WO2005068624A1

WO2005068624A1 - 関節リウマチ治療薬のスクリーニング法

Info

Publication number: WO2005068624A1
Application number: PCT/JP2005/000358
Authority: WO
Inventors: Shigeki Momohara; Masahiro Takeuchi; Junpei Abe
Original assignee: Astellas Pharma Inc.
Priority date: 2004-01-16
Filing date: 2005-01-14
Publication date: 2005-07-28
Also published as: JP2007104902A

Abstract

　DGPP1Sタンパク質、DGPP1Lタンパク質、DGPP2Sタンパク質又はDGPP2Lタンパク質の抑制物質を選択する、関節リウマチ治療薬のスクリーニング方法、及び前記抑制物質を有効成分とする関節リウマチ治療薬を開示する。

Description

明細書

関節リウマチ治療薬のスクリーニング法

技術分野

[0001] 本発明は、関節リウマチ治療薬のスクリーニング法に関する。

背景技術

[0002] 関節リウマチ（Rheumatoid arthritis, RA)は滑膜組織に病変の主座を持ち、関節の発赤、腫脹、熱感、疼痛、運動制限、及び破壊をもたらす原因不明の慢性炎症性疾患である。 RAの滑膜組織では、インターロイキン- 1 (interleukin- 1、 IL- 1)、インター口ィキン- 6 (IL-6)、インターロイキン- 8 (IL-8)、インターロイキン- 12 (IL- 12)、インター口ィキン- 15 (IL-15)、インターロイキン- 18 (IL-18)、腫瘍壊死因子 oc (tumor necrosis factor- 、 TNF- )などの炎症性サイト力イン、一酸化窒素 (nitric oxideゝ NO)、プロスタグランジン（prostaglandins PGs)などの過剰産生が知られている（非特許文献 1)。また、滑膜組織を構成する免疫担当細胞は CD40/CD40リガンド系、 ICAM-1 (intercellular

adhesion molecule- 1) / LFA- 1 (leukocyte adnesion molecule- 1)糸などの糸田胞表 ΐϋ 分子を介して相互に活性ィヒしあい、炎症反応の遷延に関与すると考えられている（非特許文献 2)。更に、滑膜組織での血管新生はパンヌス形成及びその維持に関与すると考えられている (非特許文献 3)。

近年、モノクローナル抗体、可溶性受容体などを用い、 IL-1、 IL-6や TNF- αを標的とした治療法が開発されその有効性が注目を集めてヽる（非特許文献 4)。しかし、従来の治療標的分子を機序とする治療法では完全寛解導入には至らない患者群が存在する (非特許文献 5)。従って、既存の報告とは異なる新しい治療標的分子の同定が望まれている。

[0003] 本発明で用いることのできる DGPP1L及び DGPP1Sの配列と相同性のある配列が、データベース genpeptに BC033025

(2002.6.24)として収載されて、る。

[0004] 本発明で用いることのできる DGPP2Lと相同性のある配列力特許文献 1、特許文献 2、及び特許文献 3に記載されている。このうち特許文献 1要約中には、 DGPP2Lと相同性のある配列は悪性腫瘍、血液疾患、 HIV感染、免疫性疾患および種々の炎症の診断、処置に有用と記載されている。特許文献 2には DGPP2Lと相同性のある配列は過増殖性疾患のような腫瘍性疾患を含む疾患の診断、治療、予防 Z予後に有用であること、神経性疾患、免疫系疾患、筋疾患、生殖性疾患、消化関係の疾患、肺疾患、循環器疾患、又は腎疾患のような疾患の治療にも有用であること、また、当該ポリペプチドの異常な発現や活性と関わる疾患の検査薬として有用であり、癌ゃ慢性関節リウマチの処置に有用であることが記載されている。特許文献 3には DGPP2L と相同性の高い配列が開示され、過増殖性疾患 (例えば癌）、免疫不全性疾患 (例えば AIDS)、自己免疫疾患 (例えば関節炎）、神経性疾患 (例えばアルツハイマー病）、代謝異常 (例えばフ二ルケトン尿症）、炎症性疾患 (例えば喘息）、循環器病 (例えばァテローム性動脈硬化症）、血液疾患 (血友病）、生殖性疾患 (例えば不妊症)及び感染症 (例えばインフルエンザ)等の検査、処置、予防または予後に有用であると記載されている。

[0005] 本発明で用いることのできる DGPP2Sと同一の配列が前記特許文献 1に記載され、相同性のある配列が前記特許文献 2及び特許文献 3に記載されている。

[0006] 非特許文献 1：「ザ ·ジャーナル ·ォブ ·ェクスメンタル ·メデイシン（The Journal of Experimental Medicine)」、（米国)、 1991年、第 173卷、 p.569- 574

非特許文献 2 :「ザ'ジャーナル'ォブ 'リューマトロジー（The Journal of Rheumatology )」、（カナダ）、 2002年、第 29卷、 p.875-882

非特許文献 3 :「アースライティス 'リサーチ（Arthritis Research)」、（英国）、 2002年、第 4卷補遺 3、 p.S81-S90

非特許文献 4 :「カレント 'ファーマシューティカル 'バイオテクノロジー（Current

Pharmaceutical Biotechnology)」、（米国）、 2000年、第 1卷、 p.217- 233

非特許文献 5 :「ネイチヤー'レビューズ 'ィムノロジー（Nature Reviews Immunology)」

、（英国）、 2002年、第 2卷、 p.364-371

特許文献 1：国際公開第 02/26798号パンフレット

特許文献 2：国際公開第 01/55163号パンフレット特許文献 3：国際公開第 01/55301号パンフレット

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0007] 本発明は関節リウマチの改善及び Z又は治療に有用な物質のスクリーニング方法及び新たな作用機序に基づく関節リウマチ治療用医薬組成物を提供することを課題とする。

課題を解決するための手段

[0008] 「配列番号 2で表されるアミノ酸配列」力もなるポリペプチドを「DGPP1Lタンパク質」、「配列番号 2の第 50— 313番で表されるアミノ酸配列」からなるポリペプチドを「 DGPP1Sタンパク質」、「配列番号 4で表されるアミノ酸配列」力もなるポリペプチドを「 DGPP2Lタンパク質」、「配列番号 4の第 21— 291番で表されるアミノ酸配列」からなるポリペプチドを「DGPP2Sタンパク質」、「配列番号 2の第 50— 313番又は配列番号 2の第 50— 313番で表されるアミノ酸配列において 1一 10個のアミノ酸が欠失、置換、及び Z若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ脱リン酸酵素活性 (

dephosphorylation

enzyme activity)を有するポリペプチド」を「DGPP1機能的等価改変体」、「配列番号 4 の第 21— 291番で表されるアミノ酸配列又は配列番号 4の第 21— 291番で表されるァミノ酸配列において 1一 10個のアミノ酸が欠失、置換、及び Z若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ脱リン酸酵素活性を有するポリペプチド」を「DGPP2機能的等価改変体」と称する。また、「配列番号 2で表されるアミノ酸配列との同一性が 90%以上であるアミノ酸配列からなり、かつ脱リン酸酵素活性を有するポリペプチド」を「 DGPP 目同ポリペプチド」、「配列番号 4で表されるアミノ酸配列との同一性が 90% 以上であるアミノ酸配列からなり、かつ脱リン酸酵素活性を有するポリペプチド」を「 DGPP2相同ポリペプチド」と称する。

[0009] DGPP1Lタンパク質、 DGPP1Sタンパク質、 DGPP1機能的等価改変体及び DGPP 目同ポリペプチドを総称して「DGPP1ポリペプチド」と称する。 DGPP2Lタンパク質、 DGPP2Sタンパク質、 DGPP2機能的等価改変体、及び DGPP2相同ポリペプチドを総称して「DGPP2ポリペプチド」と称する。また、 DGPP1Lタンパク質、 DGPP1Sタンパク質、 DGPP1機能的等価改変体、 DGPP 目同ポリペプチド、 DGPP2Lタンパク質、 DGPP2Sタンパク質、 DGPP2機能的等価改変体、及び DGPP2相同ポリペプチドを総称して「本明細書のポリペプチド」と称する。 DGPP1機能的等価改変体、 DGPP 目同ポリペプチド、 DGPP2機能的等価改変体、及び Z又は DGPP2相同ポリペプチドとしては、脱リン酸酵素活性及び増殖抑制活性を有するポリペプチドが好まし、。

[0010] 本発明者らは、鋭意研究を行なった結果、 DGPP1S、 DGPP1L、 DGPP2S、及び

DGPP2Lタンパク質を取得 (実施例 2)し、該タンパク質がそれぞれ脱リン酸酵素活性を有することを生化学的に見出した (実施例 3)。 DGPP1ポリペプチド及び DGPP2ポリペプチドは、ともに脱リン酸酵素であり、 DGPP1L又は DGPP1Sタンパク質と DGPP2L 又は DGPP2Sタンパク質の活性中心の同一性は 83. 7%であった。また、 DGPP1S、 DGPP1L、 DGPP2S、及び DGPP2Lタンパク質がヒト RA患者滑膜組織の血管内皮にお Vヽて発現亢進してヽること、 RA病態を特徴づける組織で発現亢進してヽることを見出した（実施例 1、実施例 4)。更に、血管内皮での DGPP1S及び DGPP1Lの発現抑制が、血管内皮増殖抑制をもたらすことを見出した (実施例 6)。関節リウマチでは滑膜組織における血管新生は病態進行に関与すると考えられている。前記知見に基づき、 DGPP1ポリペプチドを抑制する物質及び Z又は DGPP2ポリペプチドを抑制する物質を選択することにより関節リウマチ治療薬をスクリーニングする方法を確立して提供した。 DGPP1ポリペプチドを抑制する siRNAを提供し、本発明を完成させた。

[0011] すなわち、本発明は、

[1]試験物質が、（1)配列番号 2、配列番号 2の第 50— 313番、配列番号 4及び Z 又は配列番号 4の第 21— 291番で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、 (2) 配列番号 2の第 50— 313番及び Z若しくは配列番号 4の第 21— 291番で表されるアミノ酸配列又は配列番号 2の第 50— 313番及び Z若しくは配列番号 4の第 21— 2 91番で表されるアミノ酸配列において 1一 10個のアミノ酸が欠失、置換、及び Z若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ脱リン酸酵素活性を有するポリペプチド、あるいは（3)配列番号 2又は配列番号 4で表されるアミノ酸配列との同一性が 90%以上であるアミノ酸力なり、かつ脱リン酸酵素活性を有するポリペプチド

を抑制するか否かを分析する工程を含む、関節リウマチ治療薬のスクリーニング方法 [2]抑制が発現抑制である、 [1]に記載のスクリーニング方法、

[3]抑制が脱リン酸酵素活性抑制である、 [1]に記載のスクリーニング方法、

[4]前記分析工程で選択された試験物質が、関節リウマチ治療活性を有するか否かを確認する工程を更に含む、 [1]一 [3]のいずれか 1つに記載のスクリーニング方法

[5] (1) [1]に記載のポリペプチド、 (2) [1]に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は（3) [1]に記載のポリペプチドを発現している細胞を含む関節リウマチ治療薬スクリーニングツール、

[6] (1) [1]に記載のポリペプチド、 (2) [1]に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は（3) [1]に記載のポリペプチドを発現している細胞の関節リウマチ治療薬スクリーニングのための使用、

