JP2010506885A - Toll様受容体機能を調節するための化合物及び方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】Toll様受容体4の活性化及びシグナル伝達の抑制方法。当該方法は、配列番号1のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質の発現又は生物学的機能を阻害する、治療上有効量の化合物を準備するステップと、かかる処置を必要とする被験者にそれを投与するステップとを有してなる。
【選択図】図1
Description
−配列番号1のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質の発現又は生物学的機能を阻害する、治療上有効量の化合物を準備するステップと、
−かかる処置を必要とする被験者にそれを投与するステップとを有してなる。
−Toll様受容体4とToll様受容体14とを含んでなる第1及び第2の細胞サンプルを準備するステップと、
−上記第1及び第2のサンプルと、上記Toll様受容体14と結合するエンドトキシンとを、上記Toll様受容体14が、エンドトキシンと結合するときにToll様受容体4と会合できる条件下で、接触させるステップと、
−前記第1のサンプルと、候補調節化合物とを、前記化合物の結合が可能な条件下で接触させるステップと、
−Toll様受容体4受容体の複合体の活性化状態を、前記第1と第2のサンプル間での、下流の活性化レベルの比較によってモニタするステップを有してなり、
前記第1のサンプルと前記第2のサンプルとの間での、Toll様受容体4のシグナル伝達の減少により、Toll様受容体4とToll様受容体14との会合の阻害剤としての調節化合物が同定される。
−Toll様受容体4とToll様受容体14とを含んでなる第1及び第2の細胞サンプルを準備するステップと、
−第1のフルオロフォア分子でToll様受容体4を標識し、第2のフルオロフォア分子でToll様受容体14を標識するステップと、
−前記第1のサンプルと、Toll様受容体4受容体の活性化を生じさせる分子とを接触させるステップと、
−Toll様受容体4及び/又はToll様受容体14の結合が可能な条件下で、前記第1及び第2のサンプルと候補調節化合物とを接触させるステップと、
−フルオロフォアの蛍光をモニタすることによって、Toll様受容体4受容体の結合状態及び/又は活性化をモニタするステップとを有してなり、蛍光の変化により、上記候補調節化合物が、Toll様受容体4の活性化及びシグナル伝達の調節化合物として同定される。
−TLR4及びTLR14を含んでなる第1及び第2の細胞サンプルを準備するステップと、
−第1のフルオロフォア分子でTLR4を標識し、第2のフルオロフォア分子でTLR14を標識するステップと、
−TLR14と結合してTLR4を活性化し、それによりTLR4とTLR14との会合を生じさせる分子と、前記第1のサンプルと、を接触させるステップと、
−前記第1のサンプルと、候補調節化合物とを、TLR14及び/又はTLR4への当該調節化合物の結合を可能にする条件下で接触させるステップと、
−フルオロフォアの蛍光をモニタすることによって、TLR4受容体の結合状態及び/又は活性化をモニタするステップとを含んでなり、
前記蛍光の変化により、上記候補調節化合物が、TLR4とTLR14との間に形成される共受容体複合体を崩壊させる機能を発揮するとして同定され、それによりTLR4受容体の調節化合物としての調節化合物が同定される。
−Toll様受容体14の発現又は生物学的機能を阻害する、治療上有効量の化合物を準備するステップと、
−かかる処置を必要とする被験者にそれを投与するステップを有してなる。
本発明には、TLR14タンパク質を活性化する調節化合物を同定するためのアッセイシステム及びスクリーニング方法、更には、TLR14活性化をモニタする方法が包含される。本願明細書の「アッセイシステム」とは、1つ以上の特定の事象を検出及び/又は測定するアッセイを実施し、その結果を分析するために必要な全ての構成要素を含むシステムである。
