JP5576275B2 - 再灌流障害および組織損傷を処置するためのtlr−2拮抗薬の使用 - Google Patents
再灌流障害および組織損傷を処置するためのtlr−2拮抗薬の使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5576275B2 JP5576275B2 JP2010518699A JP2010518699A JP5576275B2 JP 5576275 B2 JP5576275 B2 JP 5576275B2 JP 2010518699 A JP2010518699 A JP 2010518699A JP 2010518699 A JP2010518699 A JP 2010518699A JP 5576275 B2 JP5576275 B2 JP 5576275B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- tlr2
- receptor
- toll
- binding
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P39/00—General protective or antinoxious agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P39/00—General protective or antinoxious agents
- A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P41/00—Drugs used in surgical methods, e.g. surgery adjuvants for preventing adhesion or for vitreum substitution
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/10—Antioedematous agents; Diuretics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/06—Antiarrhythmics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/12—Antihypertensives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
- G01N33/567—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds utilising isolate of tissue or organ as binding agent
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Diabetes (AREA)
Description
細胞または組織におけるTLR2の1つ以上の生物学的活性を減少させるのに十分な量で、TLR2活性または発現の少なくとも1つの拮抗薬と、細胞または組織とを接触させる工程を含む、方法を提供することである。
Toll様受容体2の機能を調節する治療有効量の薬剤を提供する工程、および
そのような処置を必要とする被験体に前記化合物を投与する工程を含む、方法が提供される。
Toll様受容体2の機能を調節する治療有効量の薬剤を提供する工程、および
前記化合物を、そのような処置を必要とする被験体に投与する工程、を含む。
Toll様受容体2タンパク質の発現を遮断する、治療有効量の阻害核酸を提供する工程、および
そのような処置を必要とする被験体に前記阻害核酸を投与する工程、を含む。
(a)核酸の候補混合物を提供する工程、
(b)Toll様受容体2を発現する細胞を前記候補核酸混合物と接触させる工程、
(c)他の候補核酸に比べてToll様受容体2に対する高い親和性を有する核酸を選択する工程、
(d)Toll様受容体2に対する親和性を有する少なくとも1つの核酸を提供するために、前記選択された核酸を増幅させる工程、および
(e)Toll様受容体2に対する高い親和性および特異性を有する核酸から少なくとも1つの核酸を選択する工程、を含む。
Toll様受容体2のリガンドに結合できるToll様受容体2の可溶性形態またはその可溶性断片の治療有効量を提供する工程、および
治療有効量の前記化合物をそのような処置を必要とする被験体に投与する工程、を含む。
Toll様受容体2に結合特異性を有するリガンドと共に膜結合Toll様受容体2の受容体を提供する工程、
候補化合物をToll様受容体2と接触させる工程、
Toll様受容体2をToll様受容体2のリガンドに曝露する工程、
Toll様受容体2に対するToll様受容体2のリガンドの結合を測定する工程、を含み、Toll様受容体2のリガンドによるToll様受容体2の結合の阻害は、前記候補化合物がToll様受容体2の活性化およびシグナル伝達の調節因子であることを示す。
