JP5554703B2 - 自己免疫疾患の治療のための組成物および方法 - Google Patents

Description

本発明は、関節炎の治療のための化合物および方法に関する。特に、Ｔｏｌｌ様受容体２の機能および／または発現を阻害することによって機能する関節リウマチを治療および予防するための方法が提供される。

関節炎は、進行性、炎症性の自己免疫疾患である。最も蔓延している形態の関節炎は関節リウマチであり、これは、関節の炎症によって特徴付けられる慢性の炎症性障害である。関節リウマチが死をもたらすことはまれであるが、関節リウマチの関連する症状（これは、最も典型的には、関節可動性の減少を含む）は、個体の生活の質に対する顕著な障害を引き起こし得る。

関節リウマチ（ＲＡ）は、典型的に多関節性であり、すなわち、これは多くの関節に影響するということである。一度引き金を引かれると、これは、滑膜の炎症をもたらし、浮腫、血管拡張およびＣＤ４＋ Ｔ細胞の活性化を導く。疾病進行の早期および中間のマーカーとしては、サイトカインの発現；腫瘍壊死因子 α、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＩＬ−１５ならびにトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）が挙げられる。１度関節の炎症が生じると、滑膜が厚くなり、一方軟骨は分解する。この一連の事象は、関節破壊および関節可動性の減少をもたらす。

ＲＡを治療するために使用される治療上のアプローチは、一般的に、炎症の媒介物を標的にする。特に、腫瘍壊死因子の阻害剤は、この症状を呈している被験者に広く処方されてきている。他の治療は、抗ＣＤ２０抗体、インターロイキン−１（ＩＬ−１）遮断薬、およびＴ細胞活性化の遮断薬に関する。

Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、自然免疫反応の活性化において鍵となる役割を有するパターン認識受容体のファミリーを形成する。１１のＴｏｌｌ様受容体がヒトにおいて現在までに同定されている。ＴＬＲファミリーのメンバーは、１０〜１５のＴＬＲを有するほとんどの哺乳類の種で高度に保存される。各ＴＬＲは特定の病原体に関連する分子署名を認識する。Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２、ＣＤ２８２、ＴＬＲ−２）は、ペプチドグリカン、リポタンパク質およびリポテイコ酸によって活性化される。Ｔｏｌｌ様受容体は、各ダイマーが異なるリガンド特異性を有するホモダイマーまたはヘテロダイマーのいずれかを形成することが知られる。ＴＬＲ２は、ＴＬＲ１またはＴＬＲ６のいずれかと、おそらくまた、ＴＬＲ１０と、膜結合型受容体としてヘテロダイマーを形成する。さらに、ＴＬＲ２の外部ドメインは、循環器および乳汁中のＣＤ１４と可溶性ヘテロダイマーを形成する。

ＴＬＲ２へのリガンド結合は、細胞質のアダプタータンパク質（ＴＩＲＡＰ（アダプタータンパク質を含んでいるＴｏｌｌ−インターロイキン−１ 受容体領域）としても知られる、ＭｙＤ８８およびＭａＩ（ＭｙＤ８８−アダプター様）など）との相互作用によって媒介された下流の情報伝達をもたらす。ＴＬＲ２およびＴＬＲ２によって引き起こされた情報伝達と、免疫系の活性化との関連は、ＴＬＲ２を、炎症および疾病の発症における重要な媒介物として関係付ける。従って、ＴＬＲ２情報伝達経路の調節に関連して、重要な治療上の関心がある。ＴＬＲ２を媒介した免疫情報伝達が炎症および疾病において重要性を有するという同定が、ＴＬＲ２の機能活性を遮断または抑制する働きを有するように設計された、いくつかの治療上のアプローチをもたらすことが認識されている。

発明者らは、驚くべきことに、重要な前炎症性メディエータとして、関節リウマチの発症および進行において、ＴＬＲ２を媒介したＩＬ−８（インターロイキン８）サイトカイン生成が関連することを同定した。

理論によって縛られることを望むことなく、発明者らは、関節リウマチを呈している被験者の滑液に存在する化合物が、Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）の活性化を引き起こし、次に、これは、Ｔｏｌｌ様受容体２によって媒介された細胞内情報伝達をもたらし、これは炎症促進性反応を引き起こす媒介物（炎症性サイトカインなど）の発現を引き起こすことを予測した。特に、関節リウマチの発生および進行を参照し、発明者らは、Ｔｏｌｌ様受容体２の活性化が、炎症性サイトカイン ＩＬ−８の生成および、炎症促進性免疫応答の関連する発生をもたらす細胞内情報伝達をもたらすことを示した。

従って、発明者らは、活性化の遮断または、Ｔｏｌｌ様受容体２の機能もしくは細胞内能力の抑制が、次に、ＩＬ−８の生成の減少をもたらし、次に、これは被験者における関節リウマチの発症を特徴づける異常な免疫応答の下方調節をもたらすことを同定した。

本発明の第１の態様によれば、自己免疫性関節炎の治療および／または予防のための方法が提供され、当該方法は、
Ｔｏｌｌ様受容体２の機能を調節する、治療有効量の薬剤を準備する工程と、
当該化合物を、このような治療を必要とする被験者に投与する工程と、を含む。

本願明細書において定義される用語「機能を調節する」は、薬剤が、Ｔｏｌｌ様受容体２の１つ以上の生物学的機能的活性を調節すること意味する。特定の実施態様では、Ｔｏｌｌ様受容体２の機能の調節は、Ｔｏｌｌ様受容体２の活性化の阻害および／またはＴｏｌｌ様受容体２によって媒介された下流の細胞内情報伝達の阻害もしくは抑制に関する。調節は、さらに、Ｔｏｌｌ様受容体２の発現の抑制にまでおよぶ可能性がある。

本願明細書において定義される、ＴＬＲ２を調節する「薬剤」は、Ｔｏｌｌ様受容体２の活性化もしくは機能を抑制または遮断する化合物である。当該「薬剤」は、Ｔｏｌｌ様受容体２へのリガンドもしくは結合化合物の結合を阻害または遮断する拮抗薬化合物であり得る。例えば、当該「薬剤」は、Ｔｏｌｌ様受容体２の細胞外領域に結合するＴｏｌｌ様受容体結合剤であってもよく、当該薬剤は、ＴＬＲ２特異的な活性化リガンドの結合を阻害する。さらに、当該「薬剤」は、リガンド結合および／もしくはＴｏｌｌ様受容体２の活性化の後に、Ｔｏｌｌ様受容体２によって媒介された細胞内情報伝達を阻害または抑制する化合物であってもよい。当該「薬剤」は、さらに、Ｔｏｌｌ様受容体２の発現を調節してもよい。

特定の実施態様では、当該「薬剤」は、Ｔｏｌｌ様受容体２に対して結合特異性を有する結合化合物であってもよい。特定の実施態様では、当該結合化合物は、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣薬、核酸、ポリヌクレオチド、多糖類、オリゴペプチド、炭水化物、脂質、小分子化合物、および自然に生じる化合物（植物由来の化合物など）からなる群から選択されるが、これらに限定されない。

特定の実施態様では、当該薬剤は、リガンド結合部位以外の部位でＴｏｌｌ様受容体２に結合し、結合することで、Ｔｏｌｌ様受容体２の構造（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）における変化をもたらし、Ｔｏｌｌ様受容体２作動薬の結合の阻害を導く結合化合物である。

１つの実施態様によれば、ＴＬＲ２結合剤を含むＴＬＲ２調節剤（ＴＬＲ２拮抗薬など）は、高い親和性で、例えば、少なくとも約１０^７Ｍ^−１（典型的には約１０^８Ｍ^−１、より典型的には約１０^９Ｍ^−１〜１０^１０Ｍ^−１以上）の親和定数でＴＬＲ２に結合し、ＴＬＲ２応答性細胞および／または組織における１つ以上のＴＬＲ２生物活性を調節（例えば、減少および／または阻害）する。

特定の実施態様では、ＴＬＲ２調節剤は、被験者の関節領域に局在化された滑膜もしくは結合組織を含む細胞または組織上に発現したＴｏｌｌ様受容体２を標的とする。炎症性滑膜は、関連する関節障害ならびに軟骨および骨の分解を引き起こす。本発明の方法および組成物を使用して調節され得る（例えば、阻害され、または減少させられる）代表的なＴＬＲ２活性としては、下記のうち１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）ＴＬＲ２発現の阻害または抑制、（ｉｉ）ＴＬＲ２リガンド結合の阻害、および（ｉｉｉ）ＴＬＲ２によって媒介された細胞内情報伝達の阻害または抑制。

従って、さらなる態様では、本発明は、ＴＬＲ２−応答性細胞および／または組織（例えば、滑膜（内膜または内膜下など）の細胞）における機能を調節する方法（例えば、ＴＬＲ２の１つ以上の生物活性の調節）を与える。当該方法は、ＴＬＲ２−応答性細胞および／またはＴＬＲ２−応答性組織を、ＴＬＲ２調節剤（例えば、ＴＬＲ２−結合剤（例えば、ヒトＴＬＲ２活性または発現の拮抗薬））と、ＴＬＲ２−応答性細胞または組織の機能（または、細胞もしくは組織におけるＴＬＲ２の生物活性）を調節するのに十分な量で接触させる工程を含む。１つの実施形態では、当該接触させる工程は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば、細胞可溶化物中）または再構成系において作用できる。あるいは、主題の方法は、培養液中の細胞、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで行うことができる。例えば、細胞（例えば、精製された細胞または組み換え細胞）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養でき、当該接触させる工程は、培養培地にＴＬＲ２調節剤を添加することによって作用できる。典型的に、ＴＬＲ２−応答性細胞は哺乳類の細胞、例えば、ヒトの細胞である。いくつかの実施態様では、当該ＴＬＲ２−応答性細胞は、滑膜の細胞（例えば、内膜または内膜下の細胞）、またはこれに関連する細胞集団である。他の実施形態では、当該方法は、被験者に存在する細胞上で、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏの手順の一部として、または、動物対象（例えば、ヒト被験者、またはｉｎ ｖｉｖｏの動物モデルを含む）で行うことができる。当該ｉｎ ｖｉｖｏの手順は、治療上または予防のものであってもよく、炎症性モデルは、例えば、ＥＡＥモデル、または遺伝的に改変されたモデル（例えば、過剰発現したＴＬＲ２を有する動物モデル、またはＴＬＲ受容体における変異もしくは欠損）であってもよい。ｉｎ ｖｉｖｏの方法については、当該ＴＬＲ２調節剤（単独または別の薬剤との組み合わせ）は、自己免疫疾患（関節リウマチなど）に罹患している被験者に、被験者において１つ以上のＴＬＲ２を媒介した活性または機能を調節するのに十分な量で投与できる。いくつかの実施態様では、投与されるＴＬＲ２調節剤の量または投与量は、１つ以上のＴＬＲ２活性（例えば、本願明細書に記載された１つ以上のＴＬＲ２生物活性）を変化させる（例えば、減少または阻害させる）ために必要とされるＴＬＲ２調節剤の量をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで試験することによって、投与前に決定できる。任意に、当該ｉｎ ｖｉｖｏの方法は、自己免疫障害または症状に関連する１つ以上の症候を有する、またはこれらを有するリスクを有する被験者を同定（例えば、評価、診断、スクリーニング、および／または選択）する工程（単数または複数）を含むことができる。

特定の実施態様では、１つ以上のＴＬＲ２生物活性の阻害、低下または減少が要求され、ＴＬＲ２応答性細胞および／または組織は、例えば、ＴＬＲ２拮抗薬を被験者に投与することによって、ＴＬＲ２拮抗薬と接触させられる。１つの実施形態では、当該ＴＬＲ２拮抗薬は、ＴＬＲ２ポリペプチドまたはｍＲＮＡと相互作用（例えば、結合）し、１つ以上のＴＬＲ２活性を減少させ、または阻害する。典型的に、拮抗されたＴＬＲ２は、哺乳類のＴＬＲ２（またはその機能的な変異体）、例えば、ヒトＴＬＲ２またはマウスＴＬＲ２である。特定の実施態様では、拮抗されたＴＬＲ２は、図４（配列番号２）で定義されるヒトＴＬＲ２配列（ジェンバンク受入番号 ＡＡＣ ３４１３３（ＵＲＬ ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）によって定義される、７８４のアミノ酸全長の、ヒト Ｔｏｌｌ様受容体配列を含む）または、図５（配列番号３）（ジェンバンク受入番号 ＮＰ＿０３６０３５（マウス））によって定義されるアミノ酸配列を含むマウスＴＬＲ２配列、もしくはその部分、および／または実質的にそれらと相同の配列、または、配列番号２もしくは配列番号３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる配列および／もしくはそれらと実質的に相同の配列を含む。

特定の実施態様では、自己免疫性関節炎は、関節リウマチ、炎症性関節炎、若年性関節リウマチ、骨関節炎および乾癬性関節炎を含む群（しかしこれらに限定されない）のうち１つ以上であってもよい。さらなる実施態様では、当該自己免疫性関節炎は、コラーゲン誘導性関節炎であってもよい。さらなる実施態様では、当該自己免疫性関節炎は、関節炎に関連する他の炎症性の症状を含んでもよい。

本願明細書において定義されるＴｏｌｌ様受容体２はまた、ＴＬＲ２、ＴＬＲ−２またはＣＤ２８２とも呼ばれてもよい。典型的に、当該Ｔｏｌｌ様受容体２はヒト Ｔｏｌｌ様受容体２である。ヒト由来のＴｏｌｌ様受容体２のアミノ酸配列は、ジェンバンク受入番号 ＡＡＣ ３４１３３で定義され、当該配列は７８４のアミノ酸を含む。あるいは、当該Ｔｏｌｌ様受容体２は、マウスＴｏｌｌ様受容体２である。さらなる実施態様では、当該Ｔｏｌｌ様受容体２は、ヒトまたはマウス以外のいずれかの哺乳類（例えば、ウシまたはラット）由来である。特定のさらなる実施態様では、本発明のこの態様の抗体は交差反応性であり、すなわち、これは異なる種由来のＴｏｌｌ様受容体２に対する結合特異性を有する。

用語、結合化合物は、特定の結合剤を意味し、標的に特異的に結合する天然のまたは非天然の分子（特に、ＴＬＲ２上に存在するエピトープ）を意味する。本発明における使用のための適した結合化合物の例としては、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣薬、核酸、炭水化物、脂質、および小分子化合物が挙げられるが、これらに限定されない。

