CN108384787B - 一种RCAN1适配子RCAN1-s14 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种RNA适配子RCAN1‑s14以及其在制备RCAN1蛋白靶向抑制剂药物中的用途。本发明通过蛋白印迹和RNA敏感性实验技术分析证实，RCAN1可以与RNA相互结合，并筛选出特异性RCAN1适配子RCAN1‑S14。此外，本发明证实RCAN1‑S14可以通过与RCAN1结合可以减弱RCAN1相关生物学功能，从而可用于制备治疗与RCAN1相关疾病的靶向药物。

Description

一种RCAN1适配子RCAN1-s14
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种小分子RNA适配体RCAN1-s14以及其在在制备RCAN1蛋白靶向抑制剂药物中的用途。
技术背景
钙调磷酸酶调节因子(the regulator of Calcineurin 1，RCAN1)位于21号染色体的唐氏综合症关键区域(Down Syndrome Critical Region,DSCR)，因此之前又被称作唐氏综合症关键域蛋白1(Down Syndrome Critical Region 1,DSCR1)。根据起始编码RCAN1蛋白的外显子不同，RCAN1又细分为RCAN1.1和RCAN1.4。RCAN1.1又含有RCAN1.1S和RCAN1.1L两种转录产物。RCAN1的主要功能是通过与神经钙调蛋白钙依赖磷酸酶(calcineurin)相互作用，从而抑制钙依赖磷酸酶的活性及钙依赖磷酸酶-NFAT信号通路。相反地，RCAN1也能被钙依赖磷酸酶-NFAT信号通路激活，因此RCAN1的基因调控形成了负反馈调节。这种紧张有序的RCAN1负反馈调节也预示着RCAN1在细胞功能及相关疾病的发生和发展过程中的重要作用。
研究发现，RCAN1在细胞凋亡，应激，记忆和分化等生理过程中有非常重要的调节作用。钙依赖磷酸酶(Calcineruin)是一个钙离子依赖的丝氨酸/苏氨酸蛋白膦酸酯酶，参与钙信号通路的细胞反应，在细胞信号应激和环境刺激中可以调节细胞的凋亡和记忆过程，也能介导骨骼肌和心肌的发展和分化。研究发现未磷酸化状态下RCAN1基因的蛋白产物calcipressin 1能与钙依赖磷酸酶的催化亚基结合并抑制钙依赖磷酸酶的催化活性，RCAN1便成为了钙依赖磷酸酶内源性抑制剂。然而当RCAN1被糖原合成激酶3(glycogensynthase kinase 3,GSK-3)磷酸化后，与钙依赖磷酸酶分离并降解，随后钙依赖磷酸酶被激活。NFATC1(activated T-cell transcription factor 1)作为钙依赖磷酸酶的作用底物被脱磷酸化后入核，激活了RCAN1的转录。因此，RCAN1与钙依赖磷酸酶/钙依赖磷酸酶-NFAT之间存在负反馈调节机制。此外，RCAN1也同样参与了NF-B信号通路。在人类胚胎大脑的研究中发现，RCAN1可以被NF-B诱导激酶NIK(NF-B-inducing kinase)特异性结合并磷酸化，RCAN1蛋白稳定性增加，可溶性和非可溶性的RCAN1含量增加，而可溶性蛋白的增加导致了细胞毒性物质的形成。之前的研究也发现RCAN1.4可以提高IκBα的稳定性，抑制NF-B介导的环氧化酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)的合成，起到一定的抗炎作用。
目前的研究表明，短暂性的RCAN1过量表达具有细胞保护作用，而长期过量的表达则与某些疾病发生和发展有密切联系。例如与唐氏综合症(Down syndrome,DS)，阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD)等神经退行性疾病，炎症反应，心肌肥厚，血管形成以及癌症的发生有关。在中枢神经系统方面，RCAN1主要在大脑皮层，海马，黑质，丘脑和延髓中的表达。过量的RCAN1不仅在神经元中具有毒性作用，促进神经元的凋亡，还使得神经元对氧化应激作用更加敏感。阿尔茨海默病(Alzheimer Disease,AD)，又称为老年性痴呆，是一种进行性神经系统退行性疾病，是痴呆中最常见的类型，临床上主要表现为渐进性记忆减退、认知功能障碍以及其他神经精神症状和行为障碍。阿尔茨海默病具有两个特征性的病理变化：β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein，Aβ)斑块形成和神经原纤维缠结。研究表明，在AD患者的脑部RCAN1的mRNA是非AD患者的两倍，而在严重的神经元缠结的患者中，RCAN1 mRNA的量是正常人的三倍。DS患者中，在具有AD症状的病人脑部也检测到同样的结果。在AD患者中Aβ能直接上调RCAN1的表达。上调的RCAN1又抑制了钙依赖磷酸酶的活性，由此导致高度磷酸化的Tau蛋白的累积成对螺旋状丝纤维的形成，最终出现了AD症状的细胞改变。RCAN1敲除的小鼠同时出现了空间学习和记忆的缺陷，相关信号记忆减弱，长时程增强效应的损害等现象。由此，学者们推测RCAN1在限制膦酸酯酶的信号通路，长时程增强效应和记忆中具有重要作用。