(i)TLR14の一過性の発現により、LPSシグナル伝達が増強され、
(ii)siRNAによるTLR14のノックダウンにより、LPSシグナル伝達が阻害され、
(iii)LPSがTLR14と結合し、
(iv)TLR14が膜画分、更には脳において発現し、EAEモデルマウスにおける炎症において、TLR14の発現レベルの強化が観察され、すなわちTLR14が特定の疾患及び炎症症状において上方制御されうることを示唆する。
特定の実施形態では、本発明は、例えばTLR14に対するエンドトキシン(例えばLPS)の結合を防止することによるか、又は、TLR14とTLR4とが複合体を形成して共受容体複合体を形成することを抗体により防止することによる、TLR14の生物学的機能的な活性の阻害への、抗体及び関連する結合化合物の使用に関する。
(1)通常それとともに存在する少なくとも幾つかのタンパク質を含まず、
(2)同じ給源(例えば同じ種)からの他のタンパク質を実質的に含まず、
(3)異なる種に由来する細胞により発現され、又は、
(4)天然には生じない、ということである。
TLR14又はTLR4に存在するエピトープとの親和性及び結合特性を有する、TLR14の機能的活性を制限する抗体を産生するための具体的方法は、上記のとおりである。
(i)ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して、かかる核酸(例えばゲノム給源由来)の試料を増幅すること、
(ii)化学合成、又は
(iii)cDNA配列の調製。抗体断片をコードするDNAは、当業者に公知のあらゆる適切な方法で調製し、使用できる。その方法は、コードDNAを採取し、発現される部分の両側の適切な制限酵素認識部位を同定し、上記DNAから上記部分を切り出すことにより行われる。上記の部分を更に、市販の標準的な発現システムの適切なプロモータに、作動可能に連結させることができる。他の組換え方法は、適切なPCRプライマーを用いてDNAの関連部分を増幅することである。上記配列への修飾を行うことが可能であり、例えば、部位特異的突然変異導入を用いて、修飾されたペプチドを発現させるか、又は上記核酸の発現に用いる宿主細胞のコドン使用頻度に適合させることができる。
免疫グロブリン(TLR14又はTLR4と結合し、TLR14の生物学的機能を阻害することができ、ゆえに本発明の方法で使用できる)は、当業者に公知のあらゆる技術を使用して同定できる。かかる免疫グロブリンは、免疫グロブリンポリペプチドの人工レパートリを含んでなるライブラリから簡便に分離できる。「レパートリ」とは、核酸のレベルにおいて、1つ以上の鋳型分子のランダム、セミランダム又は誘導されたバリエーションから生じさせ、多数の結合特性を生じさせた、分子のセットのことを指す。レパートリを生じさせるための方法は、従来技術において周知である。
ペプチドの類縁体(例えばペプチド擬態物)は、鋳型のペプチドの代表的な特性を有する、非ペプチド化合物である。かかるペプチドの類縁体は典型的には、コンピュータによる分子モデリングを使用して開発される。TLR14との親和性及び結合特性を有し、エンドトキシン(例えばLPS)と結合して、共受容体複合体としてTLR4と会合するTLR14の生物学的機能活性を阻害するペプチドと、構造的に類似するペプチド擬態物を使用して、かかるTLR14に対する抑制機能を有すると決定されたポリペプチド及びタンパク質に類似する、予防的及び治療的効果を発揮させてもよい。
コンビナトリアルライブラリ技術(Schultz,JS(1996)Biotechnol.Prog.12:729−743)により、ポリペプチドの活性(本発明ではTLR14の生物学的活性)を調節する能力に関して、非常に膨大な数の異なる物質を試験する効率的な方法が提供される。活性の調節、あるいはそれに関するスクリーニングの前に、試験化合物を、ポリペプチドと相互作用する能力に関して、例えば酵母ツーハイブリッドシステム(ポリペプチドと試験化合物の両方をコードする核酸が、酵母において発現できることが必要)により選抜してもよい。これは、試験物質が実際にポリペプチドの活性を調節する能力を有するかの試験を行う前の、大雑把なスクリーニングとして使用できる。