用語「特異的に結合する」または「結合特異性」は、非標的エピトープに結合するよりも大きい親和性を有する、ＴＬＲ２に存在する標的エピトープに結合する結合化合物の能力を意味する。特定の実施態様では、特異的結合は、非標的との親和性よりも、少なくとも１０、５０、１００、２５０、５００、または１０００倍大きい親和性で、標的に結合することを意味する。特定の実施態様では、親和性は、アフィニティーＥＬＩＳＡ アッセイによって測定される。特定の実施態様では、親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ アッセイによって測定される。特定の実施態様では、親和性は、動力学的方法によって判定される。特定の実施態様では、親和性は、平衡／溶液法によって判定される。

特定の実施態様では、結合化合物は、ＴＬＲ２に存在する少なくとも１つのエピトープに結合し、このエピトープへの結合は、ＴＬＲ２機能の阻害をもたらす。「エピトープ」は、結合化合物（例えば小分子または抗体）によって、当該小分子または抗体の結合領域によって、認識および結合されることができるＴＬＲ２の一部を意味する。エピトープは、一般的に、化学的に活性な表面基からなり、特定の三次元構造特性および特定の電荷特性を有する。典型的に、当該結合化合物は、ＴＬＲ２の結合活性に拮抗し、そのため、阻害性または抑制性エピトープとして知られるエピトープに結合する。「阻害する」または「阻害性」エピトープは、結合化合物（小分子または抗体など）によって結合された場合、ＴＬＲ２の生物活性の減少をもたらすエピトープを意味する。ＴＬＲ２上に存在し、かつ、ＴＬＲ２機能に拮抗するために当該結合化合物によって結合されるエピトープは、５以上のアミノ酸残基を含んでもよい。特定の実施態様では、当該結合化合物は、配列番号１において本願明細書で定義されたヒトＴＬＲ２の細胞外領域のアミノ酸配列のアミノ酸残基２９２〜５８６に存在する少なくとも５つの連続的なアミノ酸残基からなるエピトープを認識する。

特定の実施態様では、当該結合化合物は、抗体、典型的にはモノクローナル抗体である。特定の実施態様では、当該モノクローナル抗体は、マウス抗体、ヒト化抗体またはラクダ抗体であってもよい。特定の実施態様では、当該抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥを含む群から選択されるアイソタイプのものであってもよい。特に、当該抗体は、アイソタイプ ＩｇＧのものであり、サブクラス ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のものであってもよい。

ＴＬＲ２活性を抑制するように機能する場合、典型的に、ＴＬＲ２結合化合物は、Ｔｏｌｌ様受容体２の機能、ならびに、特に、Ｔｏｌｌ様受容体２の活性化および下流の媒介された情報伝達を減少させ、阻害し、またはこれらに拮抗する。Ｔｏｌｌ様受容体２の活性の減少、阻害または拮抗作用は、Ｔｏｌｌ様受容体２が、Ｔｏｌｌ様受容体１またはＴｏｌｌ様受容体６とヘテロダイマーを形成するかどうかに関わらず生じる可能性がある。用語「Ｔｏｌｌ様受容体２の活性化および下流の媒介された情報伝達」は、活性化されたＴＬＲ２によって引き起こされたいずれかの細胞内情報伝達経路を意味する。当該情報伝達経路は、ＴＬＲ−２特異的な経路であってもよく、または、「共有された」経路であってもよく、当該経路は、他の源（例えば、転写因子 ＮＦ−κＢの活性化に寄与する経路）によって活性化されてもよい。

ＴＬＲ２は、２つの機能的なヘテロダイマーに２量化することが知られる。そのため、ＴＬＲ２は、ＴＬＲ１またはＴＬＲ６と２量化できる。この２量化は、異なる微生物の成分の結合をもたらす識別と関連すると考えられている。さらに、ＴＬＲ２はまた、Ｔｏｌｌ様受容体１０と関連する可能性がある。

発明者らは、関節炎を呈している被験者の関節におけるＴＬＲ２を媒介した炎症の抑制を網羅する治療上のアプローチを与えるため、ヘテロダイマーがＴＬＲ１またはＴＬＲ６と形成されているかどうかに関わらず、ＴＬＲ２に対する結合特異性を有する結合化合物を与えることが望ましいことを認識している。この点について、下記の広範な実験法で、発明者らは、結合された場合、ＴＬＲ２活性を抑制するエピトープを同定した。

本発明の特定の実施態様では、結合化合物が抗体である場合、当該抗体は、Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）の成熟細胞外領域のＮ−末端およびＣ−末端部分の両方に由来する残基を含むエピトープに結合する。特定の実施態様では、当該エピトープは、Ｔｏｌｌ様受容体２の５８６のアミノ酸配列から特定された１９〜３９の残基を含んでいてもよく、当該アミノ酸は、ＫＥＥＳＳＮＱＡＳＬＳＣＤＲＮＧＩＣＫＧＳ（配列番号４）である。さらに、当該結合エピトープは、配列番号１のアミノ酸配列のＣ−末端領域に存在するＴｏｌｌ様受容体２のアミノ酸残基５３８〜５４９をさらに含んでいてもよく、この配列は、アミノ酸 ＣＳＣＥＦＬＳＦＴＱＥＱＱ（配列番号５）を含む。

特定のさらなる実施態様では、抗体は、（ｉ）１０^−７Ｍ〜１０^−１１Ｍの間の解離定数、（ｉｉ）１０^−８Ｍ〜１０^−９Ｍの間の解離定数、（ｉｉｉ）１０^−９Ｍ〜１０^−１０Ｍの間の解離定数、（ｉｖ）１０^−１１Ｍ〜１０^−１２Ｍの間の解離定数からなる群から選択される解離定数（Ｋｄ）を有していてもよい。

特定のさらなる実施態様では、本発明のこの態様は、免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖の可変領域をコードする単離された核酸またはベクターをさらに与える。

特定のさらなる実施態様では、本発明は、Ｔｏｌｌ様受容体２に対する結合特異性を有し、自己免疫の症状または疾病（最も典型的には、関節リウマチ）の治療のための薬物の調製においてＴｏｌｌ様受容体２の機能を抑制するように機能する、結合化合物の使用を与える。

特定の実施態様では、当該結合化合物は、抗体、特に、モノクローナル抗体である。本発明の特定の実施態様では、当該結合化合物は抗体であり、当該抗体は、Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）の成熟細胞外領域のＮ−末端およびＣ−末端の部分の両方に由来する残基を含むエピトープに結合する。

本発明のさらなる態様によれば、自己免疫の症状または疾病（最も典型的には、関節リウマチ）の治療のための医薬組成物が与えられ、当該組成物は、少なくとも１つの薬剤的に許容できる担体、希釈剤、可溶化剤、乳化剤、保存剤および／またはアジュバントとともに、ＴＬＲ２に対する結合特異性を有する結合化合物を含む。

特定の実施態様では、当該結合化合物は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体もしくは合成された抗体、融合タンパク質もしくはその断片、天然のもしくは合成の化学物質またはペプチド模倣薬を含む群から選択されるが、これらに限定されない。

特定の実施態様では、当該医薬組成物は、第２の治療薬（サイトカイン阻害剤、または免疫抑制剤など、しかしこれらに限定されない）をさらに含んでいてもよい。当該免疫抑制剤は、抗ＣＤ２０抗体、抗ＴＮＦ抗体、インターロイキン−１（ＩＬ−１）遮断薬、またはＴ細胞活性化の遮断薬のうち少なくとも１つであってもよい。

発明者らは、ＴＬＲ２の機能に拮抗する結合化合物の使用に基づく、本願明細書で定義された関節リウマチの治療方法は、併用薬を与えるために改変することができることをさらに認識し、当該併用薬は、関節リウマチの発症をもたらす免疫応答を抑制する働きをする少なくとも１つのさらなる化合物をさらに含む。

従って、本発明のさらなる態様は、関節リウマチの治療および／または予防のための方法を与え、当該方法は、
Ｔｏｌｌ様受容体２とＴｏｌｌ様受容体２作動薬との間の相互作用を阻害する治療有効量の薬剤を、治療を必要とする被験者に投与する工程と、
治療有効量の少なくとも１つの第２の免疫抑制化合物をさらに投与する工程と、を含む。

特定の実施態様では、当該第２の免疫抑制化合物は、抗ＣＤ２０抗体、抗ＴＮＦ抗体、インターロイキン−１（ＩＬ−１）遮断薬、またはＴ細胞活性化の遮断薬のうち少なくとも１つを含んでいてもよい。

特定の実施態様では、当該第２の化合物は、非ステロイド性の抗炎症性薬剤、有機金誘導体、Ｄ−ペニシラミン、４−アミノキノリン、アザチオプリン、メトトレキセート、シクロスポリン、血管新生抑制剤、Ｔ細胞に対するモノクローナル抗体、接着分子に対するモノクローナル抗体、およびサイトカインもしくは増殖因子に対するモノクローナル抗体を含む群から選択される。

特定の実施態様では、当該方法は、抗ＴＮＦ抗体と同時に投与される、抗ＴＬＲ２抗体を投与する工程を含む。特定のさらなる実施態様では、抗ＴＮＦ抗体と経時的に投与される抗ＴＬＲ２抗体が与えられる。

特定のさらなる実施態様では、当該第２の免疫抑制化合物は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の機能的活性に対する結合特異性を有し、これを阻害する、抗体、抗体断片、小分子またはペプチド模倣薬などの結合化合物である。

腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）は、関節リウマチの発症の原因である、鍵となる炎症性媒介物であるとして認められている。

本発明の特定の実施態様では、ＴＬＲ２結合化合物が抗体である場合、本発明はまた、２つの異なる標的に対して結合特異性を有する抗体である、二重特異性抗体を与えてもよく、当該二重特異性抗体は、ＴＬＲ２の機能の阻害ならびに、腫瘍壊死因子、ＣＤ２０：ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＩＬ−１５からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインのうち、少なくとも１つに対する結合特異性をもたらすＴＬＲ２受容体上に存在する少なくとも１つのエピトープに対する結合特異性を有する。

本発明のさらなる態様は、治療有効量の抗ＴＬＲ２抗体を、抗ＴＮＦ−α抗体および抗ＣＤ２０抗体、抗ＩＬ−１抗体、抗ＩＬ−６抗体、抗ＩＬ−８抗体および抗ＩＬ−１５抗体のうち少なくとも１つと組み合わせて、薬剤的に効果的な希釈剤または担体と一緒に含む医薬組成物を与える。

本発明のさらなる態様は、関節リウマチの治療のための薬物の調製において、関節リウマチを引き起こす異常な免疫応答を媒介する少なくとも１つの炎症性媒介物に結合し、その機能を抑制する第２の結合化合物と一緒に、Ｔｏｌｌ様受容体２の機能に拮抗する結合化合物の使用を与える。

特定の実施態様では、当該第２の結合化合物は、抗ＣＤ２０抗体、抗ＴＮＦ抗体、インターロイキン−１（ＩＬ−１）遮断薬、またはＴ細胞活性化の遮断薬のうち少なくとも１つを含む。

発明者らは、関節リウマチを呈している被験者に特徴的な異常な免疫応答を抑制するための方法における可溶型のＴＬＲ２受容体の有用性をさらに同定し、当該免疫系は、自己抗原、特に、関節の細胞構造および成分を標的にする。

そのため、特定のさらなる実施態様では、本発明は、可溶型のＴｏｌｌ様受容体２の提供にまでおよび、当該可溶型は、これらがＴＬＲ２に結合し、活性化するリガンドの膜結合型のＴＬＲ２と競合する働きをする点で特徴付けられる。膜結合型ＴＬＲ２を活性化するために利用可能なＴＬＲ２特異的なリガンドの量が減少するため、可溶型のＴＬＲ２へのＴＬＲ２特異的なリガンドの結合は、ＴＬＲ２の活性化の下方制御をもたらす。

従って、本発明のさらなる態様は、自己免疫性関節炎を治療および／または予防するための方法を与え、当該方法は、
治療有効量の可溶型のＴｏｌｌ様受容体２またはその可溶性断片を準備する工程と、
同一のものをこのような治療を必要とする被験者に投与する工程と、を含む。

特定の実施態様では、当該可溶型のＴＬＲ２は、組み換え技術によって調製される。可溶型のＴｏｌｌ様受容体２は、典型的に、ＴＬＲ２のみの細胞外領域を含み、従って、ジェンバンク受入番号 ＡＡＣ ３４１３３で定義されるＴｏｌｌ様受容体２の細胞内領域および膜貫通型領域は存在しない。特定の実施態様では、当該可溶型のＴｏｌｌ様受容体２は、定義されたヒト Ｔｏｌｌ様受容体２配列の１〜５８７のアミノ酸を含んでいてもよい。当該可溶性Ｔｏｌｌ様受容体２配列は、１以上のアミノ酸残基の付加、欠損または置換によって修飾されていてもよい。

特定の実施態様では、自己免疫性関節炎は関節リウマチに関連する。さらなる実施態様では、自己免疫性関節炎はコラーゲン誘導性関節炎である。

特定の実施態様では、当該可溶型のＴｏｌｌ様受容体２は、配列番号３において本願明細書で定義されたＴＬＲ２の細胞外領域に由来する。さらなる実施態様では、当該可溶型の可溶性Ｔｏｌｌ様受容体２は、切断型の全長のＴｏｌｌ様受容体２アミノ酸配列から与えられる。典型的に、当該可溶性のＴＬＲ２は、除去もしくは置換された細胞内領域および／または膜貫通型領域を含む少なくとも一部のアミノ酸残基を有し、これらの欠損および／または置換はＴｏｌｌ様受容体２タンパク質を可溶性にする。特定のさらなる実施態様では、細胞内領域および／または膜貫通型領域の、欠損および／または置換に加え、欠損および／または置換は、さらに細胞外領域のアミノ酸残基になる可能性がある。ＴＬＲ２の細胞外領域のアミノ酸残基のいずれのこのような欠損および／または置換は、可溶性になり、ＴＬＲ２の結合特性を維持するＴＬＲ２の修飾された変形体となるようになされてもよい。