最近的一些研究表明，RCAN1与癌症相关联。有研究表明，在RCAN1敲除的小鼠中，将通过VEGF-钙依赖磷酸酶-NFAT信号通路抑制肿瘤的生长。而在RCAN1转基因小鼠中，RCAN1能通过抑制钙依赖磷酸酶信号通路被抑制，以至于在肿瘤中的血管形成被抑制。由此可见RCAN1可以成为用于抗血管生成和抗癌症的靶基因。
随着生物科技的不断发展，DNA或者RNA不仅是遗传信息的载体，还可以依靠自身的空间结构与其他类型的分子相互作用，阻断或者封闭靶分子的生物功能，从而达到治疗疾病的目的。核酸适配子(Aptamer)是指能与蛋白或者其他小分子物质相结合的单链或者双链DNA和RNA。适配子作为药物比传统的抗体类药物或者小分子药物更具优点。适配子药物比小分子药物的空间结构大，更容易与生物大分子特异性结合，抗药性低。同时，适配子的最大优势是极易合成和修饰。指数富集的配基系统进化技术(Systematic Evolution ofLigands by Exponential Enrichment，SELEX)是体外筛选治疗性药物一项常用技术，也是其最具吸引力的领域之一。SELEX用于筛选核酸适配子药物不仅增强了人们对核酸-蛋白相互作用的认识，也为寻找适配子新药提供了一条新方法。
最新的研究报道，RCAN1的N端包含了一个RNA结合域(RNA recognition motif，RRM)，也成为RBD(RNA binding domain)或者RNP(ribonucleoprotein domain)。这一发现为RCAN1特异性靶向适配子的发现提供了一定的理论依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种RNA适配子RCAN1-s14，其序列如SEQ ID NO:1所示。
AUACAACAAAAACAAAAACAAGAAA
SEQ ID NO：1
本发明还提供一种RNA适配子RCAN1-s14在制备RCAN1蛋白靶向抑制剂药物中的用途。
在本发明一个优选的实施方案中，所述药物包括有效剂量的RCAN1-s14及其药学上可接受的载体或病毒载体。
在本发明一个优选的实施方案中，所述的药学上可接受的载体为壳聚糖、胆固醇、脂质体和纳米颗粒中的一种或多种；所述的病毒载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺病毒载体中的一种或多种。
在本发明一个优选的实施方案中，所述的药物的剂型为注射剂。
在本发明一个优选的实施方案中，所述药物用于治疗RCAN1相关疾病包括由RCAN1引起或者造成RCAN1异常表达的疾病。
在本发明一个优选的实施方案中，所述疾病包括唐氏综合症、阿尔茨海默症等神经退行性疾病，炎症反应，心肌肥厚和癌症。
本发明所述的RCAN1-s14在制备RCAN1蛋白靶向抑制剂药物中的应用，已经通过如下技术方案得到证实：
首先，本发明通过蛋白印迹技术分析RCAN1.1S全长RCAN1.1S-FL和其截短体RCAN1.1S-1-103aa在细胞内的分布。我们将RCAN1.1S-FL和RCAN1.1S1-103aa分别转染HEK293细胞，然后进行细胞核和细胞质分离，将分离后的蛋白进行蛋白印迹技术分析。结果表明，RCAN1.1S-FL和RCAN1.1S-1-103aa在细胞核里的含量均高于各自在细胞浆里的分布。
其次，本发明通过RNase A敏感实验分析RCAN1对RNase A是否有敏感性，即RCAN1是否有与RNA结合的可能性。我们将RCAN1.1S-FL和RCAN1.1S1-103aa分别转染HEK293细胞，然后分别加入RNase A(1mg/ml)在37℃环境下作用7min。此后我们通过蛋白印迹技术和共聚焦技术检测RCAN1的含量是否有变化，同时我们用能与RNA特异性结合的SRSF-1(Serine/Arginine-rich splicing factor-1)基因作为RNase A敏感性实验的阳性对照。蛋白印迹和共聚焦结果均显示，RCAN1.1S1-103aa的RNase A敏感性实验阳性，即说明RCAN1.1S1-103aa可以与RNA相结合。这也与之前RCAN1中N端含有RNA结合域的发现相一致。
为进一步探究和筛选与RCAN1特异性结合的RNA适配子，我们在体外纯化了RCAN1.1S1-103aa。我们将构建的原核生物表达载体pet-RCAN1-1-103转化到BL21(DE3)感受态细胞，经蛋白诱导后收集细胞，通过Ni-NTAResin亲和层析柱，分离纯化得到RCAN1.1S-1-103蛋白。
其次，本发明利用指数富集的配基系统进化技术(Systematic Evolution ofLigands by Exponential Enrichment，SELEX)在体外筛选与RCAN1高度特异性结合的RNA适配子。我们在体外建立了含有35个随机寡核苷酸的文库，通过与纯化的RCAN1.1S1-103aa蛋白不断结合和Ni-NTA Resin的不断重复筛选，最后将筛选出的寡核苷酸进行分子克隆，通过一代测序确定了可能结合的RNA适配子序列。通过对筛选出来的序列进行分析后，我们对其中的一个序列(命名为RCAN1-S14)进行了二级结构预测(The mfold Web Server)。