特定の更なる態様において、LPSと結合して、TLR4と複合体形成する、TLR14の生物学的機能を阻害する化合物は、ポリペプチドである。適切なポリペプチドの発現、単離及び精製は、あらゆる適切な技術によって実施できる。
特定の更なる実施態様において、TLR14の生物学的機能を阻害する化合物は、小分子であってもよい。
本発明は、TLR14遺伝子産物の発現を抑制する化合物又は組成物を投与することによって、エンドトキシンにより媒介されるTLR4媒介性のシグナル伝達を抑制する方法を包含する。
したがって、上記のように、本発明の一態様は、適切なタイプの細胞において、TLR14の発現を阻害又は抑制するための、RNAiの使用方法の提供に関する。「発現の阻害」という用語は、TLR14遺伝子又はコード配列の発現レベルが、コントロールと比較し、少なくとも約2倍、通常少なくとも約5倍(例えば10倍、15倍、20倍、50倍、100倍以上)低下又は阻害されることを意味する。特定の実施形態では、標的TLR14遺伝子/コード配列の発現が効果的に阻害される程度まで、TLR14標的遺伝子の発現が低下する。この場合、標的遺伝子の発現の阻害とは、コード配列(例えばゲノムDNA、mRNAなど)のタンパク質などのポリペプチド産生物(本発明ではTLR14)への転写又は翻訳が阻害されることを意味する。
また、本発明は、TLR14の発現サイレンシングに用いられるアンチセンス核酸の提供に関する。アンチセンス試薬は、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ODN)、特に天然の核酸を化学的に修飾した合成ODNであってもよく、又はRNAとしてのかかるアンチセンス分子を発現する核酸構築物であってもよい。アンチセンス配列は、標的のTLR14遺伝子のmRNAと相補的で、標的のTLR14遺伝子産物の発現を阻害する。
特定の更なる実施態様において、Toll様受容体14の生物学的機能を阻害する化合物は、可溶性タンパク質(典型的には可溶化型のTLR14)である。
上記のように、本発明の特定の態様は、複合薬剤に関するものであり、その際の組成物又は方法は、TLR14の生物学的機能活性を阻害する化合物の投与に関連し、それらは、CD14活性を抑制するのに有用な、少なくとも1つの更なる治療用化合物と組み合わせて投与される。
本発明は、TLR14の発現又は生物学的機能的な活性を阻害する化合物を含んでなる医薬組成物を包含する。本発明に係る、及び本発明に使用される医薬組成物は、活性成分(すなわちTLR14の発現又は生物学的活性の阻害剤)に加えて、当業者に周知の薬理学的に許容できる賦形剤、担体、緩衝剤又は他の物質を含んでなってもよい。適切な医薬用の担体としては、例えば水、グリセロール、エタノールなどが挙げられる。
U373細胞を、96ウェルプレート(ウェルあたり2×104細胞)に播き、その翌日、空のベクター又はTLR14発現ベクター(50ng)、並びに、Renillaルシフェラーゼ内部コントロールプラスミド(Promega社)40ngと共にNF−kB−ルシフェラーゼレポーター遺伝子(Stratagene社)80ngを用いてトランスフェクションした。GENEJUICE(商標)(Novagen社)を用いて、製造業者の指示に従い、一過的にトランスフェクションした。24時間後に細胞を、100ng/mlの最終濃度で、LPS(Sigma社)で6時間刺激した。細胞を更に受動的な溶解緩衝液(Promega社)中に添加し、レポーター遺伝子活性をルミノメーターで測定した。データを、コントロールのレベルに対する平均誘導倍率±SDとして表し、代表的な実験の場合は3つの別々の実験(各々3回実験を行う)の最小値として表した。
