JP2013216635A - Ｔｒｅｍ−１活性阻害剤 - Google Patents

Abstract

【課題】ＴＲＥＭ−１活性阻害剤や、該活性阻害剤を有効成分として含有するＴＲＥＭ−１の活性化に起因する炎症性障害の予防又は治療剤を提供すること。
【解決手段】本願発明者は、マウスＴＲＥＭ−１の機能的リガンドがマウスシアル酸結合性免疫グロブリン様レクチン−Ｇ（Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ）であること、ヒトＴＲＥＭ−１の機能的リガンドが、免疫細胞表面受容体である白血球免疫グロブリン様受容体Ａ１（ＬＩＬＲ Ａ１）、及び白血球免疫グロブリン様受容体Ｂ２（ＬＩＬＲ Ｂ２）であることを明らかにした。上記ＴＲＥＭ−１リガンドに対する中和抗体又はその抗体断片、あるいは上記ＴＲＥＭ−１リガンドを標的とする機能性核酸を用いることによって、ＴＲＥＭ−１活性阻害剤や、ＴＲＥＭ−１の活性化に起因する炎症性障害の予防又は治療剤を提供することができる。
【選択図】なし

Description

本発明は、ＴＲＥＭ−１リガンドに対する中和抗体又はその抗体断片、あるいはＴＲＥＭ−１リガンドを標的とする機能性核酸を有効成分として含有するＴＲＥＭ−１活性阻害剤や、該活性阻害剤を有効成分として含有するＴＲＥＭ−１の活性化に起因する炎症性障害の予防又は治療剤に関する。

ＴＲＥＭ−１（Triggering receptor expressed on myeloid cells-1）は免疫グロブリン様細胞表面受容体ファミリーに属する受容体であり、ＩＴＡＭ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif）含有アダプター分子であるＤＡＰ１２（DNAX activation protein 12）を介して免疫細胞の機能調節に関与すると考えられている（非特許文献１及び２）。ＴＲＥＭ−１は、好中球及び、単球／マクロファージのサブセット上に発現しており、これらの細胞におけるＴＲＥＭ−１発現は各種のＴＬＲ（Toll-like receptor）を介した刺激によって促進される（非特許文献１、３、及び４）。また、アゴニスト抗体によるＴＲＥＭ−１の活性化は、マクロファージ及び好中球からの複数の炎症性サイトカイン及びケモカインの産生をもたらすこと、さらに、この応答は、ＴＬＲライゲーションをはじめとする他の自然免疫刺激と相乗的に作用して、炎症性応答を増幅させることが報告されている（非特許文献３〜６）。

ＴＲＥＭ−１の活性化が、細菌感染症、炎症性腸炎、膠原病等の疾患に関与することは、実験的に明らかにされている。例えば、ＬＰＳ誘導性又は細菌誘導性敗血症性ショックがみられるマウスに、ＴＲＥＭ−１の細胞外領域とＩｇとの融合タンパク質（ＴＲＥＭ−１−Ｉｇ）、又は合成ＴＲＥＭ−１ペプチドを投与した場合、投与しない場合に比較して長時間生存することが明らかにされている（非特許文献３及び７）。また、炎症性大腸炎は腸における細菌性の損傷がその発症機序に重要な役割を果たしていることが知られる疾患であるところ、炎症性大腸炎モデルマウスにＴＲＥＭ−１アンタゴニストペプチドを投与してＴＲＥＭ−１からのシグナル伝達を遮断した結果、炎症性大腸炎が軽減されることが確認された（非特許文献８）。さらに、関節リウマチのモデルマウスであるコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）マウスの関節由来の滑膜マクロファージには、ＴＲＥＭ−１が豊富に発現しており、ＣＩＡマウスに可溶性ＴＲＥＭ−１−Ｉｇ遺伝子を導入して、ＴＲＥＭ−１の機能を阻害すると、誘導抗原に対するＴ細胞及びＢ細胞免疫応答を妨害することなく、ＣＩＡに対して有意な治療効果をもたらすことが明らかにされている（非特許文献９及び特許文献１）。

以上のような研究結果は、ＴＲＥＭ−１の活性化が、細菌感染症、炎症性腸炎、膠原病等の病態生理に重要な役割を果たしていることを強く示唆するものである。また、非特許文献３には、敗血症モデルにおけるＴＲＥＭ−１の遮断が、細菌感染症の抑制を妨害することなく炎症性サイトカインの産生を減弱させることが明らかにされていることから、ＴＲＥＭ−１の活性化を阻害することによって、微生物感染症に対する免疫防御を維持したままで、リウマチ等の治療を行うことが可能であると考えられる。しかし、ＴＲＥＭ−１の天然のリガンド（以下、「ＴＲＥＭ−１リガンド」と称する場合がある）は同定されておらず、ＴＲＥＭ−１リガンドの生理的役割や、ＴＲＥＭ−１リガンドとＴＲＥＭ−１との相互作用を阻害する物質についてはほとんど研究されていなかった。

特開２０１１−９３８０６号公報

J Immunol 164: 4991-4995, 2000 Nat Immunol 7: 1266-1273, 2006 Nature 410: 1103-1107, 2001 J Immunol 170: 3812-3818, 2003 J Immunol 180: 3520-3534, 2008 J Leukoc Biol 80: 1454-1461, 2006 J Exp Med 200:1419-1426, 2004 J Clin Invest. 117:3097-3106, 2007 Arthritis Rheum 60:1615-1623, 2009

本発明の課題は、ＴＲＥＭ−１活性阻害剤や、該活性阻害剤を有効成分として含有するＴＲＥＭ−１の活性化に起因する炎症性障害の予防又は治療剤を提供することにある。

本発明者は、まず、以下のような実験によってマウス及びヒトＴＲＥＭ−１のリガンドを同定した。すなわち、本発明者は、マウスＴＲＥＭ−１と特異的に結合するＡ２０細胞、及びヒトＴＲＥＭ−１に特異的に結合するヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、２種類のｃＤＮＡ発現ライブラリを構築し、それぞれのライブラリを導入したＢａ／Ｆ３細胞から、マウスＴＲＥＭ−１に結合する細胞及びヒトＴＲＥＭ−１に結合する細胞を単離して、遺伝子の解析を行った。そして、解析の結果、マウスＴＲＥＭ−１の機能的リガンドがシアル酸結合性免疫グロブリン様レクチン−Ｇ（sialic acid binding Ig-like lectin G；Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ；配列番号１）であること、ヒトＴＲＥＭ−１の機能的リガンドが、免疫細胞表面受容体である白血球免疫グロブリン様受容体Ａ１（Leukocyte immunoglobulin-like receptor Ａ1；ＬＩＬＲ Ａ１；配列番号２）、及び白血球免疫グロブリン様受容体Ｂ２（Leukocyte immunoglobulin-like receptor B2；ＬＩＬＲ Ｂ２;配列番号３）であることを明らかにした。Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇは、生理学的機能が不明なオーファンリガンドとして以前から知られており、また、ＬＩＬＲ Ａ１及びＬＩＬＲ Ｂ２は、ヒト主要組織適合性複合体クラスＩ分子（ＭＨＣＩ）と結合するヒト免疫系細胞表面受容体であることが知られていたが（Tissue Antigens 64: 215-225, 2004）、これらの分子はいずれもＴＲＥＭ−１との関連について全く知られていなかった。

