidos es igual y plenamente aplicable a oligonucleótidos. El término "célula huésped" (o "célula huésped recombinante"), como se usa en la presente, se propone referirse a una célula que ha sido alterada genéticamente o es apta de ser alterada genéticamente mediante la introducción de un polinucleótido exógeno, tal como un plásmido o vector recombinante. Se debe entender que tales términos se proponen referirse no solamente a la célula ++++ particular sino a la progenie de tal célula. Debido a que pueden ocurrir ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido ya sea a mutación o influencias ambientales, tal progenie puede en efecto no ser idéntica a la célula original, pero todavía están incluidos dentro del alcance del término "célula huésped" como se usa en la presente. "Anticuerpos" (Abs) e "inmunoglobulinas" (Ig) son glicoproteinas que tienen las mismas características estructurales. En tanto que los anticuerpos exhiben especificidad de enlace a un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas semejantes a anticuerpo que en general carecen de especificidad de antígeno. Los polipéptidos de la última clase son por ejemplo producido a bajos niveles por el sistema linfático y a niveles incrementados o mielomas. Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" son usados intercambiablemente en el sentido más amplio e incluyen anticuerpos monoclonales (por ejemplo, anticuerpos monoclonales de plena longitud o intactos), anticuerpos policlonales, anticuerpos monovalentes, anticuerpos multivalentes, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos bisespecífieos en tanto que exhiban la actividad biológica deseada) y pueden también incluir ciertos fragmentos de anticuerpo (como se describe en mayor detalle en la presente) . Un anticuerpo puede ser quimérico, humano, humanizado y/o madurado por afinidad. "Fragmentos de anticuerpo" comprende solamente una porción de un anticuerpo intacto, en donde la porción retiene preferiblemente una, preferiblemente la mayoria o todas las funciones normalmente asociadas con aquella porción cuando está presente en un anticuerpo intacto. En una modalidad, un fragmento de anticuerpo comprende un sitio de enlace de antigeno del anticuerpo intacto y así retiene la habilidad para enlazarse al antigeno. En otra modalidad, un fragmento de anticuerpo, por ejemplo uno que comprende la región Fe, retiene por lo menos una de las funciones biológicas normales asociadas con la región Fe cuando está presente en un anticuerpo intacto, tal como enlace de FcRn, modulación de vida media de anticuerpo, función ADCC y enlace de complemento. En una modalidad, un fragmento de anticuerpo es un anticuerpo monovalente que tiene una vida media in vivo sustancialmente similar a un anticuerpo intacto. Por ejemplo, tal fragmento de anticuerpo puede comprender en el brazo de enlace de antígeno enlazado a una secuencia de Fe capaz de conferir estabilidad in vivo al fragmento. La "región variable" o "dominio variable" de un anticuerpo se refiere a los dominios amino-terminal de cadena pesada o ligera del anticuerpo. Estos dominios son en general las partes más variables de un anticuerpo y contienen los sitios de enlace de antígeno. El término "región hipervariable", "HVR" o "HV", cuando son usados en la presente se refieren a las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles definidos estructuralmente. En general, los anticuerpos comprenden seis regiones hipervariables; tres en las VH (Hl, H2, H3) y tres en la VL (Ll, L2, L3). Un número de delineaciones de región hipervariable son usadas y son abarcadas en la presente. Las regiones que determinan la complementareidad de Kabat (CDR) están basadas en la variabilidad de secuencia y son las más usadas comúnmente (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia se refiere en lugar de esto a la ubicación de los bucles estructurales (Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Las regiones hipervariables de AbM representan una solución intermedia entre las CDR de Kabat y bucles estructurales de Chothia y son usadas por los elementos de programación de modelado de anticuerpo de AbM de Oxford Molecular. Las regiones hipervariables de "contacto" están basadas en un análisis de las estructuras cristalinas de complejo disponible. Los residuos de cada una de estas regiones hipervariables son indicados a continuación. Bucle Kabat AbM Chothia Contact de Kabat Ll L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96 Hl H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (Numeración de Kabat) Hl H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Numeración de Chotia) H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101 Residuos de "estructura" o "FR" son aquellos residuos de dominio variable diferentes a los residuos de región hipervariable como se define en la presente. El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, esto es, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que se presentan de manera estaba en la naturaleza que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos contra un solo antígeno. Además, en contraste con preparaciones de anticuerpo policlonales que incluyen comúnmente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos) , cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un solo determinante sobre el antigeno. Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en los cuales una porción de cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo particular, en tanto que el resto de la(s) cadena (s) es idéntico con u homólogo con secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, también como fragmentos de tales anticuerpos, en tanto que exhiban la actividad biológica deseada (patente estadounidense No. 4,816,567; y Morrison et ah, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). Formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murino) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencia minima derivada de inmunoglobulina no humana. Por la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales residuos de una región hipervariable del receptor son reemplazados por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunas instancias, los residuos de región de estructura (FR) de la inmunoglobulina humana son reemplazados por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no son encontrados en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones son realizadas para refinar adicionalmente el desempeño de anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de por lo menos uno y comúnmente dos, dominios variables, en los cuales todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todos o sustancialmente todos los FR son aquellos de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe) , comúnmente aquella de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, véase Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Véanse también los siguientes artículos de revistas y referencias citadas en las mismas: Vaswani y Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol . 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035- 1038 (1995); Hurle y Gross, Curr. Op . Biotech. 5:428-433 (1994) . Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a aquella de un anticuerpo producido por un humano y/o ha sido realizada utilizando cualquiera de las técnicas para fabricar anticuerpos humanos como se revela en la presente. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de enlace de antigeno no humanos. Un anticuerpo "madurado por afinidad" es uno con una o más alteraciones en una o más CDR/HVR del mismo que dan como resultado una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antigeno, en comparación con un anticuerpo original que no posee aquella(s) alteración (es) . Anticuerpos madurados por afinidad preferidos tendrán afinidades nanomolares o aún picomolares por el antigeno objetivo. Anticuerpos madurados or afinidad son producidos mediante procedimientos conocidos en el arte. Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) describe la maduración por afinidad mediante entremezcla de dominio de VH y VL . Mutagénesis aleatoria de CDR/HVR y/o residuos de estructura es descrita por: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol . 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154 (7) : 3310-9 (1995); y Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992) . El término "región Fe" es usado para definir la región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que puede ser generada mediante digestión de papaína de un anticuerpo intacto. La región Fe puede ser una región de Fe de secuencia natural o una región de Fe variante. Aunque las fronteras de la región de Fe de una cadena pesada de inmunoglobulina podrían variar, la región de Fe de cadena pesada de IgG humana es usualmente definida para estirarse de un residuo de aminoácido en posición aproximadamente Cys226, o de posición aproximadamente Pro230, al término carboxilo de la región Fe. La región de Fe de una inmunoglobulina comprende en general dos dominios constantes, un dominio CH2 y un dominio CH3, y comprende opcionalmente un dominio CH4. "Cadena de región de Fe" en la presente significa una de las dos cadenas de polipéptido de una región Fe. La frase "sustancialmente similar" o "sustancialmente equivalente", como se usa en la presente, denota un grado de similaridad suficientemente alto entre dos valores numéricos, de tal manera que aquel de habilidad en el arte considerarla la diferencia entre los dos valores ser de poca o ningún significado biológico dentro del contexto de la característica biológica medida por los valores. La diferencia entre los dos valores es preferiblemente menor de alrededor de 50%, preferiblemente menor de alrededor de 40%, preferiblemente menor de alrededor de 30%, preferiblemente menor de alrededor de 20%, preferiblemente menor de alrededor de 10%. El término "agente citotóxico" como se usa en la presente se refiere a una sustancia que inhibe o impide la función de células y/o provoca destrucción de células. El término se propone incluir isótopos radioactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioactivos de Lu) , agentes quimioterapéuticos y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fungal, de plantas o animales, en los que se incluyen fragmentos y/o variantes de las mismas. Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes de alquilación tales como tiotepa y ciclofosfamida CYTOXAN®; alquil sulfonatos tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilmelaminas en las que se incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, tirietilentiofosfo-ramida y trimetilolmelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona) ; delta-9-tetrahidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®) ; beta-lapacona; lapacol; colchicinas; ácido betulinico; una camptotecina (en los que se incluyen el análogo sintético de topotecan (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®) , acetilcamptotecina, escopolectina y 9-aminocamptotecina) ; briostatina; calistatina; CC-1065 (en las que se incluyen sus análogos sintéticos de adozelesina, carzelesina y bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilínico; teniposide; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (en las que se incluyen los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1) ; eleuterobina; pancratistatina; a sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibióticos tales como los antibióticos de enedina (por ejemplo, calicheamicina, especialmente calicheamicina gammall y calicheamicina omegall (véase, por ejemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dinemicina, en los que se incluyen dinemicina A; una esperamicina; también como cromóforo de neocarzinostatina y cromóforos de antibiótico enedina cromoproteína relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina (en los que se incluyen ADRIAMICINA®, morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina, inyección de liposoma de HCl doxorubicina (DOXIL®) y desoxidoxorubicina) , epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromycin, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tales como metotrexate, gemcitabina (GEMZAR®), tegafur (UFTORAL®) , capecitabina (XELODA®), una epotilona y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexate, pteropterina, trimetrexate; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico tales como ácido frolinico; aceglatona; aldofosfamida glicoside; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo de polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, O) ; razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2 , 2 ' , 2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretan; vindesina (ELDISINE®, FELDESIN®) ; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromana; gacitosina; arabinoside ("Ara-C"); tiotepa; taxoide, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL®) , formulación de nanoparticulas albúmina-diseñadas de paclitaxel (ABRAXANE™) y doxetaxel (TAXOTERE®); cloranbucilo; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexate; análogos de platino tales como cisplatina y carboplatina; vinblastina (VELB AN®) ; platino; etopósido (VP-16) ; ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®) ; oxaliplatina; leucovovina; vinorelbina (NAVELBINE®) ; novantrona; edatrexate; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tales como ácido retinoico; sales, ácidos o derivados aceptables farmacéuticamente de cualquiera de los anteriores; también como combinaciones de dos o más de los anteriores tales como CHOP, una abreviatura para una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina y prednisolona y FOLFOX, una abreviatura para un régimen de tratamiento con oxaliplatina (ELOXATIN™) combinada con 5-FU y leucovovina. También incluidos en esta definición están agentes anti-hormonales que regulan, reducen, bloquean o inhiben los efectos de hormonas que pueden promover el crecimiento de cáncer y están frecuentemente en forma de tratamiento sistémico o tratamiento de cuerpo entero. Pueden ser hormonas por si mismos. Ejemplos incluyen anti-estrógenos y moduladores de receptor de estrógeno selectivos (SERM), en los que se incluyen, por ejemplo, tamoxifen (en los que se incluyen tamoxifen NOLVADEX®), raloxifeno (EVISTA®) , droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY1 17018, onapristona y toremifeno (FARESTON®); anti-progesteronas; reguladores descendentes de receptor de estrógeno (ERD) ; antagonistas de receptor de estrógeno tales como fulvestrant (FASLODEX®); agentes que funciona para suprimir o cerrar los ovarios, por ejemplo, agonistas de la hormona que libera hormona leutinizante (LHRH) tales como acetato de leupropide (LUPRON® y ELIGARD®) , acetato de goserelina, acetato de buserelina y tripterelina; otros anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida y bicalutamida; e inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógeno en las glándulas adrenales, tales como, por ejemplo, 4 (5) -imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol (MEGASE®) , exemestano (AROMASIN®) , formestanie, fadrozol, vorozol (RIVISOR®) , letrozol (FEMARA®) y anastrozol (ARIMIDEX®) . Además, tal definición de agentes quimioterapéuticos incluye bisfosfonatos tales como clodronato (por ejemplo, BONEFOS® o OSTAC®) , etidronato (DIDROCAL®) , NE-58095, ácido zoledrónico/zoledronato (ZOMETA®), alendronato (FOSAMAX®), pamidronato (AREDIA®) , tiludronato (SKELID®) o risedronato (ACTONEL®) ; también como troxacitabina (un análogo de citocina nucleósido de 1, 3-dioxolano) ; oligonucleótidos antisentido, particularmente aquellos que inhiben la expresión de genes en rutas de señalización implicadas en proliferación de célula aberrante, tal como por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras un receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R) ; vacunas tales como vacuna THERATOPE® y vacunas de terapia genética, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN® y vacuna VAXID®; inhibidor de topoisomerasa 1 (por ejemplo, LURTOTECAN®) ; rmRH (por ejemplo, ABARELIX®); lapatinib ditosilato (un inhibidor de molécula pequeña de cinasa de tirosina ErbB-2 y EGFR doble también conocido como GW572016) ; inhibidores de COX-2 tales como celecoxib (CELEBREX®; 4- (5- (4-metilfenil) -3- (trifluorometil) -lH-pirazol-1-il) benzenesulfonamida; y sales, ácidos o derivados aceptables farmacéuticamente de cualquiera de los anteriores. Un anticuerpo de "bloqueo" o un anticuerpo "antagonista" es uno que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno al que se enlaza. Tal bloqueo puede ocurrir por cualesquier medios, por ejemplo mediante interferencia con la interacción de proteína-proteína tal como enlace de ligando a un receptor. En una modalidad, los anticuerpos de bloqueo o anticuerpos antagonistas inhiben sustancial o completamente la actividad biológica del antígeno. Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos que está caracterizado comúnmente por crecimiento/proliferación celular sin regular. Ejemplos de cáncer incluyen pero no están limitados a, carcinoma, linfoma (por ejemplo, linfoma de Hodgkin y no de Hodgkin), blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de célula escamosa, cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer de célula no pequeña, adenocarcinoma del pulmón, carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovarios, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de pecho, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándula salival, cáncer de riñon, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello. Como se usa en la presente, "tratamiento" se refiere a una intervención clínica en un intento por alterar el curso natural del individuo o célula que es tratado y puede ser efectuado ya sea para profilaxis o durante el curso de patología clínica. Efectos deseables del tratamiento incluyen prevención de la presencia o recurrencia de enfermedad, alivio de síntomas, disminución de cualesquier consecuencias patológicas, directas o indirectas de la enfermedad, prevención de metástasis, disminución de la velocidad de avance de enfermedad, mejora o alivio del estado de la enfermedad y remisión o prognosis mejorada. En algunas modalidades, las moléculas moduladoras y métodos de la invención son usados para retardar el desarrollo de una enfermedad o alteración. Una "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosificaciones y por períodos de tiempo necesarios, para obtener el resultado terapéutico o profiláctico deseado. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" de un agente terapéutico puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo y peso del individuo y la habilidad del anticuerpo para producir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva es también una en la cual cualesquier efectos tóxico o perjudiciales del agente terapéutico son sobrepasados por los efectos terapéuticamente benéficos. Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosificaciones y por períodos de tiempo necesarios, para obtener el resultado profiláctico deseado. Comúnmente pero no de manera necesaria, p puesto que una dosis profiláctica es usada en sujetos antes de o en una etapa anterior de la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva será menor que la cantidad terapéuticamente efectiva, .

II . Composiciones y métodos de la invención A. Anticuerpos Moduladores de DSCRl En una modalidad, la presente invención proporciona anticuerpos moduladores de DSCRl que pueden encontrar uso en la presente como agentes terapéuticos y/o de diagnóstico. Anticuerpos ejemplares incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, bisespecíficos y heteroconjugados. Aspectos de la generación, identificación, caracterización, modificación y producción de anticuerpos están bien establecidos en el arte, por ejemplo como se describe en la publicación de solicitud de patente estadounidense No. 2005/0042216 de los párrafos 522 a 563, 604 a 608 y 617 a 688.

Los anticuerpos moduladores de DSCRl revelados en la presente pueden ser formulados en cualquier forma apropiada para administración a una célula/tejido objetivo. Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser formulados como inmunoliposomas. Un "liposoma" es un vesiculo pequeño compuesto de varios tipos de lípidos, fosfolipidos y/o surfactante que es útil para administración de un fármaco a un mamífero. Los componentes del liposoma son dispuestos comúnmente en una formulación bicapa, similar a la disposición de lipidos de membranas biológicas. Liposomas que contienen el anticuerpo son preparados mediante métodos conocidos en el arte, tal como se describe en Epstein et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); patentes estadounidenses Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y W097/38731 publicado el 23 de octubre de 1997. Liposomas con tiempo de circulación mejorado son revelados en la patente estadounidense No. 5,013,556. Liposomas particularmente útiles pueden ser generados mediante el método de evaporación de fase inversa con una composición de lípido que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina PEG-derivada (PEG-PE) . Los liposomas son extruídos a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Fragmentos de Fab' del anticuerpo de la presente invención pueden ser conjugados a los liposomas como se describe en Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982) vía una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico está contenido opcionalmente dentro del liposoma. Véase Gabizon et al., J. National Cáncer Inst. 81(19) :1484 (1989) .