再次，本发明利用RNA pull-down assay进一步验证RCAN1-S14是与RCAN1.1S-1-103aa特异性结合的RNA适配子。我们在RCAN1-14s适配子末端进行了biotin修饰，命名为Biotin-s14cold。我们将HEK293细胞系转染质粒pcDNA-RCAN1.1s-1-103aa-6myc，提取蛋白50ug后分别与Biotin-s14cold(1uM),10Xs14cold(10uM),10Xs14mutant(10uM)和streptavidin-beads体外结合，4℃孵育3h后，提取蛋白用9E10抗体检测RCAN1.1s-1-103aa-6myc水平。结果发现10Xs14cold可以竞争biotin-s14cold和RCAN1.1s-1-103aa的结合，而10Xs14mutant不能竞争biotin-s14cold和RCAN1.1s-1-103aa的结合，由此可见适配子RCAN1-s14可以特异性地结合RCAN1.1s-1-103aa。
为了进一步量化适配子RCAN1-s14与RCAN1.1s-1-103aa的结合力，本发明利用表面等离子体共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)进行RNA和蛋白之间的亲和力分析。我们把体外纯化RCAN1.1s-1-103aa蛋白，利用Biacore3000将RCAN1-1-103aa蛋白偶联于CM5芯片，再将不同浓度的RCAN1-S14(0-30uM)或其突变s14mutant(0-30uM)依次通过芯片表面得出蛋白和RNA相互作用的亲和力参数。经分析测定结果后，RCAN1-S14与RCAN1-1-103aa蛋白亲和力参数为1.48e-8，而s14mutant的亲和力参数为2.5e-7。
由上述结果可知，本发明已经筛选和明确了与RCAN1.1s-1-103aa特异性结合RNA适配子。但此适配子对RCAN1是否有生物学功能上的影响，具体影响如何也需要进一步的实验验证。我们之前的研究发现，RCAN1可以抑制转录因子NF-κB的入核而抑制NF-κB信号通路，因此我们进一步探究RCAN1-s14是否可以竞争RCAN1的该生物学功能。
本发明进一步将RCAN1-s14，RCAN1.1S和NF-κB信号通路的指示质粒NF-κB-luc一起转染入HEK293细胞系，利用双荧光素酶报告基因实验检测NF-κB信号通路的活性。与之前结果一致，RCAN1.1s可以抑制NF-κB信号通路，但加入适配子RCAN1-s14后，RCAN1的抑制作用减弱，此结果表明RCAN1-s14可以特异性减弱RCAN1抑制NF-κB信号通路的作用。同样地，我们用敲除RCAN1的质粒pSiRCAN1转染HEK293细胞，再用双荧光素酶报告基因实验检测NF-κB信号通路的活性，结果同样说明RCAN1-s14的该生物学功能。此后将RCAN1-s14插入慢病毒载体Plenti-u6-gfp-puro中，标记为Plenti-RNA-GFP,转染HEK293后检测NF-κB-luc活性，RCAN1的抑制作用同样被减弱。
除了上述功能，RCAN1被发现能引起神经元的凋亡。本发明进一步验证RCAN1-s14对RCAN1引起的神经细胞凋亡的影响。我们将适配子RCAN1-s14，RCAN1.1S转染进人的神经母细胞瘤细胞系SH-sy5y。然后利用tunel法检测SH-sy5y细胞的凋亡。结果表明，RCAN1-s14可以减弱RCAN1引起的神经细胞的凋亡。
综上所述，本发明明确了RCAN1.1S-1-103aa可与RNA相结合，并且筛选出了能与RCAN1特异性相结合的RNA适配子。通过进一步研究RNA与RCAN1的相互作用，确定了RCAN1-s14是能与RCAN1特异性结合的RNA适配子。而后的实验也表明RCAN1-s14通过与RCAN1结合来减弱RCAN1的生物学功能，因此RCAN1-s14适配子可以应用于制备RCAN1蛋白靶向抑制剂药物。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种RNA适配子RCAN1-s14的新用途，具体为RCAN1-s14在制备抑制RCAN1的靶基因药物中的应用。作为抑制RCAN1基因的靶点，RCAN1-s14不仅对制备抑制RCAN1的靶基因药物具有重要的意义，对其进行细胞功能学研究的结果表明，RCAN1-s14可显著减弱与RCAN1相关的的生物学功能，可用于制备治疗与RCAN1相关疾病的靶向药物。
附图说明
图1为RCAN1.1s-FL和RCAN1.1s-1-103aa在细胞内的定位。
图2为图1的蛋白定量
图3为采用RNase A敏感性实验检测RCAN1的RNA敏感性，蛋白印迹法检测RNA敏感性。
图4为采用RNase A敏感性实验检测RCAN1的RNA敏感性，共聚焦法检测RNA敏感性。
图5为蛋白印迹法检测原核系统纯化的RCAN1.1s-1-103aa蛋白。
图6为采用RNApull-down assay检测RCAN1-s14与RCAN1.1s-1-103aa特异性结合。
图7为采用表面等离子体共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)进行RNA和蛋白之间的亲和力分析，RCAN1-s14与RCAN1.1s-1-103aa结合的亲和力分析。
图8为采用表面等离子体共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)进行RNA和蛋白之间的亲和力分析，RCAN1-s14mut与RCAN1.1s-1-103aa结合的亲和力分析。