[7] [1]一 [4]のいずれか 1つに記載の分析工程及び Z又は確認工程、並びに製剤化工程を含む、関節リウマチ治療用医薬組成物の製造方法、

[8] [ 1 ]— [4]の、ずれか 1つに記載のスクリーニング方法で得ることができる物質を有効成分とする、関節リウマチ治療用医薬組成物、

[9] [1]に記載のポリペプチドを抑制する物質を有効成分とする、関節リウマチ治療用医薬組成物、

[10] [1]に記載のポリペプチドを抑制する物質を、関節リウマチの治療が必要な対象に有効量で投与することを含む、関節リウマチ治療方法、

[11] [1]に記載のポリペプチドを抑制する物質の、関節リウマチ治療用医薬組成物製造のための使用、

[12]配列番号 1に記載の塩基配列の NAに続く 19一 21塩基力なる、配列番号 1 で表される塩基配列力なるポリヌクレオチドに特異的な塩基配列に基づいて設計される siRNA、

[13]二重鎖 RNA部分が、配列番号 32で表される塩基配列、又はそのセンス鎖の 3' 末端が 1若しくは 2塩基欠失した塩基配列カゝらなる siRNA、

[14] [12]又は [13]に記載の siRNAを有効成分とする、関節リウマチ治療用医薬組成物

に関する。

[0012] 本明細書において「脱リン酸酵素活性を有する」とは、リン酸含有物質末端のリン酸残基を遊離させる活性を有することを、う。あるポリペプチドが「脱リン酸酵素活性を有する」か否かは、特に限定されるものではないが、標識されたリン酸含有物質、例えば末端リン酸基が標識されたジァシルグリセロールピロリン酸の末端リン酸基が遊離されることを検出すること（Toke D.A et al J. Biol. Chem. 1998 (273) p3278-p3284 )、又は未標識のリン酸含有物質、例えばジァシルグリセロールピロリン酸の末端リン酸基が遊離されることを検出することで確認することができる。より好ましくは、実施例 3に記載の方法により、確認することができる。リン酸含有物質としては、より好ましくはジァシルグリセロールピロリン酸を用いることができる。

[0013] 「増殖抑制活性を有する」とは、所定の細胞集団において、細胞数の増加が抑制されることを意味する。「増殖抑制活性を有する」か否かは、例えば、実施例 6に記載の方法で確認することができる。好ましくは、所定の細胞集団における細胞数の増加が抑制されるとは、この集団における細胞数が、少なくとも約 10%、好ましくは少なくとも 20%、より好ましくは少なくとも 40%、更に好ましくは少なくとも約 50%、コントロールの集団における細胞数と比して少ないことを意味する。

[0014] 「本明細書のポリペプチドを抑制する物質」としては本明細書のポリペプチドのうち DGPP1Sタンパク質及び DGPP1Lタンパク質を抑制する物質がより好まし!/、。「本明細書のポリペプチドを抑制する物質」としては、「本明細書のポリペプチドの発現を抑制する物質」と「本明細書のポリペプチドの機能を抑制する物質」が含まれるが、「本明細書のポリペプチドの発現を抑制する物質」が好ましぐ DGPP1Sタンパク質及び DGPP1Lタンパク質の発現を抑制する物質が更に好ましい。また、「関節リウマチ治療用医薬組成物」としては、本明細書のポリペプチドを抑制する物質 (好ましくは、 DGPP1Sタンパク質及び DGPP1Lタンパク質を抑制する物質)を有効成分とする関節リウマチ治療用医薬組成物がより好ま、。

[0015] 本明細書において、「siRNA」とは、小分子量干渉 RNA (small

interfering RNA)を意味する。 siRNAは、二重鎖の RNA部分と、好ましくはセンス鎖及びアンチセンス鎖の 3，末端のオーバーハングとからなり、 RNA干渉（RNAi;RNA interference)と呼ばれる配列特異的な遺伝子発現抑制を誘導する（Fire, A.等， Nature, 391, 806-811, 1998)。本発明の siRNAとしては、配列番号 6で表される塩基配列からなるセンス鎖と、配列番号 7で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖とからなる siRNAがより好まし!/、。

[0016] 本明細書における「関節リウマチ治療薬」には、関節リウマチである患者の治療のために使用する薬剤と、関節リウマチ傾向にある対象に予防的に使用する薬剤との両方が含まれる。

[0017] 本発明で用いることのできる DGPP1L及び DGPP1Sと同一の配列は知られていない。これらと相同性のある配列が、データベース genpeptに BC033025

(2002.6.24)として収載されているがその機能については不明であり、 DGPP1L及び DGPP1Sが RA治療薬のスクリーニングツールとして有用であること、この知見を利用した RA治療薬のスクリーニング方法は本発明者らが初めて見出した知見である。

[0018] 本発明で用いることのできる DGPP2Lと同一の配列は知られていないが、 DGPP2Sと同一の配列が特許文献 1に記載されて、る。 DGPP2S及び DGPP2Lと相同性のある配列が特許文献 2及び特許文献 3に記載されている。このうち特許文献 1の要約中には、 DGPP2Lと相同性のある配列（DGPP2Sと同一の配列）は悪性腫瘍、血液疾患、 HIV感染、免疫性疾患および種々の炎症の診断、処置に有用であると記載されている。特許文献 2には DGPP2L及び DGPP2Sと相同性のある配列を含む多数の配列が開示され、これらのポリペプチドは過増殖性疾患のような腫瘍性疾患を含む疾患の診断、治療、予防 Z予後に有用であること、神経性疾患、免疫系疾患、筋疾患、生殖性疾患、消化関係の疾患、肺疾患、循環器疾患、又は腎疾患のような疾患の治療にも有用であること、当該ポリペプチドの異常な発現や活性と関わる疾患の検査薬として有用であり、癌や慢性関節リウマチの処置に有用であることが記載されている。し力しながら、これら多数の配列のうち、どの配列のものがどの用途に用いることができる力の具体的開示はなぐまた、実際に行った実施例もない。

[0019] 特許文献 3には DGPP2L及び DGPP2Sと相同性のある配列を含む多数の配列が開示され、過増殖性疾患 (例えば癌）、免疫不全性疾患 (例えば AIDS)、自己免疫疾患 (例えば関節炎）、神経性疾患 (例えばアルツハイマー病）、代謝異常 (例えばフ二ルケトン尿症）、炎症性疾患 (例えば喘息）、循環器病（例えばァテローム性動脈硬化症）、血液疾患 (血友病）、生殖性疾患 (例えば不妊症)及び感染症 (例えばインフルェンザ)等の検査、処置、予防または予後に有用であると記載されている。し力しながら、特許文献 3には具体的な実施例の記載はおろ力、これらの用途の具体的な裏付けは全くな、。従って DGPP2L及び DGPP2Sが RA治療薬のスクリーニングツールとして有用であることは本発明者らが初めて見出した知見であり、更には、この知見を利用した RA治療薬のスクリーニング方法は本発明者らが初めて行った発明である。発明の効果

[0020] 本発明のスクリーニング方法によれば、関節リウマチの治療薬として有用な物質を得ることができる。本発明のスクリーニング方法で得られた物質は、本明細書のポリべプチドを発現抑制することにより血管新生を抑制するという全く新たな作用機序に基づく関節リウマチ治療剤として有用である。

また、本発明の siRNAは、本発明の関節リウマチ治療用医薬組成物の有効成分として有用である。

図面の簡単な説明

[0021] [図 1]293T細胞での DGPP1S、 DGPP1L、 DGPP2S及び DGPP2Lタンパク質発現を示した図面である。

[図 2]RA滑膜線維芽様細胞サンプル又は OA滑膜線維芽様細胞サンプルにおける DGPP1及び DGPP2遺伝子の発現を比較した結果を示すグラフである。

[図 3]DGPP1Sタンパク質及び DGPP1Lタンパク質の脱リン酸酵素活性の結果を示すグラフである。斜線のバーはジァシルグリセロールピロリン酸を添加しない場合、黒塗りのバーはジァシルグリセロールピロリン酸を添カ卩した場合の結果を示す。図の縦軸は 624nmの吸光度を示す。

[図 4]DGPP2Sタンパク質及び DGPP2Lタンパク質の脱リン酸酵素活性の結果を示すグラフである。斜線のバーはジァシルグリセロールピロリン酸を添加しない場合、黒塗りのバーはジァシルグリセロールピロリン酸を添カ卩した場合の結果を示す。図の縦軸は 624nmの吸光度を示す。 [図 5]微小血管内皮細胞に各種 siRNA導入して、 24、 48、 72時間後の DGPP1Sタンパク質及び DGPP1Lタンパク質特異的な siRNA導入による DGPP1Sタンパク質及び DGPP1Lタンパク質の相対的な発現の結果を示すグラフである。縦軸は DGPP1Sタンノク質及び DGPP1Lタンパク質の相対的な発現度（％)を、横軸はトランスフエクシヨンした後の時間 (hr)を示す。

[図 6]図 5に示す条件での生細胞数を計測した結果を示すグラフである。縦軸は生細胞数（X 10⁴)を、横軸はトランスフエクシヨンした後の時間 (hr)を示す。ひし形マークはコントロール _siRNA、黒塗り四角マークは DGPP1Sタンパク質及び DGPP1Lタンパク質特異的 siRNAをトランスフエクシヨンした場合の結果を示す。

発明を実施するための最良の形態

[0022] 以下に本発明について詳細に説明する。本明細書における遺伝子操作技術は特に断りのない限り「Molecular CloningJ Sambrook, Jら、 Cold Spring

Harbor Laboratory Press, 1989年等の公知技術に従って実施可能であり、タンパク質操作技術は特に断りのない限り「タンパク実験プロトコール」（秀潤社、 1997年)等の公知技術に従って実施可能である。

[0023] く本発明のスクリーニングツール及びスクリーニングのための使用 >

本発明には、

(1) (i)本明細書のポリペプチド、すなわち DGPP1Lタンパク質、 DGPP1Sタンパク質、 DGPP1機能的等価改変体 (配列番号 2で表されるアミノ酸配列の第 50— 313番ある、は配列番号 2の第 50— 313番で表されるアミノ酸配列において、 1一 10個 (好ましくは 1 一 7個、より好ましくは 1一 5個、更に好ましくは 1一 3個)のアミノ酸が欠失、置換、及び Z若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ脱リン酸酵素活性を有するポリぺプチド）、 DGPP 目同ポリペプチド (配列番号 2で表されるアミノ酸配列で表されるァミノ酸配列との同一性が 90%以上 (好ましくは 95%以上、更に好ましくは 98%以上)であるアミノ酸配列力なり、かつ脱リン酸酵素活性を有するポリペプチド）（以下、 DGPP1ポリペプチド型スクリーニングツールと称する）、

DGPP2Lタンパク質、 DGPP2Sタンパク質、 DGPP2機能的等価改変体（配列番号 4で表されるアミノ酸配列の第 21— 291番あるいは配列番号 4の第 21— 291番で表されるアミノ酸配列において、 1一 10個 (好ましくは 1一 7個、より好ましくは 1一 5個、更に好ましくは 1一 3個)のアミノ酸が欠失、置換、及び Z若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ脱リン酸酵素活性を有するポリペプチド)並びに Zあるいは DGPP2相同ポリペプチド (配列番号 4で表されるアミノ酸配列との同一性が 90%以上 (好ましくは 95 %以上、更に好ましくは 98%以上)であるアミノ酸配列力なり、かつ脱リン酸酵素活性を有するポリペプチド）（DGPP2ポリペプチド型スクリーニングツールと称する）、 (以下、 DGPP1ポリペプチド型スクリーニングツール及び DGPP2ポリペプチド型スクリ一ユングツールを本発明のポリペプチド型スクリーニングツールと称する）、