B. Polipéptidos Moduladores de DSCRl En un aspecto, un modulador de DSCRl de la invención comprende un polipéptido. En una modalidad, el polipéptido modulador antagoniza la actividad de NFAT en una célula endotelial. En una modalidad, el polipéptido modulador antagoniza la actividad de CnA en una célula endotelial. En una modalidad, los polipéptidos se enlazan, de preferencia específicamente a DSCRl o una molécula intracelular que interactúa con DSCRl o CnA. Los polipéptidos pueden ser sintetizados químicamente utilizando metodología de sintesis de péptidos conocida o pueden ser preparados o purificados utilizando tecnología recombinante. En una modalidad, un polipéptido modulador de DSCRl es de por lo menos aproximadamente 5 aminoácidos de longitud, alternativamente por lo menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ó 100 aminoácidos de longitud o más, en donde tales polipéptidos son capaces de modular la actividad de DSCRl. Estos polipéptidos pueden ser identificados sin experimentación indebida utilizando técnicas bien conocidas. A este respecto, se nota que técnicas para seleccionar bibliotecas de oligopéptido para oligopéptidos que son capaces de enlazarse específicamente a un polipéptido objetivo son bien conocidas en el arte (véase, por ejemplo, patentes estadounidenses Nos. 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143; publicaciones de PCT Nos. WO 84/03506 y WO84/03564; Geysen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A., 82:178- 182 (1985); Geysen et al., en Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987); Schoofs et al., J. Immunol, 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 87:6378; Lowman, H.B. et al. (1991) Bioquímica, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol. 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88:8363 y Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668). A este respecto, el despliegue de bacteriófago (fago) es una técnica bien conocida que permite seleccionar bibliotecas de oligopéptido grandes para identificar miembro (s) de aquellas bibliotecas que son capaces de enlazarse específicamente a un objetivo de polipéptido. El despliegue de fago es una técnica mediante la cual polipéptidos variantes son desplegados como proteínas de fusión a la proteina de recubrimiento sobre la superficie de partículas de bacteriófago (Scott, J.K. y Smith, G. P. (1990) Science. 249: 386) . La utilidad del despliegue de fago radica en el hecho de que bibliotecas grandes de variantes de proteína aleatorizadas selectivamente (o cADN clonados aleatoriamente) pueden ser clasificadas rápida y eficientemente en cuanto a aquellas secuencias que se enlazan a una molécula objetivo con alta afinidad. El despliegue de péptidos (Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 87:6378) o bibliotecas de proteína (Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry. 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 88:8363) sobre fago se han usado para seleccionar millones de polipéptidos o oligopéptidos en cuanto a aquellos con propiedades de enlace específicas (Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668). La clasificación de bibliotecas de fago de mutantes aleatorios requiere una estrategia para la construcción y propagación de un gran número de variantes, un procedimiento para purificación de afinidad utilizando el receptor objetivo y medios para evaluar los resultados de enriquecimiento de enlace. Patentes estadounidenses Nos. 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689 y 5, 663, 143. Aunque la mayoria de los métodos de despliegue de fago han usado fago filamentoso, los sistemas de despliegue de fago lamboides (WO 95/34683; patente estadounidense 5,627,024), sistemas de despliegue de fago T4 (Ren et al., Gene. 215: 439 (1998); Zhu et al., Cáncer Research. 58(15): 3209-3214 (1998); Jiang et al., Infection & Immunity, 65(11): 4770-4777 (1997); Ren et al., Gene, 195 (2 ): 303-311 (1997); Ren, Protein Sd. 5: 1833 (1996); Efimov et al., Virus Genes. 10: 173 (1995)) y sistemas de despliegue de fago T7 (Smith y Scott, Methods in Enzymology, 217: 228-257 (1993); patente estadounidense 5,766,905) son bien conocidos. Muchas otras mejoras y variaciones del concepto de despliegue de fago básico han sido ahora desarrollados. Estas mejoras realzan la habilidad de los sistemas de despliegue para seleccionar bibliotecas de péptido en cuanto a enlace a moléculas objetivo seleccionadas y para desplegar proteínas funcionales con el potencial de seleccionar estas proteínas en cuanto a propiedades deseadas. Dispositivos de reacción combinacionales en cuanto a reacciones de despliegue de fago han sido desarrollados (WO 98/14277) y bibliotecas de despliegue de fago han sido usadas para analizar y controlar interacciones bimoleculares (WO 98/20169; WO 98/20159) y propiedades de péptidos helicoidales restringidos (WO 98/20036) . WO 97/35196 describe un método de aislamiento de un ligando de afinidad en el cual una biblioteca de despliegue de fago es puesta en contacto con una solución en la cual el ligando se enlazará a una molécula objetivo y una segunda solución en la cual el ligando de afinidad no se enlazará a la molécula objetivo, para aislar selectivamente ligandos de enlace. WO 97/46251 describe un método de bio-toma panorámica de una biblioteca de despliegue de fago aleatoria con un anticuerpo purificado por afinidad y luego aislamiento del fago de enlace, seguido por un proceso de micro-toma panorámica utilizando cavidades de microcaja para aislar el fago de enlace de alta afinidad. El uso de proteína A de Staphylococcus aureus como marcador de afinidad también se ha reportado (Li et al. (1998) Mol Biotech., 9:187). WO 97/47314 describe el uso de bibliotecas de sustracción de sustrato para distinguir especificidades de enzima utilizando una biblioteca combinacional que puede ser una biblioteca de despliegue de fago. Un método para seleccionar enzimas apropiadas para uso en detergentes utilizando despliegue de fago es descrito en WO 97/09446. Métodos adicionales para seleccionar proteínas de enlace específicas son descritos en las patentes estadounidenses Nos. 5,498,538, 5,432,018 y WO 98/15833. Métodos para generar bibliotecas de péptido y seleccionar estas bibliotecas también son revelados en las patentes estadounidenses Nos. 5,723,286, 5,432,018, 5,580,717, ,427,908, 5,498,530, 5,770,434, 5,734,018, 5,698,426, 5,763, 192 y 5,723,323. Métodos para generar, identificar, caracterizar, modificar y producir polipéptidos moduladores están bien establecidos en el arte, por ejemplo como se describe en la publicación de solicitud de patente estadounidense No. 2005/0042216 de los párrafos 606 a 608, 614 a 688. En una modalidad, los polipéptidos para antagonizar la actividad de compartimiento DSCRl-dependiente pueden ser designados en base a la estructura de dominio de DSCRl, por ejemplo como se describe en Rothermel et al., Trends Cardiovascular Med. (2003), 13(1):15-21; Vega et al., J. Biol. Chem. (2002), 277 (33 ): 30401-30407. Por ejemplo, el polipéptido puede comprender un aminoácido de aproximadamente posición 96 a aproximadamente 125, o aproximadamente 108 a aproximadamente 122 de DSCRl humano. En otra modalidad, el polipéptido comprende por lo menos una porción de la secuencia de serina-prolina (SP) y por lo menos una porción del dominio de enlace de calcineurina N y/o C-terminal de DSCRl humano, en donde el polipéptido es capaz de enlazarse al compartimero para inhibir la expresión del gen compartimero-regulado .

C . Moléculas pequeñas moduladoras de DSCRl En una modalidad, las moléculas pequeñas de modulador de DSCRl son moléculas orgánicas diferentes a los oligopéptidos o anticuerpos como se define en la presente que modulan la actividad de DSCRl. Las moléculas pequeñas moduladoras de DSCRl pueden ser identificadas y sintetizadas químicamente utilizando metodología conocida (véase por ejemplo Publicación de PCT Nos. WO 00/00823 y WO 00/39585) . Las moléculas pequeñas orgánicas moduladoras de DSCRl son usualmente menores de aproximadamente 2000 daltons de tamaño, alternativamente menores de aproximadamente 1500, 750, 500, 250 o 200 daltons de tamaño, en donde tales moléculas pequeñas orgánicas pueden ser identificadas sin experimentación indebida utilizando técnicas bien conocidas. A este respecto, se notará que técnicas para seleccionar bibliotecas de molécula pequeña orgánicas en cuanto a moléculas que son capaces de enlace a un polipéptido objetivo son bien conocidas en el arte (véanse, por ejemplo publicaciones de PCT Nos. WO 00/00823 y WO 00/39585. Moléculas pequeñas orgánicas moduladoras de DSCRl pueden ser por ejemplo, aldeídos, cetonas, oximas, hidrazonas, semicarbazonas, carbazidas, aminas primarias, aminas secundarias, aminas terciarias, hidrazinas N-sustituídas, hidrazidas, alcoholes, éteres, tioles, tioéters, disulfuros, ácidos carboxílicos, esteres, amidas, ureas, carbamatos, carbonatos, cetales, tiocetales, acétales, tioacetales, haluros de arilo, sulfonatos de arilo, haluros de alquilo, sulfonatos de alquilo, compuestos aromáticos, compuestos heterociclicos, anilinas, alquenos, alquinos, dioles, aminoalcoholes, oxazolidinas, oxazolinas, tiazolidinas, tiazolinas, enaminas, sulfonamidas, epóxidos, aziridinas, isocianatos, cloruros de sulfonilo, compuestos diazo, cloruros de ácido o los semejantes.

D . Moduladores de DSCRl que comprenden ácidos nucleicos En un aspecto, un modulador de DSCRl de la invención comprende una molécula de ácido nucleico. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico puede comprender un oligonuclétido de sentido/antisentido, un ARN inhibidor/interferente (por ejemplo, un ARN inhibidor pequeño/interférente (siRNA), o un aptámero. Métodos para seleccionar, identificar y fabricar estos moduladores de ácido nucleico son conocidos en el arte. Por ejemplo, siRNAs han probado capaces de modular expresión genética en donde antagonistas tradicionales tales como moléculas pequeñas o anticuerpos han fallado. (Shi Y., Trends in Genetics 19 ( 1 ): 9-12 (2003) ) . ARN de doble hebra sintetizados in vitro, que son de menos de 30 nucleótidos de longitud (por ejemplo, aproximadamente 15 a 25, 17 a 20, 18 a 20, 19 a 20, o 21 a 23 nucleótidos) pueden actuar como ARN interférente (iARN) y pueden inhibir específicamente la expresión genética (véase, por ejemplo Fire A., Trends in Genetics (1999), 391; 806-810; solicitudes de patente estadounidenses 09/821832, 09/215257; patente estadounidense. No. 6,506,559; PCT/US01/10188 ; solicitud de patente europea No. de Serie 00126325) . Se cree que estos iARN actúan por lo menos en parte al moderar la degradación de sus ARN objetivo. Sin embargo, puesto que son de menos de 30 nucleótidos de longitud, no disparan un mecanismo de defensa antiviral de la célula. Tales mecanismos incluyen producción de interferón y una supresión general de la síntesis de proteína de célula huésped. Prácticamente, los siARN pueden ser sintetizados y luego clonados a vectores de ADN. Tales vectores pueden ser transfectados y fabricados para expresar siARN a altos niveles. El alto nivel de expresión de siARN es usado para "expulsar" o reducir significativamente la cantidad de proteína producida en una célula y asi es útil en ajustes celulares en donde se cree que la sobreexpresión de una proteina está enlazada a una alteración patológica. Los aptámeros son moléculas de ácido nucleico que son capaces de enlazarse a una molécula objetivo, tal como una proteina de DSCRl. La generación y uso terapéutico de aptámeros están bien establecidos en el arte. Véase, patente estadounidense No. 5,475,096, y la eficacia terapéutica de Macugen® (Eyetech, New York) para tratamiento de degeneración macular relacionada con la edad. La tecnología anti-sentido está bien establecida en el arte. Detalles adicionales con respecto a esta tecnología son proporcionados posteriormente en la presente.

E . Formulaciones farmacéuticas Formulaciones terapéuticas de los moduladores de DSCRl usados de acuerdo con la invención son preparadas para almacenamiento al mezclar el modulador de DSCRl que tiene el grado de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizadores aceptables farmacéuticamente opcionales (Remington, s Pharmaceutical Sciences lßth edition, Osol, A. Ed. (1980), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos a los receptores a las dosificaciones y concentraciones usadas e incluyen soluciones reguladores del pH tales como acetato, Tris, fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes en los que se incluyen ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenes tales como metil o propil paraben; catecol, resorcinol; ciciohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinil pirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos en los que se incluye glucosa, mañosa o dextrinas; agentes gelantes tales como EDTA; tonificadores tales como trehalosa y cloruro de sodio, azucares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; surfatantes tales como polisorbato; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos de metal (por ejemplo, complejos de Zn-proteina); y/o surfatantes no iónicos tales como TWEEN®, PLURONICS® o polietilenglicol (PEG) . Las formulaciones de la presente pueden también contener más de un compuesto activo como sea necesario para la indicación particular que es tratada, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre si. Por ejemplo, además de un modulador de DSCRl, puede ser deseable incluir en la formulación, un modulador adicional, por ejemplo, un segundo anticuerpo que se enlaza a un epítopo diferente sobre la proteina de DSCRl o un anticuerpo a algún otro objetivo. Alternativa o adicionalmente, la composición puede comprender además un agente quimioterapéutico, agente citotóxico, citocina, agente inhibidor de crecimiento, agente antihormonal y/o cardioprotector. Tales moléculas están apropiadamente presentes en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito planeado. Los ingredientes activos pueden también estar atrapados en microcápsulas preparadas por ejemplo mediante técnicas de conservación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacilato) , respectivamente, en sistemas de administración de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanoparticulas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Tales técnicas son reveladas en Remington' s Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A.Ed.(1980). Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos apropiados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semi-permeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, tales matrices están en forma de artículos formados, por ejemplo películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) o poli(alcoho lvinilico) ) , polilacturos (patente estadounidense No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y gama etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como el LUPRON DEPOT® (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leoproluro) y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico . Las formulaciones a ser usadas para utilización en vivo deben ser estériles. Esto se lleva a cabo fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles .

F. Tratamiento con un modulador de DSCRl de la invención Los moduladores de DSCRl de la invención tienen varias aplicaciones no terapéuticas. Los moduladores pueden ser útiles para la escalación o detección de enfermedades que expresan DSCRl (por ejemplo, en radio formación de imagen) . Los anticuerpos, oligopéptidos y moléculas pequeñas orgánicas son también útiles para la purificación o inmunoprecipitación de DSCRl de células, para detección y cuantificación de DSCRl in vitro, por ejemplo en un ELISA o Western blot, para modular eventos celulares en una población de células. Actualmente, dependiendo de la etapa del cáncer, el tratamiento de cáncer involucra una o una combinación de las siguientes terapias: cirugía para remover el tejido canceroso, terapia de radiación y quimioterapia. La terapia que comprende moduladores de DSCRl puede ser especialmente deseable en pacientes de edad avanzada que no toleran la toxicidad y efectos secundarios de quimioterapia bien y en enfermedad metaestática en donde la terapia de radiación tiene utilidad limitada. Para aplicaciones terapéuticas, los moduladores de DSCRl pueden ser usados solos o en terapia de combinación, por ejemplo con hormonas, antiangiógenos, o compuestos radiomarcados o con cirugía, crioterapia y/o radioterapia. Los moduladores de DSCRl pueden ser administrados en conjunción con otras formas de terapia convencional, ya sea consecutivamente con, terapia pre- o post- convencional. Fármacos quimioterapéuticos tales como TAXOTERE® (docetaxel), TAXOL® (paclitaxel), estramustina y mitoxantrona son usados en tratamiento de cáncer, en particular, en pacientes de buen riesgo. Los moduladores de DSCRl serían en general administrados con una dosis terapéuticamente efectiva del agente quimioterapéutico. En otra modalidad, un modulador de DSCRl es administrado en conjunción con quimioterapia para reducir los efectos secundarios resultantes del agente quimioterapéutico, por ejemplo paclitaxel. El Physicians' Desk Reference (PDR) revela dosificaciones de estos agentes que han sido usados en el tratamiento de varios cánceres. El régimen de dosificación y dosificaciones de estos fármacos quimioterapéuticos mencionados anteriormente que son terapéuticamente efectivos dependerán del cáncer particular que es tratado, la extensión de la enfermedad y otros factores familiares para el médico de habilidad en el arte y pueden ser determinados por el médico. Los moduladores de DSCRl son administrados a un paciente humano, de acuerdo con métodos conocidos, tales como administración intravenosa, por ejemplo como un bolo o mediante infusión continua en un periodo de tiempo, mediante rutas intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o inhalación. La administración intravenosa o subcutánea del anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica es preferida en una modalidad de la invención. Otros regímenes terapéuticos pueden ser combinados con la administración del modulador de DSCRl. La administración combinada incluye coadministración utilizando formulaciones separadas o una sola formulación farmacéutica y administración consecutiva ya sea en un orden u otro, en donde preferiblemente hay un periodo de tiempo en tanto que ambos (o todos) los agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas. Preferiblemente, tal terapia combinada da como resultado un efecto terapéutico sinergistico y/o reducción de efectos secundarios indeseables. También puede ser deseable combinar la administración del modulador de DSCRl, con la administración de un agente terapéutico dirigido contra otro antígeno asociado con la condición patológica particular. En otra modalidad, los métodos de tratamiento terapéuticos de la presente invención involucran la administración combinada de una molécula moduladora de DSCRl y uno o más agentes quimioterapéuticos o agentes inhibidores de crecimiento, en los que se incluyen co-administración de cocteles de diferentes agentes quimioterapéuticos. Los agentes quimioterapéuticos incluyen fosfato de estramustina, prednimustina, cisplatina, 5-fluorouracilo, melfalana, ciclofosfamida, hidroxiurea e hidroxiureataxanos (tales como paclitaxel y doxetaxel) y/o antibióticos de antraciclina. La preparación y programas de dosificación para tales agentes quimioterapéuticos pueden ser usados de acuerdo con las instrucciones del fabricante o como se determina empíricamente por el práctico experimentado. Programas de preparación y dosificación para tal quimioterapia también son descritos en Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992) . El modulador de DSCRl puede ser combinado con un compuesto anti-hormonal, por ejemplo un compuesto antiestrógeno tal como tamoxifeno; una anti-progesterona tal como onapristona (véase, EP 616 812) o un anti-andrógeno tal como flutamida, en dosificaciones conocidas para tales moléculas. En donde el cáncer a ser tratado es cáncer independiente de andrógeno, el paciente puede previamente haber sido sometido a terapia anti-andrógeno y después que el cáncer se vuelve independiente de andrógeno, el modulador de DSCRl puede ser administrado al paciente. Algunas veces, puede ser benéfico también co-administrar un cardioprotector (para impedir o reducir la disfunción miocardiaca asociada con la terapia) o una o más citocinas al paciente. Además de los regímenes terapéuticos anteriores, el paciente puede ser sometido a remoción quirúrgica de células de cáncer y/o terapia de radiación, antes, simultáneamente con o post-terapia de modulador de DSCRl. Dosificaciones apropiadas para cualquiera de los agentes co-administrados anteriores son aquellas usadas actualmente y pueden ser disminuidas debido a la acción combinada (sinergia) del agente y modulador de DSCRl. Para la prevención o tratamiento de enfermedad, la dosificación y modo de administración serán escogidos por el médico de acuerdo con criterios conocidos. La dosificación apropiada del modulador de DSCRl dependerá del tipo de enfermedad a ser tratada, como se define anteriormente, la severidad y curso de la enfermedad, si el modulador de DSCRl es administrado por propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta al modulador de DSCRl y la discreción del médico que atiende. El modulador de DSCRl es administrado convenientemente al paciente a una vez o en una serie de tratamientos. En una modalidad, el modulador de DSCRl es administrado mediante infusión intravenosa o mediante inyecciones subcutáneas. Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, aproximadamente un microgramo/Kg a aproximadamente 50 miligramos/Kg de peso corporal (por ejemplo, una dosis de aproximadamente 0.1-15 mg/Kg/dosis) de anticuerpo puede ser una dosificación candidata inicial para administración al paciente, ya sea, por ejemplo mediante una o más administraciones separadas o mediante infusión continua. Un régimen de dosificación puede comprender administrar una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 miligramos/Kg, seguida por una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 2 miligramos/kg del anticuerpo modulador de DSCRl. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles. Una dosificación diaria típica podría fluctuar de aproximadamente un microgramo/Kg a 100 mg/Kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas en varios días o más largo, dependiendo de la condición, el tratamiento es sostenido hasta que ocurre una supresión deseable de los síntomas de la enfermedad. El avance de esta terapia puede ser monitoreado fácilmente mediante métodos y análisis convencionales y basados en criterios conocidos para el médico u otras personas de habilidad en el arte. Además de la administración de un modulador de polipéptido (por ejemplo, polipéptido, anticuerpo, etc.) al paciente, la invención contempla la administración de un modulador mediante terapia genética. Tal administración de ácido nucleico que comprende/codifica el modulador de DSCRl es abarcada por la expresión "administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un modulador de DSCRl". Véase, por ejemplo, WO 96/07321 publicado el 14 de marzo de 1996 concerniente con el uso de terapia genética para generar anticuerpos intracelulares. Hay dos procedimientos principales para introducir el ácido nucleico (contenido opcionalmente en un vector) a las células del paciente; in vivo y ex vivo. Para la administración in vivo, el ácido nucleico es inyectado directamente al paciente, usualmente en el sitio en donde se requiere el modulador de DSCRl. Para el tratamiento ex vivo, las células del paciente son removidas, el ácido nucleico es introducido a éstas células aisladas y las células modificadas son administradas al paciente ya sea directamente o por ejemplo encapsuladas dentro de membranas porosas que son implantadas al paciente (venase, por ejemplo patentes estadounidenses Nos. 4,892,538 y 5,283,187). Hay una variedad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos a células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico es transferido a células cultivadas in vitro o in vivo en las células del huésped propuesto. Técnicas apropiadas para la transferencia de ácido nucleico a células mamíferas in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextran, el método de precipitación de fosfato de calcio, etc. Un vector usado comúnmente para administración ex vivo del gen ex vivo del gen es un vector retroviral. En una modalidad, las técnicas de transferencia de ácido nucleico in vivo incluyen transfección con vectores virales (tales como adenovirus, virus de herpes simple I o virus adeno-asociados) y sistemas a base de lípido (lípidos útiles para la transferencia moderada por lipido del gen son DOTMA, DOPE y DC-Chol, por ejemplo) . Para la revisión de los protocolos de marcación de gen y terapia genética actualmente conocidos véase Anderson et al., Science 256:808-813 (1992). Véase también WO 93/25673 y las referencias citadas en el mismo. Los anticuerpos del modulador de DSCRl de la invención pueden estar en las diferentes formas abarcadas por la definición de "anticuerpo" en la presente. Así, los anticuerpos incluyen anticuerpo de plena longitud o anticuerpo intacto, fragmentos de anticuerpo, anticuerpo de secuencia natural o variantes de aminoácido, anticuerpos humanizados, quiméricos o de fusión y fragmentos funcionales de los mismos. La invención proporciona una composición que comprende un modulador de DSCRl y un portador. En una modalidad adicional, una composición puede comprender un modulador de DSCRl en combinación con otros agentes terapéuticos tales como agentes citotóxicos o agentes inhibidores de crecimiento, en los que se incluyen agentes quimioterapéuticos . La invención también proporciona formulaciones que comprenden un modulador de DSCRl y un portador. En una modalidad, la formulación es una formulación terapéutica que comprende un portador aceptable farmacéuticamente .

G. Artículos de manufactura y equipos Otra modalidad de la invención es un artículo de manufactura que contiene materiales útiles para el tratamiento de una alteración utilizando un modulador de DSCRl. El articulo de manufactura comprende un recipiente y una etiqueta o inserto de paquete sobre o asociado con el recipiente. Recipientes apropiados incluyen, por ejemplo botellas, frascos, jeringas, etc. Los recipientes pueden ser formados a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente retiene una composición que es efectiva para el tratamiento de la condición y puede tener un orificio de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un frasco que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Por lo menos un agente activo en la composición es un modulador de DSCRl de la invención. La etiqueta o inserto de paquete indica que la composición es usada para el tratamiento de una alteración particular. La etiqueta o inserto de paquete comprenderá adicionalmente instrucciones para administrar la composición al paciente. Adicionalmente, el artículo de manufactura puede comprender además un segundo recipiente que comprende una solución reguladora aceptable farmacéuticamente, tal como agua bacterioestática para inyección (BWFI), solución salina de pH regulado de fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir adicionalmente otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, en los que se incluyen otras soluciones reguladoras del pH, diluyentes, filtros, agujas y jeringas. También se proporcionan equipos que son útiles para varios propósitos. Se pueden proporcionar equipos que contienen moduladores de DSCRl de la invención para la detección y cuantificación de DSCRl in vitro, por ejemplo en un análisis de ELISA o un análisis de Western blot. Con el articulo de manufactura, el equipo comprende un recipiente y una etiqueta o inserto de paquete sobre o asociados con el recipiente. El recipiente retiene una composición que comprende por lo menos un modulador de DSCRl de la invención. Recipientes adicionales pueden ser incluidos que contienen, por ejemplo diluyentes y soluciones reguladoras del pH, anticuerpos de control. La etiqueta o inserto de paquete puede proporcionar una descripción de la composición también como instrucciones para el uso in vitro o de detección propuesto.

H . Moduladores de DSCRl que comprenden polipéptidos o ácidos nucleicos - Formas especificas y aplicaciones En una modalidad, los ácidos nucleicos de la invención incluyen oligonucleótidos/polinucleótidos antisentido o sentido que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos de una sola hebra (ya sea ARN o ADN) capaces de enlace a ácidos nucleicos de DSCRl endógenos o que codifican polipéptidos de DSCRl. Los oligonucleótidos antisentido o sentido, de acuerdo con la presente invención, comprenden por lo menos un fragmento de la región de codificación de ADN de DSCRl. Tal fragmento comprende en general por lo menos aproximadamente 14 nucleótidos, preferiblemente alrededor de 14 a 30 nucleótidos. La habilidad para derivar un polinucleótido antisentido o sentido, en base a una secuencia de cADN que codifica una proteína dada es descrita por ejemplo en Stein and Cohén (Cáncer Res. 48:2659, 1988) and van der Krol et al. (BioTechniques 6:958, 1988). El enlace de oligonucleótidos sentido o antisentido a secuencias de ácido nucleico objetivo da como resultado la formación de dúplex que bloquean la transcripción o traducción de la secuencia objetivo mediante uno de varios medios, en los que se incluyen degradación mejorada de los dúplex, terminación prematura de transcripción o traducción o mediante otros medios. Tales métodos son abarcados por la presente invención. Los oligonucleótidos antisentido así pueden ser usados para bloquear la expresión de una proteína de DSCRl en células endoteliales. Los oligonucleótidos antisentido o sentido comprende además oligonucleótidos que tienen cadenas fundamentales de azúcar-fosfodiester modificadas (u otros enlaces de azúcar, tales como aquellos descritos en WO 91/06629) y en donde tales enlaces de azúcar son resistentes a nucleasias endógenas. Tales oligonucleótidos con enlaces de azúcar resistentes son estables in vivo (esto es, capaces de resistir la degradación enzimática) pero retienen la especificidad de secuencia para ser aptos para enlazarse a secuencias de nucleótido objetivo. Sitios intragénicos preferidos para el enlace antisentido incluyen la región que incorpora el codon de inicio/partida de traducción (5' -AUG / 5' -ATG) o codon de terminación/parada (5'-UAA, 5' -UAG y 5-UGA / 5'-TAA, 5' -TAG y 5' -TGA) del cuadro de lectura abierta (ORF) del gen. Estas regiones se refieren en una porción del mARN o gen que abarca de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleótidos contiguos ya sea en una dirección u otra (esto es, 5' o 3' ) de un codon de inicio o terminación de traducción. Otras regiones ejemplares para el enlace antisentido incluyen: intrones; exones; uniones de intron-exon; el cuadro de lectura abierta (ORF) o "región de codificación", que es la región entre el codón de inicio de traducción y el codón de terminación de traducción; la corona 5' de un mARN que comprenden el residuo de guanosina N7-metilado unido al residuo más 5' del mARN via un enlace de trifosfato 5' -5' e incluye la estructura de coronación 5' en si misma también como los primeros 50 nucleótidos adyacentes a la corona; la región sin traducir 5' (5'UTR), la porción de un mARN en dirección 5' del codon de inicio de traducción y así incluye nucleótidos entre el sitio de clonación 5' y el codón de inicio de traducción de un mARN o nucleótidos correspondientes en el gen y la región sin traducir 3' (3' UTR), la porción de un mARN en dirección 3' del codón de terminación de traducción y asi incluye nucleótidos entre el codón de terminación de traducción y el extremo 3' de un mARN o nucleótidos correspondientes en el gen. Ejemplos específicos de compuestos antisentido útiles para inhibir la expresión de polipéptido de DSCRl incluyen oligonucleótidos que contienen cadenas fundamentales modificadas o enlaces de internucleótidos no naturales. Los oligonucleótidos que tienen cadenas fundamentales modificadas incluyen aquellos que retienen un átomo de fósforo en la cadena fundamental y aquellos que no tienen un átomo de fósforo en la cadena fundamental. Para los propósitos de esta especificación y como se hace referencia algunas veces en el arte, los oligonucleótidos modificados no tienen un átomo de fósforo en su cadena fundamental de internucleótido pueden también ser considerados como oligonucleócidos . Cadenas fundamentales de oligonucleótidos modificadas ejemplares incluyen, por ejemplo, fósforotioatos, fósforotioatos quirales, fósforoditioatos, fósfotriésteres, aminoalquilfósfotri-ésteres, metil- y otros alquil-fosfonatos en los que se incluyen 3' -alquilenfosfonatos, 5' -alquilenfosfonatos y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos en los que se incluyen 3' -amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfos-fonatos, tionoalquilfosfotriésteres, selenofosfatos y borano- fosfatos que tienen enlaces 3' -5' normales, análogos 2' -5' enlazados de estos y aquéllos que tienen polaridad invertida, en donde uno o más enlaces de internucleótido es un enlace 3' a 3', 5' a 5' ó 2' a 2' . Oligonucleótidos ejemplares que tienen polaridad invertida comprenden un solo enlace 3' a 3' en el enlace de internucleótido más 3', esto es, un solo residuo de nucleótido invertido que puede ser abásico (la nucleobase falta o tiene un grupo hidroxilio en lugar de la misma) . Varias sales, sales mezcladas y formas de ácido libre también están incluidos. Patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de enlaces que contienen fósforo incluyen pero no están limitadas a patentes estadounidenses Nos. 3,687,80 4,469, 863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897 5,264, 423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131 5,399, 676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677 5,476, 925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 5,194,599; 5,565,555 5,527,899; 5,721,218; 5,672,697 y 5,625,050, cada una de las cuales es incorporada a la presente por referencia. Ejemplos de cadenas fundamentales de oligonucleótidos modificadas que no incluyen un átomo de fósforo en las mismas tienen cadenas fundamentales que son formadas mediante enlaces de internucleócido de alquilo de cadena corta o cicloalquilo, enlaces de internucleócido de heteroátomo mezclado y alquilo o cicloalquilo o uno o más enlaces de internucleósido heteroatómicos o heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Estos incluyen aquellos que tienen enlaces de morfolino (formados en parte a partir de la porción de azúcar de un nucleócido) ; cadenas fundamentales de siloxano; cadenas fundamentales de sulfuro, sulfóxido y sulfona; cadenas fundamentales formiacetilo y tioformiacetilo; cadenas fundamentales de metilenformiacetilo y tioformiacetilo; cadenas fundamentales de riboacetilo; cadenas fundamentales que contienen alqueno; cadenas fundamentales de sulfamato; cadenas fundamentales de metilenemino y metilenhidracino; cadenas fundamentales de sulfonato y sulfonamida; cadenas fundamentales de amida y otras que tienen partes de componentes N, O, S y CH.sub.2 mezcladas. Patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de tales oligonucleócidos incluyen, pero no están limitadas a, patentes estadounidenses Nos. ,034, 506; 5, 166, 315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141 5,235, 033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257 5, 466, 677; 5, 470, 967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225 5,596,086; 5, 602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046 555,,, 666111000,,,222888999;;; 55,, 661188,,770044;; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360 5,677,437; 5,792,608; 5,646,269 y 5,677,439, cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia. En otros ejemplos de oligonucleótidos antisentido, tanto el enlace de azúcar como de internucleócido, esto es, la cadena fundamental, de las unidades de nucleótido son reemplazados con nuevos grupos. Las unidades base son mantenidas para hibridización con un compuesto objetivo de ácido nucleico apropiado. Uno de tales compuestos oligoméricos, un mimético de oligonucleótido que ha mostrado tener excelentes propiedades de hibridización, es denominado como un ácido nucleico de péptido (PNA) . En los compuestos de PNA, la cadena fundamental de azúcar de un oligonucleótido es reemplazada con una cadena fundamental que contiene amida, en particular, una cadena fundamental de aminoetilglicina . Las nucleobases son retenidas y son enlazadas directa o indirectamente a átomos de nitrógeno aza de la porción de amida de la cadena fundamental. Patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de compuestos de PNA incluyen, pero no están limitadas a, patentes estadounidenses Nos. 5,539,082; 5,714,331 y 5,719,262, cada una de las cuales es incorporada a la presente por referencia. Enseñanzas adicionales de compuestos de PNA se pueden encontrar en Nielsen et al., Science, 1991, 254,1497-1500. Ejemplos de oligonucleótidos antisentido que incorporan cadenas fundamentales de fósforotioato y/o cadenas fundamentales heteroátomo y en particular -CH2-NH-0-CH2_, -CH_N (CH3) -0-CH2- [conocida como cadena fundamental de metileno (metilimino) o MMI], -CH2-0-N (CH3) -CH2_, -CH2_N (CH3) -N (CH3) -CH2_ y -O-N (CH3) -CH2-CH2- [en donde la cadena fundamental de fosfodiester natural es representada como -0-P-0-CH2-] descrita en la patente estadounidense No. 5,489,677, a la que se hace referencia anteriormente y las cadenas fundamentales de amida de la patente estadounidense No. 5,602,240, a la que se hace referencia anteriormente. Ejemplos adicionales son oligonucleótidos antisentido que tienen estructuras de cadena fundamental de morfolino de la patente estadounidense No. 5,034,506 a la que se hace referencia anteriormente. Oligonucleótidos modificados pueden también contener una o más porciones de azúcar sustituidas. Oligonucleótidos ejemplares comprenden uno de los siguientes en posición 2' : OH; F; O-alquilo, S-alquilo, o N-alquilo; O-alquenilo, S-alquenilo, o N-alquenilo; O-alquinilo, S-alquinilo o N-alquinilo o O-alquilo-O-alquilo, en donde el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden estar sustituidos o sin sustituir con Ci a Cío alquilo o C2 a Cío alquenilo o alquinilo. Particularmente preferidos son 0[ (CH2)nO]raCH3, 0(CH2)nOCH3 0(CH2)nNH2, 0(CH2)nCH3, 0(CH2)nONH2, y O (CH2) nON [ (CH2) nCH3) ] 2, en donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. Otros oligonucleótidos antisentido ejemplares comprenden uno de los siguientes en posición 2' : Ci a Cío alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, alquenilo, alquinilo, alkarilo, aralquilo, O-alkarilo o O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Ci, Br, CN CF3, OCF3, SOCH3, S02 CH3, 0N02, N02, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalkarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de mezclas ARN, un grupo de reportero, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una modificación posible incluye 2' -metoxietoxi (2'-0-CH2CH2OCH3, también conocido como 2' -0- (2-metoxietilo) o 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504) esto es, un grupo alcoxialcoxi . Una modificación preferida adicional incluye 2' -dimetilaminooxietoxi, esto es, un grupo 0(CH2)2ON (CH3)2 también conocido como 2'-DMAOE, y 2'-dimetilaminoetoxietoxi (también conocido en el arte como 2'-0-dimetilaminoetoxietilo o 2'-DMAE0E), esto es 2' -0-CH2-0-CH2-N(CH2) . Una modificación adicional incluye ácidos nucleicos bloqueados (LNA) en los cuales el grupo 2' -hidroxilo está enlazado al átomo de carbono 3' o 4' del anillo de azúcar, formando mediante esto una procesión de azúcar bicíclica. El enlace puede ser un grupo metelino (-CH2-)n que une el átomo de oxigeno 2' y el átomo de carbono 4' en donde n es 1 o 2. LNA y la preparación de los mismos son descritos en WO 98/39352 y WO 99/14226. Otras modificaciones incluyen 2' -metoxi (2'-0-CH3), 2' -aminopropoxi (2' -OCH2CH2CH2NH2) , 2' -alil (2' -CH2-CH=CH2) , 2'-0-alil (2' -0-CH2-CH=CH2) y 2 ' - fluoro (2'-F). La modificación 2'puede ser en la posición arabino (hacia arriba) o posición ribo (hacia abajo). Una modificación 2'- arabino es 2'-F.