ヒト Ｔｏｌｌ様受容体２の細胞外領域（外部ドメイン）のアミノ酸配列は、本願明細書において、配列番号３として与えられる。ヒト形態のＴｏｌｌ様受容体２の細胞外領域は、５８７のアミノ酸残基、特に、ジェンバンク受入番号 ＡＡＣ ３４１３３（ＵＲＬ ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）で定義された、定義された７８４のアミノ酸全長ヒト Ｔｏｌｌ様受容体配列の、１〜５８７のアミノ酸を含む。本願明細書において定義される、ＴＬＲ２の外部ドメインは、細胞外の間隙におよぶＴＬＲ２の膜結合型形態の部分である。

特定の実施態様では、可溶性Ｔｏｌｌ様受容体２（ｓＴＬＲ２）分子は、このような治療上のアプローチの有効性を促進するために、滑液を標的としてもよい。このような方法でのｓＴＬＲ２のターゲティングは、ｓＴＬＲ２の全身性投与がＴＬＲ２リガンドの全体的な免疫抑制をもたらす可能性があるため有利である。

可溶型のｓＴＬＲ２のターゲティングは、融合タンパク質の形成を通じて与えられる可能性があり、当該融合タンパク質は、第２のペプチドに結合した、ＴＬＲ２受容体の可溶性部分（典型的には、細胞外領域またはその部分）からなり、典型的に、Ｆｃ受容体結合タンパク質は、免疫グロブリン（典型的にヒト免疫グロブリン）の重鎖に由来する。当該Ｆｃ領域は、治療上のタンパク質の循環半減期を延長するために、広範に使用されている。

本発明のさらなる態様では、免疫細胞に関連する障害を治療または予防するための方法が与えられ、当該方法は、
Ｔｏｌｌ様受容体２の発現または機能を阻害する化合物を準備する工程と、
同一のものを、このような治療を必要とする被験者に、当該被験者における免疫細胞活性を阻害し、または減少させるのに十分な量で投与する工程と、を含み、そのため、当該障害を予防する。

特定の実施態様では、免疫細胞に関連する障害は、関節炎、関節リウマチまたは若年性関節リウマチを含む群から選択されるが、これらに限定されない。

特定のさらなる実施態様では、当該免疫細胞に関連する障害は、複数の硬化症、全身性エリテマトーデス（ｌｕｐｕｓ ｅｒｔｈｙｅｍａｔｏｓｉｓ）、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患およびクローン病から選択される群の少なくとも１つのメンバーであるが、これらに限定されない。

特定の実施態様では、当該方法は、サイトカイン阻害剤、増殖因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症薬、代謝剤、酵素阻害剤、細胞分裂阻害剤および細胞傷害性薬剤を含む群のうち少なくとも１つから選択される第２の治療薬を投与する工程をさらに含む。

特定のさらなる実施態様では、当該第２の治療化合物は、ＴＮＦ拮抗薬、例えば、可溶型のＴＮＦ受容体もしくはＴＮＦに対する抗体、抗ＣＤ２０抗体、およびＩＬ−１２拮抗薬、およびＩＬ−１５拮抗薬、ＩＬ−１７拮抗薬、ＩＬ−１８拮抗薬、炎症促進性Ｔ細胞抑制因子、制御性Ｔ細胞プロモーター、小分子、例えば、メトトレキセート、レフルノミド、ラパマイシンもしくは類似体、プロドラッグもしくはその塩、Ｃｏｘ−２阻害剤、ＮＳＡＩＤまたはｐ３８阻害剤を含む群から選択されるが、これらに限定されない。

発明者らは、関節リウマチを呈している被験者から単離された滑液にＴＬＲ２を曝露した後に、ＴＬＲ２を媒介したＩＬ−８生成をもたらすことを同定した。ＩＬ−８は、滑膜を付着することが見出され、関節の変質の原因となる異常な免疫応答を上方制御する炎症性サイトカインとして機能する。発明者らは、ＴＬＲ２タンパク質の生成を阻害することによって、ＴＬＲ２の活性化および情報伝達を下方制御することの有用性をさらに認識している。ＴＬＲ２の生成の阻害は、膜結合型ＴＬＲ２の下方制御をもたらし、次に、これは、ＴＬＲ２の情報伝達を減少させる。従って、発明者らは、ＴＬＲ２タンパク質の発現を阻害するために、抑制性核酸が投与される治療上のアプローチの有用性をさらに認識している。

従って、本発明のさらなる態様は、ＴＬＲ２を媒介したＩＬ−８の生成を抑制する方法を与え、当該方法は、
Ｔｏｌｌ様受容体２タンパク質の発現を遮断する治療有効量の抑制性核酸を準備する工程と、
同一のものをこのような治療を必要とする被験者に投与する工程と、を含む。

特定の実施態様では、核酸の阻害としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん分子、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡを挙げることができるが、これらに限定されない。

本願明細書において定義される、用語「阻害する」および「阻害している」は、遺伝子発現と関連して使用される場合、遺伝子発現の発現抑制を意味する。遺伝子発現抑制は、遺伝子の修飾以外の機構によって遺伝子発現のスイッチを切ることである。遺伝子発現抑制は、転写レベルまたは転写後レベルで媒介され得る。転写遺伝子発現抑制は、遺伝子が転写機構から隔絶する結果となる可能性があり、例えば、ヒストン修飾によって媒介され得る。転写後の遺伝子発現抑制は、破壊された遺伝子のｍＲＮＡに由来し、これは、ＴＬＲ２タンパク質が存在する場合に、活性な遺伝子生成物（タンパク質など）を阻む。

従って、１つの実施形態では、本発明のこの態様は、関節に発現した細胞型（例えば、軟骨または滑膜の細胞）への、ＴＬＲ２タンパク質の発現の遮断における使用のための、有効量のＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）剤（干渉リボ核酸（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）など）もしくはその転写鋳型（ｓｈＲＮＡをコードしているＤＮＡなど）の提供を与える。

さらなる実施態様では、当該阻害性分子は、アンチセンスＲＮＡであってもよい。アンチセンスは、遺伝子発現の抑制を引き起こし、ｍＲＮＡに物理的に結合する一本鎖ＲＮＡ断片に関連し、これは、ｍＲＮＡの翻訳を遮断する。核酸の阻害としての使用のための適切な核酸を調製する技術は、当業者に周知である。

本発明のさらなる態様によれば、関節リウマチの治療のための薬物の調製におけるＴｏｌｌ様受容体２タンパク質の発現を遮断する抑制性核酸の使用が提供される。

特定の実施態様では、当該抑制性核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん分子、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡからなる群から選択される。

本発明のさらなる態様によれば、関節リウマチの治療における使用のための医薬組成物が与えられ、当該組成物は、少なくとも１つの医薬品担体または希釈剤とともに、治療有効量の抑制性核酸を含む。

特定の実施態様では、当該抑制性核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん分子、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡを含む群から選択されるが、これらに制限されない。

特定の実施態様では、当該医薬組成物は、少なくとも１つの免疫抑制剤をさらに含んでもよい。

本発明のさらなる態様は、関節リウマチの治療における使用のための、これまで本願明細書に記載されたＴＬＲ２調節剤を与える。

本発明のさらなる態様は、関節リウマチの治療のための薬物の調製における使用のための、これまで本願明細書において定義されたＴＬＲ２調節剤の使用を与える。

さらなる態様では、本発明は、Ｔｏｌｌ様受容体２に対する結合特異性を有する少なくとも１つのアプタマーの提供にまでおよび、これは、Ｔｏｌｌ様受容体２の機能的活性の遮断または抑制の原因となる。適したアプタマーの選択のための技術は、当業者に周知であり、例えば、ＳＥＬＥＸ技術を使用する。

従って、様々なさらなる実施態様において、本発明は、Ｔｏｌｌ様受容体２に対する結合特異性を有する核酸リガンドを同定および単離する方法にまでおよび、当該方法は、
（ａ）核酸の候補混合物を準備する工程と、
（ｂ）Ｔｏｌｌ様受容体２を発現している細胞を、候補核酸混合物と接触させる工程と、
（ｃ）他の候補核酸に対して、Ｔｏｌｌ様受容体２への増加した親和性を有する核酸を選択する工程と、
（ｄ）Ｔｏｌｌ様受容体２に対する親和性を有する少なくとも１つの核酸を与えるために選択された核酸を増幅する工程と、
（ｅ）Ｔｏｌｌ様受容体２に対する高い親和性および特異性を有する少なくとも１つの核酸を選択する工程と、を含む。

本発明のさらなる態様では、薬剤がＴｏｌｌ様受容体２を媒介したインターロイキン８の生成を阻害するかどうかを判定するための方法が与えられ、当該方法は、
（ｉ）Ｔｏｌｌ様受容体２を発現している細胞を、当該薬剤およびＴｏｌｌ様受容体２作動薬に接触させる工程と、
（ｉｉ）Ｔｏｌｌ様受容体２への当該薬剤の結合を判定する工程と、を含み、インターロイキン８の存在の増加は、当該薬剤がＴｏｌｌ様受容体２を媒介したインターロイキン８の生成を阻害しないことを示す。

本発明は、これから、例証の目的で与えられ、本発明を制限するものとして解釈されることを意図していない下記の実施例への参照とともに記載される。
グラフ（ａ）および（ｂ）は、滑液試料で刺激された２９３ ＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞からのＩＬ−８の反応を示し、グラフ（ａ）において、３つの黒色の棒の各群は、最左の棒が０．１％滑液 ｖ／ｖの結果を表わし、中央の棒が１．０％滑液 ｖ／ｖの結果を示し、一方、最右の棒が１０％滑液 ｖ／ｖの結果を示し、かつ、グラフ（ａ）および（ｂ）は、６時間後の結果を示す。 グラフ（ｃ）および（ｄ）は、滑液試料で刺激された２９３ ＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞からのＩＬ−８の反応を示し、グラフ（ｃ）および（ｄ）において、３つの黒色の棒の各群は、最左の棒が０．１％滑液 ｖ／ｖの結果を表わし、中央の棒が１．０％滑液 ｖ／ｖの結果を示し、一方、最右の棒が１０％滑液 ｖ／ｖの結果を示し、かつ、グラフ（ｃ）および（ｄ）は、２４時間後の結果を示す。 グラフ（ａ）および（ｂ）は、滑液試料で刺激された２９３ ＨＥＫ−ＴＬＲ４細胞からのＩＬ−８の反応を示し、３つの黒色の棒の各群において、最左の棒は０．１％滑液 ｖ／ｖの結果を表わし、中央の棒は、１．０％滑液 ｖ／ｖの結果を示し、一方、最右の棒は、１０％滑液 ｖ／ｖの結果を示し、かつ、グラフ（ａ）および（ｂ）は、６時間後の結果を示す。 グラフ（ｃ）および（ｄ）は、滑液試料で刺激された２９３ ＨＥＫ−ＴＬＲ４細胞からのＩＬ−８の反応を示し、３つの黒色の棒の各群において、最左の棒は０．１％滑液 ｖ／ｖの結果を表わし、中央の棒は、１．０％滑液 ｖ／ｖの結果を示し、一方、最右の棒は、１０％滑液 ｖ／ｖの結果を示し、かつ、グラフ（ｃ）および（ｄ）は、２４時間後の結果を示す。 ２４時間刺激されたＨＥＫ−ＴＬＲ−２細胞の通常の滑液に対して、滑液試料からのＩＬ−８の倍増を示し、３つの黒色の棒の各群において、最左の棒は、０．１％滑液 ｖ／ｖの結果を表わし、中央の棒は、１．０％滑液 ｖ／ｖの結果を示し、一方最右の棒は、１０％滑液 ｖ／ｖの結果を示す。 ヒト Ｔｏｌｌ様受容体２のアミノ酸配列を示す（配列番号１）。 マウス Ｔｏｌｌ様受容体２のアミノ酸配列を示す（配列番号２）。 グラフＡ、ＢおよびＣは、患者から入手した３つの別々の滑膜組織の生検試料の小片からのＩＬ−１βの発現の結果を示す。ＩｇＧは、ＩｇＧ アイソタイプコントロール抗体 ＭＡＢ００２を示し、ヒュミラは、抗ＴＮＦα モノクローナル抗体 ヒュミラ（アダリムマブ）を示し、ＯＰＮは、抗ＴＬＲ２ モノクローナル抗体 ＯＰＮ−３０１である。 グラフＡ、ＢおよびＣは、患者から入手した３つの別々の滑膜組織の生検試料の小片からのＩＬ−６の発現の結果を示す。ＩｇＧは、ＩｇＧ アイソタイプコントロール抗体 ＭＡＢ００２を示し、ヒュミラは、抗ＴＮＦα モノクローナル抗体 ヒュミラ（アダリムマブ）を示し、ＯＰＮは、抗ＴＬＲ２ モノクローナル抗体 ＯＰＮ−３０１である。 グラフＡ、ＢおよびＣは、患者から入手した３つの別々の滑膜組織の生検試料の小片からのＴＮＦ−αの発現の結果を示す。ＩｇＧは、ＩｇＧ アイソタイプコントロール抗体 ＭＡＢ００２を示し、ヒュミラは、抗ＴＮＦα モノクローナル抗体 ヒュミラ（アダリムマブ）を示し、ＯＰＮは、抗ＴＬＲ２ モノクローナル抗体 ＯＰＮ−３０１である。 グラフＡ、ＢおよびＣは、患者から入手した３つの別々の滑膜組織の生検試料の小片からのＩＦＮ−γの発現の結果を示す。ＩｇＧは、ＩｇＧ アイソタイプコントロール抗体 ＭＡＢ００２を示し、ヒュミラは、抗ＴＮＦα モノクローナル抗体 ヒュミラ（アダリムマブ）を示し、ＯＰＮは、抗ＴＬＲ２ モノクローナル抗体 ＯＰＮ−３０１である。 ４つの別々の滑膜組織の生検試料の小片からのＩＬ−１β サイトカインの発現の結果を図示しているグラフＡ、Ｂを示す。基礎は、ＴＬＲ２作動薬 Ｐａｍ３Ｃｙｓを添加していないサイトカイン発現レベルを示す。Ｐａｍは、Ｐａｍ３Ｃｙｓの２つの別々の濃度の添加を示し、一方、ＴＮＦは、サイトカイン ＴＮＦ−αの添加を示す。 ４つの別々の滑膜組織の生検試料の小片からのＩＬ−１β サイトカインの発現の結果を図示しているグラフＣ、Ｄを示す。基礎は、ＴＬＲ２作動薬 Ｐａｍ３Ｃｙｓを添加していないサイトカイン発現レベルを示す。Ｐａｍは、Ｐａｍ３Ｃｙｓの２つの別々の濃度の添加を示し、一方、ＴＮＦは、サイトカイン ＴＮＦ−αの添加を示す。 ４つの別々の滑膜組織の生検試料の小片からのＩＬ−６ サイトカインの発現の結果を図示しているグラフＡ、Ｂを示す。基礎は、ＴＬＲ２作動薬 Ｐａｍ３Ｃｙｓを添加していないサイトカイン発現レベルを示す。Ｐａｍは、Ｐａｍ３Ｃｙｓの２つの別々の濃度の添加を示し、一方、ＴＮＦは、サイトカイン ＴＮＦ−αの添加を示す。 ４つの別々の滑膜組織の生検試料の小片からのＩＬ−６ サイトカインの発現の結果を図示しているグラフＣ、Ｄを示す。基礎は、ＴＬＲ２作動薬 Ｐａｍ３Ｃｙｓを添加していないサイトカイン発現レベルを示す。Ｐａｍは、Ｐａｍ３Ｃｙｓの２つの別々の濃度の添加を示し、一方、ＴＮＦは、サイトカイン ＴＮＦ−αの添加を示す。 ４つの別々の滑膜組織の生検試料の小片からのＴＮＦ−α サイトカインの発現の結果を図示しているグラフＡ、Ｂを示す。基礎は、ＴＬＲ２作動薬 Ｐａｍ３Ｃｙｓを添加していないサイトカイン発現レベルを示す。Ｐａｍは、Ｐａｍ３Ｃｙｓの２つの別々の濃度の添加を示す。ＴＮＦ−α 陽性対照をこの実験に含めたが、結果が１０１２〜３１０３ ＴＮＦ−α ｐｇ／ｍｌにおよんだため、グラフＡおよびＢから除外した。 ４つの別々の滑膜組織の生検試料の小片からのＴＮＦ−α サイトカインの発現の結果を図示しているグラフＣ、Ｄを示す。基礎は、ＴＬＲ２作動薬 Ｐａｍ３Ｃｙｓを添加していないサイトカイン発現レベルを示す。Ｐａｍは、Ｐａｍ３Ｃｙｓの２つの別々の濃度の添加を示す。ＴＮＦ−α 陽性対照をこの実験に含めたが、結果が１０１２〜３１０３ ＴＮＦ−α ｐｇ／ｍｌにおよんだため、グラフＣおよびＤから除外した。 ４つの別々の滑膜組織の生検試料の小片からのＩＦＮ−γ サイトカインの発現の結果を図示しているグラフＡ、Ｂを示す。基礎は、ＴＬＲ２作動薬 Ｐａｍ３Ｃｙｓを添加していないサイトカイン発現レベルを示す。Ｐａｍは、Ｐａｍ３Ｃｙｓの２つの別々の濃度の添加を示し、一方、ＴＮＦは、サイトカイン ＴＮＦ−αの添加を示す。 ４つの別々の滑膜組織の生検試料の小片からのＩＦＮ−γ サイトカインの発現の結果を図示しているグラフＣ、Ｄを示す。基礎は、ＴＬＲ２作動薬 Ｐａｍ３Ｃｙｓを添加していないサイトカイン発現レベルを示す。Ｐａｍは、Ｐａｍ３Ｃｙｓの２つの別々の濃度の添加を示し、一方、ＴＮＦは、サイトカイン ＴＮＦ−αの添加を示す。 患者７由来の生検試料からの外植の阻害を示し、ＩＬ−６（グラフＡ）またはＩＬ−８（グラフＢ）の読み出しが示される。特に、１ｕｇおよび５００ｕｇの投与量で与えられたモノクローナル抗体 ＯＰＮ−３０１による阻害。ＩｇＧ アイソタイプコントロール抗体に対する比較が示され、かつ、市販の入手可能な抗体 ヒュミラ（アダリムマブ）（アボット ラボラトリーズ社）（ＴＮＦ−αを中和するモノクローナル抗体であり、従って、関節リウマチの治療におけるＴＮＦ阻害剤として使用される）との比較も示される。 患者８由来の生検試料からの外植の阻害を示し、ＩＬ−６（グラフＡ）またはＩＬ−８（グラフＢ）の読み出しが示される。特に、１ｕｇおよび５００ｕｇの投与量で与えられたモノクローナル抗体 ＯＰＮ−３０１による阻害。ＩｇＧ アイソタイプコントロール抗体に対する比較が示され、かつ、市販の入手可能な抗体 ヒュミラ（アダリムマブ）（アボット ラボラトリーズ社）（ＴＮＦ−αを中和するモノクローナル抗体であり、従って、関節リウマチの治療におけるＴＮＦ阻害剤として使用される）との比較も示される。 抗ＴＬＲ２ モノクローナル抗体 ＯＰＮ３０１（グラフＡ）、またはモノクローナル抗体 ＯＰＮ３０１とＴｏｌｌ様受容体作動薬 Ｐａｍ３ＣＳＫ４（グラフＢ）による外植の刺激および／または阻害を示す。ＩｇＧ アイソタイプコントロール抗体との比較が示され、かつ、市販の入手可能な抗体 ヒュミラ（アダリムマブ）（アボット ラボラトリーズ社）（ＴＮＦ−αを中和するモノクローナル抗体であり、従って、関節リウマチの治療におけるＴＮＦ阻害剤として使用される）との比較も示される。