(ii)本明細書のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、本発明のポリヌクレォチド型スクリーニングツールと称する）、あるいは

(iii)本明細書のポリペプチドを発現している細胞（以下、本発明の細胞型スクリー- ングツールと称する）

力もなる関節リウマチ治療薬スクリーニングツール、

(2) (i)本明細書のポリペプチド、

(ii)本明細書のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は

(iii)本明細書のポリペプチドを発現して、る細胞

の関節リウマチ治療薬スクリーニングのための使用

が含まれる。

[0024] 本明細書において、「スクリーニングツール」とは、スクリーニングの為に用いる物（具体的には、スクリーニングの為に用いるポリペプチド、ポリヌクレオチド又は細胞）をいう。「関節リウマチ治療薬スクリーニングツール」とは、関節リウマチ治療薬をスクリーユングするために、本発明のスクリーニング方法において、試験化合物を接触させる対象となる細胞、ポリヌクレオチド又はポリペプチドである。当該ポリペプチド、ポリヌクレオチド又は細胞の、関節リウマチ治療薬スクリーニングのための使用も本発明に含まれる。

[0025] DGPP1機能的等価改変体及び DGPP2機能的等価改変体の起源はヒトに限定されない。例えば、配列番号 2又は配列番号 4で表されるアミノ酸配列のヒトにおける変異体が含まれるだけでなぐ前述の（i)の本発明のポリペプチド型スクリーニングツールであるポリペプチドのいずれかに該当する限り、ヒト以外の他の脊椎動物（例えばマウス、ラット、ゥサギ、ゥマ、ヒッジ、ィヌ、サル、ネコ、クマ、ブタ、 -ヮトリなど）由来のものも含まれる。更には、前述の（i)の本発明のポリペプチド型スクリーニングツールであるポリペプチドいずれかに該当する限り、天然ポリペプチドに限定されず、配列番号

2又は配列番号 4で表されるアミノ酸配列を元にして遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチドも含まれる。

[0026] なお、本明細書における前記「同一性」とは、 BLASTパッケージ [sgi32bit版,パージヨン 2.0.12;National Center for

Biotechnology Information(NCBI)より入手]の bl2seqプログラム (Tatiana

A . Tatus ova , Thomas

L.Madden.FEMS Microbiol丄 ett., 174,247- 250,1999)を用いて得られた値を意味する

。なお、パラメーターでは、ペアワイズアラインメントパラメータ一として、

「プログラム名」として「blastp」を、

「Gap挿入 Cost値」を「0」で、

「Gap伸長 Cost値」を「0」で、

「Matrix」として「BLOSUM62」を、

それぞれ使用する。

[0027] DGPP1機能的等価改変体には、配列番号 2で表されるアミノ酸配列又は配列番号 2で表されるアミノ酸配列において 1一 10個のアミノ酸が欠失、置換、及び Z若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ脱リン酸酵素活性を有するポリペプチドが含まれ、 DGPP2機能的等価改変体には、配列番号 4で表されるアミノ酸配列又は配列番号 4で表されるアミノ酸配列において 1一 10個のアミノ酸が欠失、置換、及び Z若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ脱リン酸酵素活性を有するポリペプチドが含まれる。

[0028] 本発明のポリペプチド型スクリーニングツールとしては DGPP1ポリペプチド (特に好ましくは DGPP1Lタンパク質又は DGPP1Sタンパク質）及び Z又は DGPP2ポリペプチド (特に好ましくは DGPP2Lタンパク質又は DGPP2Sタンパク質）、本発明のポリヌクレオチド型スクリーニングツールとしては DGPP1ポリペプチド（特に好ましくは DGPP1Lタンパク質又は DGPP1Sタンパク質)及び Z又は DGPP2ポリペプチド (特に好ましくは DGPP2Lタンパク質又は DGPP2Sタンパク質）をコードするポリヌクレオチド（最も好ましくは配列番号 1で表される塩基配列、配列番号 1で表される塩基配列の第 148— 93 9番、配列番号 2で表される塩基配列、及び Z又は配列番号 2で表される塩基配列の第 61— 873番）、本発明の細胞型スクリーニングツールとしては DGPP1ポリべプチド（特に好ましくは DGPP1Lタンパク質又は DGPP1Sタンパク質)及び Z又は DGPP2ポリペプチド（特に好ましくは DGPP2Lタンパク質又は DGPP2Sタンパク質）を発現してヽる細胞が好ましい。

[0029] 本明細書のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本明細書に開示された配列情報に基づ、て一般的遺伝子工学的手法により容易に製造し取得することが出来る。

本明細書のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば次のように得ることができるが、この方法に限らず公知の操作「Molecular CloningJ [Sambrook, Jら、 Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989年、等]でも得ることができる。

[0030] 例えば、（1) PCRを用いた方法、（2)常法の遺伝子工学的手法 (すなわち cDNAライブラリーで形質転換した形質転換株から所望のアミノ酸を含む形質転換株を選択する方法)を用いる方法、又は（3)化学合成法などを挙げることができる。各製造方法については、 WO01/34785号に記載されているのと同様に実施できる。

[0031] PCRを用いた方法では、例えば、 WO01/34785の「発明の実施の形態」 1)タンパク質遺伝子の製造方法 a)第 1製造法に記載された手順により、本明細書のポリべプチドをコードするポリヌクレオチドを製造することができる。該記載において、「本発明のタンパク質を産生する能力を有するヒト細胞あるいは組織」とは、例えば、ヒト滑膜組織、ヒト滑膜線維芽様細胞を挙げることができる。ヒト滑膜細胞又はヒト滑膜線維芽様細胞から mRNAを抽出する。次いで、この mRNAをランダムプライマー又はオリゴ dTプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行い、第一鎖 cDNAを合成することが出来る。得られた第一鎖 cDNAを用い、目的遺伝子の一部の領域をはさんだ 2種類のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)に供し本明細書のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその一部を得ることができる。より具体的には、例えば参考例 1 に記載の方法により本明細書のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを製造することが出来る。

[0032] 常法の遺伝子工学的手法を用いる方法では、例えば、 WO01/34785の「発明の実施の形態」 1)タンパク質遺伝子の製造方法 b)第 2製造法に記載された手順により、本明細書のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを製造することができる。

化学合成法を用いた方法では、例えば、 WO01/34785の「発明の実施の形態」 1)タンパク質遺伝子の製造方法 c)第 3製造法、 d)第 4製造法に記載された方法によって、本明細書のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを製造することができる。

[0033] 本明細書のポリペプチド、本明細書のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された細胞は、例えば、 WO01/34785の「発明の実施の形態」 2)本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明の組換え蛋白の製造方法に記載された方法により実施できる。単離された本明細書のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、適当なベクター DNAに再び組込むことにより、真核生物又は原核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。また、これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現させることが可能である。

[0034] 本明細書のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された細胞作製用の発現ベクターは、本明細書のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなぐ例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、本明細書のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入することにより得られる発現ベクターを挙げることができる。

[0035] 本発明の細胞型スクリーニングツール (すなわち本発明のポリペプチドを発現している細胞）には、内在性に (天然に)本発明のポリペプチドを発現している細胞及び本明細書のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された細胞の両方が含まれる力本明細書のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換され、本明細書のポリペプチドを発現して、る細胞がより好ましい。本発明の細胞型スクリーニングツールのうち本明細書のポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された細胞は、前記発現ベクターでトランスフエクシヨンされ、本明細書のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなぐ例えば、本明細書のポリべプチドをコードするポリヌクレオチド力 S、宿主細胞の染色体に組み込まれた細胞であることもできるし、あるいは、本明細書のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの形で含有する細胞であることもできる。本発明の細胞型スクリーニングッールは、例えば、前記発現ベクターにより、所望の宿主細胞をトランスフエクシヨンすることにより得ることができる。より具体的には、例えば、参考例 2に記載のように本明細書のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをほ乳類動物細胞用の発現べクタ一 pcDNA3.1に組み込むことにより、所望のタンパク質の発現ベクターを得ることができ、該発現ベクターを市販のトランスフエクシヨン試薬リポフエクトァミンを用いてヒト胎児腎臓由来 293T細胞に取り込ませて本明細書のポリペプチドをコードするポリヌクレォチドを含む発現ベクターで形質転換された細胞を製造することができる。

[0036] 上記で得られる所望の形質転換細胞は、常法に従!、培養することができ、該培養により本明細書のポリペプチドが生産される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば上記 293T細胞であれば牛胎児血清 (FBS)等の血清成分を添加したダルベッコ修飾イーグル最小必須培地 (DMEM)等の培地に G418をカ卩えたものを使用できる。

[0037] 又は、例えば、実施例 2に記載のように本明細書のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを昆虫細胞用の発現ベクター pFastBacに組み込むことにより、所望のタンノク質の発現ベクターを得ることができ、該発現ベクターを市販のトランスフエクシヨン試薬セルフエクチンを用いて昆虫細胞 (例えば Sf-9細胞）に取り込ませて本明細書のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現可能ならしめるウィルスを調製し、更に、昆虫細胞にそのウィルス感染させて本明細書のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された細胞を製造することができる。

[0038] 上記で得られる所望の細胞は、常法に従!、培養することができ、該培養により本明細書のポリペプチドが生産される。該培養に用いられる培地としては、採用した昆虫細胞種に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば Sf-9細胞であれば 0.5% Penicillin- Streptomycinをカ卩えた EX-CELL420培地を使用できる。上記により、形質転換細胞に生産される本明細書のポリペプチドは、該ポリべプチドの物理的性質や生化学的性質等を利用した各種の公知の分離操作法により、分離又は精製することができる。

[0039] 本明細書のポリペプチドはマーカー配列とインフレームで融合して発現させることで、該ポリペプチドの発現の確認、精製等が可能になる。マーカー配列としては、例えば、 FLAGェピトープ（epitope)、へキサヒスチジンタグ（Hexa- Histidine tag)、へマグルチンタグ (Hemagglutinin

tag)、 mycェピトープ（epitope)などがある。また、マーカー配列と前記ポリペプチドの間にェンテロキナーゼ、ファクター _Xa、トロンビンなどのプロテアーゼが認識する特異的なアミノ酸配列を挿入することにより、マーカー配列部分をこれらのプロテアーゼにより切断除去する事が可能である。

[0040] <本発明のスクリーニング方法 >

本発明のスクリーニング方法は、本明細書のポリペプチドを抑制する力否かを分析

(すなわち、検出又は測定)する工程を含む、関節リウマチ治療薬のスクリーニング方法である。本明細書のポリペプチドの「抑制」には、本明細書のポリペプチドの「発現抑制」及び「機能抑制」の両方が含まれる力「発現抑制」がより好ましい。

本明細書における「スクリーニング」とは、多数の試験物質の中から目的の活性を有する物質を篩い分けること、及び、或る試験物質について、その物質が目的の性質を有する物質である力否かを検出すること (すなわち、篩い分けること)の両方を含む