Modificaciones similares pueden también ser realizadas en otras posiciones sobre el oligonucleótido, particularmente la posición 3' del azúcar sobre el nucleótido 3' terminal o el oligonucleótidos 2' -5' enlazados y la posición 5' del nucleótido 5' terminal. Los oligonucleótidos pueden también tener miméticos de azúcar tales como porciones de ciclobutilo en lugar de la azúcar de pentofuranosilo . patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de tales estructuras de azúcar modificadas incluyen, pero no están limitadas a, patentes estadounidenses Nos. 4,981,957 ,118,800; 5,319,080; 5,359,044 5,393,878; 5,446,137 ,466,786; 5,514,785; 5,519,134 5,567,811; 5,576,427 ,591,722; 5,597,909; 5,610,300 5,627,053; 5,639,873, ,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 5,792,747 y 5,700,920, cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia en su totalidad. Los oligonucleótidos pueden también incluir modificaciones o sustituciones de nucleobase (frecuentemente terminada en el arte simplemente como "base") . Como se usa en la presente, las nucleobases "sin modificar" o "naturales" incluyen las bases de purina adenina (A) y guanina (G) y las bases de pirimidina timina (T) , citosina (C) y uracilo (U) .

Nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases sintéticas y naturales tales como 5- metilcitosina (5-me-C) , 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros alquil derivados de adenina y guanina, 2-propilo y otros alquil derivados de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinilo (-C=C-CH3 o -CH2-C=CH) uracilo y citosina y otros alquinil derivados de bases de pirimidina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (seudouracilo) , 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8- sustituidas, 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7- desazaaguanina y 7-desazaadenina y 3-desazaaguanina y 3-desazaadenina . Nucleobases modificadas adicionales incluyen pirimidinas triciclicas tales como fenoxazina citidina ( lH-pirimido [5, 4-b] [1, 4 ] benzoxazin-2 (3H) -ona) , fenotiacina citidina (lH-pirimido [5, 4-b] [1, 4 ] benzotiacin-2 (3H) -ona) , abrazaderas G tales como una fenoxacina citidina sustituida (por ejemplo, 9- (2-aminoetoxi) -H-pirimido [5, 4-b] [1,4] benzoxazin-2 (3H) -ona) , carba-zol citidina (2H-pirimido [4, 5-b] indol-2-ona) , piridoindol citidina (H-pirido [3' , 2' : 4 , 5] pirrólo [2, 3-d] pirimidin-2-ona) . Nucleobases modificadas pueden también incluir aquéllas en las cuales la base de purina o pirimidina es reemplazada con otros heterociclos, por ejemplo 7-desaza-adenina, 7-desaza-guanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Nucleobases adicionales incluyen aquéllas reveladas en la patente estadounidense No. 3,687,808, aquellas reveladas en The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, y aquéllas reveladas por Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613. Ciertas de estas nucleobases son particularmente útiles para incrementar la afinidad de enlace de los compuestos oligomédicos de la invención. Estas incluyen pirimidina 5-sustituidos, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y 0-6 sustituidas, en las que se incluyen 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina . Se ha demostrado que las sustituciones de 5-metilcitosina incrementan la estabilidad dúplex de ácido nucleico mediante 0.6-1.2 grados. C. (Sanghvi et al, Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Ratón, 1993, pp . 276-278) y son sustituciones base ejemplares, por ejemplo cuando son combinadas con modificaciones de azúcar de 2 ' -O-metoxietilo. Patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de nucleobases modificadas incluyen pero no están limitadas a: patentes estadounidenses Nos. 3, 687, 808 4,845,205; 5, 130,302 5,134,066 5,175,273 5,367, 066 5,432,272; 5,457, 187 5,459,255 5,484,908 5,502,177 5,525,711; 5,552,540 5,587,469 5,594,121 5,596,091 5, 614, 617; 5,645,985 5,830,653 5,763,588 6,005, 096 5,681,941 y 5,750,692, cada una de las cuales es incorporada a la presente por referencia Otra modificación de oligonucleótidos antisentido comprende enlace químicamente al oligonucleótido una o más porciones o conjugados que mejoran la actividad, distribución celular o absorción celular del oligonucleótido. Los compuestos de la invención pueden incluir grupos conjugados enlazados covalentemente a grupos funcionales tales como grupos hidroxilo primarios o secundarios. Grupos conjugados de la invención incluyen intercaladores, moléculas de reportero, poliaminas, poliamidas, polietilen glicoles, poliéteres, grupos que mejoran las propiedades farmacodinámicas de oligómeros y grupos que mejoran las propiedades farmacocinéticas de oligómeros. Grupos conjugados típicos incluyen colesteroles, lípidos, lípidos de catión, fosfolípidos, fosfolipidos catiónicos, biotina, fenazina, foliato, fenantridina, antraquinona, acridina, floresceinas, rodaminas, cumarinas y tintes. Grupos que mejoran las propiedades farmacodinámicas, en el contexto de esta invención, incluyen grupos que mejoran la absorción de oligómero, mejoran la resistencia del oligómero a la degradación y/o refuerzan la hibridización secuencia-específica con ARN. Grupos que mejoran las propiedades farmacocinéticas, en el contexto de esta invención, incluyen grupos que mejoran la absorción de oligómero, distribución, metabolismo o excreción. Porciones de conjugado incluyen pero no están limitados a porciones de lípido tales como una porción de colesterol (Letsinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1989,86,6553-6556), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), un tioéter, por ejemplo hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucí. Acids Res., 1992, 20, 533-538), una cadena alifática, por ejemplo residuos de dodecandiol o undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), un fosfolípido, por ejemplo di-hexadecil-rac-glicerol o trietil-amonio 1, 2-di-0-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucí. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973) o adamantano ácido acético (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), una porción de palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta 1995, 1264, 229-237) o una cadena octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol . Los oligonucleótidos de la invención pueden también ser conjugados a sustancias farmacoactivas, por ejemplo aspirinas, warfarina, fenilbutazona, ibuprofeno, suprofeno, fenbufeno, queetoprofeno, (S)-(+)- pranoprofeno, carprofeno, dansilsarcosina, ácido 2, 3, 5, -triyodobenzoico, ácido flufenámico, ácido folínico, una benzotiadiazida, clorotiazida, una diazepina, indometicina, un barbiturato, una cefalosforina, un fármaco sulfa, un antidiabético, un antibacteriano o un antibiótico. Conjugados de oligonucleótidos-fármaco y su preparación son descritos en la solicitud de patente estadounidense número de serie 09/334,130 (presentadoa el 15 de junio de 1999) y patentes estadounidenses Nos. 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313 ,545,730 5,552,538 5,578,717 5,580,731 5,580,731 5,591,584 5, 109, 124 5, 118,802 5,138,045 5,414, 077 5,486, 603 5,512, 439 5,578,718 5, 608, 046 4,587,044 4, 605,735 4, 667, 025 4,762,779 4,789,737 4,824, 941 4,835,263 4,876, 335 4, 904,582 4,958,013 5,082,830 5,112, 963 5,214, 136 5,082, 830 5,112,963 5,214, 136 5,245, 022 5,254, 469 5,258, 506 5,262,536 5,272,250 5,292, 873 5,317, 098 5,371,241 5,391,723 5,416,203 5,451, 463 5,510,475 5,512, 667 5,514,785 5,565,552 5,567, 810 5,574, 142 5,585,481 5,587,371 5,595,726 5,597, 696 5,599,923; 5,599,928 y 5,688,941, cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia. No es necesario que todas las composiciones en un compuesto dado sean modificadas uniformemente y en efecto más de una de las modificaciones mencionadas anteriormente pueden ser incorporadas en un solo compuesto o en un sólo nucleócido dentro de un oligonucleótido. La presente invención también incluye compuestos antisentido que son compuestos quiméricos. Compuestos antisentido "quiméricos" ó "quimeras", en el contexto de esta invención, son compuestos antisentido, particularmente oligonucleótidos, que contienen dos o más regiones químicamente distintas, cada una compuesta de por lo menos una unidad de monómero, esto es, un nucleótido en el caso de un compuesto de oligonucleótido. Estos oligonucleótidos contienen comúnmente por lo menos una región en donde el oligonucleótido está modificado para conferir al oligonucleótido resistencia incrementada a la degradación de nucleasia, absorción celular incrementada, y/o afinidad de enlace incrementada por el ácido nucleico objetivo. Una región adicional del oligonucleótido puede servir como sustrato para enzimas capaces de escindir híbridos de ARN:ADN ó ARN:ARN. A manera de ejemplo, RNasa H es una endonucleasa celular que escinde la hebra de ARN de un dúplex de ARN: ADN. Por consiguiente, la activación de RNase H, da como resultado la escisión del ARN objetivo, mejorando mediante esto extensamente la eficiencia de inhibición de oligonucleótido de expresión genética. Consecuentemente, resultados comparables pueden frecuentemente ser obtenidos con oligonucleótidos más cortos cuando se usan oligonucleótidos quiméricos, en comparación con fosforotioato desoxioligonucleótidos que hibridizan a la misma región objetivo. Compuestos antisentido quimérico de invención pueden ser formados como estructuras compuestas de dos o más oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados, oligo-nucleósidos y/o miméticos de oligonucleótidos, se describen anteriormente. Oligonucleótidos antisentido quiméricos ejemplares incorporan por lo menos un azúcar 2' modificado (preferiblemente 2' -O- (CH2 ) 2-0-CH3 ) en la terminal 3' para conferir resistencia de nucleasa y una región con por lo menos 4 azúcares 2'-H contiguos para conferir actividad de RNasa H. Tales compuestos también han sido denominados en el arte como híbridos o gápmeros. Gápmeros ejemplares tienen una región de azúcares 2' modificados (preferiblemente 2' -O- (CH2) 2-0-CH3) en la terminal 3'- y en la terminal 5' separados por al menos una región que tiene por lo menos 4 azúcares 2' -mezcla H contiguos y pueden incorporar enlaces de cadena fundamental de fosforotioato. Patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de tales estructuras híbridas incluyen pero no están limitadas a, patentes estadounidenses Nos. 5,013,830; 5,149,797; 5,220,007; 5,256,775; 5,366,878; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356; y 5,700,922, cada una de las cuales es incorporada a la presente por referencia en su totalidad. Los compuestos antisentido usados de acuerdo con esta invención pueden ser fabricados conveniente y sistemáticamente por medio de la técnica bien conocida de síntesis en fase sólida. Equipo para tal síntesis es vendido por varios vendedores en los que se incluye, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, California). Cualesquier otros medios para tales sintesis conocidos en el arte pueden ser empleados adicional o alternativamente. Es bien conocido usar técnicas similares para preparar oligonucleótidos tales como los fósforos tioatos y derivados alquilados. Los compuestos de la invención pueden también ser mezclados, encapsulados, conjugados, o asociados de otra manera con otras moléculas, estructuras de molécula o mezclas de compuestos, como por ejemplo, liposomas, moléculas apuntadas al receptor, formulaciones orales, rectales, tópicas u otra formulación, para ayudar en la toma, distribución y/o absorción. Patentes Estadounidenses representativas que enseñan la preparación de tal toma, distribución y/o absorción que ayuda a las formulaciones incluyen, pero no están limitadas a, Patentes Estadounidenses Nos 5, 108, 921; 5,354,844 5,416,016 ,459, 127 5,521,291; 5,543,158 5,547,932 5,583, 020 5,591,721 4,426,330; 4,534,899 5,013,556 5,108, 921 5,213, 804 5,227, 170; 5,264,221 5,356, 633 5,395, 619 5,416, 016 5,417, 978; 5,462, 854 5,469, 854 5,512,295 5,527, 528 5,534,259; 5,543,152; 5,556,948; 5,580,575; y 5,595,756, cada una de las cuales es incorporada a la presente por referencia. Otros ejemplos de oligonucleótidos de sentido o antisentido incluyen aquellos oligonucleótidos que son enlazados covalentemente a porciones orgánicas, tales como aquellas descritas en WO 90/10048, y otras porciones que incrementan la afinidad del oligonucleótido por una secuencia de ácido nucleico u objetivo, tal como poli- (L-lisina) . Todavía además, agentes intercalantes, tales como elipticina y agentes alquilantes o complejos de metal pueden ser anexados a oligonucleótidos de sentido o antisentido para modificar las especificidades de enlace del oligonucleótido antisentido o sentido por la secuencia de nucleótido objetivo. Oligonucleótidos antisentido o sentido pueden ser introducidos a una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico objetivo mediante cualquier método de transferencia genética, en los que se incluyen, por ejemplo, transfección de ADN moderada por CaP04-, electroporación o mediante el uso de vectores de transferencia genética tales como virus de Epstein-Barr. En un procedimiento ejemplar, un oligonucleótido antisentido o sentido es insertado a un vector retroviral apropiado. Una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico objetivo es puesta en contacto con el vector retroviral recombinante, ya sea in vivo o ex vivo. Vectores retrovirales apropiados incluyen, pero no están limitados a, aquellos derivados de los retrovirus murinos M-MuLV, N2 (un retrovirus derivado de M-MuLV) , o los vectores de copia doble designados como DCT5A, DCT5B y DCT5C (véase WO 90/13641) . Oligonucleótidos de sentido o antisentido también pueden ser introducidos a una célula que contiene la secuencia de nucleótidos objetivo mediante formación de un conjugado con una molécula de enlace de ligando, como se describe en WO 91/04753. Moléculas de enlace de ligando apropiadas incluyen pero no están limitadas a, receptores de superficie celular, factores de crecimiento, otras citosinas u otros ligandos que se enlazan a receptores de superficie celular. En general, la conjugación de la molécula de enlace de ligando de preferencia no interfiere sustancialmente con la habilidad de la molécula de enlace de ligando para enlazarse a su molécula o receptor correspondiente o bloquear la entrada del oligonucleótido de sentido o antisentido o su versión conjugada a la célula. Alternativamente, un oligonucleótido sentido o antisentido puede ser introducido a una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico objetivo mediante la formación de un complejo de oligonucleótido-lípido, como se describe en WO 90/10448. El complejo de oligonucleótido sentido o antisentido-lípido, es preferiblemente disociado dentro de la célula mediante una lipasa endógena. Moléculas ARN ó ADN antisentido o sentido son en general de por lo menos aproximadamente 5 nucleótidos de longitud, alternativamente por lo menos de aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, ó 1000 nucleótidos de longitud, en donde en este contexto, el término "aproximadamente" significa la longitud de secuencia de nucleótidos a la que se hace referencia más o menos 10% de aquella longitud a la que se hace referencia. El ácido nucleico que codifica un polipéptido modulador de DSCRl puede también ser usado en terapia genética. En aplicaciones de terapia genética, se introducen genes a células con el fin de obtener síntesis in vivo de un producto genético terapéuticamente efectivo, por ejemplo para reemplazo de un gen defectuoso. "Terapia genética" incluye tanto terapia genética convencional en donde se obtiene un efecto duradero mediante un solo tratamiento y la administración de agentes terapéuticos genéticos, que involucra la administración de una vez o repetida de un ADN o mARN terapéuticamente efectivo. ARN y ADN antisentido pueden ser usados como agentes terapéuticos para bloquear la expresión de ciertos genes in vivo. Ya se ha demostrado que oligonucleótidos antisentido cortos pueden ser importados a células en donde actúan como inhibidores, a pesar de sus bajas concentraciones intracelulares provocadas por su toma restringida por la membrana celular. (Zamecnik et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:4143-4146 [1986]). Los oligonucleótidos pueden ser modificados para mejorar su toma, por ejemplo al sustituir subgrupos fosfodiester cargados negativamente por grupos sin cargar. Hay una variedad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos a células viables. Las técnicas varian dependiendo de si el ácido nucleico es transferido a células cultivadas in vitro o in vivo en las células del huésped propuesto. Técnicas apropiadas para la transferencia de ácido nucleico a células mamíferas in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextrana, el método de precipitación de fosfato de calcio, etcétera. Las técnicas de transferencia genética in vivo actualmente preferidas incluyen transfección con vectores virales (comúnmente retrovirales) y transfección moderada por proteina-liposoma de recubrimiento viral (Dzau et al., Trens in Biotechnology 11, 205-210 [1993]). En algunas situaciones, es deseable proporcionar la fuente de ácido nucleico con un agente que apunta a las células objetivo, tal como un anticuerpo específico para una proteína de membranas superficial celular o la célula objetivo, un ligando para un receptor sobre la célula objetivo, etcétera. En donde se emplean liposomas, las proteínas que se enlazan a una proteína de membrana de superficie celular asociada con endocitosis puede ser usada para punteamiento y/o para facilitar la absorción, por ejemplo proteínas de capsio o fragmentos de los mismos tópicos para un tipo de célula particular, anticuerpos para proteínas que sufren internalización en ciclización, proteínas que apuntan a la localización intracelular y mejoran la vida media intracelular. La técnica de endocitosis moderada por receptor es descrita, por ejemplo por Wu et al., J. Biol. Chem 262,4429-4432 (1987); y Wagner et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990). Para una revisión de marcación genética y protocolos de terapia genética véase Anderson et al., Science 256, 808-813 (1992). Polipéptidos moduladores de DSCRl y moléculas de ácido nucleico de invención pueden ser usados diagnósticamente para tipificación de tejido, en donde polipéptidos de DSCRl pueden ser expresados diferencialmente en un tejido en comparación con otro, preferiblemente en un tejido enfermo en comparación con un tejido normal del mismo tipo de tejido. La presente invención abarca métodos para seleccionar compuestos para identificar aquellos que modulan DSCRl. Los análisis de selección en cuanto a candidatos de fármaco antagonistas están diseñados para identificar compuestos que se enlazan o acomplejan con el polipéptido de DSCRl o interfieren de otra manera con la interacción de los polipéptidos de DSCRl con otras proteínas celulares, en las que se incluyen, por ejemplo inhibir la expresión del polipéptido de DSCRl de células. Tales análisis de selección incluirán análisis propensos a la sección de alto rendimiento de bibliotecas químicas, haciéndolos particularmente apropiados para identificar candidatos de fármacos de molécula pequeña. Los análisis pueden ser efectuados en una variedad de formatos, en los que se incluyen análisis de enlace de proteina-proteina, análisis de selección bioquímicos, inmunoanálisis y análisis a base de célula, que están bien caracterizados en el arte. Todos los análisis por antagonistas son comunes en que requieren poner en contacto el candidato de fármaco con un polipéptido de DSCRl bajo condiciones y por un tiempo suficiente para permitir que éstos dos componentes interactúen. En análisis de enlace, la interacción es enlace y el complejo formado puede ser aislado o detectado en la mezcla de reacción. En una modalidad particular, el polipéptido de DSCRl o el fármaco candidato es inmovilizado sobre una fase sólida, por ejemplo, sobre una caja de micro-título mediante uniones covalentes o no covalentes. La unión no covalente se lleva a cabo en general al recubrir la superficie sólida con una solución del polipéptido de DSCRl y secado. Alternativamente, un anticuerpo inmovilizado, por ejemplo un anticuerpo monoclonal, especifico para el polipéptido de DSCRl a ser inmovilizado puede ser usado para afianzarlo sobre una superficie sólida. El análisis se lleva a cabo al agregar el componente no inmovilizado, que puede ser marcado por un marcador detectable, al componente inmovilizado, por ejemplo, la superficie recubierta que contiene el componente afianzado. Cuando la reacción está completa, los componentes que no reaccionaron son removidos, por ejemplo mediante lavado y los complejos afianzados sobre la superficie sólida son detectados. Cuando el componente originalmente no inmovilizado porta un marcador detectable, la detección del marcador inmovilizado sobre la superficie indica que ocurrió el acomplejamiento. En donde el componente originalmente no inmovilizado que no porta un marcador, el acomplejamiento puede ser detectado, por ejemplo al utilizar un anticuerpo marcado que se enlaza específicamente al complejo inmovilizado. Si el compuesto candidato interactúa con pero no se enlaza a un polipéptido de DSCRl, su interacción con DSCRl puede ser analizada mediante métodos bien conocidos para detectar interacciones de proteína-proteína. Tales análisis incluyen procedimientos tradicionales, por ejemplo reticulación, co-inmunoprecipitación y co-purificación por medio de gradientes o columnas cromatográficas . Además, las interacciones de proteína-proteína pueden ser monitoreadas al utilizar un sistema genético a base de levadura descrito por Fields y colaboradores (Fields and Song, Nature (London) , 340:245-246 (1989); Chien et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991)) como se revela por Chevray y Nathans, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 5789-5793 (1991). Muchos activadores transcripcionales, tales como GAL4 de levadura, consisten de dos dominios modulares físicamente discretos, uno que actúa como el dominio de enlace ADN el otro que funciona como el dominio de transcripción-activación. El sistema de expresión de levadura descrito en las publicaciones anteriores (denominado en general como el "sistema de dos híbridos") , toma ventaja de esta propiedad y emplea dos proteínas híbridas, una de la cual la proteína objetivo es fusionada al dominio de enlace de ADN de GAL4 y otra en la cual las proteínas de activación candidatas son fusionadas al dominio de activación. La expresión de un gen reportero copertímero bajo el control de un promotor GAL4-activado depende de la reconstitución de la actividad del GAL4 vía interacción de proteína-proteína. Colonias que contienen polipéptidos que interactúan son detectadas con un sustrato cromogénico en cuanto a beta-galactosidasa. Un equipo completo (MATCHMAKER™) para identificar interacciones de proteína-proteína entre dos proteínas específicas utilizando la técnica de dos híbridos está disponible comercialmente de Clontech. Este sistema puede también ser extendido para mapear dominios de proteína involucrados en interacciones de proteínas específicas también como para localizar residuos de aminoácidos que son cruciales para estas interacciones. Los compuestos que interfieren con la interacción de DSCRl y otros componentes intra- o extracelulares pueden ser probados como sigue: usualmente una mezcla de reacción es preparada que contiene DSCRl y el componente intra- o extracelular bajo condiciones y por un tiempo que permite la interacción y enlace de los dos productos. Para probar la habilidad de un compuesto candidato para inhibir el enlace, la reacción es ejecutada en ausencia y en presencia del compuesto de prueba. Además, un placebo puede ser agregado a una tercera mezcla de reacción, para servir como control positivo. El enlace (formación de complejo) entre el compuesto de prueba y el componente intra- o extracelular presente en la mezcla es monitoreada como se describe anteriormente en la presente. La formación de un complejo en la(s) reacción (es) de control pero no en la mezcla de reacción que contiene el compuesto de prueba indica que el compuesto de prueba interfiere con la interacción del compuesto de prueba y su socio de reacción. Para analizar antagonistas, el polipéptido de DSCRl puede ser agregado a una célula junto con el compuesto a ser seleccionado por una actividad particular y la habilidad del compuesto para inhibir la actividad de interés en presencia del polipéptido de DSCRl indica que el compuesto es una antagonista al polipéptido de DSCRl. El polipéptido de DSCRl puede ser marcado, tal como mediante radioactividad, de tal manera que el número de moléculas de polipéptido de DSCRl enlazadas a una molécula receptora puede ser usado para determinar la efectividad del antagonista potencial.