本発明は、少なくとも部分的には、自己免疫性関節炎の発生または進行に関連付けられるＴＬＲ２発現細胞または組織のＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）の１つ以上の生物活性を減少させる方法に基づき、細胞または組織を、細胞または組織におけるＴＬＲ２の１つ以上の生物活性を減少させるのに十分な量のＴＬＲ２活性または発現の拮抗薬と接触させる工程を含む。特定の実施態様では、ＴＬＲ２発現細胞または組織は、滑膜組織の細胞である。特定の実施態様では、当該接触させる工程は、細胞可溶化物、再構成系または培養液中の細胞で起こる。当該接触させる工程は、被験者に存在している細胞上で起きてもよく、当該被験者は、自己免疫性関節炎を有する、またはこれを有するリスクを有するヒト患者であってもよい。当該ＴＬＲ２は、ヒトまたはマウスのＴＬＲ２であってもよい。特定の実施態様では、当該拮抗薬は、ＴＬＲ２の細胞外領域に結合してもよい。

従って、特定の態様では、本発明は、Ｔｏｌｌ様受容体２の機能を阻害するために、Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）と特異的に結合する結合化合物またはその断片を与える。本発明は、免疫介在性の疾病、特に、自己免疫の症状（関節炎、特に、ＴＬＲ２を媒介した免疫細胞の活性化が疾患病状に寄与している関節リウマチなど）の治療のための組成物、使用および方法をさらに与える。

本発明の結合エピトープに対する親和性および結合特異性を有する結合化合物は、多くの自己免疫の症状（関節リウマチなど）の阻害において有用性を有し、これは、Ｔｏｌｌ様受容体２を通じた情報伝達の後に媒介され、または引き起こされる。

そのため、本発明は、関節における免疫介在性の症状および炎症性の症状または病原性の症状（関節リウマチなど）の治療のための組成物および方法を与える。

さらなる態様では、本発明は、試験試料における自己免疫性関節炎の進行を評価、診断、および／またはモニターする方法を与える。当該方法は、ＴＬＲ２またはＴＬＲ２に関連する遺伝子から選択された、核酸もしくはポリペプチドの発現または活性の評価を含み、そのため、参考試料（通常の健康な被験者から入手した試料など）に対する核酸またはポリペプチドのレベルの相違は、試験試料の由来である被験者における自己免疫性関節炎の存在または進行を判定するように、試料の処理の前に判定され得る。特定の実施態様では、ＴＬＲ２に関連する核酸またはポリペプチドは、本発明のＴＬＲ２調節剤に対する反応において変化した発現によって特徴付けられる。

特定の実施態様では、参考試料に対する、試験試料中のＴＬＲ２またはＴＬＲ２に関連する遺伝子のレベルの増加は、ＴＬＲ２を媒介したＩＬ−８の生成が、自己免疫性関節炎に関連する疾患病状の発生および進行に寄与するかも知れないという可能性を示し得る。他の実施形態では、参考試料に対する、試験試料中のＴＬＲ２またはＴＬＲ２に関連する遺伝子のレベルの減少は、本発明のＴＬＲ調節剤の化合物が、ＴＬＲ２を媒介した自己免疫性関節炎の発生または進行の可能性を減少させるように作用していることを示し得る。

特定の実施態様では、評価工程はｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで生じる。例えば、試料（血清試料など）は、被験者から入手される。特定のさらなる実施態様では、当該評価工程は、ｉｎ ｖｉｖｏで生じる。例えば、被験者に、ＴＬＲ２、またはＴＬＲ２に関連する核酸もしくはポリペプチドと相互作用する、検出可能な程度に標識された薬剤を投与することにより、その結果、シグナルが核酸もしくはポリペプチドの活性または発現のレベルに関連して生じる。

さらに別の態様では、本発明は、ＴＬＲ２の機能を調節する化合物（例えば、試験化合物）を同定するための方法またはアッセイを与える。当該方法またはアッセイは、ＴＬＲ２またはＴＬＲ２に関連するタンパク質と相互作用する（例えば、これらに結合する）試験薬剤を準備または同定する工程を含んでいてもよい。当該試験化合物は、抗体分子、ペプチド、可溶性ＴＬＲ２もしくはその融合物、変異体分子、小分子（例えば、コンビナトリアルライブラリーまたは天然の生成物のライブラリーのメンバー）、核酸、アンチセンス分子、リボザイム、ＲＮＡｉ、三重らせん分子、またはそのいずれかの組み合わせであり得る。特定の実施態様では、当該試験化合物は、ＴＬＲ２ポリペプチドもしくは核酸の活性または発現を調節（例えば、減少または増加）する。例えば、ＴＬＲ２核酸の発現は、例えば、ｍＲＮＡの転写の変化および／またはｍＲＮＡの安定性の変化によって調節できる。

特定の実施態様では、評価工程は、ＴＬＲ２（例えば、本願明細書に記載されたＴＬＲ２）、またはＴＬＲ２をコードしている核酸のうち１つ以上を、試験化合物と接触させる工程と、当該試験化合物の存在下で、所定のレベル（例えば、当該試験化合物のない対照試料）に対して、ＴＬＲ２ポリペプチドまたはこれをコードしている核酸の１つ以上の活性の変化を評価する工程と、を含む。当該接触させる工程は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（培養された細胞（例えば、内膜細胞または内膜下細胞）中）またはｉｎ ｖｉｖｏ（例えば、当該試験化合物を、非ヒト被験者、例えば、自己免疫性関節炎またはＴＬＲ２もしくはＴＬＲ２に関連するタンパク質をコードしている遺伝子における変異を有する動物モデルに投与することによる）で作用する可能性がある。当該接触させる工程（単数または複数）および／または当該試験化合物の投与は繰り返してもよい。

１つの実施形態では、当該試験化合物は、同一のまたは異なるアッセイにおいて同定され、かつ評価される。例えば、試験化合物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは無細胞系において同定され、動物モデルまたは細胞に基づいたアッセイで評価される。いずれの順序または組み合わせのアッセイが使用されてもよい。例えば、高処理量のアッセイは、動物モデルまたは組織培養と組み合わせて使用され得る。他の実施形態では、当該方法またはアッセイは、近接依存性信号発生（例えば、第１の融合タンパク質（例えば、ＴＬＲ２部分を含む融合タンパク質）および第２の融合タンパク質（例えば、ＴＬＲ２に関連するポリペプチドを含む融合タンパク質）を含む二重ハイブリッドアッセイ）に基づいた工程を準備する工程と、二重ハイブリッドアッセイを、試験化合物に、当該ツーハイブリッド法が、複合体の形成および／または安定性における変化（例えば、レポーター遺伝子の転写の活性化を開始する複合体の形成）を検出する条件下で接触させる工程と、を含む。

さらに別の態様では、本発明は、１つ以上のＴＬＲ２もしくは本願明細書で開示された複合体のＴＬＲ２に関連するポリペプチド成分をコードする１つ以上の核酸を含む宿主細胞を与える。

本願明細書で使用される用語「エピトープ」は、特異的結合リガンドによって結合されることができる高分子の一部、この場合、ポリペプチドの一部（特に、Ｔｏｌｌ様受容体２）に関連する。エピトープは、ポリペプチド配列内に含まれるアミノ酸残基の近接配列または非近接配列から定められてもよい。用語「近接するエピトープ」は、エピトープを定めるポリペプチド内のアミノ酸残基の線形列からなるエピトープを定義する。「非近接エピトープ」は、アラインメントが非線形の一連のアミノ酸残基からなるエピトープであり、すなわち、非連続的な様式で、ポリペプチド配列の長さに沿って、残基が配置され、または分類されている。非連続的なエピトープは、アミノ酸残基が２つの線形配列に分類される非連続的なエピトープであってもよく、あるいは、当該非連続的なエピトープは、当該エピトープに寄与する残基がポリペプチドの長さに沿って配置された線形アミノ酸配列の３つ以上の群において与えられる非連続的な散乱したエピトープであってもよい。

（抗体）
本発明によって与えられる抗体は、いくつかの技術によって与えられてもよい。例えば、ファージディスプレイに基づいたバイオパニングアッセイなどのスクリーニング技術の組み合わせは、本発明の結合エピトープに対する結合特異性を有するアミノ酸配列を同定するために使用されてもよい。このようなファージディスプレイバイオパニング技術はファージディスプレイライブラリーの使用に関連し、これは、免疫選択を模倣する手順における、適したエピトープ結合リガンドを同定する方法において、糸状性細菌の表面上の抗体結合断片のディスプレイを通じて利用される。特異的結合活性を有するファージが選択される。選択されたファージは、その後、キメラ抗体、ＣＤＲグラフトされた抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体の産生において使用できる。

さらなる実施態様では、当該抗体は、培養における連続的な細胞株による抗体分子を産生するいずれかの適した方法を使用して産生されていてもよいモノクローナル抗体である。適した方法は当業者に周知であり、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｋｏｈｌｅｒら Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５−４９７．１９７５）が挙げられ、キメラ抗体またはＣＤＲグラフトされた抗体は、本発明の範囲内でさらに提供される。さらなる実施態様では、本発明の抗体は、宿主細胞における組み換えＤＮＡの発現によって産生されてもよい。