[0041] 本発明者らは、本明細書のポリペプチドに含まれる DGPP1Lタンパク質、 DGPP1Sタンパク質、 DGPP2Lタンパク質、及び DGPP2Sタンパク質は、 RA患者由来の滑膜線維芽様細胞において発現が亢進しており（実施例 1)、更にヒト RA滑膜組織のパンヌス形成及びその維持に関与すると考えられている血管新生を構成する血管内皮において発現亢進しており（実施例 4)、更に、 DGPP1Lタンパク質及び DGPP1Sタンパク質の発現を抑制すると微小血管内皮細胞の増殖が抑制されることを見出した (実施例 6 )。また、 DGPP1Lタンパク質、 DGPP1Sタンパク質、 DGPP2Lタンパク質、及び DGPP2S タンパク質は脱リン酸酵素活性を有することを見出した (実施例 3)。一般的に、発現抑制による細胞への生理的効果は、当該分子の活性の抑制によっても同様に起こることが認識されている。これらの知見により、本明細書のポリペプチドの活性及び Z 又は機能を抑制するか否力を分析する工程を含む関節リウマチ治療薬のスクリー- ング系を構築することができる。

[0042] 本明細書のポリペプチドを抑制する力否かを分析する工程としては、 DGPP1ポリべプチド及び Z又は DGPP2ポリペプチドを抑制するカゝ否かを分析する工程が含まれる力 DGPP1ポリペプチドを抑制するか否かを分析する工程が好ましい。試験物質のうち、本発明のポリペプチドを抑制する物質 (すなわち DGPP1ポリペプチド及び Z又は DGPP2ポリペプチドを抑制する物質）、好ましくは DGPP1ポリペプチドを抑制する物質、更に好ましくは DGPP1Lタンパク質及び DGPP1Sタンパク質を抑制する物質を選択することができる。

[0043] (1)本明細書のポリペプチドの発現を抑制するか否かを分析する工程

本明細書のポリペプチドをコードする mRNA、又は、本明細書のポリペプチドの発現を抑制する力否力を分析する工程を実施することにより、関節リウマチ治療薬のスクリ一-ングが可能である。具体的には、組織、細胞における本明細書のポリペプチドの発現量の変化を分析する工程を実施することによってスクリーニングすることができる

[0044] 本明細書のポリペプチドをコードする mRNA、又は、本明細書のポリペプチドが、特定の細胞にぉ、て産生される力否かを決定するために、多様な核酸技術及び免疫学的技術を使用することができる。

例えば、本明細書のポリペプチドを発現して、る任意のヒト細胞 (好ましくは RA滑膜組織、又は微小血管内皮細胞)を用い、試験物質の存在下若しくは非存在下で培養した後、細胞の抽出物を調製し、次いで、抽出物を分析することにより、前記試験物質が本明細書のポリペプチドの mRNA又はタンパク質の発現を減少若しくは抑制するか否力を分析する工程を実施することができる。すなわち、本明細書のポリペプチドを減少若しくは抑制する試験物質は、前記試験物質を含むサンプルに存在する本明細書のポリペプチドの mRNA並びにタンパク質の量を減少させるので、公知の分析方法、例えば、ノーザンブロット又は ELISA法 [例えば、 DGPP1ポリペプチド又は DGPP2ポリペプチドを認識する抗体をプレート等の固相に吸着させた後、そこに試験物質を含むサンプルを加え、次いで、先の抗体とは抗原ェピトープが異なる DGPP1 ポリペプチド又は DGPP2ポリペプチドを認識する抗体を加えて、後者の抗体の固相への結合度合ヽを分析する（Methods

in Enzymology, 118, 742-766, 1986) ]等で同定することができる。より具体的には、実施例 6に記載した方法で、本明細書のポリペプチドの発現抑制を分析することができる。本明細書のポリペプチドのうち、 DGPP1ポリペプチド及び Z又は DGPP2の発現抑制は、同時に分析することもできるし、いずれか一方を先に分析することもできる。

[0045] 本発明のスクリーニング方法は、例えば、 DGPP1ポリペプチド及び Z又は DGPP2ポリペプチドを発現してヽる細胞 (好ましくはヒト細胞）を、試験物質の存在下若しくは非存在下で培養する工程、並びに、試験物質存在下で培養した前記細胞における DGPP1ポリペプチド又は DGPP2ポリペプチドの mRNA又はタンパク質の量力試験物質非存在下で培養した前記細胞における量と比較して減少したカゝ否カゝを分析するェ程を含む。

[0046] 別の方法としては、プロモーター活性の阻害は下流の遺伝子の転写の抑制を生じる一般的事象に基づき、本明細書のポリペプチドのプロモーター領域を、レポーター遺伝子 (例えば、ルシフェラーゼ遺伝子）上流に連結した作動可能なベクターを作製し、外因的に導入した宿主細胞を利用し、試験物質の存在下若しくは非存在下におけるレポーター活性 (例えば、ルシフェラーゼ活性)を分析することにより、前記試験物質がレポーター遺伝子の発現を減少又は抑制するカゝ否かを分析する工程を実施することができる。

[0047] 前記ベクターとしては、例えば、本明細書のポリペプチドの開始コドン ATGの上流域をレポーター遺伝子上流に連結した組み換え DNAであって、し力も、一過的な複製、あるいは、宿主染色体への挿入を可能とするベクターを用いることができる。こうして外因的に得られた宿主細胞を試験物質の存在下又は非存在下で培養した後、細胞の抽出物を調製し、次いで、抽出物を分析することにより、前記試験物質が本明細書のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのプロモーター活性を減少又は抑制する力否かを決定することができる。本明細書のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのプロモーター活性を減少又は抑制する試験物質は、前記試験物質を含むサンプルに存在するレポーター活性の量を減少させるので、それを指標として同定することができる。

[0048] 本発明のスクリーニング方法は、例えば、本明細書のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子を連結したベクターで形質転換した細胞を、試験物質の存在下又は非存在下で培養する工程、並びに、試験物質存在下で培養した前記細胞におけるレポーター活性が、試験物質非存在下で培養した前記細胞と比較して減少したカゝ否かを分析する工程を含む。

[0049] (2)本明細書のポリペプチドの機能を抑制するか否力を分析する工程

本発明のスクリーニング方法には、本明細書のポリペプチドと試験物質と前記ポリペプチドの基質とを接触させる工程、及び、試験物質と接触させた前記ポリペプチドの脱リン酸酵素活性が、試験物質と非接触の時の活性と比較して減少した力否かを分析する工程を含むことを特徴とするスクリーニング方法が含まれる。

[0050] 本発明のスクリーニング法における脱リン酸酵素活性の分析は、特に限定されるものではないが、本明細書のポリペプチドによる、標識されたリン酸含有物質、例えば末端リン酸基が標識されたジァシルグリセロールピロリン酸の末端リン酸基が遊離されることを検出すること（Toke D.A et al J. Biol. Chem. 1998 (273) p3278- p3284)、又は未標識のリン酸含有物質、例えばジァシルグリセロールピロリン酸の末端リン酸基が遊離されることを検出することで行うことができる。より好ましくは、実施例 3に記載の方法により、確認することができる。リン酸含有物質として、より好ましくはジァシルグリセロールピロリン酸である。

[0051] 例えば、実施例 3に記載の条件で、 DGPP1Sタンパク質、 DGPP1Lタンパク質、

DGPP2Sタンパク質又は DGPP2Lタンパク質、基質、及び試験物質の存在又は非存在下で、 DGPP1Sタンパク質、 DGPP1Lタンパク質、 DGPP2Sタンパク質又は DGPP2L タンパク質の脱リン酸酵素活性を分析することにより、前記試験物質が DGPP1Sタンパク質、 DGPP1Lタンパク質、 DGPP2Sタンパク質又は DGPP2Lタンパク質の機能を減少若しくは抑制する力否かを分析することができる。すなわち、 DGPP1Sタンパク質、 DGPP1Lタンパク質、 DGPP2Sタンパク質又は DGPP2Lタンパク質の機能を減少若しくは抑制する試験物質は、前記試験物質を含むサンプルに存在する DGPP1Sタンパク質、 DGPP1Lタンパク質、 DGPP2Sタンパク質又は DGPP2Lタンパク質による遊離リン酸の量を減少させる。このようにして、 IC50=10 mol/L以下の物質を、好ましくは IC50=1 μ mol/L以下の物質を、更に好ましくは、 IC50=0.1 μ mol/L以下の物質を脱リン酸酵素阻害活性を有する物質として、選択することができる。

[0052] 前記項目（1)の本明細書のポリペプチドの発現を抑制する力否力を分析する工程、又は、前記項目（2)の本明細書のポリペプチドの機能を抑制する力否力を分析する工程を含む本発明のスクリーニング方法でスクリーニングすることのできる試験物質は、特に限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル'ケミストリー技術 (Tetrahedron, 51, 8135-8137, 1995)によって得られた化合物群、あるいは、ファージ 'ディスプレイ法 (J.

Mol. Biol, 222, 301-310, 1991)などを応用して作成されたランダム ·ペプチド群を用いることができる。また、微生物の培養上清、植物若しくは海洋生物由来の天然成分、又は動物組織抽出物などもスクリーニングの試験物質として用いることができる。更には、本発明のスクリーニング方法により選択された化合物 (ペプチドを含む)を、化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を用いることができる。

[0053] 本発明のスクリーニング方法では、本明細書のポリペプチドを抑制する力否かを分祈し、本明細書のポリペプチドを抑制する試験物質を選択した後、選択された試験物質が、関節リウマチ治療活性を有することを確認する工程を更に含むことが好ましい。関節リウマチ治療活性を有することを確認する工程としては、公知の評価方法、例えば、以下のような抗炎症作用を分析する方法を実施する工程が挙げられる。

[0054] 抗炎症作用は、小動物での関節リウマチ実験モデルに試験物質を投与して「炎症の改善」を分析することによって確認することができる。

小動物としては、例えば、マウス、ラットなどを使用することができ、関節リウマチ実験モデルとしては、 II型コラーゲン誘発関節炎モデル、アジュバント誘発関節炎モデルなどが利用可能である [「関節炎モデル」（2000年）日本医学館監修京極方久

] o 「炎症」とは、物理的、化学的、又は生物学的な要因による損傷や刺激に対する生体の免疫反応の結果生ずる現象であり、多くの場合、炎症組織における痛み、熱感、発赤、腫脹を引き起こし、さらに炎症組織の機能抑制又は機能喪失を生ずることもある。

「改善」とは、治療的効果が示されることを意味し、例えば、小動物での関節リウマチ動物モデルに前記試験物質を投与又は摂取させることにより、病的な症状を緩和若しくは消失させる力又はその症状の悪ィ匕を抑制することを意味する。「病的な症状」とは炎症反応と関連する症状、障害又は検出可能な生体内の変化を意味し、限定するものではないが、腫脹、関節変形等の炎症反応に伴う症状、 CRP (C-rea_Cti_ve protein ;C反応性タンパク質）、炎症性サイト力イン、抗 DNA抗体の検査値の急激な増加等の炎症反応の指標が挙げられる。「炎症の改善」とは、前記試験物質を小動物での関節リウマチ実験モデルに投与又は摂取させた結果、炎症反応を緩和若しくは消失させる力、又はその炎症反応の悪ィ匕を抑制する作用を意味する。例えば、前記試験物質を II型コラーゲン誘発関節炎モデルマウスに投与した後、該マウスにおける四肢の腫脹の程度、後肢のフットパッドの厚さ、炎症性サイト力イン値、 II型コラーゲンに対する抗体価等を経時的に測定することにより、「炎症の改善」を評価することができる。