TLR14に対する結合特性を有する市販のsiRNAは、Dharmacon社及びQiagen社から購入した。ヒト星状細胞腫U373細胞を、5×104細胞/mlの濃度で、10cmのシャーレにおいて準備した。次の日、細胞を、製造業者の指示に従い、OLIGOFECTAMINE(商標)(Invitrogen社)を使用して、siRNAでトランスフェクションした。48時間後に細胞から培地を除去し、SDS−PAGE用のサンプルバッファを直接プレートに添加した。サンプルを超音波破壊し、5分間ボイルし、13000回転/分で1分間遠心分離した。サンプルを次にSDS−PAGE及びウエスタンブロッティングにより解析した。IkBα及びホスホp38に対する抗体はCell Signalling社から購入した。TLR4抗体はSanta Cruz社から購入した。
HEK293細胞を、1×105細胞/mlで、10cmのプレートに播いた。翌日、細胞をTLR14発現プラスミド3μgによってトランスフェクションした。24時間後に、1%のNP40を含んでなる800μlのHepesバッファ中で細胞を溶解させた。細胞可溶化物を、非標識のLPSの有無において、1μg/mlの最終濃度のビオチン−LPS(Invivogen社)で、室温で1時間インキュベートした。ストレプトアビジン−アガロースビーズ(Pierce社)をPBSで2回洗浄し、サンプルに添加した(40μl/ポイント)。1時間後に、ビーズを溶解緩衝液で3回洗浄し、SDS−PAGEサンプルバッファ20μl中に再懸濁した。タンパク質のサンプルを、10%SDS−PAGEゲルで泳動し、ニトロセルロース膜へ転写し、ウエスタンブロッティングを行った。得られるブロットを、抗TLR14抗体をプローブとして解析した。
LPSに反応する星状細胞腫細胞系(U373)において、レポーター遺伝子アッセイを実施した。50ngの空のコントロールベクター又はTLR14プラスミドで、24時間にわたりトランスフェクションした。細胞を回収する前に、過度に発現されたTLR14の有無において、LPS(100ng/ml)により6時間刺激し、レポーター遺伝子活性を分析した。
TLR14がTLR4のための共受容体として機能するか否かを更に確認するため、TLR14ノックダウンに特異的なsiRNAsを、Qiagen社から購入した。これらのTLR14特異的なsiRNAsを用いて、LPS誘導性のIkB分解及びp38リン酸化の効果を評価した。
LPS結合アッセイを実施し、TLR14へのLPSの結合を測定した。HEK293細胞を、TLR14でトランスフェクションした。24時間後に細胞を溶解させ、室温で、ビオチン化LPS(1μg/ml)又は非標識のLPSで1時間インキュベートした。次にストレプトアビジンアガロースビーズ上でプルダウンアッセイを実施した。
amaxaベースのトランスフェクションシステム(program S−019)を使用して、TLR14(Qiagen)に対して特異的なsiRNAにより、THP1細胞をトランスフェクションした。
amaxaベースのトランスフェクションシステム(program S−019)を使用して、TLR14(Qiagen)に対して特異的なsiRNAにより、THP1細胞をトランスフェクションした。スクランブルバージョンのQiagen siRNAを用いて、siRNAがTLR14に特異的であることを確認するためのネガティブコントロールとした。72時間後に、100ng/mlのLPSで細胞を24時間刺激した。上清を除去し、IL−6及びTNF−αELISAアッセイを実施した。
U373脳星状細胞腫細胞を、4μgのTLR14でトランスフェクションした。2時間後に、100ng/mlのLPSで細胞を2時間刺激した。細胞を、サイトゾル及び膜画分に分画した。ウエスタンブロット分析により、膜におけるTLR14の発現を確認した。
野生型(WTと表記)及び自己免疫脳脊髄炎(EAEと表記)モデル実験マウスから、脳を摘出し、皮質、海馬及び小脳に解剖した。これらの断片のウエスタンブロット分析により、タンパク質レベルでのTLR14の発現が確認された。