さらなる実施態様では、ヒト化抗体もまた与えられる。ヒト化抗体は、米国特許第５，５８５，０８９号明細書に記載されたＷｉｎｔｅｒの方法によって産生されてもよい。

さらなる特定の実施態様では、当該モノクローナル抗体はヒト抗体であってもよく、遺伝子導入動物（例えば、遺伝子導入マウス、これは内在性のマウスの免疫グロブリン遺伝子の発現を欠損させ、または抑制するように遺伝的に修飾されている）を使用して産生され、優先して発現されるヒトの重鎖および軽鎖をコードする部位を有し、これは完全なヒト抗体の産生をもたらす。

特定のさらなる実施態様では、当該結合化合物は、抗体（例えば、抗体結合断片（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖまたは単鎖のＦｖ（ｓｃＦＶ）など））に由来する結合断片である。

特定のさらなる実施態様では、当該結合化合物は、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、合成された抗体もしくは合成抗体、融合タンパク質もしくはその断片、または天然もしくは合成の化学物質またはペプチド模倣薬を含む。

「抗体」は免疫グロブリンであり、天然または、部分的もしくは全体的な合成によって産生される。当該用語はまた、抗体結合領域である、もしくはこれと相同である結合領域を有する、いずれかのポリペプチド、タンパク質またはペプチドを網羅する。これらは天然の供給源由来であってもよく、またはこれらは部分的もしくは全体的な合成によって産生されてもよい。抗体の例は、免疫グロブリンアイソタイプおよびそのアイソタイプのサブクラス、および抗原結合領域（Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄなど）を含む断片、ならびに二重特異性抗体である。

さらなる実施態様では、当該抗体は、ラクダ抗体、特に、ラクダ重鎖抗体であってもよい。さらに当該抗体の断片は、ラクダ重鎖抗体由来の領域抗体またはナノボディであってもよい。さらなる実施態様では、当該抗体は、サメ抗体またはサメ由来の抗体であってもよい。

特定の実施態様では、当該抗体は「単離された抗体」であり、これは、当該抗体が（１）通常見出される少なくともいくつかのタンパク質を含まず、（２）同一の供給源（例えば、同一の種）からの他のタンパク質を基本的に含まず、（３）異なる種からの細胞によって発現され、または（４）天然には生じないことを意味する。

抗体はいくつかの方法で修飾できるため、用語「抗体」は、要求された特異性を有する結合領域を有するいずれかの結合メンバーまたは物質を網羅するように解釈されるべきである。本発明の抗体は、モノクローナル抗体もしくは断片、誘導体、その機能的な等価物もしくは相同体であってもよい。当該用語は、天然または全体的にもしくは部分的に合成された、免疫グロブリン結合領域を含むいずれかのポリペプチドを含む。従って、別のポリペプチドに融合された免疫グロブリン結合領域もしくは等価物を含むキメラ分子が含まれる。キメラ抗体のクローンおよび発現は、欧州特許出願公開第０，１２０，６９４号明細書および欧州特許出願公開第０，１２５，０２３号明細書に記載されている。

抗体サブタイプはＩｇＧ１であることが好ましいが、抗体の定常部は、いずれかの適した免疫グロブリンサブタイプであってもよい。しかし、別の実施態様では、当該抗体のサブタイプは、ヒト免疫グロブリン分子が使用されるＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥクラスのものであってもよい。このような抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４など（しかしこれらに限定されない）のいずれかのサブクラスにさらに属していてもよい。

本願明細書に記載された抗体分子および／または可溶性もしくは融合タンパク質は、１つ以上の他の分子実体（例えば、抗体（例えば、二重特異性抗体または多選択性抗体）、毒素、放射性同位元素、細胞傷害性薬剤または細胞分裂阻害剤など）に、機能的に結合されていてもよい（例えば、化学的結合、遺伝子融合、非共有結合性会合などによる）。

全抗体の断片は、抗原結合の機能を果たすことができる。このような結合断片の例は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１抗体領域を含むＦａｂ断片；１つの抗体のＶＬおよびＶＨ領域からなるＦｖ断片；Ｆ（ａｂ’）２断片、２つの結合されたＦａｂ断片を含む二価断片；ＶＨ領域およびＶＬ領域がペプチドリンカーによって結合され、これにより２つの領域が、抗原結合部位を形成するように関連することが可能となる、単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）；または遺伝子融合によって構築された多価もしくは多選択性の断片であってもよい二重特異性抗体、である。

本発明における使用のための抗体またはポリペプチドの断片（例えば、ＴＬＲ２特異的な抗体の断片）は、一般的に、少なくとも５〜７の近接するアミノ酸（しばしば、少なくとも約７〜９の近接するアミノ酸、典型的には少なくとも約９〜１３の近接するアミノ酸、より好ましくは少なくとも約２０〜３０以上のより近接するアミノ酸、および最も好ましくは少なくとも約３０〜４０以上の連続したアミノ酸）のアミノ酸残基の伸長を意味する。

このような抗体またはポリペプチドまたはＴＬＲ２特異的な抗体の断片の「誘導体」は、タンパク質のアミノ酸配列の変動（例えば、当該タンパク質をコードする核酸の操作、または当該タンパク質自体の変化による）によって修飾された抗体またはポリペプチドを意味する。天然のアミノ酸配列のこのような誘導体は、好ましくはＴＬＲ２結合活性を有するペプチドを与える間に、１つ以上のアミノ酸の挿入、付加、欠損および／または置換に関連していてもよい。好ましくは、このような誘導体は、２５以下のアミノ酸（より好ましくは１５以下、さらにより好ましくは１０以下、さらにより好ましくは４以下、最も好ましくは１または２のアミノ酸のみ）の挿入、付加、欠損および／または置換に関連する。

用語「抗体」は、「ヒト化」された抗体を含む。ヒト化抗体を作製する方法は当該技術分野で公知である。方法は、例えば、Ｗｉｎｔｅｒ（米国特許第５，２２５，５３９号明細書）によって記載されている。ヒト化抗体は、モノクローナル抗体（ＴＬＲ２特異的な抗体など）の高頻度可変性領域およびヒト抗体の定常部を有する、修飾された抗体であってもよい。従って、結合メンバーは、ヒト定常部を含んでいてもよい。

高頻度可変性領域以外の可変領域はまた、ヒト抗体の可変領域由来であってもよく、かつ／または、ＴＬＲ２特異的な抗体などのモノクローナル抗体由来であってもよい。このような場合、全体の可変領域は、マウスのモノクローナル抗体、ＴＬＲ２特異的な抗体由来であってもよく、当該抗体は、キメラ化されたと言える。キメラ化された抗体を作製するための方法は当該技術分野で公知である。このような方法としては、例えば、Ｂｏｓｓ（セルテック（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ））およびＣａｂｉｌｌｙ（ジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ））によって米国特許明細書に記載されたものが挙げられる。それぞれ、米国特許第４，８１６，３９７号明細書および米国特許第４，８１６，５６７号明細書参照。

最初の抗体の特異性を保持する他の抗体またはキメラ分子を産生するために、モノクローナル抗体および他の抗体を得て、組み換えＤＮＡ技術の技術を使用することが可能である。このような技術は、異なる免疫グロブリンの定常部または定常部とフレームワーク領域に対する抗体の免疫グロブリン可変領域もしくは相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードしているＤＮＡの導入に関連していてもよい。例えば、欧州特許出願公開第０，１８４，１８７（Ａ）号明細書、英国特許出願公開第２，１８８，６３８（Ａ）号明細書または欧州特許出願公開第２３９，４００（Ａ）号明細書を参照。抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞は、産生された抗体の結合特異性を変化させる（または変化させない）遺伝的変異または他の変化にさらしてもよい。

特定の実施態様では、ＴＬＲ２抑制化合物またはＴＬＲ結合化合物が抗体である場合、当該抗体は、被験者に治療有効量で投与される。特定の実施態様では、当該治療有効量は、１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１ｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１００ｐｇ／ｋｇ、および５００ｐｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇから選択される範囲の抗体を含む。

（抗体の生成）
本発明のＴＬＲ２エピトープに対して親和性および結合特異性を有する抗体を産生するための特定の方法論は、これまでに本願明細書に記載されている。

本発明の抗体または抗体断片、および本発明における使用のための抗体または抗体断片はまた、全体的または部分的に、化学合成によって生成されてもよい。当該抗体は、確立された、標準的な、液相または、好ましくは固相のペプチド合成法に従ってすぐに調製することができ、その一般的な記述は、広く利用可能であり、当業者に周知である。さらに、これらは、溶液中で、液相法または、固相、液相および溶液化学のうちのいずれかの組み合わせによって調製されてもよい。

本発明における使用に適した抗体または抗体断片の産生の別の簡便な方法は、これらをコードしている核酸を、発現系における核酸の使用によって発現させることである。

本発明に従った使用のための核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでいてもよく、全体的にまたは部分的に合成されてもよい。好ましい態様では、本発明における使用のための核酸は、上記の本発明の抗体または抗体断片をコードする。当業者は、本発明の抗体または抗体断片を依然として与える、このような核酸に対する置換、欠損および／または付加を決定することができる。

本発明とともに使用するための抗体または抗体断片をコードしている核酸配列は、核酸配列およびクローンが利用可能である場合、当業者によって、本願明細書に含まれた情報および参考文献ならびに当該技術分野で公知の技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）、およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９２）参照）を使用してすぐに調製することができる。これらの技術としては、（ｉ）（例えば、ゲノム供給源からの）このような核酸試料を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用、（ｉｉ）化学合成、または（ｉｉｉ）ｃＤＮＡ配列の調製、が挙げられる。抗体断片をコードしているＤＮＡは、当業者に知られたいずれかの適した方法（コードＤＮＡの入手、発現される部分のいずれかの側の適した制限酵素の認識部位の同定、および当該ＤＮＡからの当該部分の切断による方法を含む）で生成し、使用してもよい。次いで、当該部分は、適したプロモーターに、標準的な市販の入手可能な発現系で、作動可能に連結（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）されてもよい。別の組み換えアプローチは、ＤＮＡの関連する部分を、適したＰＣＲプライマーで増幅することである。配列の修飾は、例えば、部位特異的な変異原性を使用して、修飾されたペプチドの発現を導くように、または核酸を発現するために使用される宿主細胞におけるコドンの優先度を考慮するようになされることができる。

当該核酸は、上記の少なくとも１つの核酸を含むプラスミド、ベクター、転写もしくは発現カセットの形態の構築物として含まれていてよい。当該構築物は、上記の１つ以上の構築物を含む組み換え宿主細胞内に含まれていてもよい。

発現は、適切な条件下で、当該核酸を含んでいる組み換え宿主細胞を培養することによって簡便に達成されてもよい。発現による産生後、当該抗体または抗体断片は、いずれかの適した技術を使用して単離され、かつ／または精製され、次いで必要に応じて使用されてもよい。

様々な異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現のための系は周知である。適した宿主細胞としては、バクテリア、哺乳類の細胞、酵母、昆虫およびバキュロウイルスの系が挙げられる。異種のポリペプチドの発現のための当該技術分野において利用可能な哺乳類の細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳ０ マウス ミエローマ細胞が挙げられる。一般的な、好ましいバクテリアの宿主は大腸菌である。原核細胞（大腸菌など）における抗体および抗体断片の発現は、当該技術分野で確立されている。培養液中の真核細胞における発現もまた、結合メンバーの産生の選択肢として、当業者が利用可能である。

抗体産生の一般的な技術は、当業者に周知であり、このような方法は、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７；米国特許第４，３７６，１１０号明細書；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（１９８８）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒにおいて考察されており、これらの内容は、参照によって本願明細書に組み込まれる。

組み換え抗体分子の調製のための技術は、上記参考文献、およびまた、例えば、欧州特許第０６２３６７９号明細書、欧州特許第０３６８６８４号明細書および欧州特許第０４３６Ｓ９７号明細書にも記載され、これらは参照によって本願明細書に組み込まれる。

本発明の好ましい実施態様では、抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードしている挿入断片を含む組み換え核酸が使用される。定義により、このような核酸は、コード一本鎖核酸、コード核酸およびその相補的核酸からなる二本鎖核酸、またはこれらの相補的（一本鎖の）核酸自身を含む。

さらに、抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードしている核酸は、自然に生じる重鎖可変領域および／もしくは軽鎖可変領域、またはその変異体をコードする確証的な配列を有する酵素的、または化学的に合成された核酸であってもよい。

組み換えＤＮＡ技術は、本発明の抗体を改善するために使用してもよい。従って、キメラ抗体は、その免疫原性を、診断上または治療上の適用において減少させるために構築されてもよい。さらに、例えば、遺伝子組み換え体（ブタなど）内の免疫原性は、抗体のヒト化に類似する技術であるＣＤＲグラフティングによって、抗体を変化させることによって最小化してもよい。このような技術の例は、欧州特許第０，２３９，４００号明細書（Ｗｉｎｔｅｒ）に記載されている。受容者内の免疫原性を減少させるため、本発明は、ヒト定常部に融合された抗体の重鎖可変領域をコードしている挿入断片を含む組み換え核酸を使用してもよい。同様に、本発明は、ヒト定常部κまたはλに融合された抗体の軽鎖可変領域をコードしている挿入断片を含む組み換えＤＮＡに関する。

抗体は、さらに、抗体の５つの人工レパートリーを産生するための抗体遺伝子の変異原性によって生成されてもよい。この技術は、抗体ライブラリーの調製を可能にする。抗体ライブラリーはまた、市販で入手可能である。従って、本発明は、免疫グロブリンの人工レパートリー（好ましくは人工ｓｃＦｖ レパートリー）を、免疫グロブリン供給源として、本発明のエピトープに対して特異性を有する結合分子を同定するために有利に使用する。

（抗体の選択系）
本発明のエピトープに結合でき、従って、本発明の方法において使用してもよい免疫グロブリンは、当業者に知られたいずれかの技術を使用して同定できる。このような免疫グロブリンは、免疫グロブリンポリペプチドの人工レパートリーを含むライブラリーから簡便に単離されてもよい。「レパートリー」は、結合特異性の多重度を与えるために、核酸レベルで、１つ以上の鋳型分子のランダム、半ランダムに、または定方向変異性で生じた一連の分子を意味する。レパートリーを生じるための方法は、当該技術分野においてよく特徴付けられている。