Toll様受容体2の活性化および/またはシグナル伝達を調節する治療有効量の薬剤を提供する工程、および
治療有効量の前記化合物をそのような処置を必要とする被験体に投与する工程、を含む。
治療有効量のToll様受容体2の抑制薬剤を提供する工程、および
前記処置を必要とする被験体に前記抑制薬剤を投与する工程、を含む。
「抗体」は、天然または部分的もしくは完全に合成的に産生される免疫グロブリンである。この用語はまた、結合ドメイン、つまり抗体結合ドメイン、またはそれに相同的である結合ドメインを有する任意のポリペプチド、タンパク質またはペプチドを含む。これらは天然源由来であってもよいか、またはそれらは部分的もしくは完全に合成的に産生されてもよい。抗体の例は、免疫グロブリンアイソタイプおよびそれらの同形のサブクラスならびにFab、scFv、Fv、dAb、Fd、および二重特異性抗体などの抗原結合ドメインを含む断片である。
本発明によって提供される抗体は、多くの手段によって提供され得る。例えば、ファージディスプレイベースのバイオパニングアッセイなどの組み合わせスクリーニング技術が、本発明の結合エピトープに対する結合特異性を有するアミノ酸配列を同定するために使用され得る。このようなファージディスプレイバイオパニング技術は、糸状菌の表面上の抗体結合断片のディスプレイを介して、免疫選択を模倣する手順において適切なエピトープ結合リガンドを同定する方法で利用されるファージディスプレイライブラリーの使用を含む。特異的結合活性を有するファージが選択される。選択されたファージはその後、キメラ、CDR移植、ヒト化またはヒト抗体の産生に使用され得る。
本発明のエピトープに結合でき、従って本発明の方法に使用され得る免疫グロブリンは、当業者に公知の任意の技術を用いて同定され得る。そのような免疫グロブリンは、簡便に、免疫グロブリンポリペプチドの人工レパートリーを含むライブラリーから単離され得る。「レパートリー」とは、複数の結合特異性を与えるために、核酸レベルで、ランダム、準ランダムまたは1つ以上の鋳型分子の直接変異によって産生される分子のセットをいう。レパートリーを産生するための方法は、当該分野において十分に特徴付けられている。
ペプチド模倣物またはペプチド模倣薬などのペプチド類似物は、鋳型ペプチドの代表的な特性を有する非ペプチド化合物である。そのようなペプチド類似物は、典型的に、コンピューターによる分子モデリングを用いて開発される。本発明のTLR2結合エピトープに対する親和性および結合特異性を有するペプチドに構造的に類似するペプチド模倣物は、類似の診断的、予防的および治療的効果を媒介するために使用され得る。
種々のさらなる態様において、本発明は、TLR2活性または発現に拮抗する低分子化合物を同定するのに使用するためのスクリーニングおよびアッセイ方法に関する。特定のさらなる態様は、同定された化合物にまで及び、従って、前記結合化合物は、結合した場合、エピトープに対する親和性および結合特異性を有し、TLR2の機能活性を阻害する。
上記のように、本発明は併用治療にまで及び、組成物または方法は、再灌流障害の原因となり得る免疫応答を抑制するか、または心臓病を処置するのに役立つ少なくとも1つのさらなる治療化合物と組み合わせて投与されるTLR2の機能的活性を阻害する結合化合物の投与に関する。
本発明のモノクローナル抗体または融合タンパク質は単独で投与され得るが、好ましくは、意図される投与経路に依存して選択される一般に適切な薬理学的に許容できる賦形剤、希釈剤または担体を含む医薬組成物として投与される。適切な薬理学的担体の例としては、水、グリセロール、エタノールおよび他のGRAS試薬が挙げられる。
(材料および方法)
(i)動物および実験計画
雄性C57BL6マウス(8〜12週齢、体重25〜30グラム)に、30分の虚血後、24時間の再灌流を受けさせた。
梗塞面積(IS)を、リスク領域(AAR)および全左心室(LV)の割合として表した。AAR/LVの比を、虚血および再灌流を受けた心筋組織の範囲(すなわち、危険にさらされた面積)について測定した。IS/AARの比は、危険にさらされた心筋内の梗塞面積を決定するための正確な尺度であり、さらに主用評価項目であり、その主用評価項目から処置の有効性が取り扱われる。副次的評価項目IS/LVの比は、全左心室壁内の梗塞面積の割合である。
全てのデータを平均±SDとして表した。歪度±SDおよび尖度±SDの正規性を確認した後、ボンフェローニ調整(表2)およびダネットT検定(両側(2−sided))(表4)を用いて一元配置分散分析(one−way ANOBA)を、群間の差を試験するために使用した。異常分布が疑われた場合(すなわち、尖度および歪度の値がそれらの標準偏差の2倍である場合)、Kolmogorov−Smirnov試験を実施した。全ての統計的分析を、Windows(登録商標)(SPSS,Chicago,USA)用のSPSSバージョン13.0を用いて実施し、p<0.05を有意とみなした。