[0055] また、前記試験物質の「炎症の改善」効果の確認は、上記のような小動物での実験動物モデルを使用する方法の他、市販の様々な検査薬を使用して行うこともできる。例えば、そのような検査薬としては、抗核抗体検査試薬、抗 DNA抗体検査試薬、慢性リウマチ検査試薬、抗甲状腺抗体検査試薬、自己抗体陽性血清等の自己免疫疾患検査試薬、 CPR(C反応性タンパク質)定量用試薬、サイト力イン測定試薬等が挙げられる [「膠原病'リウマチ診断」（2000年)メジカルビユー社監修鎌谷直之」。

[0056] <本発明の関節リウマチ治療用医薬組成物、及びその製造法 >

く本発明のスクリーニング方法〉に記載の方法による分析工程、及び製剤化工程を含む、関節リウマチ治療用医薬組成物の製造方法も本発明に含まれる。また、本明細書のポリペプチドを抑制する物質の関節リウマチ治療用医薬組成物製造のための使用も本発明に含まれる。本発明の医薬組成物の有効成分は、本明細書のポリペプチドを抑制する物質である限り、特に限定されるものではない。これらは、例えば、本発明のスクリーニング方法と同様の工程で、本明細書のポリペプチドを抑制する物質を選択することにより得ることができる。そのような物質としては、例えば、 siRNA、タンパク質 (抗体又は抗体断片を含む）、ペプチド、又はそれ以外の化合物が挙げられる。

[0057] 本発明の医薬組成物の有効成分として例示される siRNAは、二重鎖の RNA部分と、好ましくはセンス鎖及びアンチセンス鎖の 3，末端のオーバーハングと力もなり、 RNAi を誘導する。 RNAiは進化的に保存された現象で、 RNaselllエンドヌクレアーゼによつて生じる 21— 23塩基の siRNAを介して起こる（Genes

Dev. 15, 485-490, 2001)。その 21— 23塩基の siRNA間には、効果に差はあるもののいずれも RNAi効果を示す。また、 3'側のオーバーハングはそれぞれ 1又は 2塩基の任意の核酸 (リボ核酸又はデォキシリボ核酸)であるが、 2塩基が好ましぐ標的に相補した塩基が好まヽが、相補して、なヽものでも充分な RNAi効果が認められる（ EMBO.

J., 20, 6877-7888, 2001; Genes Dev., 15, 188-200, 2001)。また、オーバーハングがな!ヽ siRNAも RNAi効果を示す。

なお、前記塩基数 (21— 23塩基）は、オーバーハングを含むセンス鎖又はアンチセンス鎖の各々の塩基数である。また、センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ塩基数であることもできるし、異なる塩基数であることもできるが、同じ塩基数であることが好ましい。

[0058] siRNAの 3'側オーバーハングを構成するリボ核酸としては、例えば、 U (ゥリジン）、 A

(アデノシン）、 G (グアノシン）、又は C (シチジン）を用いることができ、 3，側のオーバ一ハングを構成するデォキシリボ核酸としては、例えば、 dT (チミジン）、 dA (デォキシアデノシン）、 dG (デォキシグアノシン）、又は dC (デォキシシチジン）を用いることができる。

[0059] 本発明の医薬組成物の有効成分として用いることのできる、本発明の siRNAには、本明細書のポリペプチドの発現を特異的に抑制することのできる siRNA (以下、本明細書のポリペプチド特異的な siRNAと称する）が含まれる。 [0060] 本明細書のポリペプチド特異的な siRNAは、本明細書のポリペプチドをコードする塩基配列に特異的な DNA塩基配列 (好ましくは 21塩基一 23塩基からなる塩基配列）に基づいて設計され、本明細書のポリペプチドの発現を特異的に抑制することのできる siRNAである限り、特に限定されるものではなぐ常法 (例えば、 J.

Am. Chem. Soc, 120, 11820—11821, 1998;及び Methods, 23, 206-217, 2001)により製造することができる。より具体的には、本明細書のポリペプチドに特異的な DNA塩基配列は、例えば、以下の手順により選択することができる。すなわち、本明細書のポリペプチドの開始コドン力 50塩基以上下流の最初の NAを見つける（転写因子の結合部位を避けるため）。 NAに続く 19一 21の塩基配列を記録し、 NAを含む 21— 23塩基の GCコンテントを計算し、 50%前後であることを確認する。 GCコンテントが 30%以下や 70%以上である場合、あるいは、 50%前後であっても複数の候補が必要な場合には、更に下流の NAを選択し、同様にして GCコンテントを計算する。得られた塩基配列候補について、データベース検索を実施し、本明細書のポリペプチドに特異的であることを確認する。 Nは、 A、 T、 G、又は Cの何れであってもよぐ実施例 5で作製した siRNAの場合のように Aであることが好まし!/、。

[0061] なお、本明細書のポリペプチドに特異的であるか否かは、例えば、 National

し enter for Biotechnology Information(Nし BI)の BLA¾ i，(Basic local alignment search tool; J. Mol. Biol, 215, 403-410, 1990)サーチで本明細書のポリペプチドとは完全に一致する力他には完全に一致する配列が存在しないことにより確認することができる。

siRNAを設計するための DNA塩基配列が得られると、その配列に基づ!/、て siRNAを設計することができる。例えば、二重鎖 RNA部分が、得られた DNA塩基配列をそのまま RNA配列に変換した RNA塩基配列からなる、 siRNAを設計することができる。なお、本明細書において、 DNA塩基配列を RNA塩基配列に変換するとは、 DNA塩基配列における dTを Uに変換し、それ以外の塩基、すなわち、 dA、 dG、及び dCを、それぞれ、 A、 G、及び Cに変換することを意味する。

[0062] 本明細書のポリペプチドに特異的な塩基配列の例としては、例えば、配列番号 5で表される塩基配列を挙げることができる。配列番号 5で表される塩基配列に基づいて設計される、本明細書のポリペプチド特異的な siRNAとしては、例えば、二重鎖 RNA部分力配列番号 32で表される塩基配列、又はそのセンス鎖の 3'末端が 1若しくは 2塩基欠失した塩基配列力なる siRNA を挙げることができる。

[0063] これらの本明細書のポリペプチド特異的な siRNAには、例えば、センス鎖及び Z又はアンチセンス鎖の 3 '末端に、それぞれ独立して、 1又は 2塩基の任意の核酸 [例えば、リボ核酸 (U、 A、 G、若しくは C等)又はデォキシリボ核酸 (dT、 dA、 dG、若しくは dC等） ]が付加されたオーバーハングを有する siRNA、並びにオーバーハングを有しない siRNAが含まれる。なお、センス鎖及びアンチセンス鎖（オーバーハングを有する場合には、それを含む）は、同じ塩基数であることもできるし、異なる塩基数であることもできるが、同じ塩基数であることが好ましい。

前記オーバーハングとしては、センス鎖及び Z又はアンチセンス鎖の 3 '末端に、それぞれ独立して、 1又は 2塩基の任意の核酸が付加されたオーバーハングが好まヽ

[0064] 本発明の DGPP1ポリペプチド特異的な siRNAとしては、配列番号 6で表される塩基配列からなるセンス鎖と、配列番号 7で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖とからなる siRNAが特に好ま、。配列番号 6で表される塩基配列からなるセンス鎖及び配列番号 7で表される塩基配列力なるアンチセンス鎖は、それぞれ、第 1番目一第 19番目の塩基力なる RNA二重鎖を形成し、第 20番目及び第 21番目が 3'側ォーバーハングを形成する。

[0065] 本発明の医薬糸且成物の有効成分としては、例えば、アンチセンスポリヌクレオチド（ DNA及び RNAを含む）を用いることができる。

アンチセンスポリヌクレオチドを設計及び作製する方法は、周知であり (J. Am. Chem. So ， 103: 3185-3191, 1981)、まず、例えば、 NCBIの BLASTサーチで本明細書のポリペプチド特異的な配列 (例えば、配列番号 5で表される塩基配列）を選択し、それに対するアンチセンスポリヌクレオチドを、本発明の医薬組成物の有効成分として用いることができる。

[0066] 本発明の医薬組成物は、前記有効成分のタイプに応じて、非経口経路 (例えば、皮下経路、静脈内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、経皮経路、又は頰内経路)を介して投与することができる。あるいは、又は同時に、経口経路によって投与することもできる。投薬量は、レシピエントの年齢、健常度、及び体重、同時処置される種類 (もしあれば）、処置の頻度、並びに所望される効果の性質に依存する。各成分の有効な量の至適な範囲の決定は、当業者の範囲内である。典型的な投薬量は 0.1— 100mg/kg体重であり、好ましい投薬量は、 0.1— 10mg/kg体重であり、最も好ましい投薬量は、 0.1— lmg/kg体重である。薬理学的に活性な薬剤に加えて、本発明の組成物は、薬学的に受容可能な適切なキャリアーを含むことができ、これには、作用の部位に到達するために薬学的に使用可能な、調製物への活性な化合物のプロセシングを容易にする賦形剤及び Z又は補助剤を含む。

[0067] 非経口投与のために適切な処方物は、水溶性形態の活性化合物（例えば、水溶性の塩)の水溶液を含む。更に、適切な油性の注入懸濁液としての活性ィ匕化合物の懸濁液が投与可能である。適切な親油性溶媒又はべヒクルは、脂肪油又は合成の脂肪酸エステルを含む。水溶性注入懸濁液は、懸濁液の粘度を増加する物質を含むことができる。必要に応じて懸濁液は安定剤を含むことができる。リボソームも、細胞への送達のために、薬剤をカプセルィ匕するために使用することができる。本発明に従う全身投与についての薬学的組成物は、腸投与、非経口投与、又は局所投与について処方することができる。実際、処方物の全ての 3つのタイプは、有効成分の全身性投与を達成するために同時に使用することができる。

[0068] 経口投与のための適切な処方物は、堅質又は軟質ゼラチンカプセル、丸剤、錠剤、エリキシル、懸濁液、シロップ、又は吸入薬、及びそれらの制御された放出形態を含む。本発明の医薬組成物は、単独で、又は組み合わせで、あるいは、他の治療剤又は診断剤と組み合わせて使用することができる。特に好まし、実施形態にぉ、て、本発明の医薬組成物は、一般的に受容されている医療の実施に従って、これらの状態について典型的に処方される他の化合物とともに投与することができる。

[0069] <本発明の治療方法 >

本明細書のポリペプチドを抑制する物質を投与することを含む、関節リウマチ治療方法も本発明に含まれる。このような治療としては、前記本発明の関節リウマチ治療用医薬組成物を投与する治療や、以下の遺伝子治療を挙げることができる。

[0070] <遺伝子治療 >

関節リウマチの治療において、本明細書のポリペプチド発現の調節因子をコードする遺伝子発現単位 (例えば、配列番号 5で表される塩基配列に対するアンチセンス分子又は siRNA分子）を、処置される被験体に導入することにより、遺伝子治療をすることができる。このような調節因子は、細胞又は特定の標的細胞で、構成的に継続的に産生させることもできるし、あるいは、誘導性とすることもできる。