Un antagonista de DSCRl potencial es un constructo de ARN o ADN antisentido preparado utilizando tecnología antisentido, por ejemplo, en donde una molécula de ARN o ADN antisentido actúa para bloquear directamente la traducción de mARN mediante hibridización a mARN apuntado e impedir la traducción de proteína. La tecnología antisentido puede ser usada para controlar la expresión genética por medio de formación de triple-hélice o ADN o ARN antisentido, ambas de tales métodos están basados en el enlace de un polinucleótido a ADN o ARN. Por ejemplo, la porción de codificación 5' de la secuencia de polinucleótidos que codifica la proteina de DSCRl madura puede ser usada para designar un oligonucleótido de ARN antisentido o de aproximadamente 10 a 40 pares de base de longitud. Un oligonucleótido de ADN está designado para ser complementario a una región del gen involucrada en la transcripción (triple hélice - véase Lee et al., Nucí. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney et al., Science. 241: 456 (1988); Dervan et al., Science, 251:1360 (1991)), impidiendo mediante esto la transcripción y la producción del polipéptido de DSCRl . El oligonucleótido de ARN antisentido hibridiza al mARN in vivo y bloquea la traducción de la molécula de mARN al polipéptido de DSCRl (antisense - Okano, Neurochem., 56:560 (1991); 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expresión (CRC Press: Boca Ratón, FL, 1988) . Los oligonucleótidos descritos anteriormente pueden también ser administrados a células, de tal manera que el ARN o ADN antisentido puede ser expresado in vivo para inhibir la producción del polipéptido de DSCRl. Cuando se usa ADN antisentido, oligodesoxiribonucleótidos derivados del sitio de inicio de traducción, por ejemplo, entre aproximadamente posiciones -10 y +10 de la secuencia de nucleótido de gen objetivo, son preferidas. Antagonistas potenciales incluyen moléculas pequeñas que se enlazan al sitio activo, el sitio de interacción de proteina u otro sitio de enlace relevante del polipéptido de DSCRl, bloqueando mediante esto la actividad biológica normal del polipéptido de DSCRl. Ejemplos de moléculas pequeñas incluyen, pero no están limitadas a, péptidos pequeños o moléculas semejantes a péptido, preferiblemente péptidos solubles y compuestos orgánicos e inorgánicos sin peptidilo sintéticos . Las ribozimas con moléculas de ARN enzimáticas capaces de catalizar la escisición específica de ARN. Las ribozimas actúan mediante hibridización específica de secuencia al ARN objetivo complementario, seguido por escisión endonucleolítica . Sitios de escisión de ribozima específicos dentro de un objetivo de ARN potencial pueden ser identificados mediante técnicas conocidas. Para detalles adicionales, véase, por ejemplo, Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994) y publicación de PCT No. WO 97/33551 (publicado el 18 de septiembre de 1997) . Moléculas de ácido nucleico en formación de triple hélice usadas para inhibir la transcripción deben ser de una sola hebra y compuestas de desoxinucleótidos . La composición base de estos oligonucleótidos está diseñada de tal manera que promueve la formación de triple hélice vía reglas de apareamiento de base de Hoogsteen, que requiere en general estiramientos dimensionables de purinas o pirimidinas sobre una hebra de un dúplex. Para detalles adicionales, véase, por ejemplo, publicación de PCT No. WO 97/33551, supra. Estas moléculas pequeñas pueden ser identificadas mediante cualquiera de uno o más de los análisis de selección discutidos anteriormente en la presente y/o mediante cualesquier otras técnicas de selección bien conocidas para aquellos experimentados en el arte. En una modalidad, anticuerpos de internalización son preferidos. Los anticuerpos pueden poseer ciertas características o ser modificados para posees tales características, que mejoran la administración de anticuerpos a células. Técnicas para obtener esto son conocidas en el arte. En todavía otra modalidad, un anticuerpo puede ser expresado en una célula objetivo al introducir un ácido nucleico capaz de expresar el anticuerpo a una célula apuntada. Véase, por ejemplo, patentes estadounidenses Nos. 6,703,019; 6,329,173; y publicación de PCT No. 2003/077945. Lipoinfecciones o liposomas pueden también ser usados para administrar el anticuerpo a células. En donde se usan fragmentos de anticuerpo, el fragmento inhibidor más pequeño que se enlaza específicamente al dominio de enlace de la proteina objetivo es en general ventajoso. Por ejemplo, en base a las secuencias de región variable de un anticuerpo, moléculas de péptido pueden ser diseñadas que retienen la habilidad para enlazarse a la secuencia de proteína objetivo. Tales péptidos pueden ser sintetizados químicamente y/o producidos mediante tecnología de ADN recombinante. Véase, por ejemplo, Marasco et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 90: 7889-7893 (1993). La entrada de polipéptidos moduladores a células objetivo puede ser mejorada mediante métodos conocidos en el arte. Por ejemplo, ciertas secuencias, tales como aquellas derivadas de Tat de HIV o la proteína de homeodominio de antenapedia son aptos de dirigir la toma eficiente de proteínas heterólogas a través de membranas celulares. Véase, por ejemplo, Chen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1999), 96:4325-4329. La formulación en la presente puede también contener más de un compuesto activo como sea necesario para la indicación particular que es tratada, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. Alternativamente o además, la composición puede comprender un agente que mejora su función, tal como, por ejemplo, un agente citotóxico, citocina, agente quimioterapéutico o agente inhibidor de crecimiento. Tales moléculas están apropiadamente presentes en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito planeado. Los siguientes son ejemplos de los métodos y composiciones de la invención. Se comprenderá que varias otras modalidades se pueden llevar a la práctica, dada la descripción general provista anteriormente. Los ejemplos son ofrecidos por propósitos ilustrativos solamente y no se pretende limitar el alcance de la presente invención de ninguna manera.