THP1細胞を、1mlあたり1×105細胞で、10cmのプレート上に播き、一晩インキュベートした。24時間後に培地を除去し、細胞をPBSで洗浄し、かき取り、分画バッファ(10mMのトリス−HCl、10mM MgCl2、1mM EDTA、250mM スクロース、200mM PMSF、pH7.5)中に入れた。サンプルを、Dounceホモジナイザ中で20ストローク処理し、100,000×gで1時間遠心分離した。上清(サイトゾル画分)を新しい試験管へ移し、ペレット(膜画分)を、50μlのSDS−PAGEサンプルバッファ[50mMのTris−Cl、pH6.8/10%のグリセロール(体積/体積)/2%のSDS(重量/体積)/0.1%のブロモフェノールブルー(重量/体積)/5%の2−メルカプトエタノール]中に再懸濁させた。サンプルを、SDS−PAGE及びウエスタンブロッティングにより分析した。
Claims (28)
- Toll様受容体4の活性化及びシグナル伝達を抑制する方法であって、
−配列番号1のアミノ酸配列を有するToll様受容体14タンパク質の発現又は生物学的機能を阻害する、治療上有効量の化合物を準備するステップと、
−かかる処置を必要とする被験者にそれを投与するステップとを有してなる方法。 - Toll様受容体14の発現又は生物学的機能を阻害する前記化合物が、タンパク質、ペプチド、ペプチド擬態物、核酸、ポリヌクレオチド、多糖類、オリゴペプチド、炭水化物、脂質、小分子化合物及び天然の化合物からなる群から選択される、請求項1記載の方法。
- Toll様受容体14の発現又は生物学的機能を阻害する前記化合物が、抑制性核酸である、請求項1記載の方法。
- 前記抑制性核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスDNA、アンチセンスRNA、リボザイム、iRNA、miRNA、siRNA及びshRNAからなる群から選択される、請求項3記載の方法。
- 前記化合物が、Toll様受容体4と、共受容体としてのToll様受容体14との複合体化を阻害することによって、Toll様受容体14の生物学的機能を阻害する抗体である、請求項2記載の方法。
- 前記抗体が、Toll様受容体14への結合を阻害して、それによりToll様受容体4と、共受容体としてのToll様受容体14との複合体化を阻害する、請求項5記載の方法。
- 前記抗体が、Toll様受容体4への結合を阻害して、それによりToll様受容体4と、共受容体としてのToll様受容体14との複合体化を阻害する、請求項5記載の方法。
- CD14の発現又は生物学的機能を阻害する、治療上有効量の組成物を、被験者に投与するステップを更に有してなる、請求項1から7のいずれか1項記載の方法。
- Toll様受容体4の活性化及びシグナル伝達の抑制に用いられる医薬組成物であって、少なくとも1つの薬学的に許容できる希釈剤、賦形剤若しくは担体に加えて、Toll様受容体14の発現又は生物学的機能を阻害する化合物を含んでなる医薬組成物。
- Toll様受容体4の活性化及びシグナル伝達により媒介される症状の治療用薬剤の調製への、Toll様受容体14の発現又は生物学的機能を阻害する化合物の使用。
- Toll様受容体4の活性化及びシグナル伝達により媒介される前記症状が、敗血症又は感染性ショックである、請求項10記載の使用。
- Toll様受容体4の活性化及びシグナル伝達により生じる症状の治療用薬剤に用いられる、Toll様受容体14の発現又は生物学的機能を阻害する化合物を含んでなる組成物。
- Toll様受容体4と、共受容体としてのToll様受容体14との会合を阻害する化合物を同定するためのアッセイ方法であって、
−Toll様受容体4とToll様受容体14とを含んでなる、第1及び第2の細胞サンプルを準備するステップと、
−前記第1及び第2のサンプルと、上記Toll様受容体14と結合するエンドトキシンとを、上記Toll様受容体14が、エンドトキシンと結合するときにToll様受容体4と会合できる条件下で、接触させるステップと、
−前記第1のサンプルと、候補調節化合物とを、前記化合物の結合が可能な条件下で接触させるステップと、