生存−全ての動物が30分の虚血後、24時間の再灌流で生存していた。
実施例1の実験を以下に示すように、および図15〜23にさらに示すように繰り返した。
全ての動物は、30分の虚血/24時間の再灌流で生存していた。IgGアイソタイプで処置した2匹のマウスを除いて、全ての動物は、MI/R障害後28日にも生存していた。死因は、手順および/または感染症の原因と関連していなかった。
図15、16、17および18は、異なる群における心臓の断面の代表的な例を示す。
表5ならびに図19、20および21は、データおよびそれらの分布を示す。全てのデータは正規分布されている。p38阻害剤群は異常分布に対する疑いがあったが、Kolmogorov−Smirnov試験により、その正規性(p=0.077)が示された。
AAR/LVは群の中で異ならず、左心室は群の間の処置によって等しい影響を受けていたことを意味する(図1)。
表5は、PBS処置に対する多重比較を示す。TLR2ノックアウトおよびマウスIgG1抗TLR2抗体OPN−301処置は、有意な梗塞面積の減少を生じる。マウスIgG1抗TLR2抗体OPN−301での処置は、AAR内の梗塞面積(IS/AAR)を45%(p=0.001)減少させる。TLR2ノックアウト(KO)マウスは、33.3%(p=0.025)の減少を示す。意図される陽性対照p38阻害剤で処置したマウスは、梗塞面積の減少を示さない(p=0.956)(図20)。
図24および表6は、梗塞28日後の心臓機能および形状の変化を示す。拡張終期および収縮末期の体積の両方は、生理的食塩水およびIgGアイソタイプ処置で増加するが、OPN−301処置は、両方のパラメーターの減少を生じる。さらに、駆出率は、生理的食塩水およびIgGアイソタイプで処置したマウスにおいて悪化する。対照的に、マウスIgG1抗TLR2抗体OPN−301は、駆出率のわずかな増加によって示されるように、梗塞28日後の心臓機能を保存する。これらのデータは、OPN−301処置での梗塞面積の減少が、MI/R障害後、保存された心臓機能および心臓形状になることを示唆する。
ブタ血液試料を、室温で保存されている試料を用いて、ヘパリン化したチューブに与える(n=4〜5)。TLR2機能を拮抗するOPN−301モノクローナル抗体の阻害可能性を決定する。TLR−2/TLR−4阻害ペプチドおよびTLR−4阻害ペプチドをまた、精製されたブタPBMCの誘導後に、定義したTLR作動薬を用いて評価する。
ブタPBMCを、マウスIgG1抗TLR2抗体OPN−301(1000−0.01ng/mg)またはTLR阻害ペプチドの投薬量の存在下または非存在下において、TLR−2作動薬Pam3CSK4およびFSL−1またはTLR−4作動薬LPSで誘導する。細胞を6時間および24時間誘導し、TNF−αの存在について上清を試験した。
ウサギPBMCを、マウスIgG1抗TLR2抗体OPN−301(1000〜0.01ng/ml)またはTLR阻害ペプチドの用量範囲の存在下または非存在下において、TLR−2拮抗薬Pam3CSK4およびFSL−1またはTLR−4作動薬LPSで誘導する。細胞を6時間および24時間誘導し、上清をTNF−αの存在について試験した。
以前の実験により、マウス虚血再灌流障害におけるマウスIgG1抗TLR2抗体OPN−301の治療効果が示された。マウスIgG1抗TLR2抗体OPN−301の作用機構をより完全に決定する研究は有益である。マウスで実施した以前の虚血研究と同様のプロトコルを使用するが、免疫組織化学、炎症、好中球、サイトカイン、アポトーシスおよびマトリクスターンオーバーなどの他のパラメーターを試験する。
虚血再灌流を、TLR−2とTLR4阻害剤との組み合わせを用いて評価する。これは、マウスIgG1抗TLR2抗体OPN−301が、この動物モデルにおいて機能を示すことを与えるブタで実施する。以前に実施した研究により、心臓虚血炎症応答におけるTLR4の役割が明確に示されている。マウスIgG1抗TLR2抗体OPN−301で実施した以前の研究が、TLR2を阻害する治療効果を示すため、併用治療アプローチはさらに有益であり得る。
実験は、マウスIgG1抗TLR2抗体OPN−301が特定のマウスモデル(ApoE−/−腱板モデル)において治療効果を有するか否かを評価する。動脈硬化性プラーク形成の内在する一連のイベントにおける最初の工程の1つは、血管損傷部位への単球のリクルートメントである。TLRファミリーの10個のメンバーのうち、TLR1、TLR2、およびTLR4の発現は、ヒト動脈硬化性プラークにおいて著しく向上する。最近、TLR4およびTLR2のライゲーションは、マウスの動脈において内膜新生を促進することが観測されている。さらに、向上したTLR2発現は、プラークを不安定化することが示されている。従って、この実験は、プラークサイズおよび形成を減少する際のOPN−301およびTLR阻害ペプチドの治療可能性を試験し、アテローム性動脈硬化のマウスマデルにおけるプラーク安定性を評価する。