続いて、本発明者は、上記ＴＲＥＭ−１リガンドに対する抗体が、ＴＲＥＭ−１の活性化に起因する疾患に対する予防又は治療効果を有するかどうかを検討した。すなわち、本発明者は、マウスＴＲＥＭ−１リガンドであるＳｉｇｌｅｃ−Ｇに対する中和抗体（抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ中和抗体）を作製して、かかる抗体をＣＩＡマウス（関節リウマチモデルマウス）に投与した。そして、抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ中和抗体投与後のＣＩＡマウス病態の変化を観察し、抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ中和抗体がＣＩＡの症状を改善する効果を有することを明らかにした。また、抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ中和抗体を投与したマウスにおけるＴ細胞及びＢ細胞応答を調べた結果、抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ中和抗体の投与による獲得免疫の減弱は認められなかった。これらの実験結果から、本発明者は、ＴＲＥＭ−１リガンドの中和抗体を投与することによって、感染症に対する免疫防御を低下させることなく、ＴＲＥＭ−１の活性化に起因する疾患を予防及び治療できることを見い出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、（１）（ａ）ＴＲＥＭ−１リガンドに対する中和抗体又はその抗体断片；（ｂ）ＴＲＥＭ−１リガンドを標的とする機能性核酸；の（ａ）又は（ｂ）を有効成分として含有するＴＲＥＭ−１活性阻害剤や、（２）ＴＲＥＭ−１リガンドが、ＬＩＬＲ Ａ１又はＬＩＬＲ Ｂ２である前記（１）記載の活性阻害剤や、（３）中和抗体が、ヒト抗体、キメラ抗体、又はヒト化抗体である前記（１）又は（２）記載の活性阻害剤や、（４）抗体断片が、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ、ｄｉａｂｏｄｙ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、又はＳｃ（Ｆｖ）_２である前記（１）又は（２）記載の活性阻害剤や、（５）中和抗体又はその抗体断片が、ＰＥＧ化された中和抗体又はその抗体断片である前記（１）〜（４）のいずれかに記載の活性阻害剤や、（６）機能性核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、核酸アプタマー、リボザイム、又はデコイである前記（１）〜（５）のいずれかに記載の活性阻害剤に関する。

また、本発明は、（７）前記（１）〜（６）のいずれかに記載の活性阻害剤を有効成分として含有する、ＴＲＥＭ−１の活性化に起因する炎症性障害の予防又は治療剤や、（８）炎症性障害が、膠原病、細菌感染症、又は炎症性腸疾患である前記（７）記載の予防又は治療剤や、（９）膠原病が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、シェーグレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、リウマチ熱、又は結節性多発性動脈炎である前記（８）記載の予防又は治療剤や、（１０）細菌感染症が、敗血症又は細菌性大腸炎である前記（８）記載の予防又は治療剤や、（１１）炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎又はクローン病である前記（８）記載の予防又は治療剤に関する。

本発明によれば、ＴＲＥＭ−１リガンドによるＴＲＥＭ−１の活性化を特異的に阻害することが可能であり、ＴＲＥＭ−１の活性化に起因する炎症性障害の予防又は治療を安全且つ効果的に行うことができる。

マウスＢ細胞及びＢａ／Ｆ３細胞形質導入株へのＴＲＥＭ−１−Ｈｉｓの結合を示す図である。図１ａは、マウス脾細胞を、ＦＩＴＣで標識した抗Ｂ２２０ ｍＡｂ及びビオチン化ＴＲＥＭ−１−Ｈｉｓで染色し、次いでＰＥストレプトアビジンで染色した結果を示す。図１ｂは、Ｂ細胞株Ａ２０及びＫ４６をビオチン化対照Ｉｇ（塗りつぶし）又はビオチン化ＴＲＥＭ−１−Ｈｉｓ（塗りつぶしなし）で染色し、次いでＰＥストレプトアビジンで染色した結果を示す。図１ｃ〜ｅは、ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（モック）又はＳｉｇｌｅｃ−Ｇ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰをコードするレトロウイルスを、Ｂａ／Ｆ３細胞に形質導入し、親のＢａ／Ｆ３細胞とモック（ｃ）又はＳｉｇｌｅｃ−Ｇ形質導入株（ｄ、ｅ）との混合物を、ビオチン化ＴＲＥＭ−１−Ｈｉｓ（ｃ、ｄ）又はＴＲＥＭ−１−ＧＳＴ（ｅ）で染色し、次いでＰＥストレプトアビジンで染色した結果を示す。 Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ刺激によるマクロファージからのＴＮＦ−α分泌を示す図である。図２ａは、Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ−Ｉｇ単独、又はＳｉｇｌｅｃ−Ｇ−Ｉｇ及びＴＲＥＭ−１−Ｈｉｓによってコーティングされたマイクロタイタープレートで、腹腔マクロファージを２４時間培養し、培養上清中のＴＮＦ−α濃度をＥＬＩＳＡにより調べた結果を示す。図２ｂは、腹腔マクロファージをＬＰＳ単独で刺激した場合と、ＬＰＳと固定化されたＳｉｇｌｅｃ−Ｇ−Ｉｇとで刺激した場合のＴＮＦ−α濃度を調べた結果を示す。 抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇモノクローナル抗体の作製について示す図である。図３ａは、ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（モック）又はＳｉｇｌｅｃ−Ｇ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ）をコードするレトロウイルスをＢａ／Ｆ３細胞に形質導入し、親のＢａ／Ｆ３及びモック又はＳｉｇｌｅｃ−Ｇ形質導入株の混合物を、ビオチン化抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ ｍＡｂで染色し、次いでＰＥストレプトアビジンで染色した結果を示す。図３ｂは、Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇを発現するＢａ／Ｆ３細胞を、抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ ｍＡｂでプレインキュベートし、ビオチン化ＴＲＥＭ−１−Ｈｉｓで染色した結果を示す。網掛したヒストグラム（Ｉ）は、ビオチン化ＴＲＥＭ−１−Ｈｉｓで染色し、次いでＰＥストレプトアビジンで染色した細胞を、太線（II）は、ＴＲＥＭ−１−Ｈｉｓで染色する前に抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ ｍＡｂでプレインキュベートした細胞のヒストグラムをそれぞれ示している。対照ラットＩｇによるプレインキュベートは、ＴＲＥＭ−１−ＨｉｓのＳｉｇｌｅｃ−Ｇ発現Ｂａ／Ｆ３細胞への結合を阻害しなかった（データは示さず）。また、点線（III）は、バックグラウンド染色を示す。 抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ ｍＡｂのＣＩＡマウス（関節リウマチモデルマウス）に及ぼす影響を示す図である。図４ａは、ＣＩＡは完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）とエマルジョン化したII型コラーゲン（ＣII）を用いた、一次免疫（０日目）及び二次免疫（２１日目）を行ってＣＩＡを誘導したマウスに、１００μｇの対照ラットＩｇ（○）又は５０μｇ（□）、１００μｇ（△）の抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ ｍＡｂを１日おきに、０日目〜４１日目の間腹腔内注射した結果を示す。図４ｂ〜ｅは、ＣＩＡ誘導後４１日目のマウスの後肢の中足指節関節を、ヘマトキシリン及びエオシン染色（ｂ、ｃ）並びに軟Ｘ線写真（ｄ、ｅ）により調べた結果を示す。図中、コントロール（ｂ、ｄ）は、Ｉｇで処理した対照マウス由来の関節を示し、抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ ｍＡｂ（ｃ、ｅ）は、１００μｇの抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇで処理したマウス由来の関節をそれぞれ示す。また、スケールバーは１００μｍである。図４ｆは、関節炎の重症度を組織学的にスコア化した結果を示す。図４ｇは、関節の骨侵食を、Ｘ線写真でスコア化した結果を示す。図４ｆ及び４ｇにおいて、スコアは、独立した観察者により決定された。値は、各群のマウスの総スコアの平均±ＳＤである。また、図ｆ及びｇにおいて、白抜きカラムは対照群を、塗りつぶしカラムは抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ ｍＡｂ治療群をそれぞれ示す。図４ｈは、対照Ｉｇ５０μｇ（○）又は、抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ ｍＡｂ５０μｇ（□）を１日おきに、２６日目〜４０日目の間、２つの群のマウスに腹腔内注射し、関節炎スコアの変化を調べた結果を示す図である（＊ｐ＜０．０５）。 ＣII特異的Ｔ細胞及びＢ細胞応答に対する抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ ｍＡｂ治療の効果を示す図である。図５ａは、対照Ｉｇ（白抜きカラム）又は抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ ｍＡｂ１００μｇ（塗りつぶしカラム）で治療したＣＩＡマウスから４１日目に単離した全脾細胞を、示されている量のＣIIの存在下又は非存在下にて７２時間培養し、培養物を、［^３Ｈ］チミジンでパルスし、取り込まれた放射線を測定した結果を示す。図５ｂは、対照Ｉｇ（白抜きカラム）又は抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ ｍＡｂ１００μｇ（塗りつぶしカラム）で治療したＣＩＡマウスの、抗−ＣII、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、及びＩｇＧ２ｂの血中濃度を、３２日目及び４１日目にＥＬＩＳＡで測定した結果を示す。この実験においては、関節炎マウス由来の血清の混合物で構成される標準血清を段階希釈にて各プレートに添加し、標準曲線を得た。標準血清を１ユニットと定義し、血清試料の抗体力価を、前記標準曲線により決定した。データは、２つの実験由来の各群における平均±ＳＤとして示す。 ヒトＴＲＥＭ−１−Ｈｉｓを用いてヒトＰＢＭＣのフローサイトメトリー分析を行った結果を示す図である。ヒトＰＢＭＣを、ビオチン化ヒトＴＲＥＭ−１−Ｈｉｓと反応（室温、３０分間）させて洗浄した後に、さらに、ストレプトアビジン−ＰＥ及びＰＣ５標識抗ＣＤ１９抗体と反応（氷上、３０分間）させて洗浄し、フローサイトメトリー解析を行った。図中、横軸はヒトＴＲＥＭ−１−Ｈｉｓの結合を、縦軸はＣＤ１９の発現をそれぞれ表す。 ＬＩＬＲ Ａ１及びＬＩＬＲ Ｂ２と、ヒトＴＲＥＭ−１−Ｈｉｓとの結合を示す図である。ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターを用いて、モック、ＬＩＬＲ Ａ１、又はＬＩＬＲ Ｂ２を発現するＢａ／Ｆ３細胞を作製した。作製した細胞を、ビオチン化ヒトＴＲＥＭ−１−Ｈｉｓと反応（室温、３０分間）させて洗浄した後に、さらに、ストレプトアビジン−ＰＥと反応（氷上、３０分間）させて洗浄し、フローサイトメトリー解析を行った。図中、横軸はＧＦＰの発現を、縦軸はヒトＴＲＥＭ−１−Ｈｉｓの結合をそれぞれ表す。