EJEMPLOS Se llevó a cabo un análisis de genoma amplio de genes que son regulados por un factor angiogénico en células endoteliales e identificado DSCRl por ser uno de los genes más significativamente inducidos. Consistente con una función antagonista sobre la señalización de calcineurina (CnA) , la expresión de DSCRl en células endoteliales bloqueó la desfosforilación, translocación nuclear y actividad de factor nuclear de células T activada (NFAT) , un factor de transcripción involucrado en la moderación de la señalización de CnA. DSCRl fue no solamente inducido mediante VEGF, sino también por otros compuestos que activan la señalización de CnA, sugiriendo un papel más general para DSCRl en células endoteliales activadas. Como se muestra en la presente, la expresión transitoria de DSCRl atenuó una variedad de genes marcadores inflamatorios, identificando un papel regulador previamente desconocido para DSCRl en células endoteliales activadas. La expulsión de DSCRl endógeno incrementó la actividad de NFAT y estimuló la expresión de genes inflamatorios sobre células endoteliales activadas. Asi, el bucle de retroalimentación regulatorio negativo entre DSCRl y la señalización de CnA en células endoteliales identificadas representa un mecanismo molecular potential fundamental para la expresión de genes inflamatorios enseguida de la activación de células endoteliales, por ejemplo activación mediante VEGF por medio de VEGFR2. El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) se enlaza a 2 receptores de tirosina cinasa de transmembrana, denominados VEGFR-1 y -2, que regulan diversas rutas de transducción de señal en las que se incluyen fosfolipasa C-?, fosfatidilinositol 3 (PI-3) cinasa/AKT, proteína activadora de Ras guanosina trifosfatasa y la familia Src, controlando mediante esto una variedad de funciones vasculares (para una revisión, véase Ferrara y Gerber1) . VEGF representa el regulador clave de angiogénesis fisiológica y patológica asociada con una variedad de enfermedades en las que se incluyen crecimiento de tumor, inflamación crónica y retinopatía diabética. En general, la interferencia con actividad de VEGF en malignidades asociadas con angiogénesis patológica frecuentemente frena el avance de la enfermedad, fue bien tolerada y no afectó significativamente la vasculatura madura saludable (para una revisión, véase Ferrara et al.). VEGF es también conocido como factor de permeabilidad vascular VPF, en base a su habilidad para perturbar la integridad vascular e inducir fugas vasculares36'37. Mutantes de VEGF que se enlazan selectivamente a VEGFR-2 actúa como mitógenos de célula endotelial y agentes que mejoran la permeabilidad mientras que los mutantes de VEGFR-1 selectivos no parecen tener estas actividades. La señalización de VEGF por medio de VEGFR-2 y perturbación vascular parece ser una ruta principal para fugas vasculares incrementadas que se piensa que están asociadas con algunos usos de VEGF en ajustes angiogénicos terapéuticos. La identificación de nuevos genes regulados específicamente mediante VEGF en células endoteliales ha conducido a la identificación de genes expresados diferencialmente en vasculatura patológica contra normal. Se usó un análisis de sobrevivencia celular endotelial in vitro bien establecido, en el cual además de VEGF suprimió potentemente apóptosis de célula endotelial inducida mediante escasez de suero. Este análisis ha sido particularmente útil para identificar componentes moleculares de rutas de señalización en células endoteliales. Por ejemplo, este sistema de análisis fue instrumental en la identificación del papel crucial de la ruta transducción de señal de PI-3 cinasa/Akt y la importancia de Bcl2 para la sobrevivencia de célula endotelial.3'4 Condiciones similares fueron seleccionadas para el estudio actual debido a que imitan la dependencia notable de células endoteliales por VEGF durante la neoangiogénesis, tal como se observa en estudios preclinicos in vivo. Utilizando el tecnología de genCalling (CuraGen, Branford, CT) , se buscó detectar genes objetivo de VEGF en todo el transcriptoma endotelial humano.5 Se describe la identificación de DSCRl como un nuevo gen objetivo de VEGF y la caracterización funcional de DSCRl como molécula de señalización antiinflamatoria en células endoteliales. El gen humano (DSCRl) es uno de 50 a 100 genes que residen dentro la región mínima sobre el cromosoma humano 21 (HC21), que, cuando están presentes en más de 2 copias, provoca retardo mental, conocido colectivamente como Síndrome de Down (DS).6 DSCRl pertenece a una familia de proteínas conservadas, también denominadas calcipresinas38,39'40 o proteínas que interactúan con calcineurina moduladoras (MCIP) , que comprenden 3 miembros en humanos, DSCRl/MCIPl, ZAKI-4/DSCR1L1/MCIP2 y DSCR1L2/MCIP3, que comparten en común la capacidad para enlazarse a calcineurina. DSCRl funciona como una molécula de señalización citoplásmica pequeña regulada por la Ca2+/calmodulina-dependiente serina/treonina proteína fosfatasa 2B (PP2B) o calcineurina A (CnA) . Consistente con un bucle de retroalimentación regulatorio negativo, la actividad de CnA es suprimida mediante asociación con DSCRl. DSCRl es altamente expresado en el desarrollo del sistema nervioso central y corazón, mientras que en adultos, la expresión moderada ha sido detectada en numerosos tejidos y tipos de célula, en las que se incluyen células de músculo estriadas y cardiomiocitos .6 Entre estos, se ha demostrado que DSCRl interfiere con la señalización de CnA en células de músculo estriadas7 y que inhibe la hipertrofia cardiaca en modelos de animales in vivo.8 Minami et al., (J. Biol. Chem. (2004), 279 (48) :50537-50554) tiene reportó que DSCRl puede ser inducida mediante trombina. La sobreexpresión crónica de DSCRl también ha sido asociada en enfermedad, tal como enfermedad de Alzheimer e inflamación vascular y perturbación vascular han estado implicadas en enfermedad de Alzheimer, demencia vascular, demencia mezclada, etc. Ermak et al., J. Biol. Chem. (2001), 276(42) : 38787-3879441'43. Townsend et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. (2002)977:65-76; y Iadecola et al., Stroke, (2003)34;335-337. CnA juega un papel crucial durante respuestas celulares a varias señales extracelulares y esfuerzos ambientales y es importante en la regulación de apóptosis, procesos de memoria y crecimiento de músculo esqueletal y cardiaco y diferenciación (para revisiones, véase Rothermel et al.9 y Crabtree and Olson10) . La desfosforilación del factor nuclear del factor de transcripción de célula T activada (NFATcl) mediante CnA promueve su translocación al núcleo, en donde actúa cooperativamente con otros factores de transcripción, en los que se incluyen miembros de las familias API, cMAF, GATA o MEF2 familias.11 Los 4 miembros de esta familia genética (NFATcl-c4) son expresados en muchos tejidos y muestran papeles cruciales durante la guia neuronal, hipertrofia de músculo esqueletal y cardiaco y desarrollo de válvula cardiaca (para una revisión, véase Hill-Eubanks et al12) . Además de sus papeles regulatorios sus papeles regulatorios en células inflamatorias, experimentos de ablación genética recientes en ratones sugirieron funciones vasculares independientes para algunos miembros de la familia de del factor de transcripción de NFAT. Estos hallazgos sugieren que los factores de transcripción de NFAT pueden no ser requeridos para sobrevivencia de célula endotelial, pero juegan papeles importantes para el ensamble de vasos correctos durante la maduración de vasos.13-15 Estudios previos demostraron la fosforilación y translocación nuclear de NFAT en células endoteliales expuestas a agentes que estimulan la señalización de CnA tales como acetato de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) e ionomicina (10).16,17 la ciclosporina A (CsA) es un inhibidor potente de CnA y en base a los efectos inhibitorios de CsA sobre la expresión genética, varios genes objetivos de CnA potenciales fueron descritos en células endoteliales activadas, en los que se incluyen factor estimulador de colonia de granulocito- macrófago (GM-CSF),16 Cox-2,18 interleucina 8 (IL-8),19 y factor de tejido (TF).20 Así, aunque varios genes objetivo de CnA potenciales fueron identificados en células endoteliales y actividades antagónicas de DSCRl sobre la señalización de CnA fueron descritas en linfocitos y cardiomiocitos, el papel de DSCRl en la señalización de CnA en células endoteliales no fue conocida . El presente estudio identifica DSCRl como un nuevo inhibido endógeno de CnA en células endoteliales activadas y describe las secuencias biológicas de modulación de niveles de DSCRl sobre la expresión genética de marcador inflamatorio en células endoteliales. Por ejemplo, como se muestra en la presente, la interferencia con DSCRl endógeno incrementó la actividad de NFAT y estimuló la expresión de varios marcadores de inflamación, demostrando que la modulación de niveles endogenous de DSCRl son suficientes para afectar la inflamación vascular .

Materiales y métodos Clonación de DSCRl humano DSCRl fue clonado mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando a clon marcado de secuencia de expresión disponible comercialmente (EST) (Incyte, Palo Alto, CA) utilizando cebadores diseñados para introducir un sitio Clal en el extremo 5' (DSCR l-5ClaI) y un sitio EcoRI en el término 3' (DSCRl-3' EcoRI ) . El fragmento de PCR fue clonado a un vector de expresión impulsado por citomegalovirus (CMV) (Genentech, Sur de San Francisco, CA) cortado con Clal y EcoRI y los insertos fueron verificados mediante secuenciación antes de ser sometidos a experimentos adicionales. En el término C, el epitopo FLAG fue introducido adicionalmente (DSCRl-Flag) . Reactivos . Todos los anticuerpos primarios, a no ser que se indique de otra manera, fueron obtenidos de BD Pharmingen (San Diego, CA) , VEGF humano recombinante (rhVEGF) fue obtenido de Genentech y el factor de crecimiento de fibroblasto básico (b-FGF) y factor a de necrosis de tumor (TNF-a) fueron comprados de R&D Systems (Minneapolis, MN) . Células y análisis de células. Las células endoteliales humanas primarias fueron compradas de Clonetics (Santa Rosa, CA) y cultivadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para experimentos de GeneCalling, células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) fueron compradas de Clonetics (BioWhittaker, Walkersville, MD) y mantenida en medio de crecimiento endotelial (EBM-2) complementado con suero de becerro fetal al 5% (FCS) siguiendo las instrucciones del fabricante. Células (1 x 107) fueron divididas a una densidad celular de 19,000 célula/cm2 y se llevaron a cabo experimentos por triplicado para cada condición en paralelo. Veinticuatro horas después de la deposición de las células, las células fueron lavados 3 veces con solución salida de pH (PBS) y medios (Clonetics) que contienen ya sea albúmina de suero bovino al 0.1% (BSA) o BSA al 0.1% más VEGF (30 ng/mL) o FCS al 5%. El aislamiento de ARN y análisis de PCR de transcripción inversa (RT-PCR) se efectuó como se describe.21 Para experimentos de cultivo celular, se usaron las siguientes condiciones: humano (h) VEGF, 30 ng/mL; hTNF-a, 10 ng/mL; PMA, 200 ng/mL (Calbiochem, La Jolla, CA) ; CsA, 1 µM (Calbiochem) ; IO, 5 µM (Sigma, St Louis, MO) ; tapsigargina, 50 nM (Sigma). En una instancia, (si) ARNA inhibidores fueron generados mediante Dharmacon (Lafayette, CO) en base a los cADN de plena longitud del gen respectivo y utilizando el servicio "Smart-pool" (Dharmacon, Lafayette, CO) . Para experimentos de sobrevivencia de transducción adenoviral, células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) fueron mantenidas en medio de crecimiento endotelial (EBM-2) complementado con FCS al 5% siguiendo las instrucciones del fabrican. 3 x 105 células fueron divididas por cavidad de una caja de 6 cavidades (Primaria, BD Biosciences, Bedford, MA) y experimentos por duplicado para cada condición fueron efectuados en paralelo. Las células fueron infectadas con adenovirus (MOL=IOO) que codifica por un péptido de gD (Ad-Control) , DSCRl (Ad-DSCRl) o un constructo antisentido con la secuencia de codificación invertida (Ad-DSCRl-AS) por 2 horas en medio libre de suero que contiene CaCl2 10 mM y MgCl2 10 nM en un agitador vertical a temperatura ambiente. Después de esto, 5 veces el volumen de medio de crecimiento regular que contiene FCS al 5% fue agregado y las células fueron mantenidas por 1 dia en un incubador de C02. Después de esto, las células fueron lavadas tres veces con PBS y medio basal (Clonetics, Santa Rosa, CA) que contiene BSA al 0.1% fue agregado y PMA/IO, H202 y ZVAD como se indica. 24 horas después de la escasez de suero y dosificación, las células fueron contadas en un contador de células de estilo marca Coulter. Para experimentos de cultivo celular, se usaron las siguientes condiciones: PMA: 200 ng/ml (Calbiochem, La Jolla, CA) , ionomicina: 5 µM (Sigma, St. Louis, MO) , una solución de H202 al 3% fue diluida 1:300 en medio basal, BSA al 0.1% para dar como resultado una solución de H202 al 0.01%, ZVAD 5 µM.

Generación de vectores adenovirales y transducción de células endoteliales Ad-DSCRl-Flag y Ad-LacZ fueron construidos mediante clonación del inserto de cADN Notl-Notl al sitio polienlazador del equipo de construcción de vector Ad-easy de Stratagene (La Jolla, CA) , esencialmente como se describe por el fabricante.

GeneCalling Para identificar nuevos genes que son expresados diferencialmente, se usaron tecnologías "abiertas" tales como análisis serial de expresión genética (SAGE) y GeneCalling.

GeneCalling ha sido descrito en cualquier parte.5'22 Muestras de cada grupo de tratamiento fueron transcritas inversamente y sometidas a análisis de expresión cuantitativa QEA).5 Los análisis se enfocaron sobre la identificación de genes regulados por lo menos 2 veces. Los análisis iniciales que exploran los perfiles de expresión genética dependientes de condición se llevaron a cabo mediante QEA o GeneCalling, como se describe previamente.5 Western blotting e inmunoprecipitación Células cultivadas en cajas de 10 cm fueron lavadas dos veces en solución de pH regulado de Tris (tris (hidroximetil) aminometano) y 0.6 mL de solución reguladora del pH de RIPA (PBS 10 mM, Nonidet al 1% P-40, desoxicolato de sodio al 0.5%, dodecil sulfato de sodio al 0.1% [SDS], fluoruro de fenilmetilsulfonilo 100 mg/mL, aprotinina 30 µg/mL, ortovanadato de sodio 1 mM) e inhibidores de proteasa (Roche Pharmaceuticals, Gaithersburg, MD) fueron agregados. Anticuerpo monoclonal de ratón (mAb) dirigido contra NFATcl humano, c2 y c3 fue comprado de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) . El anticuerpo policlonal de cabra purificado por afinidad contra E-selectina humana, molécula-1 de adhesina de célula vascular (VCAM-1), molécula-1 de adhesión intercelular (ICAM-1) y Cox-2 fue de BD Pharmingen. El extracto de célula endotelial total, electroforesis de gel de poliacrilamida (PAGE), inmunoabsorción e inmunodetección se efectuaron de acuerdo con el protocolo de Santa Cruz Biotechnology. Un total de extracto de célula entera de 60 mg fue cargado en cada carril de un gen de poliacrilamida de 4% a 16%. El equipo de reacción de quimioluminiscencia mejorada (ECL) fue comprado de Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ) y estreptavidina de peroxidasa de rábano de Vector Laboratories (Burlingame, CA) fue utilizada. Para experimentos de NFATcl, cantidades iguales de extracto celular fueron cargadas para visualizar NFATcl (mAb 7A6; 1:500; Santa Cruz Biotechnology) y la a-tubulina de control de carga (mAb de ICN, Santa Ana, CA; 1:5000). Para Cox-2 y análisis de inmunoabsorción de TF cantidades iguales de lisado celular fueron cargadas sobre un gradiente de 6% a 12% de SDS-PAGE. Cox-2 fue analizado con un mAb anti-Cox2 (RDI, 1:500) y TF con un mAb anti-hTF (clon 7G11) fue generado en Genentech y usado a una dilución de 1:500. Antes de cargar las muestras sobre el gel, las cantidades de proteina fueron cuantificadas y ajustadas de conformidad. Como control de carga, un mAb anti-?-adaptina fue utilizado (1:1000) sobre un gel de poliacrilamida de 4% a 20%.

Análisis de apóptosis de célula endotelial Para el análisis de clasificación de célula fluorescencia-activada (FACS), las células fueron teñidas mediante anexina V fluorescente isotiocianato-conjugada y mediante el tinte fluorescente de yoduro de propidio (Pl) esencial como se describe en Gerber et al. J Biol Chem. 1998; 273:30336-30343.

Transfección transitoria de células endoteliales humanas primarias y análisis de luciferasa. Para HUVEC y transfecciones transitorias de célula endotelial microvascular humana (HMVEC) , las células (7.5 x 104) fueron depositadas por cavidad de una caja de 6 cavidades en 3 mL de medio de cultivo (Primaria; BD Biosciences, Bedford, MA) . Las cantidades de ADN de usada en la mezcla de lipofección fueron calculadas para transfección de las 3 cavidades totales. Luego, 1.25 µg de vector de expresión, 3.75 µg de reportero de luciferasa y 2.0 µg de reporteros de referencia de SV-Renilla fueron mezclados y se agregaron 14 µL de reactivo de lipofecina Fl (Targeting Systems, Santee, CA) . Luego, se agregaron 4.5 mL de medio de Eagle modificado por Dulbecco de alto contenido de glucosa (DMEM) a la mezcla. La transfección transitoria fue llevada a cabo como se recomienda por el fabricante. Para experimentos de expresión genética de reportero, las células fueron sometidas a lisis al utilizar el equipo de reportero de luciferaza doble (Promega, San Luis Obispo, CA) en 300 µL de una solución reguladora del pH de lisis pasiva 1 X siguiendo las recomendaciones del fabricante. Para experimentos de transfección transitoria que incluyen siARN, HUVEC fueron depositados en placas de 6 cavidades como se describe para experimentos de transfección transitoria. Para 6 replicas, 600 pmoles de siARN (Dharmacon, Lafayette, CO) , 7.5 µg de luciferasa y 4 µg de constructo reportero Renilla fueron mezclados en 6 mL de DMEM de alto contenido de glucosa. Para FACS y experimentos inmunohistoquimicos (IHC), 11.5 µg de plásmido de proteina fluorescente verde mejorada (EGFP) fueron agregados en lugar del plásmido de luciferasa. Antes de la incubación a 37°C durante 25 a 30 minutos, 30 µL de solución de Targefect A y 60 µL de solución B de Targefect (Targeting Systems) fueron agregados a la mezcla; 1 mL de esta solución fue usado para lipofección como se describe. Las células fueron lavadas dos veces con PBS antes de la adición de medio libre de suero y dosificación por la cantidad de tiempo indicada.

Antagonistas de siARN de DSCRl y NFATC1 Nombre gen No. Secuencia de sentido[[s]] hebra 5'-> 3' acceso basado en usado como acumulación en estudios de activación del factor angiogénico (e.g. , VEGF) : DSCRl NM 004414 GCUCAGACCUUACACAUAG (SEQ ID NO 2) DSCRl NM 004414 GGACAUCACCUUUCAGUAU (SEQ ID NO DSCRl NM 004414 GAAAGAAUGAGGAGACCUA (SEQ ID NO 4) DSCRl NM_004 14 GACAUCACCUUUCAGUAUU (SEQ ID NO: 5) Usado en estudios de activación de PMA/I0: DSCRl NM_004 14 AACGUAUGACAAGGACAUCAC (SEQ ID NO: 6) NFATC1 NM_172390, CGUAUGAGCUUCGGAUUGA (SEQ ID NO: 10) NFATC1 NM_172390, GCAGAGCACGGACAGCUA (SEQ ID NO: 11) NFATC1 NM_172390, UCAGAAACUCCGACAUUGA (SEQ ID NO: 12) NFATC1 NM 172390, GCCGGAAUCCUGAAACUCA (SEQ ID NO: 13) Nota : Todos los siRNA enlistados tienen UU como 3 ' -prominentes sobre cada hebra y 5 ' -fosfa to sobre la hebra antisen tido solamen te .