ステント挿入後、炎症応答は、典型的に、ステント−ステントを移植された被験体の免疫系によって開始される。典型的に、動脈閉塞は、この炎症免疫応答の結果として生じる。これらの実験は、ステントがマウスIgG1抗TLR2抗体OPN−301または類似のTLR阻害ペプチドでコーティングされる新規の処置計画の治療可能性を試験する。このアプローチの利点は、炎症の局所部位に非常に高い局所性を与え、内膜新生を防止し、さらなる下流の他のプラークを安定化する可能性がある。
この実施例は、抗TLR2モノクローナル抗体OPN−301が、マウスにおける梗塞面積を減少させるのに効果的である機構を考える。この実験は、炎症のためのマーカー、アポトーシスの範囲および生存経路の活性化を考える。
1群あたり6匹のマウスの群に、再灌流の5分前に尾静脈を介して10mg/kgのアイソタイプ対照または実験的抗TLR2OPN−301モノクローナル抗体(mAb)を投与した。
群 処置
1.ビヒクル対照 PBS
2.実験的mAb 10mg/kg OPN301
3.陰性対照 10mg/kg IgGアイソタイプ
4.偽処置 PBS
5.キメラ合成 10mg/kg OPN301
6.キメラ心臓 10mg/kg OPN301
C57/BL6マウス(25〜30g)を、30分の心筋虚血、および24時間の再灌流または偽処置に供した。簡単に、マウスを、フェンタニル−ドルミカム−メデトミジン(Fentanyl−Dormicum−Domitor)(上述)の混合物で麻酔した。麻酔を維持するために必要な場合、さらなる用量を与えた。マウスをインキュベートし、100%の酸素を通気した。虚血を、通常配置される左心房の頂部から1mmのLCAの上に配置されたPE−10チューブの一部で、8〜0絹縫合糸を用いて左冠静脈(LCA)を結紮することにより達成した。30分間の閉塞後、再灌流を、結紮をほどき、PE−10チューブを除去することにより、開始した。偽処置したマウスにおいて、絹縫合糸を、LCAを結紮せずに配置した。
免疫組織化学分析のために、心臓を、一晩、4%のホルモル生理的食塩水で固定し、パラフィンで包埋した。4μmの断片を切断し、障害の形態および証拠を評価するために、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。免疫組織学染色は、抗マウスMAC−3(#550292,Pharmingen,クローンM3/84,ラット抗マウスIgG1)、CD45抗体(#550539,Pharmingen,クローン30−F11,ラット抗マウスIgG2b)および好中球特異的マーカーGR−1(#Ab34345,Abcam,クローン7/4,ラット抗マウスIgG2a)を含んだ。適切な単独型二次抗体を、陽性結合を検出するために使用した。一次抗体の特異性を、種およびアイソタイプを適合した抗体を用いることにより調べた。
TNF−α、IL−1b/6/8、ICAM−1およびVCAM−1についての重要なバイオマーカーの発現を、qRT−PCRによって測定した。他の関連する分析は、マクロファージ炎症性タンパク質(MIP)、単球走化性タンパク質(MCP)−1、および生存経路タンパク質(例えば、MAPK、PI3K/Akt)のリン酸化反応の評価を含んだ。
大腿骨および脛骨を、10%のFCS、100IU/mlのペニシリン、および100μg/mlのストレプトマイシン(Invitrogen Corp.)を含む滅菌PBSでフラッシュすることにより、全骨髄を雄性TLR2+/+またはTLR2−/−マウスから回収した。受容体の短期間の生存を確実にするために、雄性TLR2+/+またはTLR2−/−マウス由来の同系脾臓の単細胞の懸濁液を、40μmの細胞濾過器を通して10%のFCS、ペニシリン、およびストレプトマイシンを含むPBSにおいて脾臓を破砕することによって得た。雄性TLR2+/+およびTLR2−/−マウスに、ヒトのコンピューター断層撮影において7Gyの1放射線量で致死的な放射線を浴びせた。放射後、滅菌PBS中の5×106のTLR2+/+またはTLR2−/−骨髄細胞および2×105のTLR2+/+またはTLR2−/−の脾臓細胞を、受容体の放射線照射したマウスの尾静脈に注入した。マウスを6週間、マイクロアイソレータケージに維持して、骨髄提供の移植を完了し、その後、心筋I/R障害を誘発させ、梗塞面積を、TTC染色を用いて24時間後に測定した。上記の免疫組織化学分析を用いて病態生理学評価も実施できる。
高分解磁気共鳴映像法(MRI,9.4T,Bruker,Rheinstetten,Germany)による心臓容積および機能の経時的評価を、心筋虚血/再灌流障害の前および28日後に実施した。スライス間の1.0mmの間隔で長軸および短軸の画像を得て、拡張末期容積(EDV)、収縮末期容積(ESV)、1回拍出量(SV)および心拍量(CO)を計算するために使用した。駆出率(EF)を100*(EDV−ESV)/EDVとして計算し、一方、SVはEDVとESVとの間の絶対差である。心拍出量は、1分あたりのSV*平均心拍として計算される1分以内の全容積の拍出量である。全てのMRIデータを、Qmassデジタル画像ソフトウェア(Medis,Leiden,the Netherlands)を用いて解析した。