本発明のＴＲＥＭ−１活性阻害剤としては、（ａ）ＴＲＥＭ−１リガンドに対する中和抗体又はその抗体断片；（ｂ）ＴＲＥＭ−１リガンドを標的とする機能性核酸；の（ａ）又は（ｂ）を有効成分として含有するものであれば特に制限されず、ここで、「ＴＲＥＭ−１リガンド」とは、ＴＲＥＭ−１に結合することによってＴＲＥＭ−１を活性化させ、ＴＲＥＭ−１の細胞内シグナル伝達経路を介した細胞の応答を引き起こすことのできる内在性の生理活性物質を意味し、かかるＴＲＥＭ−１リガンドは、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等の哺乳動物に由来するＴＲＥＭ−１リガンドであればどのようなものであってもよいが、具体的には、例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＬＩＬＲ Ａ１（NCBI Reference Sequence: NP_006854.1）、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＬＩＬＲ Ｂ２（NCBI Reference Sequence: NP_001074447.1）等のヒトＴＲＥＭ−１リガンドや、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるＳｉｇｌｅｃ−Ｇ（NCBI Reference Sequence: NP_766488.2）等のマウスＴＲＥＭ−１リガンドを好適に挙げることができ、中でも、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＬＩＬＲ Ａ１、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＬＩＬＲ Ｂ２等のヒトＴＲＥＭ−１リガンドを特に好適に挙げることができる。

本発明における「ＴＲＥＭ−１リガンドに対する中和抗体（以下、「本中和抗体」と称する場合がある）」とは、ＴＲＥＭ−１リガンドに特異的に結合して、ＴＲＥＭ−１リガンドのＴＲＥＭ−１活性化作用を阻害又は抑制する抗体を意味し、上記本中和抗体としては、具体的には、例えば、ＬＩＬＲ Ａ１に特異的に結合して、ＬＩＬＲ Ａ１によるヒトＴＲＥＭ−１リガンドの活性化を阻害又は抑制する抗ＬＩＬＲ Ａ１中和抗体や、ＬＩＬＲ Ｂ２に特異的に結合して、ＬＩＬＲ Ｂ２によるヒトＴＲＥＭ−１リガンドの活性化を阻害又は抑制する抗ＬＩＬＲ Ｂ２中和抗体や、Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇに特異的に結合して、Ｓｉｇｌｅｃ−ＧによるマウスＴＲＥＭ−１リガンドの活性化を阻害又は抑制する抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ中和抗体等を好適に挙げることができる。また、本発明における「ＴＲＥＭ−１リガンドに対する中和抗体の抗体断片（以下、「本抗体断片」と称する場合がある）」とは、上記本中和抗体の可変領域の一部又は全部を含む抗体断片であって、ＴＲＥＭ−１リガンドに特異的に結合して、ＴＲＥＭ−１リガンドのＴＲＥＭ−１活性化作用を阻害又は抑制する抗体断片を意味し、本抗体断片としては、具体的には、例えば、上記抗ＬＩＬＲ Ａ１中和抗体の可変領域の一部又は全部を含む抗体断片であって、ＬＩＬＲ Ａ１に特異的に結合して、ＬＩＬＲＡによるヒトＴＲＥＭ−１リガンドの活性化を阻害又は抑制する抗ＬＩＬＲ Ａ１中和抗体の抗体断片や、上記抗ＬＩＬＲ Ｂ２中和抗体の可変領域の一部又は全部を含む抗体断片であって、ＬＩＬＲ Ｂ２に特異的に結合して、ＬＩＬＢ２によるヒトＴＲＥＭ−１リガンドの活性化を阻害又は抑制する抗ＬＩＬＲ Ｂ２中和抗体の抗体断片や、上記抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ中和抗体の可変領域の一部又は全部を含む抗体断片であって、Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇに特異的に結合して、Ｓｉｇｌｅｃ−ＧによるマウスＴＲＥＭ−１リガンドの活性化を阻害又は抑制する抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ中和抗体の抗体断片等を好適に挙げることができる。上記本中和抗体は、どのような種類の抗体であってもよいが、ヒト抗体、キメラ抗体、又はヒト化抗体であることが好ましく、また、上記本中和抗体の断片は、どのような種類の抗体断片であってもよいが、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ、ｄｉａｂｏｄｙ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、又はＳｃ（Ｆｖ）_２等であることが好ましい。