[0071] 具体的には、前記アンチセンス分子、又は siRNA分子 (例えば、配列番号 6で表される塩基配列からなるセンス鎖と配列番号 7で表される塩基配列力なるアンチセンス鎖とからなる siRNA)を作製するための方法は、当該分野において周知である (J. Am. Chem. Soc, 103: 3185-3191, 1981)。

配列番号 5で表される塩基配列に対するアンチセンス分子を含む組み換え DNAを作製する方法は、当該分野において周知であり（「Molecular

し loning A Laboratory ManualJ , Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989等 J、好ましい組み換え DNAにおいて、配列番号 5で表される塩基配列は、発現制御配列及び Z又はベクター配列に作動可能に連結することができる。前記ベクターは、配列番号 5で表される塩基配列を含む組み換え DNAの複製、あるいは、宿主染色体への挿入を少なくとも可能とし、遺伝子治療に用いることができる。

更に、本発明では、配列番号 5で表される塩基配列に対するアンチセンスを含む組み換え DNAを外因的に導入した宿主細胞を提供し、これも遺伝子治療に用いることができる。宿主細胞は、任意のヒト細胞に限る。本発明の組み換え DNAでの適切な宿主細胞の形質転換は、周知の方法によって達成される。

実施例

[0072] 以下、実施例により本発明を詳述するが，本発明は実施例によって限定されるものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法（例えば、「Molecular Cloning A Laboratory ManualJ し old Spring Harbor

Laboratory, NY, 1989等の遺伝子操作実験マニュアル)や試薬等に添付の指示書に従った o 《参考例 1：全長オープンリーディングフレーム（open reading frame, ORF)のクロー- ングとタンパク質発現プラスミドの構築》

表 1に示すプライマーセット（配列番号 8 配列番号 9、配列番号 10 配列番号 9、配列番号 11 配列番号 12、又は、配列番号 13 配列番号 12)、ヒト脾臓由来 cDNA( Human

spleen 5，- stretch plus cDNA；インビトロジェン社）、及び DNAポリメラーゼ（Pyrobest (商標） DNA polymerase ;宝酒造社）を用いて、 94°C2分の後、 98°C10秒、 60°C30 秒、 72°C1分 30秒のサイクルを 20回、続いて 72°C3分の PCR反応を行った。この PCR産物をフエノールクロ口ホルム処理し、エタノール沈殿処理し、精製水に溶解した。これらの DNAを Hindlll-Xholで二重切断した。動物細胞発現ベクター

PCDNA3.1- CFLの Hindlll- Xhol部位に挿入し、各発現プラスミドを CFL- DGPP1L、 CFL— DGPP1S、 CFL— DGPP2L、 CFL— DGPP2Sと名付けた。 pcDNA3.1— CFLは、 pcDNA3.1(+) (インビトロジヱン社）の Xhol- Xbal部位に配列番号 19及び配列番号 20 力なる 2重鎖オリゴ DNAを挿入したプラスミドであり、本プラスミドにより、目的タンパク質に FLAGタグが付加されて発現される。前記各プラスミドの配列をジデォキシターミネーター法により、 ABI3700

DNAシークェンサ一（アプライドバイォシステムズ社)を用いて解読したところ、配列番号配列番号 3、配列番号 5、又は、配列番号 7で表される配列が得られた。それぞれの全長 ORF配列を決定した。該遺伝子をそれぞれ DGPP1L,

DGPP1S, DGPP2L,及び DGPP2Sと名付けた。

[表 1] フォヮ一ドプライマ一リバースプライマー

( 5 ' 末端に制限酵素 ( 5 ' 末端に制限酵素 Xhol Hindlll 認識配列が付加さ認識配列が付加された配列）れた配列）

CFL-DGPP1L 配列番号 8 配列番号 9

CFL-DGPP1S 配列番号 10 配列番号 9

CFL-DGPP2L 配列番号 11 配列番号 12

CFL-DGPP2S 配列番号 13 配列番号 12

FLAG 配列番号 14 配列番号 15 [0074] 《参考例 2 :動物細胞株での発現》

実施例 1におヽて作製した 4個の動物細胞発現プラスミドを、トランスフエクシヨン試薬 (リボフエタトァミン;ギブコ社)を用いて、添付指示書に従い 293T細胞 (インビトロジェン社）にそれぞれ導入した。プラスミド導入後 12-16時間で培地を無血清に置換した後、更に 48-60時間培養を継続し、細胞を回収した。回収した細胞に 50mmol/L Tris pH7.5, 0.25mol/L NaCl, 10%グリセロール， 1%トリトン (Triton) X— 100, lmmol/L EDTA, lmmol/L

EGTA, lmmol/Lフエ-ルメチルスルホ -ルフルオライド (PMSF) (シグマ社）から成る溶液を加えて溶解し、エツペンドルフチューブ遠心機（トミー精工社）にて 15000回転 15分遠心後の上清を回収した。この導入細胞ライゼート中に目的タンパク質が存在することを C末端に付カ卩した FLAGタグに対する抗体 (マウス抗 FLAGモノクローナル抗体 M2 ;シグマ社)を用いたウェスタンブロッテイングで確認した。すなわち、上記ラィゼートを SDS/4%— 20%アクリルアミドゲル (第一化学薬品社）に電気泳動（還元条件)後、ブロッテイング装置を用いてポリフッ化ビ-リデン (PVDF膜) (ミリポア社)に転写した。転写後の PVDF膜にブロックエース（大日本製薬社)を添加してブロッキングした後、ピオチンィ匕マウス抗 FLAGモノクローナル抗体、西洋わさびパーォキシダーゼ標識ストレプトアビジン (アマシャムフアルマシア社)を順次反応させた。反応後、 ECL ウェスタンブロッテイング検出システム（アマシャムフアルマシア社）を用いて目的タンパク質の発現を確認した。 DGPP1Lタンパク質、 DGPP1Sタンパク質、 GDPP2Lタンパク質、 DGPP2Sタンパク質の各発現プラスミドを導入した細胞のライゼートにお、て、各予想分子量（DGPP1Lタンパク質: 34.3kDa、 DGPP1Sタンパク質: 29.5kDa、 DGPP2L タンノク質: 32.3kDa,

及び DGPP2Sタンパク質: 30.4kDa)付近に位置するバンドが検出され、各導入細胞で目的タンパク質が発現して、ることがわ力つた（図 1)。

[0075] 《参考例 3 :滑膜組織サンプル、滑膜線維芽様細胞サンプルの取得》

ヒト関節リウマチ (RA)患者、ヒト変形性関節炎 (OA)患者力も滑膜生検により滑膜組織、滑膜線維芽様細胞を得た。滑膜組織の調製は Harigai Mらの文献 (J Rheumatol. 1999 May;26(5): 1035-43)に、滑膜線維芽様細胞の調製は Zhang HGらの文献 (Arthritis Rheum. 2000 May;43(5): 1094-105)に従った。 RSI, RS2はヒト RA患者各 1名の滑膜線維芽様細胞サンプルであり、各種病理所見スコア一は、表層細胞重層化については RS1:2,

RS2:0,リンパ濾胞毛形成については、 RS1:2, RS2:0,血管新生については RS1:3, RS2:2であった。すなわち RSIと RS2の比較において RSIは RS2よりも炎症の程度が大きいサンプルである。 OA1,

OA2は OA患者各 1名の滑膜線維芽様細胞サンプルである。

[0076] 《実施例 1：滑膜線維芽様細胞における各遺伝子の発現上昇》

ABI PRISM 7900HTシークェンスディテクシヨンシステム (Sequence

Detection System) (PEバイオシステムズ社）（以降 Prism7900とする)によるリアルタイム PCRを PCR検出定量試薬キット（SYBR

Green PCR Master Mix; PEバイオシステムズ社）を用いてキット添付の指示書に従つて行、、滑膜線維芽様細胞サンプルにおける各遺伝子の発現量を定量的に測定した。以下に詳細を述べる。 ABI7900による測定に用いたプライマーは、配列番号 1及び配列番号 3に表した配列情報からプライマーエクスプレス (Primer

Express) (PEバイオシステムズ社）により設計した。配列番号 16及び配列番号 17は、 DGPP1L遺伝子と DGPP1S遺伝子を共通して認識するプライマーである。配列番号 18 及び配列番号 19は、 DGPP2L遺伝子と DGPP2S遺伝子を共通して認識するプライマ一である。 G3PDH遺伝子のプライマーは配列番号 20及び配列番号 21である。

[0077] RA滑膜線維芽様細胞 (RS1及び RS2サンプル）、 OA滑膜線維芽様細胞（OA1及び OA2サンプル）力も RNA抽出用試薬 ISOGEN (二ツボンジーン社)を用いて全 RNA ( total

RNA)抽出を行った。抽出は、試薬添付のプロトコールに従った。抽出方法の詳細を以下に記載する。 1000000細胞に対し、 lmLの ISOGENをカ卩え、ホモジナイズ'、後、 5 分静置した。 0.2mLのクロ口ホルム（関東ィ匕学社)を加え、攪拌後 3分静置した。 12000 X gで 4°Cにて 15分の遠心分離を行った。上清を回収し、 0.5mLの 2-イソプロパノール (関東ィ匕学社)を加え、 10分静置した。 12000 X gで 4°Cにて 10分の遠心分離を行った。上清を除いた後、 70%エタノールを lmLカ卩えた。 7500 X gで 4°Cにて 5分の遠心分離を行った。風乾後、 50 L水に溶解した。

[0078] 抽出した全 RNAは、 DNase処理キット（RNeasy Mini kit, RNase- Free

DNase Set ;共にキアゲン社）を用い、カラム上で DNase処理を行った。キット添付のプロトコールに従って処理を行った。詳細を以下に記載する。全 RNA溶液に水をカロえ、 100 しとした。次に、 350 Lのキットに含まれるバッファー RLTを加え攪拌した。次に 250 Lのエタノールを加え攪拌後、キットに含まれるカラム（RNeasy

mini spin column)に加えた。 8000 X gにて 15秒遠心した。 350 μ Lのキットに含まれるノッファー RW1を加え、 8000 X gにて 15秒遠心した。更に、 10 /z Lの DNasel ストック溶液及び 70 Lのキットに含まれるバッファー RDDをカ卩え、室温で 15分静置した。 350 μ Lのバッファー RW1を加え、 8000 X gにて 15秒遠心した。 350 μ Lのバッファ

RW1を加え、 8000 X gにて 15秒遠心した。 500 Lのキットに含まれるバッファー RPEを加え、 8000 X gにて 15秒遠心した。 500 Lのバッファー RPEをカ卩え、 15000 X gにて 1 分遠心した。 30 L水を加え、 8000 X gにて 1分遠心し、全 RNA

溶液を得た。

[0079] 全 RNAを铸型とした逆転写反応により、 cDNAを作成した。全 RNA (1 μ g)を 10 μ L のランダムへキサマー (lOOng/ μ L) (アマシャムフアルマシアバイオテク社）と混合し、最終量が 48 Lとなるように水を加えた。 70°Cで 10分処理後、氷上に置いた。次に 32 μし

の RT反応混合液 [5 X First- Strand Buffer(250mmol/L Tris- HC1 pH8.3, 375mmol/L KC1, 15mmol/L