图9为采用双荧光素酶报告基因实验检测NF-κB信号通路的活性，在RCAN1高表达的HEK293里加入合成的RCAN1-s14检测NF-κB信号通路的活性；
图10为采用双荧光素酶报告基因实验检测NF-κB信号通路的活性，在RCAN1低表达的HEK293里加入合成的RCAN1-s14检测NF-κB信号通路的活性；
图11为采用双荧光素酶报告基因实验检测NF-κB信号通路的活性，在RCAN1高表达的HEK293里转染Plenti-RNA-GFP及对照检测NF-κB信号通路的活性。
图12为采用Tunel法检测RCAN1-s14对SH-sy5y凋亡的影响。
图13为pRCAN1.1s-FL-GFP及pRCAN1.1s-1-103aa-GFP质粒载体图谱。
图14为pcDNA-RCAN1.1s-1-103aa-6myc质粒载体图谱。
图15为NF-κB-luc质粒载体图谱。
图16为pSiRCAN1质粒载体图谱。
具体实施方式
以下通过具体实施方式进一步描述本发明，但本发明不仅仅限于以下实施例。本发明中所用到的材料可通过市售得到或通过本领域的常规方法得到。如：细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0027，碧云天)；anti-GFP抗体(1：000，G1546，Sigma)，RNaseA(000000010109169001，Roche)；IPTG(ST098,碧云天)；双荧光素酶报告系统试剂盒(E1910,Promega)；tunel检测试剂盒(12156792910，Roche)。
实施例1 RCAN1的细胞内定位
将RCAN1.1S全长质粒pRCAN1.1s-FL-GFP和截短质粒pRCAN1.1s-1-103aa-GFP(质粒图谱如图13所示，pRCAN1.1s-FL-GFP插入的序列为SEQ ID NO：2，pRCAN1.1s-1-103aa-GFP插入的序列为SEQ ID NO：3)转染进HEK293细胞(人肾脏上皮细胞)，48h后收细胞。利用细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0027，碧云天)将细胞核和细胞质分离，蛋白印迹法利用anti-GFP抗体(1：000，G1546，Sigma)检测二者在细胞内的分布。结果如图1和图2所示，由图中可以看出RCAN1.1S-FL和RCAN1.1s-1-103aa在细胞核内分布大于在胞浆内的分布。
pRCAN1.1s-FL-GFP插入序列：
ATGGAGGAGGTGGACCTGCAGGACCTGCCCAGCGCCACCATCGCCTGTCACCTGGACCCGCGCGTGTTCGTGGACGGCCTGTGCCGGGCCAAATTTGAGTCCCTCTTTAGGACGTATGACAAGGACATCACCTTTCAGTATTTTAAGAGCTTCAAACGAGTCAGAATAAACTTCAGCAACCCCTTCTCCGCAGCAGATGCCAGGCTCCAGCTGCATAAGACTGAGTTTCTGGGAAAGGAAAGAAGTTATATTTTGCTCAGACCTTACACATAGGAAGCTCACACCTGGCTCCGCCAAATCCAGACAAGCAGTTTCTGATCTCCCCTCCCGCCTCTCCGCCAGTGGGATGGAAACAAGTGGAAGATGCGACCCCAGTCATAAACTATGATCTCTTATATGCCATCTCCAAGCTGGGGCCAGGGGAAAAGTATGAATTGCACGCAGCGACTGACACCACTCCCAGCGTGGTGGTCCATGTATGTGAGAGTGATCAAGAGAAGGAGGAAGAAGAGGAAATGGAAAGAATGAGGAGACCTAAGCCAAAAATTATCCAGACCAGGAGGCCGGAGTACACGCCGATCCACCTCAGCTGA
SEQ ID NO：2
pRCAN1.1s-1-103aa-GFP插入序列:
ATGGAGGAGGTGGACCTGCAGGACCTGCCCAGCGCCACCATCGCCTGTCACCTGGACCCGCGCGTGTTCGTGGACGGCCTGTGCCGGGCCAAATTTGAGTCCCTCTTTAGGACGTATGACAAGGACATCACCTTTCAGTATTTTAAGAGCTTCAAACGAGTCAGAATAAACTTCAGCAACCCCTTCTCCGCAGCAGATGCCAGGCTCCAGCTGCATAAGACTGAGTTTCTGGGAAAGGAAAGAAGTTATATTTTGCTCAGACCTTACACATAGGAAGCTCACACCTGGCTCCGCCAAATCCAGACAA
SEQ ID NO：3
实施例2 RCAN1的RNaseA敏感性
我们将RCAN1.1S-FL-GFP和RCAN1.1S1-103aa-GFP分别转染HEK293细胞，转染24h后分别加入RNaseA(1mg/ml，000000010109169001，Roche)在37℃环境下作用7min,然后收集和裂解细胞，我们通过蛋白印迹技术，利用anti-GFP抗体(1：000，G1546，Sigma)检测二者表达量，结果如图3所示。同时，我们也在免疫荧光染色后使用共聚焦显微镜(型号LSM780)观察二者的含量是否有变化，结果如图4所示。我们将细胞种植于玻片，转染24h后破膜，PBS洗两次，加入RNaseA(1mg/ml)在37℃环境下作用7min，冷甲醛固定15min后用DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)染核，最后利用共聚焦技术观察二者的表达。同时我们用能与RNA特异性结合的SRSF-1(Serine/Arginine-rich splicing factor-1)基因作为RNase A敏感性实验的阳性对照。蛋白印迹和共聚焦结果均显示，RCAN1.1S1-103aa的RNase A敏感性实验阳性，即说明RCAN1.1S1-103aa可以与RNA相结合。