上記本中和抗体は、慣用のプロトコールに従って作製することができる。例えば、上記ヒト抗体は、インビトロにおいてＴＲＥＭ−１リガンドによって感作されたヒトリンパ球と、ヒトミエローマ細胞（例えば、Ｕ２６６等）とを融合させて得られるハイブリドーマの中から、ＴＲＥＭ−１リガンドと特異的に結合して、ＴＲＥＭ−１リガンドのＴＲＥＭ−１活性化作用を阻害又は抑制する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを適宜選択することによって作製することができる。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に、抗原となるＴＲＥＭ−１リガンドを投与し、前述の方法に従って所望のヒト抗体を取得してもよい（例えば、特公平１−５９８７８、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９４／０２６０２、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５等を参照のこと）。また、上記キメラ抗体は、例えば、抗ＴＲＥＭ−１リガンド抗体を産生するハイブリドーマ細胞から、Ｖ領域をコードするＤＮＡを慣用方法により単離して配列決定し、該ＤＮＡ断片とヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡとを連結して発現ベクターに導入し、宿主細胞（例えば、大腸菌、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ミエローマ細胞等）にトランスフェクトすることによって作製することができる。さらに、上記ヒト化抗体は、例えば、マウス抗ＴＲＥＭ−１リガンド抗体のＣＤＲ領域をコードするＤＮＡと、ヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡとを連結させて、適当なベクターに組み込み、該ベクターを用いて形質転換した形質転換体より調製することができる。（例えば、ＥＰ２３９４００、ＷＯ９６／０２５７６等を参照のこと）。また、上記「ヒト抗体定常領域」は、定常領域を構成するアミノ酸配列における欠失、置換、付加等により、Ｆｃ受容体又は補体と結合しないヒト抗体定常領域であってもよく、このようなＦｃ受容体又は補体と結合しないヒト抗体定常領域コードするＤＮＡは、例えば、特許第４６５９６８号等に記載されたＦｃ受容体結合部位に変異が導入された変異体の遺伝子情報に基づいて作製することができる。

また、上記本抗体断片は、慣用のプロトコールに従って作製することができる。例えば、上記Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ、ｄｉａｂｏｄｙ、及びＦｖは、ヒト又はヒト以外の動物に由来する抗ＴＲＥＭ−１リガンド抗体の全長抗体を、パパイン、ペプシン等のタンパク質分解酵素を用いて消化することによって作製するか（例えば、ＷＯ９４/２９３４８、及び以下の実施例を参照のこと）、又は、これらの抗体断片をコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現さることによって作製することができる（例えば、J. Immunol. 152, 2968-2976, 1994、Methods Enzymol. 178, 476-496, 1989、Methods Enzymol. 178, 497-515, 1989、Methods Enzymol. 121, 652-663, 1986、Methods Enzymol. 121, 663-669, 1986、Trends Biotechnol. 9, 132-137, 1991等を参照のこと）。さらに、上記ＳｃＦｖ及びＳｃ（Ｆｖ）_２は、Ｈ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域からなるＦｖの片方の鎖のＣ末端に、他方のＮ末端を適当なペプチドリンカーを挟んで連結し一本鎖化することによって作製することができる。より具体的には、例えば、上記中和抗体のＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡとペプチドリンカー（例えば、（ＧＧＧＧＳ）_３等）をコードするＤＮＡを用いてｓｃＦｖ抗体をコードするＤＮＡを構築し、これを適当なベクターに組み込み、該ベクターを用いて形質転換した形質転換体より調製することができる。

上記本中和抗体及び本抗体断片は、ヒト抗体ライブラリを用いて単離することもできる（例えば、Nature, 348, 552-554, 1990等を参照のこと）。より具体的には、例えば、ファージディスプレイ法により、ヒト抗体の可変領域をｓｃＦｖとしてファージの表面に発現させ、ＴＲＥＭ−１リガンドを固定化したプレートを用いて、ＴＲＥＭ−１リガンドに結合するファージを選択し、選択されたファージの遺伝子を解析することによって、ＴＲＥＭ−１リガンドに結合する抗体の可変領域をコードする遺伝子を同定することができる。これらの遺伝子配列を用いれば、ヒト抗ＴＲＥＭ−１リガンド中和抗体及びその抗体断片を作製することができる（例えば、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９３／０６２１３、ＷＯ９３／１１２３６、ＷＯ９３／１９１７２、ＷＯ９５／０１４３８、ＷＯ９５／１５３８８等を参照のこと）。

さらに、上記本中和抗体及び本抗体断片は、任意の水溶性重合体によって修飾されていてもよく、具体的には、例えば、ＰＥＧ化された中和抗体又はその抗体断片、フコシル化された中和抗体又はその抗体断片、グリコシル化された中和抗体又はその抗体断片等を好適に挙げることができるが、中でも、ＰＥＧ化された中和抗体又はその抗体断片を特に好適に挙げることができる。また、上記本中和抗体は、定常領域を構成するアミノ酸配列における欠失、置換、付加等により、Ｆｃ受容体又は補体と結合しないものであってもよい。

本発明における「ＴＲＥＭ−１リガンドを標的とする機能性核酸（以下、「本機能性核酸」と称する場合がある）」とは、ＴＲＥＭ−１リガンドの発現又は機能を特異的に抑制する核酸を意味し、上記本機能性核酸は、天然型、天然修飾型、合成型ヌクレオチドのいずれであってもよく、また、ＤＮＡ、ＲＮＡ、あるいはそれらのキメラ体であってもよいが、具体的には、ＴＲＥＭ−１リガンドをコードする遺伝子のセンス鎖に特異的に結合して、該遺伝子の分解又は翻訳抑制を引き起こす核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド等）や、ＴＲＥＭ−１リガンドに特異的に結合して、ＴＲＥＭ−１リガンドのＴＲＥＭ−１活性化作用を阻害又は抑制する核酸（例えば、核酸アプタマー、リボザイム等）や、ＴＲＥＭ−１リガンドをコードする遺伝子の転写調節に関与する因子に特異的に結合して、該遺伝子の転写を抑制する核酸（例えば、デコイ等）を好適に挙げることができる。より具体的には、上記本機能性核酸としては、ＬＩＬＲ Ａ１の発現又は機能を特異的に抑制するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、核酸アプタマー、リボザイム、又はデコイや、ＬＩＬＲ Ｂ２の発現又は機能を特異的に抑制するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、核酸アプタマー、リボザイム、又はデコイや、Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇの発現又は機能を特異的に抑制するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、核酸アプタマー、リボザイム、又はデコイを好適に例示することができ、中でも、ＬＩＬＲ Ａ１の発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡや、ＬＩＬＲ Ｂ２の発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡや、Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇの発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡを特に好適に例示することができる。

上記本機能性核酸は、生体内で分解されにくいように修飾した核酸であることが好ましく、特に、機能性核酸がＲＮＡの場合は、細胞内のＲＮａｓｅに対して分解されにくいように、メチル化処理やチオリン酸化処理などの抗ＲＮａｓｅ処理されていることが好ましく、核酸のリボースの２’位のメチル化処理や、核酸の骨格の結合のチオリン酸化処理がさらに好ましい。メチル化やチオリン酸化を行うヌクレオチドの数や位置は、核酸が有する発現抑制活性に若干影響を与える場合があるため、メチル化やチオリン酸化を行うヌクレオチドの数や位置等の態様には、好ましい態様が存在する。この好ましい態様は、修飾対象となる核酸の配列によっても異なるため一概にいうことはできないが、修飾後の核酸の発現抑制活性を確認するによって、好ましい態様を容易に調べることができる。

上記本機能性核酸は、ＴＲＥＭ−１リガンドをコードする遺伝子のＤＮＡ配列や、その転写調節領域のＤＮＡ配列などの情報に基づいて公知の方法により設計することができる。例えば、ｓｉＲＮＡであれば、特開２００５−１６８４８５号記載の方法を、核酸アプタマーであれば、Nature, 346(6287), 818-22, 1990等に記載の方法を、リボザイムであれば、FEBS Lett, 239, 285, 1988； タンパク質核酸酵素, 35, 2191, 1990； Nucl Acids Res, 17, 7059, 1989等に記載の方法を用いて、ＴＲＥＭ−１リガンドを標的とする機能性核酸を設計することができる。また、上記本機能性核酸は、公知の方法等を用いて調製することができる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドやリボザイムは標的遺伝子のｃＤＮＡ配列又はゲノミックＤＮＡ配列に基づいてｍＲＮＡもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができ、また、デコイやｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖をＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約９０〜約９５℃で約１分程度変性させた後、約３０〜約７０℃で約１〜約８時間アニーリングさせること等により調製することができる。また、核酸アプタマーは、特開２００７−０１４２９２号記載の方法等により調製することができる。