MgCl ),10mmol/L DTT, 0.5mmol/L dNTP, Superscript II RNase H—

2

reverse transcriptase (800 units) (以上全て GIBCO BRL社)]を加えた。混合後、 25°C 15分、 42°C50分、 70°C15分の処理を行った。

[0080] 作製した cDNAを铸型として、以下の実験を進めた。目的遺伝子の各測定サンプル間での相対的発現量を算出するための標準曲線を作成する铸型として、ヒトゲノム D NA(human

genomic DNA) (クロンテック社)の希釈系列、あるいは各測定サンプルの混合液の希釈系列を用いた。また、サンプル中の cDNA濃度の差を補正するため、補正用内部標準として G3PDH遺伝子について同様の定量解析を行い、 G3PDH遺伝子の発現量を基に補正して、 DGPP1S遺伝子及び DGPP1L遺伝子並びに DGPP1S遺伝子及び DGPP2L遺伝子の発現量を算出した。 RA滑膜線維芽様細胞サンプル RS1及び RS2では、 OA滑膜線維芽様細胞サンプル OA1及び OA2に比して、 DGPP1S遺伝子及び DGPP1L遺伝子並びに DGPP1S遺伝子及び DGPP2L遺伝子の発現量が有意に亢進していることが明らかとなった。また、 RA滑膜線維芽様細胞サンプルのうち炎症程度の大き!/、RS1サンプルは炎症程度の小さ!/、RS2サンプルに比して、 DGPP1S遺伝子及び DGPP1L遺伝子並びに DGPP1S遺伝子及び DGPP2L遺伝子の発現量が有意に亢進しており、 RAの病理所見スコア一に連動して DGPP1S遺伝子及び DGPP1L遺伝子並びに DGPP1S遺伝子及び DGPP2L遺伝子の発現量が亢進して、ること、すなわち RAの炎症症状の重篤性と DGPP1S遺伝子及び DGPP1L遺伝子並びに DGPP1S遺伝子及び DGPP2L遺伝子の発現量の亢進が相関することを見出した（図 2)。

《実施例 2： DGPP1L、 DGPP1S、 DGPP2L、及び DGPP2S組み換え体タンパク質の精製》

実施例 1で作製した 4個の動物細胞発現プラスミドを铸型にして、表 2に示すプライマーセット（配列番号 22 -配列番号 23、配列番号 24 -配列番号 23、配列番号 25 -配列番号 26、又は、配列番号 27 -配列番号 26)、及び DNAポリメラーゼ（Pyrobest (商標 )DNA

polymerase ;宝酒造社）を用いて、 94°C2分の後、 98°C10秒、 60°C30秒、 72°C1分 30秒のサイクルを 20回、続いて 72°C3分の PCR反応を行った。この PCR産物をフエノールクロ口ホルム処理し、エタノール沈殿処理し、精製水に溶解した。これらの DNA を Hindlll- Xholで二重切断した。バキュロウィルス発現ベクター pFastBacBHFLの Hindlll- Xhol部位に挿入し、各発現プラスミドを BFL- DGPP1L、 BFL- DGPP1S、 BFL— DGPP2L、 BFL— DGPP2Sと名付けた。 pFastBacBHFLは、 pFastBacHTc (インビトロジン社)の Hindlll部位を平滑末端処理後、配列番号 33及び配列番号 34からなる 2重鎖オリゴ DNAを Rsrll- BamHI部位に挿入したプラスミドであり、本プラスミドにより、目的タンパク質に FLAGタグが付加されて発現される。前記各プラスミドの配列はジデォキシターミネータ一法により、 ABI3700

DNAシークェンサ一（アプライドバイォシステムズ社)を用いて確認した。各発現ブラスミドを DHlOBacコンビテント大腸菌 (インビトロジェン社)にトランスフエタトし、それぞれのバクミド DNAを調製した。バクミド DNAのトランスフエクシヨン当日に 6穴細胞培養プレート（イワキ）に穴あたり 900000個の S19細胞（Sf-900II SFM

adaptedXインビトロジェン社)を蒔き、 0.5%ペニシリンストレプトマイシン

(Penicillin-Streptomycin) (インビトロジェン社）を含む EX- CELL420培地（-チレイ）で、 27度で 1時間保温した。 1時間後、細胞をペニシリンストレプトマイシンを含まない培地で洗浄し、常温で 30分間インキュベートしたバクミド /セルフエクチン

(CellFECTIN)液（2 /z g

バクミド DNA、 6 μ L CellFECTIN (インビトロジェン社)、 200 μ L EX- CELL420培地）及び、ペニシリンストレプトマイシンを含まない培地 800 Lをカ卩え、 27度で 5時間振盪した。 5時間後、メディウムを交換し 27度で 72時間培養した。

[0082] バクミド DNAをトランスフエタトして 72時間後の S19細胞の培養上清を、 10,000回転で 1分間遠心して回収し、その 2mLを 6穴細胞培養プレート (イワキ社）に蒔いた S19細胞に加え 27度で 72時間培養した。そして、その 72時間後に、培養上清を 10,000回転で 1分間遠心して回収し、これをウィルス液とした。

[0083] 細胞培養用 225cm²フラスコ（イワキ社）にサブコンフルェントな S19細胞を蒔き、上記のウィルス液 lmL及び培地 2mLの計 3mLを加えて常温で 1時間振盪した。 1時間後、 20mLの培地をカ卩え、 27度で 72時間培養し、培養上清を 2000回転で 3分間遠心後して回収し、遮光して 4度で保存した。これをハイタイターウィルス液とした。

[0084] 50000000個の S19細胞を上記のハイタイターウィルス液 30 μ Lを培地 3mLに添加した溶液で室温で 1時間感染させた。 1時間後、 lOOmLの培地を力卩ぇスピナ一フラスコで 3日間培養した。 3日後、細胞を 5mmol/L

EDTA/TBS (20mmol/L Tris ph7.4, 150mmol/L NaCl (シグマ社)）で洗浄後、 1700回転で 3分遠心し S19細胞を回収した。

[0085] 回収した S19細胞を 0.5%トリトン- X100溶液（50mmol/L

Tris-HCl pH7.5, 0.25mol/L NaCl, 0.5%Triton- X100, 10%グリセロール（シグマ社）， Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets (ロシュダイァグノステイタス社)）に可溶化し、シェーカーで 4°Cにおいて 150回転で 1時間振盪した。 1時間後、 8000回転で 30 分間遠心し、上清をタンパク質溶液として回収した。

ANTI-FLAG M2-ァガロースァフィ-ティーゲル (Agarose

Affinity Gel)(シグマ社)をバッファー A (100mmol/L Tris— maleate (pH6.5), 2mmol/L Triton X-100 (シグマ社)）で平衡化後、上記のタンパク質溶液を加えシェーカーで 150回転、 1時間振盪した。ゲルをカラムに移し、 20ベッドボリュームのバッファー Aで洗浄後、 100 μ g/mLの FLAG

ペプチド (シグマ社)で溶出した。これを粗精製液とした。 PD- 10カラム (アマシャムバイォサイエンス社)を 25mLのバッファー Aで平衡ィ匕後、上記の粗精製液 2.5mLを流し、その後 3.5mLのバッファー Aで溶出した。溶出タンパク質の定量は Bio-Rad プロテインアツセィキット (protein assay kit) (バイオラッド)を用いて定量した。本工程により、 DGPP1L、 DGPPIS, DGPP2L、及び DGPP2S組み換え体タンパク質（ BFL-DGPP1L, BFL— DGPP1S、 BFL-DGPP2L, BFL— DGPP2Sタンノク質と称する）力精製できた。

[表 2]

《実施例 3 : DGPP1L, DGPPIS, DGPP2L, DGPP2S組み換え体タンパク質の酵素活性測定》

実施 ί列 2で調した BFし一 DGPP1し、 BFし一 DGPP1S、 BFし一 DGPP2し、 BFし一 DGPP2S タンパク質の脱リン酸酵素活性は、基質としてジァシルグリセロールピロリン酸（ DiC8、 Avanti Polar Lipids, Inc.)の末端から遊離させるリン酸をマラカイトグリーン法を用いて検出することにより測定した。実施例 2で調製した BFL-DGPPlS(0.2ng L) 、 BFし一 DGPP1し (0.2ng/ μし)、 BFし一 DGPP2S(lng/ μし)、又は BFし一 DGPP2し (lng/ μ L) をそれぞれ 5 Lと基質溶液 (ジァシルグリセロールピロリン酸無し (-)又は、ジァシルグリセロールピロリン酸添カ卩 (+) ) 5 ^ Lとを混合し、 37°Cで 2.5時間インキュベートした。 2.5時間後、 10 /z Lの反応液に 40 Lのマラカイトグリーン溶液を加え、室温で 20分ィンキュベー後、スぺクトラマックス (SPECTRA

MAX) 250 (Molecular Devices Corporation)で 642nmの吸光度を測定した。上記の基質溶液は、ジァシルグリセロールピロリン酸（

DiC8、 Avanti Polar Lipids, In )をクロロフオルムに溶解し、その後、減圧下クロロフオルムを取り除いた後、最終濃度 100 /z g/mLになるようにバッファー A(100mmol/L Tris- maleate (pH6.5), 2mmol/L Triton X- 100)をカ卩え、 1分間ソ-ケーシヨンし完全に溶解して調製した。マラカイトグリーン溶液は、 A溶液 (4mol/L塩酸にソ-ケーシヨンして溶解した 4.2%

ammonium molybdate (シグマ社)）と B溶液（水に溶解した 0.045%Merck malachite green (シグマ社)）を 1 : 3で混合し、室温で 30分間攪拌した後、最後に 1%ツイーン (Tween)20を 1/100添カ卩して調製した。

[0088] ¾J定の結果、 BFし一 DGPP1S、 BFし一 DGPPlし、 BFし一 DGPP2S及び BFし一 DGPP2しタンノク質はジァシルグリセロールピロリン酸分解酵素活性を有することがわ力つた。また、 DGPP1Sと DGPP1Lタンパク質の単位タンパク質量あたりのジァシルグリセロールピ口リン酸分解酵素活性は類似していた。また、 DGPP2Sタンパク質と DGPP2Lタンパク質の単位タンパク質量あたりのジァシルグリセロールピロリン酸分解酵素活性の程度も類似していた（図 3及び図 4)。

[0089] ところで、既知の脱リン酸酵素分子の配列比較（Brindley D.N. and

Waggnoner D.W. J.Biol.Chem. 1998 (273) p24281- p24284)及び酵母 DPP1の触媒ドメインの解析（Toke

D.A. et al Biochemistry 1999(38) pl4606- pl4613)から、 DGPPISタンパク質（配列番号 4の第 108番ー第 124番、及び第 147番ー第 152番、及び第 199番ー第 220番）と DGPP1Lタンパク質（配列番号 2の第 157番ー第 173番、及び第 196番ー第 201番、及び第 248番ー第 269番）の活性中心は同一であり、 DGPP2Sタンパク質（配列番号 8 の第 102番-第 118番、及び第 141番ー第 146番、及び第 193番ー第 214番）と DGPP2Lタンパク質（配列番号 6の第 122番ー第 138番、及び第 161番ー第 166番、及び第 213番-第 234番）の活性中心は同一である。更に、 DGPP1Lタンパク質及び DGPP1Sタンパク質の活性中心のアミノ酸配列と、 DGPP2Lタンパク質及び DGPP2Sタンパク質の活性中心のアミノ酸配列の同一性は、 83. 7%を示す。