Microscopía de inmunodeficiencia Células endoteliales humanas primarias (7 x 103 células/cm2) fueron sembradas a cada cavidad de un portaobjetos de microscopio de 8 cámaras (Nalgene Nunc, Naperville, IL) 24 horas antes del teñido. Las células fueron infectadas con adenovirus (multiplicidad de infección [MOI] = 100) que codifican para LacZ o DSCRl por 2 horas en medio libre de suero que contiene CaC12 10 mM y MgC12 10 nM en un agitador vertical a temperatura ambiente. Después de esto, 5 veces el volumen de medio de crecimiento regular fue agregado y las células fueron mantenidas por 2 días en una incubadora de C02. Después de reemplazar los medios, las células fueron tratadas con hVEGF a una concentración de 30 ng/mL por 20 minutos. Antes de la incubación con varios anticuerpos, las células se fijaron con metanol durante 4 minutos a -20° C y lavadas con PBS a temperatura ambiente. Las células fueron incubadas en PBS que contiene el anticuerpo NFATcl antihumano de ratón primario (sc7294, Santa Cruz Biotechnology) por 1 hora a temperatura ambiente. Las células fueron luego lavadas 3 veces con PBS e incubadas en PBS que contiene IgG antiratón Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Eugene, OR) . Las células fueron finalmente lavadas 3 veces con PBS y montadas debajo de cubreobjetos en un medio de Vectashield (Vector Laboratories) . Se llevó a cabo microscopía y fotografía utilizando un microscopio de fluorescencia Zeiss Axiovert 200 equipado con una cámara monocromática AxioCam MR (Zeiss, Thornwood, NY) utilizando un objetivo de aceite X 63.

Generación de anticuerpos policlonales para DSCRl humanos en conejos y análisis de Western blot DSCRl fue amplificado mediante PCR con cebadores DSCRl-EcoRI-Pro 5', agregando una prolina extra y DSCRl-Stop-Xhol 3', al utilizar cADN de DSCRl como plantilla y clonados a pGEX-KG. GST-DSCR1 fue expresado y purificado esencialmente como se describe previamente.23 anti-GST-DSCRl de conjunto policlonal fue preparado mediante inmunización con GST-DSCR1 recombinante. Suero crudo filtrado fue usado para Western blot (1:400) . Conjuntos de cebador de sonda Oligo y TaqMan son mostrados en Tabla 1.

Tabla 1. Conjuntos de cebador de sonda Oligo y TaqMan Primer conjunto HSDSCR1.1113FP 5' (FAM) -AGG TTG TGA AAA CAG CAG CAÁ TGC AAT GT (SEQ ID NO: 14)- (TAMRA) P3' HSDSCR1.1088.F CCA CAG GAA GCC GCC TAG T (SEQ ID NO: 15) HS DSCR1 . 1171 . R TGA GGG AAG AAA GGA AAC GCT (SEQ ID NO: 16) HSGMCSF- 571T 5' (FAM) -AGG TCC AGG CCA CTC CCA CC GT (SEQ ID NO: 17 ) - ( TAMRA ) P3 ' HSGMCSF-515F GTC ATC TTG GAG GGA CCA A (SEQ ID NO: 18) HSGMCSF-610R TTC TGC CAT GCC TGT ATC A (SEQ ID NO: 19) HSTF-1911T 5' (FAM) -TTA ACT GAC TTA AGT GGC ATT AAA CAT TTG AGA GCT AA GT (SEQ ID NO: 20)- (TAMRA) P3 ' HSTF-1880F CAG CTT CCT AAT ATG CTT TAC AAT CT (SEQ ID NO: 21) HSTF-2025R CAÁ TGT CAÁ CCA TAG AAG CTT TAA GTA (SEQ ID NO: 22) HSCOX-2-3152T 5' (FAM) -CCT GGC TAC CTG CAT GCT GTT CC GT (SEQ ID NO: 23)- (TAMRA) P3 ' HSCOX-2-3130F CAG TAG GTG CAT TGG AAT CAÁ (SEQ ID NO: 24) HSCOX-2-3207R TCT TAG CAÁ AAT GGC TAA AAG AAG (SEQ ID NO: 25) HSCD34-2497T 5' (FAM) -ATC CCT GCT CAÁ CCC CTC TGG A GT (SEQ ID NO: 26)- (TAMRA) P3' HSCD34-2447F CCC AGG TCC TTG TTT GCT (SEQ ID NO: 27) HSCD34-2519R TCC AAC CGT CAT TGA AAC C (SEQ ID NO: 28) HSVCAM-1-2686T 5' (FAM) -CGA AGT TTG TTC ATC AGA CTC CTG TGC GT (SEQ ID NO: 29)- (TAMRA) P3 ' HSVCAM-1-2665F GCA TGG TAC GGA GAT GTT TC (SEQ ID NO: 30) HSVCAM-1-2730R GGC CAC ATT GGG AAA GTT (SEQ ID NO: 31) DSCRl-EcoRI-Pro 5' CCGAATTCCCATGCATTTTAGAAACTTTAACTACAG (SEQ ID NO: 32) DSCRI-Stop-Xhol 3' GGGCTCGAGCTAGCTGAGGTGGATCGGCGTGTACT CC (SEQ ID NO: 33) Resultados Identificación de nuevos genes objetivo de VEGF Genes regulados específicamente mediante VEGF en ausencia de suero fueron identificados mediante sustracción electrónica diferencial de perfiles de expresión genética derivados de HUVEC estimulados con VEGF (30 ng/mL) o FCS al 5% en relación con condiciones básales (sin adición [NA] ) , respectivamente. Un despliegue visual de cada análisis es mostrado en la figura 1A, demostrando que VEGF indujo la expresión de mARN de DSCRl en HUVEC 4.8 veces después de 6 horas y 2.9 veces después de 24 horas de estimulación, respectivamente. La presencia de FCS al 5% no alteró significativamente los niveles de expresión de DSCRl. En general, se detectaron cambios en 1.8% y 4.4% de trazas que representan alteraciones en expresión de genes en células FCS-estimuladas después de 6 y 24 horas, respectivamente. Para células VEGF-estimuladas, se observaron cambios en 1.7% y 3.4% de genes después de 6 y 24 horas, respectivamente. Las identidades de 46 fragmentos de cADN inducidos específicamente mediante VEGF pero no FCS fueron determinados como se describe previamente.5 veintiocho cADN correspondieron a genes conocidos o EST y entre estos, DSCRl fue más fuertemente inducido. Los 18 fragmentos de cADN restantes no coincidieron con ninguna secuencia conocida dentro de la base de datos pública. Trece (46%) de los 28 genes conocidos pertenecen a la clase de factores secretados, lo que enfatiza adicionalmente el papel crucial del endotelio como tejido secretorio.24 Un total de 6 genes (21%) pertenecen a la clase de proteínas citoplásmicas, involucradas potencialmente en la transducción de señal, en los que se incluyen DSCRl. Los 9 genes restantes (37%), que comprenden 3 ribosomales, 2 mitocondriales, 2 factores de transcripción, 1 gen regulador de ciclo celular y un gen involucrado en la regulación de traducción, representan la clase de genes involucrados en el control metabólico y de ciclo celular .

Condiciones que conducen a células endoteliales activadas inducen expresión de DSCRl Para verificar los resultados obtenidos de la tecnología de GeneCalling, se analizaron niveles de ARN en varias células endoteliales humanas estimuladas con VEGF u otros mitógenos de célula endotelial, mediante análisis de RT-PCR en tiempo real (TaqMan) . Confirmando los resultados previos (figura 1A) , la adición de FCS o b-FGF a HUVEC con escasez de suero no alteraron los niveles de DSCRl significativamente, mientras que la adición de VEGF indujo la expresión prolongada de DSCRl en HUVEC durante 36 horas (figura IB) . Estos hallazgos confirmaron los datos de experimentos de GeneCalling y sugirieron que DSCRl no es un marcador general expresado en células endoteliales mitóticas. Para evaluar la extensión a la cual cada uno de los 2 VEGFR es en la moderación de la inducción de DSCRl, se probaron formas de VEGF mutantes, que activan cada VEGFR de manera exclusiva, como se describe previamente.25'26 La forma mutante VEGFR-2 selectiva (VEGFR2-sel) fue igualmente potente para VEGF en inducir la expresión de DSCRl. En contraste, los ligandos VEGFR-1 selectivos (VEGFRl-sel y P1GF) fallaron en inducir alteraciones en expresión de DSCRl, indicando que VEGFR-2 era suficiente para inducir la expresión de DSCRl (figura 1B-C) . Las células endoteliales aisladas de diferentes tejidos pueden variar en sus niveles de expresión de VEGFR o en sus rutas de transducción de señal, que pueden afectar sus perfiles de expresión genética objetivo de VEGF. Para probar tales diferencias específicas de tipo de célula potential, se estimularon células endoteliales aórticas pulmonares humanas (HPAEC) , células endoteliales microvasculares dérmicas humanas (HMVEC) y células endoteliales aórticas humanas (HUAEC) con VEGF o formas mutantes selectivas de receptor y se analizó la expresión de DSCRl mediante RT-PCR en tiempo real. Como control negativo, se probaron células de músculo liso aórtico pulmonar humano (HPASMC) , que no expresa niveles significativos de receptores de VEGF (datos no mostrados) . Todas las células endoteliales probadas exhibieron niveles incrementados de expresión de DSCRl en respuesta a estimulación mediante VEGF y VEGFR2-sel pero no VEGFRl-sel, indicando que el VEGFR-2 era necesario y suficiente para la inducción de DSCRl en una variedad de células endoteliales (figura 1C y datos no mostrados). En general, la mayoría de los tipos de célula exhibieron un incremento menos prominente en expresión de DSCRl después de la estimulación prolongada mediante VEGF cuando se compara con HUVEC (figura IB) . Para determinar si las condiciones que conducen en general a células endoteliales activadas inducen la expresión de DSCRl y si CnA está involucrado en la regulación de DSCRl, se estimularon HUVEC con TNF-a o compuestos que activan la señalización de CnA tal como el ionóforo de calcio A23187 [GenBank] (10), solo o en combinación con PMA y tapsigargina, otro activador de señalización de CnA. Todos los compuestos incrementaron significativamente los niveles de mARN de DSCRl después de 5.5 horas (figura ID) y 18 horas (datos no mostrados) y tal inducción fue reprimida potentemente en presencia de CsA, un inhibidor de señalización de CnA. Interesantemente, TNF-a indujo DSCRl a niveles similares como se observa para VEGF. El análisis de Western blot de extracto de célula entera preparado de HUVEC confirmó la inducción de DSCRl enseguida de 6 horas de estimulación mediante VEGF, PMA/IO y tapsigargina (figura 1E) . Similar a los hallazgos en cuanto a niveles de mARN, no se encontró ningún incremento significativo en niveles de proteína de DSCRl enseguida de la estimulación con b-FGF o FCS al 5%. En contraste con los hallazgos para niveles de mARN, no se pudo detectar niveles de proteína de DSCRl incrementados en células estimuladas con TNF-a, sugiriendo un mecanismo diferente de regulación de expresión de DSCRl mediante VEGF y TNF-a. En base a los efectos inhibidores de CsA sobre niveles de DSCRl sobre células endoteliales activadas, se concluye que esta inducción fue en su mayoria moderada por CnA. Sin embargo, la represión incompleta de expresión de mARN mediante CsA enseguida de la estimulación con TNF-a sugiere la presencia de un mecanismo regulador desconocido adicional en células endoteliales.

DSCRl impide la translocación nuclear de NFAT VEGF, cuando es agregado a células endoteliales de vena pulmonar humana (HPVEC) , induce la translocación nuclear de NFATcl tan pronto como 20 minutos después la estimulación.27 Asi, se desea analizar la cinética de la translocación nuclear de NFATcl en HUVEC y a que extensión DSCRl puede interferir con este proceso. El análisis de IHC de células endoteliales reveló la localización nuclear prominente de NFATcl en células estimuladas mediante VEGF, que estuvo ausente en células que expresan DSCRl 20 minutos después de la estimulación (figura 2A) y también después incubación prolongada por 60 y 120 minutos (datos no mostrados). Esto, para nuestro conocimiento, es la primera demonstration de una interferencia funcional entre DSCRl y NFATcl en células endoteliales humanas primarias activadas, impidiendo la translocación nuclear de NFATcl. Adicionalmente, se estudió la localization subcelular de DSCRl en células endoteliales después de la transducción adenoviral con vectores que codifican el DSCRl marcado de epítopo (Ad-DSCR1-FLAG) o vector de control (Ad- LacZ) mediante métodos de IHC. De acuerdo con reportes previos,7'18'41 se detectó la localización citoplásmica y nuclear de DSCRl después de transducción con Ad-DSCRl-FLAG, que estuvo sin alterar en presencia de VEGF o IO/PMA (datos no mostrados). La desfosforilación de NFATcl mediante el CnA de fosfatasa de treonina serina genera la forma activada de este factor de transcripción, capaz de entrar al núcleo y estimular la transcripción. Así, se desea comparar los efectos de DSCRl sobre el estatus de fosforilación de NFATcl en células endoteliales con los efectos inducida mediante CsA. Similar a los hallazgos de Johnson et al.,27 el análisis de extracto celulares de células endoteliales activadas demostró un desplazamiento de la forma desfosforilada de NFATcl a la forma fosforilada en respuesta a DSCRl (marcado con "P" en la figura 2B) . Estos cambios fueron comparables con los efectos inducidos por CsA y sugieren el bloqueo de la actividad de fosfatasa de CnA. Además, los niveles de proteína de NFATcl globales fueron incrementados mediante DSCRl, indicando que la expresión de DSCRl puede afectar la estabilidad de proteina de NFATcl. En contraste, CsA no alteró significativamente los niveles de proteina de NFATcl, sugiriendo mecanismos potencialmente diferentes de acción entre CsA y DSCRl que regulan la actividad de CnA actividad y fosforilación de NFATcl.

DSCRl atenúa la actividad de transcripción de NFAT Experimentos con células de tumor transformadas demostraron interferencia funcional entre DSCRl y la actividad transcripcional de NFAT en células expuestas a compuestos que estimulan CnA tales como 10 y PMA.28 Para probar si tal mecanismo está presente en células endoteliales, se co-transfectaron transitoriamente vectores de expresión para DSCRl y se cuantificaron los niveles de actividad de NFAT mediante análisis de expresión de gen reportero de luciferasa en células endoteliales. Similar a los efectos inducidos mediante CsA, la expresión de DSCRl reprimió fuertemente la transcripción impulsada por NFAT en células endoteliales estimuladas con PMA, tapsigargina, TNF-a o el ionóforo de calcio A23187 [GenBank] (figura 3A) . DSCRl no interfirió significativamente con la actividad de API (figura 3B) , demostrando que los efectos eran específicos para NFAT.

DSCRl suprime la expresión en genes marcadores inflamatorios sobre células endoteliales activadas Para estudiar los efectos de expresión incrementada de DSCRl sobre expresión de gen objetivo CnA, se sometieron a transducción células endoteliales con vectores adenovirales que codifican para DSCRl y se analizaron los niveles de expresión de gen objetivo de CnA enseguida de la activación. Las condiciones probadas incluían 4 horas de incubación con VEGF, PMA/IO o tapsigargina y combinaciones de los mismos. El análisis de niveles de mARN mediante RT-PCR en tiempo real reveló inducción significativa de COX2, E-selectina y TF en células endoteliales activadas (figura 4A) . En acuerdo con reportes previos, el incremento de 2- o 3 veces en respuesta a estimulación mediante VEGF fue marcadamente menor del incremento de 10 a 20 veces en expresión genética inducida por IO/PMA.20 Estas diferencias reflejan probablemente que PMA, que actúa intracelularmente, es un inductor más potente de señalización de CnA en relación con VEGF, que se enlaza a VEGFR2 expresado extracelularmente . Como se demuestra en la presente por primera vez, la expresión de DSCRl reprimió la expresión de gen marcador inflamatorio en células endoteliales estimuladas mediante VEGF o IO/PMA. Para verificar si estos cambios en niveles de ARN se correlacionan con alteraciones en niveles de proteína, se llevaron a cabo una serie de experimentos de FACS y Western blotting. Los datos mostrados en las figuras 4B-C demuestran regulación descendente de E-selectina, VCAM-1, TF y Cox-2 mediante DSCRl. Las reducciones en TF y niveles de proteina de Cox-2 fueron más pronunciadas en respuesta a la expresión de DSCRl cuando se comprara con los efectos inducidos por CsA solo (figura 4C, compárese los carriles 4 y 7 con 4 y 5 y 6 y 9 con 6 y 5, respectivamente) . Estos hallazgos demuestran que DSCRl reduce la expresión de varios genes marcadores inflamatorios más potentemente que CsA en células endoteliales humanas activadas. Enseguida, se monitoreó la cinética de expresión de genes objetivo de VEGF, en los que se incluyen DSCRl, en respuesta a la estimulación de VEGF. Como se esperaba, los niveles de ARN de GM-CSF, TF, COX-2, VCAM-1 y E-selectina fueron incrementados entre 0 y 2 horas después de la administración de VEGF (figura 5A) . Sin embargo, tal inducción fue transitoria e invertida a represión entre 6 y 36 horas después de la estimulación, cuando se compara con células sin tratar de control. Como control, se analizó la expresión de Bcl-2 en respuesta a estimulación de VEGF, que fue expresado consistentemente en todo el experimento (figura 5A y Gerber et al).3 En conclusión, los niveles disminuidos de genes objetivo de VEGF coincidieron con niveles de expresión de DSCRl incrementados en respuesta a la estimulación de VEGF. Los datos combinados apoyan el modelo, en donde DSCRl puede actuar en bucle regulatorio de retroalimentación negativo que interfiere con la señalización de CnA en células endoteliales activadas (figura 5B) .