上記本発明のＴＲＥＭ−１活性阻害剤は、活性阻害の対象となるＴＲＥＭ−１と、同一の種類の動物に由来するＴＲＥＭ−１リガンドに対する中和抗体又は抗体断片を含有するか、あるいは、活性阻害の対象となるＴＲＥＭ−１と、同一の種類の動物に由来するＴＲＥＭ−１リガンドを標的とする機能性核酸を含有することが好ましい。具体的には、例えば、活性阻害の対象となるＴＲＥＭ−１が、ヒトＴＲＥＭ−１である場合には、本発明のＴＲＥＭ−１活性阻害剤が、ＬＩＬＲ Ａ１やＬＩＬＲ Ｂ２等のヒトＴＲＥＭ−１リガンドに対する中和抗体又はその抗体断片か、あるいは、ＬＩＬＲ Ａ１やＬＩＬＲ Ｂ２等ヒトＴＲＥＭ−１リガンドを標的とする機能性核酸を含有することが好ましく、また、活性阻害の対象となるＴＲＥＭ−１が、マウスＴＲＥＭ−１である場合には、本発明のＴＲＥＭ−１活性阻害剤が、Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ等のマウスＴＲＥＭ−１リガンドに対する中和抗体又はその抗体断片か、あるいは、Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ等のマウスＴＲＥＭ−１リガンドを標的とする機能性核酸を含有することが好ましい。本発明のＴＲＥＭ−１活性阻害剤は、上記本中和抗体、上記本抗体断片、及び上記本機能性核酸から選択される１又は複数を含有することができ、また、本発明のＴＲＥＭ−１活性阻害剤は、インビボ又はインビトロにおいて使用することができる。

本発明の、ＴＲＥＭ−１の活性化に起因する炎症性障害の予防又は治療剤（以下、「本発明の予防又は治療剤」と称する場合がある）としては、上記本発明のＴＲＥＭ−１活性阻害剤を有効成分として含有するものであれば特に制限されず、上記「ＴＲＥＭ−１の活性化に起因する炎症性障害」とは、ＴＲＥＭ−１及び／又はＴＲＥＭ−１リガンドの発現の増加や、ＴＲＥＭ−１を介した細胞内シグナル伝達経路の活性化の亢進が認められる炎症性障害を意味し、かかる「ＴＲＥＭ−１の活性化に起因する炎症性障害」としては、具体的には、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、シェーグレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、リウマチ熱、結節性多発性動脈炎等の膠原病や、敗血症、細菌性大腸炎等の細菌感染症や、潰瘍性大腸炎、クローン病等の炎症性腸疾患を好適に例示することができる。本発明の予防又は治療剤は、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等の哺乳動物であればどのようなものであっても投与対象とすることできるが、本発明の予防又は治療剤に含まれるＴＲＥＭ−１活性阻害剤が、投与対象となる動物と、同一の種類の動物に由来するＴＲＥＭ−１リガンドに対する中和抗体又は抗体断片を含有するか、あるいは、投与対象となる動物と、同一の種類に由来するＴＲＥＭ−１リガンドを標的とする機能性核酸を含有することが好ましい。具体的には、例えば、投与対象がヒトである場合には、本発明の予防又は治療剤に含まれるＴＲＥＭ−１活性阻害剤が、ＬＩＬＲ Ａ１やＬＩＬＲ Ｂ２等のヒトＴＲＥＭ−１リガンドに対する中和抗体又はその抗体断片か、あるいは、ＬＩＬＲ Ａ１やＬＩＬＲ Ｂ２等のヒトＴＲＥＭ−１リガンドを標的とする機能性核酸を含有するＴＲＥＭ−１活性阻害剤であることが好ましく、また、投与対象がマウスである場合には、本発明の予防又は治療剤に含まれるＴＲＥＭ−１活性阻害剤が、Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ等のマウスＴＲＥＭ−１リガンドに対する中和抗体又はその抗体断片か、あるいはＳｉｇｌｅｃ−Ｇ等のマウスＴＲＥＭ−１リガンドを標的とする機能性核酸を含有するＴＲＥＭ−１活性阻害剤であることが好ましい。

本発明の予防又は治療剤は、薬理学的に許容される公知の担体又は希釈剤等からなる補助成分や、炎症性障害の治療及び予防のための他の生理活性物質をさらに含有していてもよい。また、本発明の予防又は治療剤は、投与対象が炎症性障害であると判断された後に、治療を目的として投与してもよいし、投与対象が炎症性障害であると判断される前に、予防を目的として投与してもよい。本発明の予防又は治療剤の投与方法としては、特に制限されないが、例えば、注射投与（静脈内、筋肉内、動脈内等）、経口投与、経皮投与、経粘膜投与、経直腸投与、経腔投与等を好適に挙げることができる。

また、本発明の他の態様としては、（ａ）ＴＲＥＭ−１リガンドに対する中和抗体又はその抗体断片；（ｂ）ＴＲＥＭ−１リガンドを標的とする機能性核酸；の（ａ）又は（ｂ）のＴＲＥＭ−１活性阻害剤製造のための使用や、（ａ）ＴＲＥＭ−１リガンドに対する中和抗体又はその抗体断片；（ｂ）ＴＲＥＭ−１リガンドを標的とする機能性核酸；の（ａ）又は（ｂ）を有効成分として含有するＴＲＥＭ−１活性阻害剤を、ＴＲＥＭ−１の活性化に起因する炎症性障害の予防又は治療を必要とする患者に投与することにより、ＴＲＥＭ−１の活性化に起因する炎症性障害を予防又は治療する方法や、ＴＲＥＭ−１の活性化に起因する炎症性障害を予防又は治療するための、（ａ）ＴＲＥＭ−１リガンドの中和抗体又はその抗体断片；（ｂ）ＴＲＥＭ−１リガンドを標的とする機能性核酸；の（ａ）又は（ｂ）を有効成分として含有するＴＲＥＭ−１活性阻害剤や、ＴＲＥＭ−１の活性化に起因する炎症性障害の予防又は治療剤の製造における、（ａ）ＴＲＥＭ−１リガンドの中和抗体又はその抗体断片；（ｂ）ＴＲＥＭ−１リガンドを標的とする機能性核酸；の（ａ）又は（ｂ）を有効成分として含有するＴＲＥＭ−１活性阻害剤の使用にも関する。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

以下の（１）〜（９）に記載の材料及び方法を用いて、後述の実施例２〜９を行った。
［材料と方法］
（１）マウス及びラット
６週齢雄ＤＢＡ／１Ｊマウス、雌ＩＣＲヌードマウス、及び雌ＳＤラットを、Japan Charles River Breeding Laboratoriesから購入し、東京医科歯科大学の動物施設で維持した。以下の実施例に記載された全ての工程及び動物実験は、東京医科歯科大学の動物実験委員会で検討、承認された。