实施例3 RCAN1.1S-1-103aa蛋白纯化
我们将构建的原核生物表达载体pet-RCAN1-1-103转化到BL21(DE3)感受态细胞，挑取单菌落扩增细菌至10ml加入抗生素的LB里37℃摇过夜。按1：100的比例稀释过夜菌，即将10ml的过夜菌加到1L的LB里37℃培养2-3h,而后加入0.5mM的IPTG(ST098,碧云天)进行蛋白表达的诱导。经37℃过夜培养后收集细菌，裂解离心后将蛋白通过Ni-NTA Resin亲和层析柱，分离纯化得到RCAN1.1S-1-103蛋白，纯化得到的蛋白采用蛋白印记法检测，检测结果如图5所述，由图中可以看出我们构建的原核生物表达载体pet-RCAN1-1-103可以成功的表达RCAN1.1S-1-103蛋白。
实施例4采用selex进行RCAN1适配子的筛选。
首先我们建立了一个含有35个随机核苷酸的寡核苷酸文库，体外转录后产生了RNA库。我们将纯化的RCAN1.1S-1-103aa蛋白，纯化的随机RNA和Ni珠体外结合，4℃孵育2h后冲洗Ni珠3次，而后进行RNA的抽提。将抽提后的RNA反转成CDNA文库，而后进行PCR扩增。扩增后的双链DNA再一次进行体外转录，再一次形成RNA库，重复上述步骤。通过4次不断的重复筛选，我们将最后得到的双链DNA酶切后插入空白载体，进行分子克隆，最后将阳性克隆进行一代测序，得到RCN1适配子RCAN1-S14，序列如SEQ ID NO:1所示：
AUACAACAAAAACAAAAACAAGAAA
SEQ ID NO：1
实施例5采用RNA pull-down assay检测RCAN1-s14与RCAN1.1s-1-103aa特异性结合。
我们将HEK293细胞转染质粒pcDNA-RCAN1.1s-1-103aa-6myc(质粒图谱如图14所示，插入的序列为SEQ ID NO：4),提取蛋白50ug后分别与Biotin-s14cold(1uM),10Xs14cold(10uM),10Xs14mutant(10uM)和链霉抗生物素蛋白-琼脂糖珠(Sigma，08014)体外结合，4℃孵育3h后，离心并重悬streptavidin-beads三次，将5x十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白上样缓冲液加入streptavidin-beads，95℃变性5分钟后用蛋白印迹法和anti-myc抗体9E10检测RCAN1.1s-1-103aa-6myc水平。结果如图6所示，由图中可以发现10Xs14cold可以竞争biotin-s14cold和RCAN1.1s-1-103aa的结合，而10Xs14mutant不能竞争biotin-s14cold和RCAN1.1s-1-103aa的结合。
pcDNA-RCAN1.1s-1-103aa-6myc质粒中插入的序列：
ATGGAGGAGGTGGACCTGCAGGACCTGCCCAGCGCCACCATCGCCTGTCACCTGGACCCGCGCGTGTTCGTGGACGGCCTGTGCCGGGCCAAATTTGAGTCCCTCTTTAGGACGTATGACAAGGACATCACCTTTCAGTATTTTAAGAGCTTCAAACGAGTCAGAATAAACTTCAGCAACCCCTTCTCCGCAGCAGATGCCAGGCTCCAGCTGCATAAGACTGAGTTTCTGGGAAAGGAAAGAAGTTATATTTTGCTCAGACCTTACACATAGGAAGCTCACACCTGGCTCCGCCAAATCCAGACAA
SEQ ID NO：4
实施例6采用表面等离子体共振技术(SPR)进行RNA和蛋白之间的亲和力分析
我们把体外纯化RCAN1.1s-1-103aa蛋白偶联于CM5芯片，利用Biacore3000将不同浓度的RCAN1-S14(0-30uM)或其突变s14mutant(0-30uM)依次通过芯片表面，最后得出蛋白和RNA相互作用的亲和力参数，RCAN1-s14与RCAN1.1s-1-103aa结合的亲和力如图7所示，由图中可以看出RCAN1-S14与RCAN1-1-103aa蛋白亲和力参数为1.48e-8，RCAN1-s14mut与RCAN1.1s-1-103aa结合的亲和力如图8所示，由图中可以看出，RCAN1-s14mut与RCAN1.1s-1-103aa的亲和力参数为2.5e-7。
实施例7采用双荧光素酶报告基因系统检测NF-κB信号通路的活性。