いずれかのライブラリー選択系は、本発明と組み合わせて使用してもよい。大きなライブラリーの所望のメンバーを単離するための選択手順は当該技術分野で公知であり、ファージディスプレイ技術によって典型的に表わされる。このような系は、多様なペプチド配列が糸状バクテリオファージ表面上で示され、標的抗原に結合する特定の抗体断片のｉｎ ｖｉｔｒｏでの選択および増幅のため、抗体断片（およびこれらをコードするヌクレオチド配列）のライブラリーの創出に有用であることが立証されてきた。ＶＨおよびＶＬの領域をコードするヌクレオチド配列は、それらを大腸菌の細胞膜周辺腔に方向付けるリーダーシグナルをコードする遺伝子断片に結合され、結果として、得られた抗体断片は、バクテリオファージ表面上に示される（典型的に、バクテリオファージ コートタンパク質（例えば、ｐＩＩＩまたはｐＶＩＩＩ）に融合する）。あるいは、抗体断片は、λファージのカプシド（ファージ体）上の外部に示される。ファージに基づいたディスプレイ系の利点は、これらが生物学的な系であるため、選択されたライブラリーのメンバーが、バクテリア細胞の選択されたライブラリーメンバーを含むファージを単に増殖することによって、増殖できることである。さらに、ポリペプチドライブラリーメンバーをコードするヌクレオチド配列が、ファージまたはファージミドベクター上に含まれるため、配列決定、発現および引き続く遺伝子操作は、相対的に単純である。

バクテリオファージ抗体ディスプレイライブラリーおよびλファージ発現ライブラリーを構築する方法は、当該技術分野で周知である（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８ ５５２−５５４）。１つの特に有利なアプローチは、ｓｃＦｖ ファージ−ライブラリーの使用である（例えば、Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ参照）．

ファージまたは他のクローンライブラリーの使用に代わるものは、選択された標的（例えば、本発明のＴＬＲ２エピトープ）で免疫化された動物のＢ細胞由来の核酸（好ましくはＲＮＡ）の使用である。

Ｖ−領域およびＣ−領域のｍＲＮＡの単離は、抗体断片（ＦａｂまたはＦｖなど）が細胞内で発現するのを可能にする。手短に言えば、ＲＮＡは免疫化された動物のＢ細胞から（例えば、免疫化されたマウスの脾臓から）単離され、ＰＣＲプライマーがＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡをＲＮＡプールから選択的に増幅するために使用される。従って、得られたＶＨおよびＶＬの配列は、ｓｃＦｖ抗体を作製するために連結される。ＰＣＲプライマー配列は、公表されたＶＨおよびＶＬの配列に基づいていてもよい。

（ペプチド模倣薬）
ペプチド類似体（ペプチド模倣薬（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）またはペプチド模倣薬（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃ）など）は、鋳型ペプチドの代表的な特性を有する非ペプチド化合物である。このようなペプチド類似体は、典型的に、コンピューター化された分子モデリングを使用して開発される。本発明のＴＬＲ２結合エピトープに対する親和性および結合特異性を有するペプチドに構造的に類似するペプチド模倣薬は、類似する診断上の、予防のおよび治療上の効果を媒介するために使用されてもよい。

ペプチド模倣薬は、典型的に、鋳型ペプチドに構造的に類似するが、当該技術分野で周知の方法によって別の連鎖によって置き換えられた１つ以上のペプチド連鎖を有する。例えば、本発明のＴＬＲ２エピトープに対する結合特異性を有するペプチドは、それがアミド結合置換、非ペプチド部分の取り込み、または主鎖の環化を含むように修飾されていてもよい。適切にシステインが存在する場合、この残基のチオールは、遊離硫酸基の損傷を防ぐためにキャップされる。ペプチドは、プロテアーゼの攻撃から当該ペプチドを保護するため、天然配列からさらに修飾されていてもよい。

適切に、本発明のペプチドおよび本発明における使用のためのペプチドは、少なくとも１つのＣおよび／またはＮ−末端のキャップ形成、および／またはシステイン残基のキャップ形成を使用してさらに修飾されていてもよい。

適切に、本発明のペプチドおよび本発明における使用のためのペプチドは、Ｎ末端残基で、アセチル基でキャップされていてもよい。適切に、本発明のペプチドおよび本発明における使用のためのペプチドは、Ｃ末端で、アミド基でキャップされていてもよい。適切に、システインのチオール基は、アセトアミドメチル基でキャップされる。

本発明のエピトープおよびその断片を定めるポリペプチドの発現、単離および精製は、いずれかの適した技術によって達成されてもよい。

ポリペプチドを産生するための方法は、ポリペプチドをコードする組み換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞を、当該ポリペプチドの発現を促進する条件下で培養する工程と、次いで、発現されたポリペプチドを培養物から回収する工程と、を含む。当業者は、発現されたポリペプチドを精製するための手順は、使用された宿主細胞のタイプなどの要因、および当該ポリペプチドが細胞内、膜結合型または宿主細胞から分泌される可溶型であるかどうかによって変わることを認識するだろう。

いずれかの適した発現系が使用されてもよい。ベクターは、適した転写または翻訳の制御性ヌクレオチド配列に作動可能に連結した、本発明のポリペプチドまたは断片をコードしているＤＮＡであって、哺乳類、トリ、微生物、ウイルス、バクテリア、または昆虫の遺伝子に由来するものを含む。制御配列がＤＮＡ配列と機能的に関連している場合、ヌクレオチド配列は、作動可能に連結される。従って、当該プロモーターヌクレオチド配列が当該ＤＮＡ配列の転写を制御する場合、プロモーターヌクレオチド配列はＤＮＡ配列に作動可能に連結される。所望の（大腸菌）宿主細胞において複製する能力を与える複製の開始点、および形質転換体が同定された選択遺伝子は、一般的に、発現ベクターに組み込まれる。

さらに、（天然または異種の）適切なシグナルペプチドをコードしている配列は、発現ベクターに組み込むことができる。シグナルペプチド（分泌性リーダー）のＤＮＡ配列は、本発明の核酸配列のフレームで融合されてもよく、そのため、当該ＤＮＡは最初に転写され、ｍＲＮＡが当該シグナルペプチドを含む融合タンパク質に翻訳される。意図された宿主細胞において機能的であるシグナルペプチドは、当該ポリペプチドの細胞外分泌を促進する。当該シグナルペプチドは、翻訳の間に当該ポリペプチドから切断されるが、細胞からのポリペプチドの分泌を可能にする。

ポリペプチドの発現のための適した宿主細胞としては、より高度な真核生物の細胞および酵母が挙げられる。原核細胞系もまた適している。哺乳類の細胞および、特に、ＣＨＯ細胞は、宿主細胞としての使用に特に好ましい。哺乳類、原核生物、酵母、真菌および昆虫の宿主細胞との使用のための、適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８６）（ＩＳＢＮ ０４４４９０４０１８）において記載されている。

（小分子）
様々なさらなる態様では、本発明は、ＴＬＲ２活性に拮抗する化合物の同定における使用のためのスクリーニングおよびアッセイの方法に関する。特定のさらなる態様は、同定された化合物にまでおよび、それによって、当該結合化合物が本発明のエピトープに対する親和性および結合特異性を有する。

ＴＬＲ２受容体のリガンドとして同定された物質は、ペプチドであってもよく、または事実上非ペプチドであってもよい（例えば、これまで本願明細書に記載されたペプチド模倣薬）。しかし、非ペプチド「小分子」は、多くのｉｎ−ｖｉｖｏの医薬品の使用についてしばしば好ましい。従って、本発明における使用のためのＴＬＲ２結合化合物の模倣薬または模倣物は、医薬品の使用に対して設計されてもよい。

公知の薬剤的に活性な化合物に対する模倣薬の設計は、「リード」化合物に基づく、医薬品の開発において公知のアプローチである。これは、活性な化合物を合成することが困難または高価である場合、または投与の特定の方法について適していない場合に望ましいという可能性がある。例えば、ペプチドは、これらが消化管に存在するプロテアーゼによって分解されるため、経口組成物および投与のための活性な薬剤としてあまり適していない。模倣薬の設計、合成および試験は、標的特性について多数の分子をランダムにスクリーニングすることを避けるために使用されてもよい。

所定の標的特性を有する化合物からの模倣薬の設計において通常採られるいくつかの工程がある。第１に、標的特性の決定において重大なおよび／または重要な当該化合物の特定の部分が決定される。ペプチドの場合、これは、当該ペプチドのアミノ酸残基を体系的に変動させることによって（例えば、各アミノ酸残基を次々に置換することによって）なすことができる。化合物の活性な領域を構成するこれらの部分または残基は、その「ファルマコフォア」について知られる。

１度ファルマコフォアが決定されると、その構造は、その物性、例えば、立体化学、結合、大きさおよび／または電荷に従って、供給源の範囲からのデータ（例えば、分光学的技術、Ｘ線回折データおよびＮＭＲ）を使用して形にして表わされる。コンピューター分析、類似性マッピング（これは、原子間の結合よりもファルマコフォアの電荷および／または量を形にして表わす）および他の技術もまた、このモデリング工程において使用できる。

このアプローチの変形では、ＴＬＲ２結合化合物の三次元構造が形にして表わされる。これは、リガンドおよび／または結合パートナーが、結合上の構造を変化させる場合に特に有用である可能性があり、当該モデルについて模倣薬の設計を考慮に入れることを可能にする。

次いで、鋳型分子が、当該ファルマコフォアを模倣するどの化学基をグラフトできるかについて選択される。当該鋳型分子およびそれにグラフトされた当該化学基は、簡便に選択できるため、模倣薬は合成が容易であり、薬理学的に許容できる傾向にあり、ｉｎ−ｖｉｖｏで分解せず、一方、当該リード化合物の生物活性を保持している。次いで、このアプローチによって見出される当該模倣薬（単数または複数）は、これらが標的特性を有するかどうか、またはこれらがどの程度それを呈するかについて検討するためスクリーニングできる。次いで、ｉｎ−ｖｉｖｏまたは臨床試験のための１つ以上の最終模倣薬に到達するために、さらなる最適化または修飾を行うことができる。

特定の実施態様では、当該模倣薬の結合化合物は、薬物スクリーニングプログラムにおいて使用される天然または合成の化学物質であってもよい。いくつかの特徴付けられた、または特徴付けられていない成分を含む植物の抽出物もまた、使用されてもよい。

ＴＬＲ２に対する親和性および結合特異性を有する候補結合化合物は、ＴＬＲ２の機能的活性を調節するために、単離および／または精製、製造および／または使用され得る。

さらなる態様では、本発明は、コンビナトリアルライブラリー技術（Ｓｃｈｕｌｔｚ、ＪＳ（１９９６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１２：７２９−７４３）の使用におよび、これは、エピトープに結合するそれらの能力、または、エピトープに結合するリガンドの活性を調節するそれらの能力について、潜在的に膨大な数の異なる物質を試験する効率的な方法を与える。活性の調節のスクリーニングの前に、またはそれと同様に、試験物質は、ポリペプチドと相互作用する能力について、例えば、酵母ツーハイブリッド系（これは、ポリペプチドおよび試験物質の両方がコード核酸から酵母において発現され得ることを必要とする）でスクリーニングされ得る。これは、ポリペプチドの活性を調節する実際の能力について物質を試験する前に粗いスクリーニングとして使用され得る。

本発明のアッセイに加えられ得る試験物質または化合物の量は、通常、使用される化合物のタイプに依存して試行錯誤によって決定される。典型的に、約０．０１〜１００ｎＭの濃度（例えば、０．１〜１０ｎＭ）の阻害化合物が使用され得る。ペプチドが試験物質である場合、より高濃度が使用され得る。

（併用薬）
これまで本願明細書に記載されたように、本発明は、ＴＬＲ２の機能的活性を阻害する結合化合物の投与に関連する組成物または方法が、関節炎の原因である免疫応答を抑制する役割を有する少なくとも１つのさらなる治療化合物と組み合わせて投与される併用療法におよぶ。

典型的に、第１および第２の治療組成物は同時に与えられる。特定の実施態様では、第１の治療組成物（すなわち、ＴＬＲ２の機能的活性に拮抗する結合化合物）および第２の治療化合物は同時に投与される。特定のさらなる実施態様では、これらは経時的に投与される。

特定の実施態様では、併用療法は、サイトカイン阻害剤（ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＩＬ−１５の阻害剤など、しかしこれらに制限されない）、および腫瘍壊死因子の阻害剤、増殖因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症性、酵素阻害剤、代謝阻害剤、細胞傷害性薬剤または細胞分裂阻害剤のうち少なくとも１つとともに被験者に共投与されるＴＬＲ２の機能的阻害剤を含んでいてもよい。

当業者は、併用療法の被験者への投与は、関連する治療的に有効な効果を達成するために低用量の治療薬を被験者に投与できるという点で有利であり得ることを認識するだろう。より低い併用量の投与はまた、当該被験者をより低い毒性レベルにさらすこととなる。さらに、本発明によって与えられる併用療法の一部として投与される第２の治療化合物は、異なる経路を標的にしているため、治療における全体の有効性の相乗的な改善がある可能性がある。有効性の改善は、投与される低用量の必要性を再度もたらし、そのため関連して毒性を減少させる。

本発明のＴＬＲ２抑制化合物とともに投与するための適した第２の治療化合物の同定および選択において、当該第２の治療化合物は、関節炎を特徴付ける自己免疫応答の異なる段階で免疫応答を調節するこのような化合物に基づいて選択され得る。このような第２の化合物として、可溶性受容体、ペプチド抑制化合物、小分子、融合タンパク質もしくはリガンド、抗体、および抗炎症性効果を媒介するサイトカインを挙げることができるが、これらに限定されない。

上記のように、特定の実施態様では、当該第２の治療化合物は、炎症性サイトカインの生成を阻害する化合物、または炎症性サイトカインの機能を阻害する化合物であってもよい。関節炎の病理発生に寄与し得る炎症性サイトカインの例としては、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、およびＩＬ−１８が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、サイトカイン（腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ）、およびＧＭ−ＣＳＦなど）はまた、関節炎の疾患病状において役割を有することが同定されており、そのため、これらの機能は第２の治療化合物による阻害の標的になり得る。