（２）融合タンパク質の作製
マウスＴＲＥＭ−１の細胞外領域（ａａ１〜２０１）をコードする遺伝子を、マウスＩｇＧ２ａのＦｃ領域（ａａ２３７〜４６９）をコードする遺伝子、又は６×ヒスチジン（Ｈｉｓ）と連結させた。また、ヒトＴＲＥＭ−１の細胞外領域（ａａ１〜２００）をコードする遺伝子を６×ヒスチジン（Ｈｉｓ）と連結させた。これらの組換え遺伝子をそれぞれ、レトロウイルスｐＭＸ ＩＲＥＳ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ベクター（東京大学、北村博士から譲受）にサブクローニングした。それらのベクターを、ｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ（水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質）ベクターとともに、リン酸カルシウムトランスフェクション法によって、Ｐｌａｔ−Ｅパッケージング細胞株にコトランスフェクションし、組換えウイルスを作製した（Gene therapy 7:1063-1066, 2000）。上記組換えウイルスを用いてＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞系）を処理し、Aria II cell sorter（BD Biosciences社製）を用いてＧＦＰ発現細胞を選択した（J Immunol 183:438-444, 2009）。次に、上記培養上清に含まれる、マウスＴＲＥＭ−１細胞外領域とマウスＩｇＧ２ａＦｃ領域との融合タンパク質（以下、「マウスＴＲＥＭ−１−Ｉｇ」と称する場合がある）、マウスＴＲＥＭ−１細胞外領域と６×Ｈｉｓとの融合タンパク質（以下、「マウスＴＲＥＭ−１−Ｈｉｓ」と称する場合がある）、及びヒトＴＲＥＭ−１細胞外領域と６×Ｈｉｓとの融合タンパク質（以下、「ヒトＴＲＥＭ−１−Ｈｉｓ」と称する場合がある）をそれぞれ、プロテインＧアガロースゲル及びHisPur Cobalt Resin（Fisher Thermo社製）を用いて精製した。さらに、精製されたマウスＴＲＥＭ−１−Ｈｉｓ及びヒトＴＲＥＭ−１−Ｈｉｓを、ＥＺ連結スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（Fisher Thermo）を用いてビオチン標識し、ビオチン化マウスＴＲＥＭ−１−Ｈｉｓ及びビオチン化ヒトＴＲＥＭ−１−Ｈｉｓを作製した。

また、ＴＲＥＭ−１−Ｉｇの作製と同様の方法によって、マウスＳｉｇｌｅｃ−Ｇの細胞外部分（ａａ１〜５４４）をコードする遺伝子と、マウスＩｇＧ２ａのＦｃ部分をコードする遺伝子とを連結させ（Genomics 82:521-530, 2003）、マウスＳｉｇｌｅｃ−Ｇ細胞外部分とマウスＩｇＧ２ａＦｃ領域との融合タンパク質（以下、「Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ−Ｉｇ」と称する場合がある）を作製した。また、マウスＴＲＥＭ−１細胞外部分（ａａ１〜２０１）の遺伝子と、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をコードする遺伝子とを連結させて、ＧＳＴ融合タンパク質（以下、「マウスＴＲＥＭ−１−ＧＳＴ」と称する場合がある）を作製した。マウスＴＲＥＭ−１−ＧＳＴの作製は、原核生物発現系に関する他文献の記載に従って行った（Methods in molecular biology 681:259-280, 2011）。

（３）Ｂａ／Ｆ３細胞形質導入株及びＣＨＯ細胞形質導入株の作製
全長Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ ｃＤＮＡ、マウスＴＲＥＭ−１ ｃＤＮＡ、全長ＬＩＬＲ Ａ１ ｃＤＮＡ又は全長ＬＩＬＲ Ｂ２ ｃＤＮＡをそれぞれ、ｐＭＸ ＩＲＥＳ ＧＦＰベクターにサブクローニングした。上記ＣＨＯ形質導入株と同様の方法によって、これらの組換えベクターをｐｒｏＢ細胞株（Ｂａ／Ｆ３）に導入して、Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ形質導入ｐｒｏＢ細胞（Ｂａ／Ｆ３）株（以下、「Ｂａ／Ｆ３／Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ」と称する場合がある）、及びマウスＴＲＥＭ−１形質導入ｐｒｏＢ細胞（Ｂａ／Ｆ３）株（以下、「Ｂａ／Ｆ３／マウスＴＲＥＭ−１」と称する場合がある）、ＬＩＬＲ Ａ１形質導入ｐｒｏＢ細胞（Ｂａ／Ｆ３）株（以下、「Ｂａ／Ｆ３／ＬＩＬＲ Ａ１」と称する場合がある）、ＬＩＬＲ Ｂ２形質導入ｐｒｏＢ細胞（Ｂａ／Ｆ３）株（以下、「Ｂａ／Ｆ３／ＬＩＬＲ Ｂ２」と称する場合がある）を作製した。

（４）発現クローニング
Gateway vector conversion システム、及びCloneminer II ｃＤＮＡライブラリ構築キット（Invitrogen社製）を用い、Ａ２０Ｂ細胞リンパ腫細胞由来のｃＤＮＡ（American Type Culture Collection）をｐＭＸベクター（東京大学、北村博士から譲受）にサブクローニングした（Proc Natl Acad Sci USA 79: 3604-3607, 1982）。構築したライブラリベクターを用いてＢａ／Ｆ３細胞の形質導入を行った。そして、Aria II cell sorter（BD Biosciences社製）を用いて、マウスＴＲＥＭ−１−Ｈｉｓに結合した形質導入細胞をソーティングした。また、同様の方法によって、ヒトＰＢＭＣ由来のｃＤＮＡからレトロウイルス発現ライブラリベクターを作製してＢａ／Ｆ３細胞の形質導入を行い、ヒトＴＲＥＭ−１−Ｈｉｓに結合した形質導入細胞をソーティングした。

（５）抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ ｍＡｂの作製
Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ発現Ｂａ／Ｆ３細胞（Ｂａ／Ｆ３／Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ）をＳＤラットに免疫することにより、抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ ｍＡｂを作製した。免疫脾細胞をＰ３Ｕ１骨髄腫細胞と融合することにより、ハイブリドーマを作製した後、それらの培養上清を調べ、Ｂａ／Ｆ３／Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇに結合し、かつ形質導入されていないＢａ／Ｆ３細胞に結合しない抗体の存在についてスクリーニングした。腹水からｍＡｂを精製するため、選別されたハイブリドーマをＩＣＲヌードマウスの腹腔に注入した。

（６）ＦＡＣＳ分析
マウスＴＲＥＭ−１Ｌ発現細胞のフローサイトメトリー解析には、ビオチン化マウスＴＲＥＭ−１−Ｈｉｓ、ＦＩＴＣ結合抗マウスＢ２２０ｍＡｂ（BD Biosciences社製）、及び対照Ｉｇ（BD Biosciences社製）を用いた。また、ヒトＴＲＥＭ−１Ｌ発現細胞のフローサイトメトリー解析には、ビオチン化ヒトＴＲＥＭ−１−Ｈｉｓ、ストレプトアビジン−ＰＥ（e-bioscience社製）、及び細胞表面マーカーとしてＰＣ５標識抗ＣＤ１９抗体（Beckman Coulter社製）を用いた。フローサイトメトリー解析は、FACSCalibur（BD Biosciences社製）又はAccuri cytometer（Accuri cytometers社製）を、Flow Joソフトウェア（Tree Star社製）とともに用いて行った。

（７）マウスＴＲＥＭ−１及びＳｉｇｌｅｃ−Ｇの架橋
段階希釈されたＳｉｇｌｅｃ−Ｇ−Ｉｇのみ、又は、段階希釈されたＳｉｇｌｅｃ−Ｇ−Ｉｇ及びＴＲＥＭ−１−Ｉｇによりプレコーティングされた平底のマイクロタイターウェル中で、常在性腹腔マクロファージをインキュベートした（Arthritis Rheum 60:1615-1623, 2009）。２４時間後、培養上清を収集して、ＥＬＩＳＡキット（R&D systems社製）によりＴＮＦ−αを定量した。