将RCAN1-s14，RCAN1.1S和NF-κB信号通路的指示质粒NF-κB-luc(质粒图谱如图15所示，插入的序列为SEQ ID NO：5)一起转染入HEK293细胞系，24h后收集细胞，利用Dual-Luciferase双荧光素酶报告系统试剂盒(E1910,Promega)检测NF-κB-luc的表达，即NF-κB信号通路的活性。如图9所示，由图中可以看出，RCAN1.1s可以抑制NF-κB信号通路，但加入适配子RCAN1-s14后，RCAN1的抑制作用减弱，此结果表明RCAN1-s14可以特异性减弱RCAN1对NF-κB信号通路的抑制作用。同样地，我们用敲除RCAN1的质粒pSiRCAN1(质粒图谱如图15所示，插入的序列为SEQ ID NO：6)转染HEK293细胞，再用双荧光素酶报告基因系统检测NF-κB信号通路的活性，图10所示结果同样说明RCAN1-s14的该生物学功能。此后将RCAN1-s14插入慢病毒载体Plenti-u6-gfp-puro(Vigene,LT88022)中，标记为Plenti-RNA-GFP,转染HEK293细胞24h后检测NF-κB-luc活性，结果如图11所示，由图中可以看出RCAN1对NF-κB信号通路的抑制作用同样被减弱。
NF-κB-luc质粒中插入的序列：
CCGGCCATGGACGAACTGTTCCCCCTCATCTTCCCGGCAGAGCCAGCCCAGGCCTCTGGCCCCTATGTGGAGATCATTGAGCAGCCCAAGCAGCGGGGCATGCGCTTCCGCTACAAGTGCGAGGGGCGCTCCGCGGGCAGCATCCCAGGCGAGAGGAGCACAGATACCACCAAGACCCACCCCACCATCAAGATCAATGGCTACACAGGACCAGGGACAGTGCGCATCTCCCTGGTCACCAAGGACCCTCCTCACCGGCCTCACCCCCACGAGCTTGTAGGAAAGGACTCCGGGATGGCTTCTATGAGGCTGAGCTCTGCCCGGACCGCTGCATCCACAGTTTCCAGAACCTGGGAATCCAGTGTGTGAAGAAGCGGGACCTGGAGCAGGCTATCAGTCAGCGCATCCAGACCAACAACAACCCCTTCCAAGAAGAGCAGCGTGGGGACTACGACCTGAATGCTGTGCGGCTCTGCTTCCAGGTGACAGGCGGGACCCATCAGGCAGGCCCCTCCGCCTGCCGCCTGTCCTTTCTCATCCCATCTTTGACAATCGTGCCCCCAACACTGCCGAGCTCAAGATCTGCCGAGTGAACCGAAACTCTGGCAGCTGCCTCGGGGGGTGTGTTCCAACTGCCCCCAACTTTGTGGATGTCTTCTTGGAGGGGGGAGCCATATTTTATTCTTTTATTGTCAGTATCTGTATCTCTCTCTCTTTTTGGAGGTGCTTAAGCAGAAGCATTAACTTCTCTGGAAAGGGGGGAGCTGGGGAAACTCAAACTTTTCCCCTGTCCTGATGGTCAGCTCCCTTCTCTGTAGGGAACTCTGGGGTCCCCCATCCCCATCCTCCAGCTTCTGGTACTCTCCTAGAGACAGAAGCAGGCTGGAGGTAAGGCCTTTGAGCCCACAAAGCCTTATCAAGTGTCTTCCATCATGGATTCATTACAGCTTAATCAAAATAACGCCCCAGATACCAGCCCCTGTATGGCACTGGCATTGTCCCTGTGCCTAACACCAGCGTTTGAGGGGCTGGCCTTCCTGCCCTACAGAGGTCTCTGCCGGCTCTTTCCTTGCTCAACCATGGCTGAAGGAAACCAGTGCAACAGCACTGGCTCTCTCCAGGATCCAGAAGGGGTTTGGTCTGGGACTCCTTGCTCTCCCTCTTCTCAAGTGCCTAATAGTAGGGTAAGTTGTTAAGAGTGGGGGAGAGCAGGCTGGCAGCTCTCCAGTCAGGAGGCATAGTTTTTACTGAACAATCAAAGCACTTGGACTCTTGCTCTTTCTACTCTGAACTAATAAATCTGTTGCCAAGCTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO：5
pSiRCAN1质粒中插入的序列：
ATGGAGGAGGTGGACCTGCAGGACCTGCCCAGCGCCACCATCGCCTGTCACCTGGACCCGCGCGTGTTCGTGGACGGCCTGTGCCGGGCCAAATTTGAGTCCCTCTTTAGGACGTATGACAAGGACATCACCTTTCAGTATTTTAAGAGCTTCAAACGAGTCAGAATAAACTTCAGCAACCCCTTCTCCGCAGCAGATGCCAGGCTCCAGCTGCATAAGACTGAGTTTCTGGGAAAGGAAAGAAGTTATATTTTGCTCAGACCTTACACATAGGAAGCTCACACCTGGCTCCGCCAAATCCAGACAA
SEQ ID NO：6
实施例8采用Tunel法检测RCAN1-s14对SH-sy5y凋亡的影响。