Perturbación utilizando DSCRl de adenovirus modula la sobrevivencia de células endoteliales La sobreexpresión de DSCRl mediante Ad-DSCRl en células endoteliales expuestas a condiciones de esfuerzo, muerte celular endotelial inducida como la reducción de DSCRl mediante expresión del constructo antisentido de DSCRl. Esto fue visto bajo escasez de suero, exposición de H202 y tratamiento de PMA/IO y en presencia de inhibidores de Caspasa tales como ZVAD específicamente.

La exposición de DSCRl indujo la actividad de NFAT y expresión de genes marcadores inflamatorios sobre células endoteliales activadas Para probar los efectos de transfección de células endoteliales con siARN, se llevó a cabo el análisis de Western blot de células cotransfectadas con un vector de expresión que codifica por una forma epitopo-marcada de DSCRl (DSCR1-FLAG) utilizando un anticuerpo anti-Flag. Alternativamente, se determinaron los niveles endógenos de DSCRl al utilizar antisuero policlonal de conejo. Se encontró una ausencia completa de expresión de proteina de DSCRl cuando un vector de expresión que codifica por una versión FLAG-marcada (PRKN-DSCR1-FLAG) fue co-transfectada (figura 6A) , indicando que siARN que apunta a DSCRl reduce potencialmente a expresión de DSCRl. Como se esperaba, se encontró una reducción de 50% % a 70% en niveles DSCRl endógeno, que es consistente con una eficiencia de transfección similar como se determina mediante microscopía de fluorescencia de células co-transfectadas con un vector de expresión de GFP (datos no mostrados) . Estos datos sugieren que la transfección transitoria de células endoteliales con siDSCRl reduce eficientemente los niveles de proteina en células endoteliales. Enseguida, se aplicaron estas condiciones para investigar los efectos de niveles de DSCRl endógenos disminuidos en los eventos de señalización corriente abajo de CnA. Se co-transfectó transitoriamente siARN con constructores de reportero de luciferasa que contiene sitios de enlace de NFAT y células endoteliales transfectadas activadas con VEGF o PMA/IO. Hubo un incremento de 2- y 3 veces en actividad de NFAT cuando las células fueron transfectadas con siDSCRl en relación con células transfectadas de control (siControl) en presencia de ambos, IO/PMA (figura 6C) o VEGF (figura 6D) . En contraste con las células transfectadas con siDSCRl, hubo una disminución en la actividad de NFAT en células siNFATcl-transfectadas, confirmando la validez del método de co-transfección de siARN para células endoteliales humanas primarias (figuras 6C-D) .

Finalmente, se desea analizar los efectos de la expresión de DSCRl endógeno de expulsión sobre la expresión de genes objetivo de CnA en células endoteliales activadas. Para seleccionar células transfectadas con siARN, se agregó un vector de expresión de GFP a la mezcla de transfección. El análisis de FACS de células GFP+ reveló un incremento en los niveles de expresión de varios genes marcadores inflamatorios, en los que se incluyen TF, E-selectina y VCAM-1 en presencia de siDSCRl (figura 7A) , mientras que la expresión de ICAM-1 no fue afectada significativamente (datos no mostrados) . En contraste, la co-transfección de células con siNFATcl bloqueó la expresión genética, sugiriendo un papel clave de este factor de transcripción en la expresión de E-selectina, VCAM-1 y TF en células endoteliales activadas. Interesantemente, los niveles básales y activados de VCAM-1 fueron ambos reprimidos mediante siNFATcl, demostrando un papel para NFATcl en la expresión basal de VCAM-1. La magnitud de la inducción de la expresión genética inflamatoria mediante siDSCRl en células estimuladas mediante VEGF estuvo claramente debajo de los niveles observados para células estimuladas con PMA/IO (figuras 7 A-B). Similar a otros reportes,20 estos hallazgos demuestran adicionalmente un potencial reducido de VEGF para inducir la señalización de calcineurina en relación con los compuestos farmacológicos tales como PMA/IO. En resumen, los hallazgos demuestran que los niveles endógenos de DSCRl son suficientes para reprimir la expresión de genes inflamatorios sobre células endoteliales estimuladas mediante VEGF u otros activadores de señalización de CnA.

Discusión Diferencias en el mecanismo de acción entre CsA y DSCRl Aunque tanto DSCRl como CsA infieren con la actividad de CnA, difieren en sus objetivos moleculares y su mecanismo de interferencia. CsA y otros fármacos inmunosupresores como FK506 inhiben a calcineurina mediante formación de complejos con inmunofilinas celulares específicas (FKB 12 y ciclofilina A, respectivamente) y este complejo se enlaza a múltiples sitios sobre calcineurina. En contraste, DSCRl se enlaza CnA directamente vía porciones estructurales que se asemejan a dominios de interacción de calcineurina identificados por primera vez en proteínas de NFAT. Estas porciones conservadas dentro de DSCRl parecen tener importancia funcional debido a formas truncadas de DSCRl, que carecen de estas regiones, son defectuosas para enlace a CnA7 (para una revisión, véase Rothermel et al) . Por consiguiente, se cree que DSCRl se pone en contacto directamente con el sitio activo de calcineurina, quizás al inhibir el acceso de NFAT y otros sustratos de fosfoproteína . Se analizó si las diferencias en su mecanismo de acción se traducirían a efectos farmacológicos diferentes. Como se muestra en la figura 4, DSCRl y PMA/IO redujeron significativamente la expresión de varios genes objetivo NFAT, en los que se incluyen E-selectina, TF y Cox-2 en células endoteliales estimuladas con VEGF, tapsigargina o PMA/IO. Sin embargo, la reducción en expresión genética y la hiperfosforilación de NFATcl inducida mediante DSCRl fue en general más pronunciada cuando se compara con los efectos inducidos por CsA (figura 4C) . En conclusión, los efectos inhibidores incrementados de DSCRl sobre la expresión de genes inflamatorios en relación con CsA parecen ser provocados por interferencia de DSCRl con otras rutas de transducción de señal que regulan eventos inflamatorios en células endoteliales. Alternativamente, la respuesta diferencial puede ser provocada por las diferencias en las propiedades farmacológicas de CsA, que es agregado al medio de cultivo en contraposición a vectores adenovirales que expresan DSCRl en las células.

DSCRl y la regulación de genes inflamatorios sobre células endoteliales activadas CnA y el factor de transcripción corriente abajo NFAT probablemente juegan un papel durante la angiogénesis de desarrollo. Ratones defectuosos tanto en alelos de NFATcl exhiben desarrollo de válvula aórtica y pulmonar defectuosa con muerte subsecuente alrededor del día embriónico 14.5, como consecuencia de insuficiente cardiaca congestiva.13'15 Experimentos de doble expulsión en ratones que carecen de NFATc3 y NFATc4 no deterioran el desarrollo de válvula, sino que dan como resultado mortalidad embriónica alrededor del día embriónico 11 debido a defectos generalizados en ensamble de vasos sanguíneos.14 Un fenotipo vascular similar fue observado en embriones deficientes tanto en alelos CnA. Estos hallazgos sugieren que las rutas de transducción de señal de CnA no controlan directamente la sobrevivencia de célula endotelial pero son importantes para la maduración del vaso.29 En apoyo de esta noción, no se ha detectado ningún cambio significativo en la sobrevivencia de célula endotelial en respuesta a alteraciones en niveles de DSCRl (datos no mostrados).

Un bucle de retroalimentación negativa mediante DSCRl en células endoteliales En células endoteliales, muchos de los genes reprimidos por CsA16,17-20 fueron descritos independientemente por ser regulados por VEGF.16'18"20'30'33 Estas observaciones implican que VEGF puede regular esta clase de genes vía CnA. En apoyo de esta teoría, la adición de CsA a células endoteliales estimuladas con VEGF atenuaron los niveles de expresión de IL-8, GM-CSF y Cox-2.18'32"34 Todos estos genes son regulados ascendentemente mediante VEGF de manera transitoria y la incubación prolongada con VEGF da como resultado su regulación hacia abajo. El trabajo en células endoteliales apunta a la regulación hacia arriba concomitante de NFATcl, un factor de transcripción que modera la señalización de CnA y la proteina inhibidora DSCRl, en donde DSCRl genera un bucle de retroalimentación negativo (figura 5B) en células endoteliales. En apoyo de esta ruta de señalización, se encontraron niveles más altos de expresión de E-selectina, TF, COX-2 y VCAM-1 2 horas después de la estimulación de VEGF. En contraste, 6 horas después del tratamiento, los niveles de expresión de estos genes fueron iguales de o menores de los niveles de las células de control sin tratar. Durante el curso de tiempo del experimento, los niveles de DSCRl se incrementaron por las primeras 6 horas después de la estimulación y alcanzaron una meseta después de esto (figura 5A) . Consistente con la retroalimentación negativa, la expresión de genes objetivo de VEGF se correlaciona inversamente con la expresión de DSCRl. El modelo de un bucle de retroalimentación negativo predice adicionalmente que la expulsión del componente inhibidor daría como resultado niveles incrementados de genes marcadores inflamatorios sobre células endoteliales (figura 5B) . Consistente con esta expectación, experimentos de siARN a apuntan al DSCRl endógeno revelaron actividad transcripcional de NFAT incrementada (figura 6C) y expresión de genes objetivo de CnA, en los que se incluyen TF, VCAM-1 y E-selectina sobre células endoteliales activadas (figura 7A) . Cuando se analizan células endoteliales tratadas con VEGF, la expulsión de DSCRl endógeno mediante siARN dio como resultado actividad incrementada de NFAT (fiqura 6D) y niveles de expresión de TF, E-selectina y VE-cadepna (figura 7B) . Sobre todo, la magnitud de inducción en células VEGF-estimuladas fue menos pronunciada cuando se compara con el tratamiento con PMA/IO, que puede ser explicado por la potencia superior de los últimos compuestos para estimular la actividad de CnA. La inducción concomitante de eventos de señalización estimulatopos e inhibidores en respuesta a la estimulación de citocina ha sido descrita para otros sistemas biológicos. Un bucle de retroalimentación negativo fue descrito en linfocitos para limitar los efectos de estimulación prolongada mediante TNF-a o IL-I. Ambas citocmas inducen A20, una molécula adaptadora intracelular que interfiere negativamente con la señalización de TNF-a en varios tipos de células.35 Así, similar al papel protector de A20 en la señalización de TNF-a, se cree que DSCRl podría impedir daños vasculares durante períodos de activación de célula endotelial prolongada mediante factores angiogenicos (por ejemplo, VEGF) u otros estímulos. En conclusión, se proporciona en la presente la evidencia directa por primera vez por un papel de DSCRl en la represión de genes inflamatorios sobre células endoteliales estimuladas con compuestos promflamatorios . Dado el papel prominente de algunos de estos genes como objetivos terapéuticos, en los que se incluyen Cox-2 y TF, nuestros hallazgos apuntan a DSCRl como un nuevo objetivo terapéutico para controlar la expresión eventos inflamatorios sobre la vasculatura y afectar la perturbación de integridad vascular.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un modulador de DSCRl caracterizado porque modula la actividad de DSCRl en células endoteliales.
2. El modulador de DSCRl de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el modulador modula la actividad de DSCRl inducida mediante señalización por medio de receptor 2 de VEGF (VEGFR-2) .
3. El modulador de DSCRl de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el modulador modula la ruta de DSCRl-calcineurina A (CnA) .
4. El modulador de DSCRl de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el modulador modula un evento celular asociado con la actividad de NFAT.
5. El modulador de DSCRl de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el evento celular es fosforilación de NFAT, translocación nuclear de NFAT o actividad transcripcional de NFAT.
6. El modulador de DSCRl de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el modulador comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido capaz de antagonizar la expresión genética inducida por CnA.
7. El modulador de DSCRl de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el polipéptido comprende un péptido que comprende por lo menos una porción de DSCRl, en donde el péptido es capaz de interactuar con CnA.
8. El modulador de DSCRl de conformidad con la reivindicación 6 ó 7, caracterizado porque el polipéptido comprende un aminoácido de aproximadamente posición 96 a aproximadamente 125 o aproximadamente posición 108 a 122 de DSCRl humano.
9. El modulador de DSCRl de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el modulador es capaz de antagonizar la función de DSCRl.
10. El modulador de DSCRl de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el modulador comprende un ácido nucleico que cuando está presente en una célula endotelial inhibe la actividad de DSCRl en la célula.
11. El modulador de DSCRl de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el ácido nucleico comprende un oligonucleótido de antisentido.
12. El modulador de DSCRl de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el ácido nucleico comprende un ARN inhibidor/interferente.
13. El modulador de DSCRl de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el ARN inhibidor/interferente es un ARN inhibidor/interferente pequeño (siARN) .
14. El modulador de DSCRl de conformidad con la reivindicación 12 ó 13, caracterizado porque el ácido nucleico comprende una o más secuencia seleccionadas del grupo que consiste de GCUCAGACCUUACACAUAG (SEQ ID NO: 2), GGACAUCACCUUUCAGUAU (SEQ ID NO: 3) , GAAAGAAUGAGGAGACCUA (SEQ ID NO: 4), GACAUCACCUUUCAGUAUU (SEQ ID NO: 5), AACGUAUGACAAGGACAUCAC (SEQ ID NO: 6), AAGGACAUCACCUUUCAGUAU (SEQ ID NO: 7), AAGUUAUAUUUUGCUCAGACC (SEQ ID NO: 8) and
AAGAUGCGACCCCAGUCAUAA (SEQ ID NO: 9 ) 15. El modulador de DSCRl de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el ácido nucleico comprende un aptámero.
16. Un método para el tratamiento de una alteración asociada con inflamación vascular anormal, el método está caracterizado porque comprende administrar a un sujeto una cantidad efectiva de un modulador de DSCR de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15, tratando mediante esto la alteración.
17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el modulador incrementa la inflamación asociada con la vasculatura.
18. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el modulador inhibe la inflamación asociada con la vasculatura.
19. Un método para el tratamiento de una alteración inmunológica asociada con inflamación vascular anormal, el método está caracterizado porque comprende administrar a un sujeto una cantidad efectiva de un modulador de DSCR de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15, tratando mediante esto la alteración.
20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el modulador incrementa la inflamación asociada con la vasculatura.
21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el modulador inhibe la inflamación asociada con la vasculatura.
22. Un método para el tratamiento de una alteración inmunológica asociada con perturbación de integridad vascular anormal, el método está caracterizado porque comprende administrar a un sujeto una cantidad efectiva de un modulador de DSCR de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15, tratando mediante esto la alteración.
23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la perturbación de integridad vascular está asociada con inflamación relacionada con célula vascular/endotelial .
24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el modulador incrementa la inflamación asociada con la vasculatura.
25. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el modulador inhibe la inflamación asociada con la vasculatura.
26. Un método para aliviar los efectos secundarios asociados con terapia antiinflamatoria, caracterizado porque comprende administrar a un sujeto un modulador de DSCR de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en conjunción con la terapia antiinflamatoria, aliviando mediante esto los efectos secundarios.
27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el modulador de DSCRl inhibe la actividad de DSCRl en una célula endotelial.
28. El método de conformidad con la reivindicación 26 o 27, caracterizado porque la terapia antiinflamatoria comprende un agente que suprime la inflamación.
29. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el modulador incrementa la inflamación asociada con la vasculatura.
30. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el modulador inhibe la inflamación asociada con la vasculatura.
31. Un método para el tratamiento de una alteración asociada con angiogénesis indeseable, el método está caracterizado porque comprende administrar a un sujeto con la alteración un agente antiangiogénico y un modulador de DSCR de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15.
32. Un método para la inhibición de crecimiento de tumor o crecimiento de una célula de cáncer, el método está caracterizado porque comprende administrar al tumor o la célula de cáncer una cantidad efectiva de un agente anti-cáncer y una cantidad efectiva de un modulador de DSCRl de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en donde las cantidades efectivas combinadas inhiben el tumor o el crecimiento de la célula de cáncer.
33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el agente anticáncer comprende un agente antiangiogénico.
34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el agente antiangiogénico comprende un antagonista de VEGF.
35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el antagonista de VEGF es un anticuerpo anti-VEGF.