（８）抗体によるＣＩＡの治療
Iwai et al.（J Immunol 169:4332-4339, 2002）の記載に従ってマウスにＣＩＡを誘導し、四肢の腫れを０〜４に等級付けした（０＝腫れなし、１＝足指関節の腫れ、又は局所的赤み、２＝手関節又は足関節の軽度の腫れ、３＝肢全体の重度の腫れ、及び４＝変形又は強直）。また、四肢の総スコアを、関節炎スコアとして用いた。さらに、以下の組織学的及び放射線学的パラメータも評価して、０〜２に等級付けした。滑膜の炎症（０＝正常、１＝局所的炎症性浸潤、及び２＝細胞の組織構造の大半を占める炎症性浸潤）；骨の破壊（０＝正常、１＝小さい領域の骨の破壊、及び２＝広範囲の骨の破壊）（Arthritis Rheum 52:3004-3014, 2005；Arthritis Res Ther 7:R1348-1359, 2005）。Ｔ細胞の増殖を評価するため、初回免疫から４１日後（４１日目）のマウス由来の全脾臓細胞を用い、１００μｇ／ｍｌ変性（６０℃、３０分）ウシコラーゲンタイプII（ＣII）の存在下又は非存在下で培養した。Iwai et al.（J Immunol 169:4332-4339, 2002）のとおりに、［^３Ｈ］チミジンの取り込みによりＴ細胞増殖を測定した。また、３２日目及び４１日目に血清試料を収集して、Iwai et al.（J Immunol 169:4332-4339, 2002）に記載のとおりに抗ＣII ＩｇＧ抗体をＥＬＩＳＡで定量した。

（９）統計的分析
抗ＣII抗体の力価及び^３Ｈ−チミジンの取り込みを、対応のあるスチューデントｔ−検定で比較した。関節炎スコア、組織学的スコア、及び放射線学的スコアをマン−ホイットニーのＵ検定で分析した。

［Ｂ細胞におけるマウスＴＲＥＭ−１リガンドの発現］
マウスＴＲＥＭ−１−Ｈｉｓを用いてマウス脾細胞のフローサイトメトリー分析を行い、マウス脾細胞にマウスＴＲＥＭ−１の潜在的リガンドが発現しているかどうかを調べた。図１ａに示すように、フローサイトメトリー分析の結果、マウスＴＲＥＭ−１−ＨｉｓがＢ２２０陽性脾細胞に顕著に結合することが明らかとなった。この結果から、Ｂ細胞にマウスＴＲＥＭ−１のリガンド（以下、「マウスＴＲＥＭ−１−Ｌ」と称する場合がある）が発現していることが明らかとなった。

［マウスＴＲＥＭ−１−Ｌの同定］
マウスＴＲＥＭ−１−Ｌ ｃＤＮＡを含むレトロウイルスｃＤＮＡライブラリを構築するために、Ｂリンパ芽球細胞株におけるマウスＴＲＥＭ−１−Ｌの発現について調べた。図１ｂに示すように、フローサイトメトリー分析の結果、マウスＴＲＥＭ−１−Ｈｉｓは、Ａ２０及びＫ４６Ｂ細胞株に結合した。この結果に基づいて、Ａ２０細胞由来レトロウイルスｃＤＮＡ発現ライブラリを構築し、Ｂａ／Ｆ３細胞に導入した。なお、Ｂａ／Ｆ３細胞は、レトロウイルス遺伝子導入の前にはマウスＴＲＥＭ−１−Ｈｉｓ結合について陰性であった（データは示さず）。

マウスＴＲＥＭ−１−Ｈｉｓに結合したＢａ／Ｆ３形質導入株を３回ソーティングした後、かかるソーティングされた細胞は一様に、マウスＴＲＥＭ−１−Ｈｉｓ結合陽性となった。導入されたｃＤＮＡを識別するため、これらの細胞から単離したｍＲＮＡをｃＤＮＡに転換し、上記レトロウイルスベクター配列のフランキング領域を特定する上流及び下流のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物の配列を決定し、上記陽性細胞が、マウスシアル酸結合性免疫グロブリン様レクチン（Ｓｉｇｌｅｃ）−Ｇの全長ｃＤＮＡを有することが示された。

さらに、Ｓｉｇｌｅｃ−ＧがマウスＴＲＥＭ−１−Ｈｉｓと相互作用することを確認するために、レトロウイルスを用いてＢａ／Ｆ３細胞に全長Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ ｃＤＮＡを形質導入し、マウスＴＲＥＭ−１−Ｈｉｓに結合するかどうかについて調べた。図１ｃ及びｄに示すように、モックを形質導入したＢａ／Ｆ３細胞及び形質導入しなかった細胞と異なり、Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇを形質導入した細胞はマウスＴＲＥＭ−１−Ｈｉｓに結合した。また、図１ｅに示すように、大腸菌発現系を用いて作製したマウスＴＲＥＭ−１の細胞外部分とＧＳＴとの組換え融合タンパク質もまた、Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ形質導入細胞に結合した。このことは注目すべきことである。原核生物系により作製された融合タンパク質には糖鎖形成が欠如しているので、マウスＴＲＥＭ−１のシアル酸と、シアル酸と結合することが知られているＳｉｇｌｅｃ−Ｇのシアロ接着（sialoadhesion）Ｖセットドメインとの間の相互作用は、この結合に関与していないはずである。

［Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ刺激によるマクロファージのＴＮＦ−α産生］
アゴニスト抗マウスＴＲＥＭ−１抗体は、特にＬＰＳで同時に刺激した場合にマクロファージからのＴＮＦ−αの放出を促進する（J Immunol 164:4991-4995, 2000）。この事実は、炎症の増幅因子としてのマウスＴＲＥＭ−１のライゲーションの役割を示すものである。Ｓｉｇｌｅｃ−ＧがマウスＴＲＥＭ−１を介して同様に作用できるかどうかを調べるため、マウス腹腔マクロファージを、Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ−Ｉｇでコーティングしたマイクロタイターウェル中でインキュベートした。図２ａに示すように、Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ−Ｉｇによる処理は、ＴＮＦ−αの産生を増大させた。また、このようなＴＮＦ−αの産生の増大は、Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ−ＩｇとマウスＴＲＥＭ−１−Ｈｉｓとを共にインキュベートすることにより抑制された。これらの結果から、Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇが、マウスＴＲＥＭ−１を介してマクロファージを刺激することが示された。さらに、図２ｂに示すように、ＬＰＳ単独でもマクロファージからのＴＮＦ−α産生を刺激したが、固定したＳｉｇｌｅｃ−Ｇ−Ｉｇによる同時刺激は、ＴＮＦ−αの分泌をさらに増加させた。これらの結果から、Ｓｉｇｌｅｃ−ＧがマウスＴＲＥＭ−１の機能的リガンドである可能性が示唆された。

［抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇモノクローナル抗体の作製］
ヒトの疾患の動物モデルにおける遮断抗体の投与はしばしば、特定のリガンド−受容体相互作用の病理学的役割を明らかにする。抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇモノクローナル抗体を作製するために、ラットをＳｉｇｌｅｃ−Ｇ発現Ｂａ／Ｆ３細胞で免疫し、免疫脾臓Ｂ細胞を単離した。これらの細胞を用いてハイブリドーマを樹立した結果、１６の融合クローンが、Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ形質導入株に結合し、かつ親のＢａ／Ｆ３細胞に結合しない抗体を産生した（図３ａ）。また、Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ形質導入株を、いくつかの抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ ｍＡｂクローンとともにプレインキュベートすると、Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ形質導入株のマウスＴＲＥＭ−１−Ｈｉｓへの結合が遮断された（図３ｂ）。抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ ｍＡｂによりマウスＴＲＥＭ−１のＳｉｇｌｅｃ−Ｇへの結合が阻害されたことも、マウスＴＲＥＭ−１がＳｉｇｌｅｃ−Ｇに直接結合することを示唆する。これらのアンタゴニストｍＡｂクローンの１つを、以下のインビボの実験に用いた。

［抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ遮断ｍＡｂを用いたマウスのコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）の治療］
Murakami et al.（Arthritis Rheum 60:1615-1623, 2009）には、インビボにおいて、マウスＴＲＥＭ−１の活性化をマウスＴＲＥＭ−１−Ｉｇで遮断することにより、関節リウマチのマウスモデルであるＣＩＡの治療に成功したことが記載されている。上記実施例４により作製された抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ ｍＡｂが、ＣＩＡに対して、マウスＴＲＥＭ−１−Ｉｇと同様の効果を示すかどうかを確認した。まず、ＤＢＡ／１ＪマウスにウシＣIIを免疫し、二次免疫の日（２１日目）から２０日間、５０μｇ若しくは１００μｇの抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ ｍＡｂ又は１００μｇの対照Ｉｇを腹腔内注射することにより治療した。この結果、抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ ｍＡｂの投与は、ＣＩＡの臨床症状を改善させることが明らかとなった（図４ａ）。また、４１日目の対照マウス由来の関節を病理組織学的に検査すると、単核細胞の浸潤、滑膜の過形成、軟骨破壊、及び骨の侵食が認められるが（図４ｂ及びｆ）、抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ ｍＡｂで治療したマウスでは、これらの特徴は抑制されることが明らかとなった（図４ｃ及びｆ）。さらに、放射線検査の結果、抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ ｍＡｂでの治療により、骨の侵食が抑制されていることが示された（図４ｄ、ｅ及びｇ）。

次に、抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ ｍＡｂによる治療が関節炎の発症後にも有効であるかどうか検討するため、当施設におけるＣＩＡ発症の平均日である２６日目から、同様の治療を開始した（J Immunol 169:4332-4339, 2002）。この治療プロトコールは、関節炎の臨床症状を低減させるのにも有効であった（図４ｈ）。これらの結果は、マウスＴＲＥＭ−１−ＩｇによるＣＩＡの治療結果と類似しており、ＣＩＡの病理におけるマウスＴＲＥＭ−１／Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ経路の役割が重要であることを示すものである。

［Ｔ細胞及びＢ細胞応答に対する抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ ｍＡｂ治療の効果］
マウスＴＲＥＭ−１のライゲーションは、単球の樹状細胞への分化を引き起こし、獲得免疫を惹起する（J Immunol 170:3812-3818, 2003）。獲得免疫におけるＳｉｇｌｅｃ−Ｇ遮断の役割を検討するため、ＣII−特異的Ｔ細胞及びＢ細胞応答の予防的治療における抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ ｍＡｂの効果を調べた。４１日目に、１００μｇの抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ ｍＡｂで治療したマウス及び対照マウスから単離した脾細胞は同程度に、ＣIIに対して良好に反応して増殖した（図５ａ）。抗−ＣII、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、及びＩｇＧ２ｂ抗体の血中濃度は、３２日目及び４１日目に２つの群で一致した（図５ｂ）。以上のことから、抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ ｍＡｂ治療は、獲得免疫を減弱させないことが明らかとなった。また、これらの結果は、マウスＴＲＥＭ−１−Ｉｇ投与の結果と類似していた。ＴＲＥＭ−１のリガンドは複数の可能性があるが、ＣＩＡの病理においてＳｉｇｌｅｃ−Ｇは、主要なリガンドである可能性がある。

［Ｂ細胞におけるヒトＴＲＥＭ−１リガンドの発現］
ヒトＴＲＥＭ−１−Ｈｉｓを用いてヒトＰＢＭＣのフローサイトメトリー分析を行い、ヒトＰＢＭＣにヒトＴＲＥＭ−１の潜在的リガンドが発現しているかどうかを調べた。図６に示すように、フローサイトメトリー分析の結果、ヒトＴＲＥＭ−１−Ｈｉｓが、ＣＤ１９陽性細胞（Ｂ細胞）に結合することが明らかとなった。この結果から、ヒトＢ細胞にマウスＴＲＥＭ−１のリガンド（以下、「ヒトＴＲＥＭ−１−Ｌ」と称する場合がある）が発現していることが明らかとなった。

［ヒトＴＲＥＭ−１−Ｌの同定］
ヒトＰＢＭＣ由来のｍＲＮＡを用いて作製したレトロウイルスｃＤＮＡライブラリを、Ｂａ／Ｆ３細胞に導入した。ビオチン化ヒトＴＲＥＭ−１−Ｈｉｓに結合したＢａ／Ｆ３形質導入株をセルソーターで単離した。さらに、このソーティングを３回繰り返すことによって、ヒトＴＲＥＭ−１−Ｌ発現細胞を濃縮した。得られたヒトＴＲＥＭ−１−Ｌ発現細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、遺伝子導入に用いたベクターに特異的プライマーを用いたＰＣＲにより導入遺伝子を増幅した。ＰＣＲ産物をゲル抽出した後に、シークエンスを解析した結果、導入遺伝子がＬＩＬＲ Ｂ２であることが明らかとなった。また、ホモロジー解析を行った結果、ＬＩＬＲ Ｂ２にホモロジーのある遺伝子としてＬＩＬＲ Ａ１を同定した。さらに、ＬＩＬＲ Ａ１及びＬＩＬＲ Ｂ２と、ヒトＴＲＥＭ−１−Ｈｉｓとの相互作用を確認するために、Ｂａ／Ｆ３細胞に全長ＬＩＬＲ Ａ１ ｃＤＮＡ又は全長ＬＩＬＲ Ｂ２ ｃＤＮＡを形質導入し、マウスＴＲＥＭ−１−Ｈｉｓに結合するかどうかについて調べた。図７に示すように、フローサイトメトリー分析の結果、ＬＩＬＲ Ａ１とＬＩＬＲ Ｂ２のいずれもがヒトＴＲＥＭ−１−Ｈｉｓと結合することが明らかとなった。以上の結果から、ＬＩＬＲ Ａ１及びＬＩＬＲ Ｂ２が、ヒトＴＲＥＭ−１のリガンドであることが示唆された。

Claims (11)

1. 以下の（ａ）又は（ｂ）を有効成分として含有するＴＲＥＭ−１活性阻害剤。
   （ａ）ＴＲＥＭ−１リガンドに対する中和抗体又はその抗体断片；
   （ｂ）ＴＲＥＭ−１リガンドを標的とする機能性核酸；
2. ＴＲＥＭ−１リガンドが、ＬＩＬＲ Ａ１又はＬＩＬＲ Ｂ２である請求項１記載の活性阻害剤。
3. 中和抗体が、ヒト抗体、キメラ抗体、又はヒト化抗体である請求項１又は２記載の活性阻害剤。
4. 抗体断片が、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ、ｄｉａｂｏｄｙ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、又はＳｃ（Ｆｖ）_２である請求項１又は２記載の活性阻害剤。
5. 中和抗体又はその抗体断片が、ＰＥＧ化された中和抗体又はその抗体断片である請求項１〜４のいずれかに記載の活性阻害剤。
6. 機能性核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、核酸アプタマー、リボザイム、又はデコイである請求項１〜５のいずれかに記載の活性阻害剤。
7. 請求項１〜６のいずれかに記載の活性阻害剤を有効成分として含有する、ＴＲＥＭ−１の活性化に起因する炎症性障害の予防又は治療剤。
8. 炎症性障害が、膠原病、細菌感染症、又は炎症性腸疾患である請求項７記載の予防又は治療剤。
9. 膠原病が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、シェーグレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、リウマチ熱、又は結節性多発性動脈炎である請求項８記載の予防又は治療剤。
10. 細菌感染症が、敗血症又は細菌性大腸炎である請求項８記載の予防又は治療剤。
11. 炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎又はクローン病である請求項８記載の予防又は治療剤。