我们将适配子RCAN1-s14，RCAN1.1S瞬时转染进人的神经母细胞瘤细胞系SH-sy5y，24h后4％多聚甲醛室温固定30min,PBS漂洗后用0.1％TritonX-100冰上通透2min,利用tunel检测试剂盒(12156792910，Roche)染色，检测SH-sy5y细胞的凋亡。结果如图12所示，由图中可以看出RCAN1-s14可以减弱RCAN1引起的神经细胞的凋亡。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 山东大学深圳研究院
<120> 一种RCAN1适配子RCAN1-s14
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
auacaacaaa aacaaaaaca agaaa 25
<210> 2
<211> 593
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggaggagg tggacctgca ggacctgccc agcgccacca tcgcctgtca cctggacccg 60
cgcgtgttcg tggacggcct gtgccgggcc aaatttgagt ccctctttag gacgtatgac 120
aaggacatca cctttcagta ttttaagagc ttcaaacgag tcagaataaa cttcagcaac 180
cccttctccg cagcagatgc caggctccag ctgcataaga ctgagtttct gggaaaggaa 240
agaagttata ttttgctcag accttacaca taggaagctc acacctggct ccgccaaatc 300
cagacaagca gtttctgatc tcccctcccg cctctccgcc agtgggatgg aaacaagtgg 360
aagatgcgac cccagtcata aactatgatc tcttatatgc catctccaag ctggggccag 420
gggaaaagta tgaattgcac gcagcgactg acaccactcc cagcgtggtg gtccatgtat 480
gtgagagtga tcaagagaag gaggaagaag aggaaatgga aagaatgagg agacctaagc 540
caaaaattat ccagaccagg aggccggagt acacgccgat ccacctcagc tga 593
<210> 3
<211> 307
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggaggagg tggacctgca ggacctgccc agcgccacca tcgcctgtca cctggacccg 60
cgcgtgttcg tggacggcct gtgccgggcc aaatttgagt ccctctttag gacgtatgac 120
aaggacatca cctttcagta ttttaagagc ttcaaacgag tcagaataaa cttcagcaac 180
cccttctccg cagcagatgc caggctccag ctgcataaga ctgagtttct gggaaaggaa 240
agaagttata ttttgctcag accttacaca taggaagctc acacctggct ccgccaaatc 300
cagacaa 307
<210> 4
<211> 307
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggaggagg tggacctgca ggacctgccc agcgccacca tcgcctgtca cctggacccg 60
cgcgtgttcg tggacggcct gtgccgggcc aaatttgagt ccctctttag gacgtatgac 120
aaggacatca cctttcagta ttttaagagc ttcaaacgag tcagaataaa cttcagcaac 180
cccttctccg cagcagatgc caggctccag ctgcataaga ctgagtttct gggaaaggaa 240
agaagttata ttttgctcag accttacaca taggaagctc acacctggct ccgccaaatc 300
cagacaa 307
<210> 5
<211> 1342
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccggccatgg acgaactgtt ccccctcatc ttcccggcag agccagccca ggcctctggc 60
ccctatgtgg agatcattga gcagcccaag cagcggggca tgcgcttccg ctacaagtgc 120
gaggggcgct ccgcgggcag catcccaggc gagaggagca cagataccac caagacccac 180
cccaccatca agatcaatgg ctacacagga ccagggacag tgcgcatctc cctggtcacc 240
aaggaccctc ctcaccggcc tcacccccac gagcttgtag gaaaggactc cgggatggct 300