特定のさらなる実施態様では、当該第２の治療化合物は、細胞表面分子の阻害剤（例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６またはこれらの受容体のリガンドに加えて、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１など、しかしこれらに限定されない）である。

特定のさらなる実施態様では、当該第２の治療化合物は、これらに由来する結合断片の抗体である。特定の例では、当該抗体は、ＴＮＦ、ＣＤ２０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１もしくはＩＬ−１８またはこれらの受容体に対する結合特異性を有し得る。

特定のさらなる実施態様では、当該第２の治療化合物は、ＢＡＳＦの抗ヒトＴＮＦ抗体 ヒュミラ（米国特許第６２５８５６２号明細書）、キメラ抗ＴＮＦ α抗体 ＲＥＭＩＣＡＤＥ（セントコア（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ））、可溶性ＴＮＦ受容体（ＴＮＦ受容体の可溶性部分を抗体のＦｃ領域の一部とともに含む融合タンパク質など、例えば、治療上のエタネルセプト（エンブレル（ＥＮＢＲＥＬ）（商標）（イミュネクス（Ｉｍｍｕｎｅｘ）、米国））であってもよい。酵素拮抗薬（ＴＮＦ α変換酵素（ＴＡＣＥ）など）もまた含まれる。

（投与）
本発明のモノクローナル抗体または融合タンパク質は、単独で投与されてもよいが、好ましくは、意図された投与経路に依存して選択される、適した薬剤的に許容できる賦形剤、希釈剤または担体を一般的に含む医薬組成物として投与される。適した医薬品担体の例としては、水、グリセロール、エタノールなどが挙げられる。

本発明のモノクローナル抗体または融合タンパク質は、いずれかの適した経路を介して治療を必要とする患者に投与され得る。本願明細書で詳述されるように、組成物は、非経口的に、注射または注入によって投与されることが好ましい。非経口投与のための好ましい経路の例としては、静脈内、心臓内、動脈内、腹腔内、筋肉内、腔内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔｙ）、皮下、経粘膜、吸入または経皮が挙げられるが、これらに限定されない。

投与経路には、局所および腸内、例えば、粘膜（肺を含む）、経口、経鼻、直腸がさらに含まれていてもよい。

好ましい実施態様では、当該組成物は、注射用組成物として送達可能である。静脈内、皮内または皮下の適用のため、有効成分は、パイロジェンフリーかつ、適したｐＨ、等張性および安定性を有する、非経口的に許容できる水溶液の形態である。当業者は、例えば、等張の媒体（塩化ナトリウム注射、リンゲル注射または、乳酸リンゲル注射など）を使用して、適した溶液をよく調製できるだろう。必要に応じ、保存剤、安定剤、バッファー、抗酸化剤および／または他の添加剤を含んでいてもよい。

組成物はまた、特定の組織（血液を含む）に入れられるミクロスフェア、リポソーム、他の微粒子送達系または徐放製剤を介して投与され得る。

本発明に従って使用され得る、上記の技術および手順ならびに他の技術および手順の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｇｅｎｎａｒｏ、Ａ．Ｒ．、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ；第２０版 ＩＳＢＮ ０−９１２７３４−０４−３ならびにＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ａｎｓｅｌ、Ｈ．Ｃ．ら 第７版 ＩＳＢＮ ０−６８３３０５−７２−７に見出すことができ、その全体の開示は参照によって本願明細書に組み込まれる。

本発明の組成物は、典型的に、被験者に「治療有効量」で投与され、これは、当該組成物が投与された個体に利点を示すのに十分なものである。典型的に、当該治療有効量は、関節リウマチの少なくとも１つの症候（炎症、膨脹、異常な血管新生、骨侵食および軟骨侵食を含み得るが、これらに限定されない）を抑制、予防または寛解するのに十分な量である。

投与された実際の用量、ならびに投与の速度および時間経過は、治療される症状の性質および重症度、ならびに治療される患者の年齢、性別および体重などの要因、ならびに投与経路に依存し、かつ、これらへの参照によって決定され得る。さらに十分な考慮が組成物の特性（例えば、その結合活性およびｉｎ−ｖｉｖｏでの血漿中での耐用期間、製剤中の融合タンパク質の濃度、ならびに送達の経路、部位および速度）に対して与えられるべきである。

投与計画は、本発明の組成物の単回投与、または当該組成物の複数回の投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ ｄｏｓｅｓ）を含み得る。当該組成物は、経時的に、または別々に、本発明の融合タンパク質が治療のための投与される症状の治療のために使用される他の治療法および薬物とともに、さらに投与され得る。

被験者に投与され得る投与計画の例は、１μｇ／ｋｇ／日〜２０ｍｇ／ｋｇ／日、１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、１０μｇ／ｋｇ／日〜１ｍｇ／ｋｇ／日を含む群から選択され得るが、これらに限定されない。

本発明のＴＬＲ２エピトープ結合化合物は、好ましくは、個体に、「治療有効量」で投与され、これは当該個体に利点を示すのに十分なものである。

投与された実際の量、ならびに投与の速度および時間経過は、治療されるものの性質および重症度に依存する。治療の指示（例えば、投与量などの決定）は、最終的に、一般的な開業医および他の医師の責任および慎重さにあり、典型的に、治療される障害、個々の患者の症状、送達部位、投与方法および医師に公知の他の要因が考慮される。

別段の定義がない限り、本願明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明の技術分野における当業者によって通常理解される意味を有する。

本願明細書全体にわたって、他に文脈上要求されない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、または変形したもの（「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」または「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」など）は、述べられた整数または整数群の包含を意味するが、いずれかの他の整数または整数群の除外を意味しないことが理解されるだろう。

本願明細書で使用される用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」などは、他に文脈上明確に要求されない限り、１つの、および複数の参照対象を含む。従って、例えば、「１つの（ａｎ）活性な薬剤」または「１つの（ａ）薬理学的に活性な薬剤」への参照は、１つの活性な薬剤および２つ以上の組み合わせの異なる活性な薬剤を含み、一方、「１つの（ａ）担体」への参照は、２つ以上の担体の混合物および１つの担体などを含む。

本願明細書で使用される用語「または」は、他に文脈上明確に示されない限り、用語「および／または」を意味し、かつ、この用語と交換可能に使用される。

本願明細書で使用される用語「約（ａｂｏｕｔ）」および「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、一般的に、測定の性質または精度を考慮した、測定された量についての誤差の許容できる程度を意味するものとする。代表的な誤差の程度は、所定の値または値の範囲の２０パーセント（％）以内、典型的に１０％以内、さらに典型的に５％以内である。アミノ酸またはヌクレオチド配列についての範囲値の構成において、用語「約」は、１つまたは両方の終点で、１、２、３、４もしくは５の残基またはヌクレオチドが異なる範囲を含む。例えば、語句「（配列の）約アミノ酸９〜２２」は、特定されたアミノ酸配列の７〜２３および１１〜２０などのアミノ酸配列を含み得る。

本発明の融合タンパク質のポリペプチド成分を記載するために使用される命名は、各アミノ酸残基において、アミノ基（Ｎ）が左側に、カルボキシ基が右側に表わされる従来の習慣に従う。

本願明細書で使用される表現「アミノ酸」は、天然および合成のアミノ酸の両方、ならびにＤアミノ酸およびＬアミノ酸の両方を含むように意図される。合成アミノ酸はまた、化学的に修飾されたアミノ酸（塩、およびアミノ酸誘導体（アミドなど）が挙げられるが、これらに限定されない）を含む。本発明のポリペプチド内に存在するアミノ酸は、メチル化、アミド化、アセチル化、またはこれらの生物活性に悪影響を与えることなく循環半減期を変化させられる他の化学基との置換によって修飾され得る。

用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本願明細書において、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合（アイソスターなど）によって共有結合的に結合された一連の少なくとも２つのアミノ酸を記載するために交換可能に使用される。ペプチドまたはタンパク質を含んでいてもよいアミノ酸の最大数に制限は置かれない。さらに、用語 ポリペプチドは、ペプチドの断片、類似体および誘導体におよび、当該断片、類似体または誘導体は当該断片、誘導体または類似体の由来であるペプチドと同一の生物学的機能的活性を保持する。

さらに、本願明細書で使用される用語「融合タンパク質」はまた、融合ポリペプチド、融合ペプチドなどを意味するように解釈され得、または、免疫複合体とも呼ばれ得る。用語「融合タンパク質」は、２つ以上のサブユニット分子（典型的にポリペプチド）が共有結合的にまたは非共有結合的に結合した分子を意味する。

本願明細書で使用される用語「治療有効量」は、ＴＬＲ２を媒介した疾病、癌の症状、または自己免疫疾患もしくは神経変性疾患などの疾病、またはこれらのうち少なくとも１つの症候の重症度を減少させ、かつ／またはこれらを寛解させるために必要とされる、本発明の融合タンパク質の量を意味する。

本願明細書で使用される用語「予防的に有効な量」は、本発明の化合物の投与後の被験者において、ＴＬＲ２を媒介したもしくはこれに誘導された疾病または症状、または自己免疫疾患もしくは神経変性疾患などの疾病、またはこれらのうち少なくとも１つの症候の最初の発生、進行または再発を予防するために必要とされる組成物の量に関する。

本願明細書で使用される用語「治療」および関連する用語「治療する」および「治療している」などは、ＴＬＲ２を媒介した症状もしくはその少なくとも１つの症状の進行、重症度および／または期間の減少を意味し、当該減少または寛解は、本発明のＴＬＲ２結合エピトープに対して特異性を有する結合化合物の投与からもたらされる。従って、用語「治療」は、被験者の利益になり得るいずれかの療法を意味する。当該治療は、現存する症状に関するものであってもよく、または予防（予防的治療）であってもよい。治療は、治療上の効果、緩和する効果、または予防効果を含んでいてもよい。本願明細書における「治療上の」および「予防的」治療への言及は、これらの最も広い文脈で考慮されるものとする。用語「治療上の」は、被験者が完全回復まで治療されることを必ずしも意味しない。同様に、「予防的」は、被験者が最終的に疾病の症状に罹患しないことを必ずしも意味しない。

本願明細書で使用される用語「被験者」は、動物、好ましくは哺乳類（特にヒト）を意味する。特定の実施態様では、当該被験者は哺乳類、特にヒトである。本願明細書で使用される用語「被験者」は、用語「患者」と交換可能である。

本願明細書において言及された全ての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体の参照によって組み込まれる。

本発明の他の特徴および利点は、記述、図および請求項から明らかとなるだろう。

（実施例１）
当該実施例における実験は、アステランド（Ａｓｔｅｒａｎｄ）から得た通常の滑液および滑液試料で刺激されたＴＬＲ−２で形質移入されたＨＥＫ−２９３細胞、およびＴＬＲ−４で形質移入されたＨＥＫ−２９３細胞からのＩＬ−８サイトカイン生成によって測定される、反応を測定する役割を有する。

（方法）
（試薬）
１）Ｔｏｌｌ様受容体２作動薬 Ｐａｍ３ＣＳＫ４（インビトロジェン、カタログ番号 ｔｌｒ−ｐｍｓ、ロット ２８−０８−ｐｍｓ）。
２）ＯＰＮ３０１ 抗ＴＬＲ２ モノクローナル抗体（マウス Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）抗体、クローン Ｔ２．５、ハイカルト バイオテクノロジー ｂ．ｖ．、セル サイエンス、米国、カントン：カタログ番号 １０５４）。
３）ＨＥＫ ２９３−ｈＴＬＲ１／２細胞（インビトロジェン、カタログ番号 ２９３−ｈｔｌｒ１／２）およびＨＥＫ−ＴＬＲ−４細胞。

ＨＥＫ−ＴＬＲ−２細胞またはＨＥＫ−ＴＬＲ−４細胞を、トリプリケートで、一晩、１×１０^５／ｍｌで、 ３７℃で、９６ウェルプレート中で培養した。次いで、連続希釈（１０％、１％および０．１％ ｖ／ｖ）の滑液を加え、細胞をさらに６および２４時間培養した。それぞれ別々の９６ウェルプレートで、細胞を、陰性対照として培地のみでも刺激し、または、ＴＬＲ−２細胞の場合は、１００ｎｇ／ｍｌのＰａｍ３ＣＳＫ４を、ＴＬＲ−４細胞については１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ（リポ多糖）で刺激した。上清を取り出し、ヒト ＩＬ−８について、特異的なヒト ＲｎＤ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ システムズ）によってアッセイした。滑液（ＳＦ）試料は患者から入手し、表１に示した。

（結果）
図１（ａ）〜（ｄ）は、滑液試料で刺激された２９３ ＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞からのＩＬ−８の反応を示す。ＩＬ−８の増加した生成は、関節リウマチを呈する被験者由来の滑液試料から見出し得る。これは、約２４時間の時点で最も明確に見出すことができる（図１（ｃ）および（ｄ））。

図２（ａ）〜（ｄ）は、滑液試料で刺激された２９３ ＨＥＫ−ＴＬＲ４細胞からのＩＬ−８の反応を示す。ＩＬ−８生成の高いバックグラウンドレベルが見られる。ＲＡを呈している、または呈していない被験者由来の滑液によって誘導されたＩＬ−８生成の間に明らかな相違はなかった。

図３は、２４時間刺激されたＨＥＫ−ＴＬＲ−２細胞の通常の滑液に対して、滑液試料によって誘導されたＩＬ−８生成の増加（倍増）レベルを示す。全ての場合において、関節リウマチを呈する被験者から入手した滑液試料は、関節リウマチを呈していない被験者から入手した滑液によって誘導されたＩＬ−８生成のレベルと比較した場合、より高いレベルのＩＬ−８生成の誘導を示したことが見出され得る。

（考察）
滑液試料は、通常の滑液と比較した場合、２９３ ＨＥＫ−ＴＬＲ−２細胞からのＩＬ−８サイトカイン生成の増加の原因となることが示された。ＩＬ−８生成のこの上方制御は、２４時間の時点で特に明らかである。ＯＰＮ−３０１ 抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体による関連する阻害を観察するためには、約４倍の増加が必要とされる。４倍の増加は、最小倍の増加であり、かつ、ＯＰＮ−３０１ 抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体が滑液で刺激された培養物に加えられた場合に、統計的かつ科学的に有意なレベルの阻害が認められるように選択された任意の数字であることに注目すべきである。