[0090] 《実施例 4：正常滑膜組織、 RA滑膜組織における DGPP1及び DGPP2の免疫組織ィ匕学的検出》

抗 DGPP1抗体及び抗 DGPP2抗体は、抗ペプチド抗体作製法 (竹縛ら編、分子生物学研究のためのタンパク実験法、バイオマニュアルシリーズ 7、実験医学別冊、羊土社、 77-86、 1994)に従い作製し精製した (免疫生物研究所)。配列番号 35で示される抗原ペプチドをゥサギに接種し、 DGPP1ポリペプチドに対する抗血清を作製した。また、配列番号 36で示される抗原ペプチドをゥサギに接種し、 DGPP2ポリペプチドに対する抗血清を作製した。それぞれの抗原ペプチドを結合したァフィ-ティカラムを用いて抗血清を精製し、それぞれ抗 DGPP1ポリクローナル特異抗体、抗 DGPP2ポリクローナル特異抗体を調製した。これら特異抗体を用いて正常滑膜組織、及び RA滑膜組織での DGPP1Lタンパク質及び DGPP1Sタンパク質、又は DGPP2Lタンパク質及び DGPP2Sタンパク質の免疫組織ィ匕学的検出を行った (Lifespan社)。 DGPP1免疫陽性細胞は正常滑膜組織の血管内皮に弱く検出されたが、 RA滑膜組織ではリウマチ結節の血管内皮が強く検出された。 DGPP2免疫陽性細胞は、正常滑膜組織では血管内皮及び血清に弱く検出されたが、 RA滑膜組織ではパンヌスマトリックス、血管内皮及び血清に強く検出された。これらの結果より、 DGPP1Lタンパク質及び DGPP1Sタンパク質並びに DGPP2Lタンパク質及び DGPP2Sタンパク質は RA病態を特徴づける組織で発現亢進して、ることがわ力つた。

[0091] 《実施例 5： DGPP1Lタンパク質及び DGPP1Sタンパク質特異的な siRNAの作製》

DGPP1Lタンパク質及び DGPP1Sタンパク質をコードする塩基配列中で、 DGPP1L及び DGPP1Sに共通する配列番号 5で表される塩基配列力もなる DNAに対応する siRNAとして、二重鎖 RNA部分が配列番号 32で表される DGPP1ポリペプチド特異的な siRNAを作製した (ダーマコンリサーチ社)。

なお、 NCBIの BLASTサーチの結果、配列番号 5は、 DGPP1Lタンパク質及び DGPP1Sタンパク質をコードする塩基配列に特異的な配列であることが示された。非特異的な siRNAの影響を検討する対照実験のために、哺乳類細胞に存在しない二本鎖 RNAのコントロール siRNA (Luciferase

GL2 Duplex;ダーマコンリサーチ社）を入手した。

[0092] 《実施例 6： DGPP1Lタンパク質及び DGPP1Sタンパク質特異的な siRNAの微小血管内皮細胞への導入による DGPP1Lタンパク質及び DGPP1Sタンパク質特異的な発現抑制及び細胞増殖抑制》

微小血管内皮細胞 Cryo HMVEC-Ad (Cambrex Bio

Science Wallkersville, Inc.)を、添付指示書に従って、ブレットキット EGM- 2MV培地（ Clonetics社)で培養した。

トランスフエクシヨン実験は、以下の手順で実施した。トランスフエクシヨンの 12時間前に、コラーゲンコート細胞培養用 12穴プレート（イワキ）に、 Cryo HMVEC- Adを 1 穴当たり 60000細胞播いた。トランスフエクシヨン当日に、血清無添加培地 OPTI-MEM (インビトロジェン社）で細胞を洗浄した後、 OPTI-MEM

400 Lを加えた。実施例 5に記載の各 siRNAを、トランスフエクシヨン試薬 (オリゴフエクタミン;インビトロジェン社)を用いて、添付指示書に従い、導入した。導入した siRNAは、コントローノレ siRNA(Luciferase

GL2 Duplex),又は DGPP1特異的な siRNAであった。

導入から 4時間経過後に、細胞培養液上清を取り除き、 lmLのブレットキット EGM-2MV培地を新たに加えた。トランスフエクシヨンは、各サンプルに対して独立に 3穴を用いて行なった。

[0093] 前記各 siRNAを導入してから 24、 48、 72時間経過後に細胞を回収し、巿販キット

(RNeasy Micro Kit ; QUIAGEN, #74004)を使用して RNAを単離した。上記実施例 4で示したように、全 RNA

を铸型とした逆転写反応により、 cDNAを作製後、上記実施例 1で示したリアルタイム PCRの条件にて測定し、 G3PDH遺伝子の発現量を基に補正して、 DGPP1L遺伝子及び DGPP1S遺伝子の発現量を算出した。コントロール siRNAを導入したサンプルの DGPP1L遺伝子及び DGPP1S遺伝子の発現量を 100とした場合、 DGPP1L遺伝子及び DGPP1S遺伝子特異的な siRNAを導入したサンプルの DGPP1L遺伝子及び

DGPP1S遺伝子の発現量は 48時間後には 20以下であったことから、実施例 5で作製した DGPP1Lタンパク質及び DGPP1Sタンパク質特異的な siRNAが DGPP1Lタンパク質及び DGPP1Sタンパク質をコードする遺伝子発現を抑制することがわ力つた（図 5)

[0094] また、上記の siRNA導入実験において、導入から 24、 48、 72時間後に、それぞれ、独立の 3穴から細胞を回収し、トリパンブルー染色によって生細胞数を計測した。 siRNA導入時の細胞数は、 60000個であった。コントロール siRNAを導入した細胞は、経時的に細胞数を増カロさせた力 DGPP1Lタンパク質及び DGPP1Sタンパク質特異的な siRNAを導入した細胞では、導入力も 48時間経過後には細胞数の増加が認められず、細胞増殖抑制が観察された（図 6)。図 5で示したように、これらの導入細胞では、導入後 24時間後から DGPP1Lタンパク質及び DGPP1Sタンパク質をコードする遺伝子の発現抑制が認められたことから、 DGPP1Lタンパク質及び DGPP1Sタンパク質の発現抑制が血管内皮細胞の増殖抑制を誘導することがわ力つた。

[0095] 血管内皮細胞の増殖阻害は、滑膜組織でのパンヌス形成及びその維持に関与すると考えられおり血管新生を阻害すると期待することができる（Paleolog E.M. Arthritis Res. 2002 4 Suppl 3： S81- S90)。

[0096] ある分子の発現抑制によって誘導される細胞での効果は、当該分子の機能抑制によっても同等の効果があると一般的に認識されている。したがって、 DGPP1Lタンパク質及び DGPP1Sタンパク質の発現抑制、又は、実施例 3で示した DGPP1Lタンパク質及び DGPP1Sタンパク質の脱リン酸酵素活性の抑制 (機能抑制）は、血管内皮細胞の増殖抑制を示し、関節リウマチ治療効果を期待することができる。

[0097] 実施例 3で示したように DGPP2Lタンパク質及び DGPP2Sタンパク質は DGPP1Lタンノク質及び DGPP1Sタンパク質と同様の脱リン酸酵素活性を有しており、酵素活性部位の相同性も高い。更に、実施例 4で示したように RA滑膜組織での DGPP1免疫陽性細胞と DGPP2免疫陽性細胞が重複して、ることから、 DGPP1Lタンパク質及び DGPP1Sタンパク質を抑制した場合と同様に、 DGPP2Lタンパク質及び DGPP2Sタンパク質、又は、 DGPP1Lタンパク質、 DGPP1Sタンパク質、 DGPP2Lタンパク質及び DGPP2Sタンパク質の抑制も血管内皮細胞の増殖抑制を示し、関節リウマチ治療効果を期待することができる。

産業上の利用可能性

[0098] 本発明は、関節リウマチ治療薬のスクリーニングの用途に適用することができる。

以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。

配列表フリーテキスト

[0099] 以下の配列表の数字見出し < 223 >には、「Artificial Sequence の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号 6の配列で表される塩基配列は、人工的に合成した siRNAのセンス鎖である。配列表の配列番号 7の配列で表される塩基配列は、人ェ的に合成した siRNAのアンチセンス鎖である。配列番号 8— 15、 22— 29の配列で表される塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。

Claims

請求の範囲

[1] 試験物質が、（1)配列番号 2、配列番号 2の第 50— 313番、配列番号 4及び Z又は配列番号 4の第 21— 291番で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、 (2)配列番号 2の第 50— 313番及び Z若しくは配列番号 4の第 21— 291番で表されるアミノ酸配列又は配列番号 2の第 50— 313番及び Z若しくは配列番号 4の第 21— 291 番で表されるアミノ酸配列において 1一 10個のアミノ酸が欠失、置換、及び Z若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ脱リン酸酵素活性を有するポリペプチド、あるいは（3)配列番号 2又は配列番号 4で表されるアミノ酸配列との同一性が 90%以上であるアミノ酸力なり、かつ脱リン酸酵素活性を有するポリペプチド

を抑制するか否かを分析する工程を含む、関節リウマチ治療薬のスクリーニング方法

[2] 抑制が発現抑制である、請求項 1に記載のスクリーニング方法。

[3] 抑制が脱リン酸酵素活性抑制である、請求項 1に記載のスクリーニング方法。

[4] 前記分析工程で選択された試験物質が、関節リウマチ治療活性を有するか否かを確認する工程を更に含む、請求項 1一 3の、ずれか一項に記載のスクリ一ユング方法。

[5] (1)請求項 1に記載のポリペプチド、（2)請求項 1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は（3)請求項 1に記載のポリペプチドを発現して、る細胞を含む関節リウマチ治療薬スクリーニングツール。

[6] (1)請求項 1に記載のポリペプチド、（2)請求項 1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は（3)請求項 1に記載のポリペプチドを発現して、る細胞の関節リウマチ治療薬スクリーニングのための使用。

[7] 請求項 1一 4のいずれか一項に記載の分析工程及び Z又は確認工程、並びに製剤化工程を含む、関節リウマチ治療用医薬組成物の製造方法。

[8] 請求項 1一 4のいずれか一項に記載のスクリーニング方法で得ることができる物質を有効成分とする、関節リウマチ治療用医薬組成物。

[9] 請求項 1に記載のポリペプチドを抑制する物質を有効成分とする、関節リウマチ治療用医薬組成物。

[10] 請求項 1に記載のポリペプチドを抑制する物質を、関節リウマチの治療が必要な対象に有効量で投与することを含む、関節リウマチ治療方法。

[11] 請求項 1に記載のポリペプチドを抑制する物質の、関節リウマチ治療用医薬組成物製造のための使用。

[12] 配列番号 1に記載の塩基配列の NAに続く 19一 21塩基力なる、配列番号 1で表される塩基配列力なるポリヌクレオチドに特異的な塩基配列に基づいて設計される siRNAo

[13] 二重鎖 RNA部分力配列番号 32で表される塩基配列、又はそのセンス鎖の 3'末端が 1若しくは 2塩基欠失した塩基配列力なる siRNA。

[14] 請求項 12又は 13に記載の siRNAを有効成分とする、関節リウマチ治療用医薬組成物。