−Toll様受容体4受容体の複合体の活性化状態を、前記第1と第2のサンプル間での、下流の活性化レベルの比較によってモニタするステップを有してなり、
前記第1のサンプルと前記第2のサンプルとの間での、Toll様受容体4のシグナル伝達の減少により、Toll様受容体4とToll様受容体14との会合の阻害剤としての調節化合物が同定される方法。 - Toll様受容体4により媒介されるシグナル伝達の阻害への、請求項13記載のアッセイ方法により同定される化合物の使用。
- Toll様受容体4の活性化及びシグナル伝達の阻害用の組成物であって、請求項13記載のアッセイ方法により同定される化合物を含んでなる組成物。
- 敗血症又は感染性ショックの治療用薬剤の調製への、請求項13記載のアッセイ方法により同定される化合物の使用。
- 敗血症又は感染性ショックの治療に用いられる組成物であって、請求項13記載のアッセイ方法により同定される化合物を含んでなる組成物。
- 少なくとも1つの薬学的に許容できる希釈剤、賦形剤又は担体に加えて、請求項13記載のアッセイ方法により同定される化合物を含んでなる、敗血症又は感染性ショックの治療及び/又は予防用の医薬組成物。
- 敗血症又は感染性ショックの治療及び/又は予防方法であって、
−請求項13記載のアッセイ方法により同定される、治療上有効量の化合物を準備するステップと、
−治療を必要とする被験者にそれを投与するステップとを含んでなる方法。 - CD14の発現又は生物学的機能を阻害する、治療上有効量の組成物を被験者に投与するステップを更に有してなる、請求項19記載の方法。
- Toll様受容体14の発現を阻害するか、又は、Toll様受容体4と共受容体複合体を形成する、Toll様受容体14の生物学的機能を阻害する化合物を同定するためのアッセイ方法であって、
−Toll様受容体4とToll様受容体14とを含んでなる第1及び第2の細胞サンプルを準備するステップと、
−第1のフルオロフォア分子でToll様受容体4を標識し、第2のフルオロフォア分子でToll様受容体14を標識するステップと、
−前記第1のサンプルと、Toll様受容体4を活性化する分子とを接触させるステップと、
−前記第1及び第2のサンプルと候補調節化合物とを、Toll様受容体4及び/又はToll様受容体14の結合を可能にする条件下で接触させるステップと、
−フルオロフォアの蛍光をモニタすることによって、Toll様受容体4受容体の結合状態及び/又は活性化をモニタするステップとを有してなり、蛍光の変化により、前記候補調節化合物が、Toll様受容体4の活性化及びシグナル伝達を調節する化合物として同定される方法。 - Toll様受容体4により媒介されるシグナル伝達の阻害への、請求項21記載のアッセイ方法により同定される化合物の使用。
- Toll様受容体4の活性化及びシグナル伝達の阻害用の組成物であって、請求項21記載のアッセイ方法により同定される化合物を含んでなる組成物。
- 敗血症又は感染性ショックの治療用薬剤の調製への、請求項21記載のアッセイ方法により同定される化合物の使用。
- 敗血症又は感染性ショックの治療に用いられる組成物であって、請求項21記載のアッセイ方法により同定される化合物を含んでなる組成物。
- 少なくとも1つの薬学的に許容できる希釈剤、賦形剤又は担体に加えて、請求項21記載のアッセイ方法により同定される化合物を含んでなる、敗血症又は感染性ショックの治療及び/又は予防用の医薬組成物。
- 敗血症又は感染性ショックの治療及び/又は予防方法であって、−請求項13記載のアッセイ方法により同定される、治療上有効量の化合物を準備するステップと、−治療を必要とする被験者にそれを投与するステップとを有してなる方法。
- CD14の発現又は生物学的機能を阻害する、治療上有効量の組成物を、被験者に投与するステップを更に有してなる、請求項19記載の方法。
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