この点について、試料３ならびに、おそらく試料１、２、６、９、および１０は、表１に詳述されているように、この基準に適合している。滑液の様々な希釈の間で明らかな用量反応は認められなかったが、これは、単に、０．１％ ｖ／ｖ以下の滑液においては、上記で示された可溶性ＴＬＲ−２リガンドの飽和レベルは、ＩＬ−８のレベルのさらなる増加が認められないということを意味しているのかもしれない。ＩＬ−８の高いバックグラウンドの分泌が、２９３−ＨＥＫ−ＴＬＲ−４細胞で認められ、通常の滑液にも、試料滑液にも、ＴＬＲ−４リガンドは試験された滑液試料のいずれにも存在していないというこの示唆を強化するものは認められなかった。これらの実験から導かれ得る最初の結論は、これらの試料は、いくつかの可溶性ＴＬＲ−２リガンドを含むということである。

（実施例２ ＴＬＲ２作動薬および拮抗薬に曝露された滑膜組織の生検試料におけるサイトカインの発現特性）
（外植実験）
滑膜組織の生検組織をヒト患者から、関節鏡検査の手順の間に取り出した。各生検試料を４片に切り、培地を含んでいる９６ウェルプレートのウェルに入れた。各ウェルには、Ｔｏｌｌ様受容体２拮抗薬および／またはＴｏｌｌ様受容体２作動薬のいずれかの異なる組み合わせを含めた。

Ｔｏｌｌ様受容体２拮抗薬は、抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体 ＯＰＮ−３０１である（（ＯＰＮ３０１）マウス Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）抗体、クローン Ｔ２．５、ハイカルト バイオテクノロジー ｂ．ｖ．、セル サイエンス、米国、カントン：カタログ番号 １０５４））。外植試料におけるＴＬＲ２活性化およびサイトカイン生成へのＯＰＮ−３０１ 抗ＴＬＲ２抗体の効果を評価する際に、３生検試料の各小片を、完全培地中で、抗ＴＬＲ２ ＯＰＮ−３０１抗体、またはＩｇＧ アイソタイプコントロール抗体（カタログ ｍａｂ００２、クローン １７１１、マウス ＩｇＧ１ モノクローナル抗体（ＲｎＤ システムズ））とともに、７２時間（３生検での総計）インキュベートした。

ＴＬＲ２拮抗薬（ＯＰＮ−３０１）の効果を評価する際に、生検試料を、完全培地中で、１μｇまたは１ｎｇのいずれかの濃度で加えたＯＰＮ−３０１ 抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体とともにインキュベートした。対照試料は、ＯＰＮ−３０１ モノクローナル抗体の添加を、ＩｇＧ アイソタイプコントロール抗体の添加に置き換えて上記のように設定した。

生検試料の第４の小片を含んでいるウェルに抗ＴＮＦ α抗体 ヒュミラ（アダリムマブ）を加えた。

次いで、試料（３つの滑膜組織の生検試料）を７２時間インキュベートした。

サイトカインＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの発現特性を測定した。これらのサイトカインの発現特性の結果を、図６（ＩＬ−１β）、７（ＩＬ−６）、８（ＴＮＦ−α）および９（ＩＦＮ−γ）に示した。

ＴＬＲ２拮抗薬の不存在におけるＴＬＲ２活性化の後に生成するサイトカインの特性を特定するために、生検試料の小片を２４時間、血清を欠乏させ、次いで、ＴＬＲ２拮抗薬 Ｐａｍ３Ｃｙｓで２４時間刺激した。４つの滑膜組織の生検試料を全体で評価し、これらの試料のうち２つを２００ｎｇまたは１μｇのＰａｍ３Ｃｙｓに曝露し、一方、さらに２つは、２００ｎｇおよび１０μｇのＰａｍ３Ｃｙｓに曝露した。

得られたサイトカインの発現特性を、図１０（ＩＬ−１β）、１１（ＩＬ−６）、１２（ＴＮＦ−α）および１３（ＩＦＮ−γ）に示した。

（結果）
図６、グラフＡ、ＢおよびＣは、患者から入手した３つの別々の滑膜組織の生検試料の小片のＩＬ−１βの発現の結果を示している。ＩｇＧは、ＩｇＧ アイソタイプコントロール抗体 ＭＡＢ００２を示し、ヒュミラは、抗ＴＮＦ αモノクローナル抗体 ヒュミラ（アダリムマブ）を示し、ＯＰＮは抗ＴＬＲ２ モノクローナル抗体 ＯＰＮ−３０１である。

図７、グラフＡ、ＢおよびＣは、患者から入手した３つの別々の滑膜組織の生検試料の小片からのＩＬ−６発現の結果を示している。ＩｇＧは、ＩｇＧ アイソタイプコントロール抗体 ＭＡＢ００２を示し、ヒュミラは抗ＴＮＦ αモノクローナル抗体 ヒュミラ（アダリムマブ）を示し、ＯＰＮは抗ＴＬＲ２ モノクローナル抗体 ＯＰＮ−３０１である。

図８、グラフＡ、ＢおよびＣは、患者から入手した３つの別々の滑膜組織の生検試料の小片からのＴＮＦ−αの発現の結果を示している。ＩｇＧは、ＩｇＧ アイソタイプコントロール抗体 ＭＡＢ００２を示し、ヒュミラは、抗ＴＮＦ αモノクローナル抗体 ヒュミラ（アダリムマブ）を示し、ＯＰＮは、抗ＴＬＲ２ モノクローナル抗体 ＯＰＮ−３０１である。

図９、グラフＡ、ＢおよびＣは、患者から入手した３つの別々の滑膜組織の生検試料の小片からのＩＦＮ−γの発現の結果を示す。ＩｇＧは、ＩｇＧ アイソタイプコントロール抗体 ＭＡＢ００２を示し、ヒュミラは、抗ＴＮＦ αモノクローナル抗体 ヒュミラ（アダリムマブ）を示し、ＯＰＮは、抗ＴＬＲ２ モノクローナル抗体 ＯＰＮ−３０１である。

図１０は、４つの別々の滑膜組織の生検試料の小片からのＩＬ−１βのサイトカイン発現の結果を図示しているグラフＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄを示す。基礎は、ＴＬＲ２作動薬 Ｐａｍ３Ｃｙｓを添加していないサイトカイン発現レベルを示す。Ｐａｍは、Ｐａｍ３Ｃｙｓの２つの別々の濃度の添加を示し、一方ＴＮＦは、サイトカイン ＴＮＦ−αの添加を示す。

図１１は、４つの別々の滑膜組織の生検試料の小片からのＩＬ−６のサイトカイン発現の結果を図示しているグラフＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄを示す。基礎は、ＴＬＲ２作動薬 Ｐａｍ３Ｃｙｓを添加していないサイトカイン発現レベルを示す。Ｐａｍは、Ｐａｍ３Ｃｙｓの２つの別々の濃度の添加を示し、一方ＴＮＦは、サイトカイン ＴＮＦ−αの添加を示す。

図１２は、４つの別々の滑膜組織の生検試料の小片からのＴＮＦ−αのサイトカイン発現の結果を図示しているグラフＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄを示す。基礎は、ＴＬＲ２作動薬 Ｐａｍ３Ｃｙｓを添加していないサイトカイン発現レベルを示す。Ｐａｍは、Ｐａｍ３Ｃｙｓの２つの別々の濃度の添加を示す。ＴＮＦ−α陽性対照はこの実験に含まれるが、結果が１０１２−３１０３ ＴＮＦ−α ｐｇ／ｍｌにおよんだため、グラフＡ、Ｂ、ＣおよびＤから除外した。

図１３は、４つの別々の滑膜組織の生検試料の小片からのＩＦＮ−γのサイトカイン発現の結果を図示しているグラフＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄを示す。基礎は、ＴＬＲ２作動薬 Ｐａｍ３Ｃｙｓを添加していないサイトカイン発現レベルを示す。Ｐａｍは、Ｐａｍ３Ｃｙｓの２つの別々の濃度の添加を示し、一方ＴＮＦはサイトカインＴＮＦ−αの添加を示す。

（実施例３ ＴＬＲ２拮抗性抗体に曝露された組織生検試料におけるＩＬ−６およびＩＬ−８サイトカインの発現特性）
生検は、３人の異なる患者から、関節鏡検査時に取り出した。各生検を、４小片に切り、培地＋／−阻害剤／刺激薬を含んでいる９６ウェルプレートのウェルに入れた。

ＯＰＮ３０１ モノクローナル抗体遮断実験（これらの結果は図１４および１５に示されている）のため、生検を完全培地＋ＩｇＧもしくはＯＰＮ ３０１ モノクローナル抗体で、７２時間インキュベートした。

刺激／遮断実験（これらの結果は、図１６に示されている）のため、生検を２４時間血清を欠乏させ、Ｐａｍ３Ｃｙｓ／ＯＰＮ３０１で、２４時間、刺激／阻害した。

結果は、図１４、１５および１６の、グラフＡ（ＩＬ−６生成を示している）またはＢ（ＩＬ−８生成を示している）に、それぞれ７、８および９と番号を付された患者由来の試料について示した。

図１４は、患者７由来の生検試料からの外植の阻害を示し、ＩＬ−６（グラフＡ）またはＩＬ−８（グラフＢ）の読み出しが示されている。特に、１ｕｇおよび５００ｕｇの投与量で与えられたモノクローナル抗体 ＯＰＮ−３０１による阻害。

図１５は、患者８由来の生検試料からの外植の阻害を示し、ＩＬ−６（グラフＡ）またはＩＬ−８（グラフＢ）の読み出しが示されている。特に、１ｕｇおよび５００ｕｇの投与量で与えられたモノクローナル抗体 ＯＰＮ−３０１による阻害。

図１６は、抗ＴＬＲ２ モノクローナル抗体 ＯＰＮ３０１（グラフＡ）または、モノクローナル抗体 ＯＰＮ３０１とともにｔｏｌｌ様受容体作動薬 Ｐａｍ３ＣＳＫ４（グラフＢ）による外植の刺激および／または阻害を示す。

図１４、１５および１６のそれぞれは、ＩｇＧ アイソタイプコントロール抗体に対する比較、および市販の入手可能な抗体ヒュミラ（アダリムマブ）（アボット ラボラトリーズ社）（ＴＮＦ−αを中和し、従って、関節リウマチの治療におけるＴＮＦ阻害剤として使用されるモノクローナル抗体）との比較が示されている。

本発明は、特定の好ましい実施態様と関連して記載されているが、請求項記載の本発明は、このような特定の実施態様に過度に制限されるべきではないことが理解されるはずである。実際、当業者に明白な本発明を実行するための記載された方法の様々な改変が、本発明によって網羅されることが意図されている。

Claims (14)

1. 自己免疫性関節炎の治療または予防のための薬剤の製造における、Ｔｏｌｌ様受容体２に特異的に結合し、かつ、Ｔｏｌｌ様受容体２の機能の拮抗薬である抗体またはその結合断片の使用。
2. 前記自己免疫性関節炎は、急性または慢性である請求項１に記載の使用。
3. 前記自己免疫性関節炎は、関節リウマチまたは若年性関節リウマチである請求項１に記載の使用。
4. 前記抗体は、ヒトＴｏｌｌ様受容体２に対して特異的に結合するヒト抗体、またはラクダ抗体である請求項１〜３いずれか１項に記載の使用。
5. 前記抗体またはその結合断片は、
   （ａ）キメラ抗体またはその断片、
   （ｂ）合成抗体またはその断片、
   （ｃ）ヒト化抗体またはその断片、および
   （ｄ）Ｆａｂ断片
   からなる群から選択される請求項１〜３いずれか１項に記載の使用。
6. 前記抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＥからなる群から選択されるアイソタイプのものである請求項１〜３いずれか１項に記載の使用。
7. 前記抗体は、アイソタイプ ＩｇＧのものであり、サブクラス ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のものである請求項１〜３いずれか１項に記載の使用。
8. 前記抗体またはその結合断片はＴｏｌｌ様受容体２に存在する抑制性エピトープに結合し、解離定数（Ｋｄ）が１０^−７Ｍ〜１０^−１１Ｍの群から選択される請求項１〜３いずれか１項に記載の使用。
9. 前記抗体またはその結合断片はヒトＴＬＲ２の細胞外領域に結合する請求項１〜３いずれか１項に記載の使用。
10. 前記抗体は、クローン Ｔ２．５に由来する抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体、そのヒト化抗体またはこれらのうちいずれかの結合断片である請求項１に記載の使用。
11. 前記抗体またはその結合断片は、免疫抑制剤と同時投与、別々の投与、または連続投与で与えられる請求項１〜１０いずれか１項に記載の使用。
12. 前記免疫抑制剤は、抗ＣＤ２０抗体、抗ＴＮＦ抗体、インターロイキン−１（ＩＬ−１）遮断薬、およびＴ細胞活性化の遮断薬からなる群から選択される請求項１１に記載の使用。
13. 前記免疫抑制剤は、抗ＴＮＦ−α抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＩＬ−１抗体、抗ＩＬ−６抗体、抗ＩＬ−８抗体、ＴＮＦ拮抗薬、ＩＬ−１２拮抗薬、ＩＬ−１５拮抗薬、ＩＬ−１７拮抗薬、ＩＬ−１８拮抗薬、炎症促進性Ｔ細胞抑制因子、制御性Ｔ細胞プロモーター、メトトレキセート、レフルノミド、ラパマイシン、Ｃｏｘ−２阻害剤、ＮＳＡＩＤおよびｐ３８阻害剤からなる群から選択される請求項１１に記載の使用。
14. 前記使用は、前記抗体またはその結合断片の単独使用であり、または、
    前記抗体または結合断片は、抗ＣＤ２０抗体、インターロイキン−１（ＩＬ−１）遮断薬、Ｔ細胞活性化の遮断薬、抗ＩＬ−６抗体、ＩＬ−８拮抗薬、ＴＮＦ拮抗薬、ＩＬ−１２拮抗薬、ＩＬ−１５拮抗薬、ＩＬ−１７拮抗薬、ＩＬ−１８拮抗薬、炎症促進性Ｔ細胞抑制因子、制御性Ｔ細胞プロモーター、メトトレキセート、レフルノミド、ラパマイシン、Ｃｏｘ−２阻害剤、ＮＳＡＩＤもしくはｐ３８阻害剤と、同時投与、別々の投与、もしくは連続投与で与えられる、請求項１〜１０いずれか１項に記載の使用。

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