tctatgaggc tgagctctgc ccggaccgct gcatccacag tttccagaac ctgggaatcc 360
agtgtgtgaa gaagcgggac ctggagcagg ctatcagtca gcgcatccag accaacaaca 420
accccttcca agaagagcag cgtggggact acgacctgaa tgctgtgcgg ctctgcttcc 480
aggtgacagg cgggacccat caggcaggcc cctccgcctg ccgcctgtcc tttctcatcc 540
catctttgac aatcgtgccc ccaacactgc cgagctcaag atctgccgag tgaaccgaaa 600
ctctggcagc tgcctcgggg ggtgtgttcc aactgccccc aactttgtgg atgtcttctt 660
ggagggggga gccatatttt attcttttat tgtcagtatc tgtatctctc tctctttttg 720
gaggtgctta agcagaagca ttaacttctc tggaaagggg ggagctgggg aaactcaaac 780
ttttcccctg tcctgatggt cagctccctt ctctgtaggg aactctgggg tcccccatcc 840
ccatcctcca gcttctggta ctctcctaga gacagaagca ggctggaggt aaggcctttg 900
agcccacaaa gccttatcaa gtgtcttcca tcatggattc attacagctt aatcaaaata 960
acgccccaga taccagcccc tgtatggcac tggcattgtc cctgtgccta acaccagcgt 1020
ttgaggggct ggccttcctg ccctacagag gtctctgccg gctctttcct tgctcaacca 1080
tggctgaagg aaaccagtgc aacagcactg gctctctcca ggatccagaa ggggtttggt 1140
ctgggactcc ttgctctccc tcttctcaag tgcctaatag tagggtaagt tgttaagagt 1200
gggggagagc aggctggcag ctctccagtc aggaggcata gtttttactg aacaatcaaa 1260
gcacttggac tcttgctctt tctactctga actaataaat ctgttgccaa gctgaaaaaa 1320
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1342
<210> 6
<211> 307
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggaggagg tggacctgca ggacctgccc agcgccacca tcgcctgtca cctggacccg 60
cgcgtgttcg tggacggcct gtgccgggcc aaatttgagt ccctctttag gacgtatgac 120
aaggacatca cctttcagta ttttaagagc ttcaaacgag tcagaataaa cttcagcaac 180
cccttctccg cagcagatgc caggctccag ctgcataaga ctgagtttct gggaaaggaa 240
agaagttata ttttgctcag accttacaca taggaagctc acacctggct ccgccaaatc 300
cagacaa 307

Claims (7)

1.一种RCAN1适配子RCAN1-s14，其特征在于，序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述的适配子RCAN1-s14在制备RCAN1蛋白靶向抑制剂药物中的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述药物包括有效剂量的RCAN1-s14及其药学上可接受的载体或病毒载体。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的药学上可接受的载体为壳聚糖、胆固醇、脂质体和纳米颗粒中的一种或多种；所述的病毒载体为逆转录病毒载体或腺病毒载体中的一种或多种。
5.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的药物的剂型为注射剂。
6.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述药物用于治疗RCAN1相关疾病包括由RCAN1引起或者造成RCAN1异常表达的疾病。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述疾病包括唐氏综合症，神经退行性疾病，炎症反应，心肌肥厚和癌症。
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