Windows(登録商標) v15.0用のSPSSソフトウェアパッケージを用いることによってデータを解析し、統計的分析を実施した。
ベースラインでの差は存在しない。梗塞の28日後、OPN−301で処置したマウスにおいて、拡張末期容積および収縮末期容積(EDV、ESV)は小さく、1回拍出量(SV)および駆出率(EF)は大きいため、OPN−301抗TLR2モノクローナル抗体で処置したマウスの心臓機能は、生理的食塩水処置に比べて良好である。左心室(左心室重量)は群の間で異ならなかった(それは良い状態である、なぜなら、他の向上した機能はより大きな心臓によって引き起こされ得るからである)。
キメラ化は成功したことを示した。1匹のマウスは、非常に低い梗塞のため分析で排除した。梗塞面積の減少を両方の群で観測した。しかしながら、血液中にTLR2を欠くマウスはより大きな減少を示した。TLR2に陽性の循環細胞は、再灌流障害により関与しているように見える。梗塞面積の減少の差は、小さい試料のサイズのため、統計的差異に到達していなかった。
Claims (15)
- 再灌流によって誘発された心臓の炎症状態の処置および/または予防のための薬剤の製造における、Toll様受容体2に対するリガンドもしくは結合化合物の結合を阻害または遮断する抗体である抗体または前記抗体由来の結合断片の使用であって、
前記抗体の結合断片は、Fab、scFv、Fv、およびdAbからなる群より選択される、使用。 - 前記再灌流によって誘発された心臓の炎症状態は、心筋虚血、虚血性心疾患、高血圧心筋虚血、鬱血性心不全、急性冠症候群、肥大、心筋梗塞、および不整脈からなる群より選択される、請求項1に記載の使用。
- 前記再灌流によって誘発された心臓の炎症状態は、低酸素症、脳卒中、および心臓発作からなる群より選択される、請求項1に記載の使用。
- 前記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体および合成抗体またはそれらの結合断片からなる群より選択される、請求項1に記載の使用。
- 前記抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、合成抗体、ラクダ抗体、およびサメ抗体、あるいはそれらのいずれか由来の結合断片からなる群より選択される、請求項1に記載の使用。
- 前記抗体は、IgG、IgA、IgM、およびIgEからなる群より選択されるアイソタイプである、請求項1に記載の使用。
- 前記抗体または結合断片は、10−7M〜10−11Mの解離定数(Kd)でToll様受容体2に存在する阻害エピトープに結合する、請求項1に記載の使用。
- 前記抗体または結合断片は、ヒトToll様受容体2の細胞外ドメインによって規定されるエピトープに結合する、請求項1に記載の使用。
- 前記抗体は、2つの完全な重鎖、および2つの完全な軽鎖、またはそれらの抗原結合断片を含む、請求項1に記載の使用。
- 前記拮抗薬は、Toll様受容体2がToll様受容体1、Toll様受容体4、Toll様受容体6またはToll様受容体10とヘテロ二量体を形成するか否かに関わらず、Toll様受容体2の機能を抑制する、請求項1〜9のいずれかに記載の使用。
- 前記抗体は、ハイブリドーマクローンT2.5またはそのヒト化型由来の抗TLR2抗体である、請求項1に記載の使用。
- 前記抗体または結合断片は、少なくとも1つの免疫抑制剤化合物と同時に、別々に、または連続して投与されるためのものである、請求項1〜11のいずれかに記載の使用。
- 前記免疫抑制剤化合物は、グルココルチコイド、細胞増殖抑制剤、代謝拮抗物質、抗CD2抗体、抗CD20抗体、抗TNF−α抗体、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、およびFTY720からなる群より選択される、請求項12に記載の使用。
- 前記抗体または結合断片は、少なくとも1つの治療的心臓血管化合物と同時に、別々に、または連続して投与されるためのものであり、
前記治療的心臓血管化合物は、HMG−CoA還元酵素阻害剤、血管拡張剤、利尿薬、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、β遮断薬、アンジオテンシンII受容体拮抗薬、カルシウムチャンネル遮断薬、抗凝固剤、アデノシン二リン酸受容体拮抗薬、チクロピジン、硫酸クロピドグレル、糖タンパク質IIb/IIIa受容体拮抗薬、ビバリルジン、アルガトロバン、ヘパリン、βアドレナリン受容体作動薬、抗血栓溶解剤、抗酸化剤、およびα遮断薬からなる群より選択される、請求項1〜11のいずれかに記載の使用。 - 前記抗体または結合断片は、虚血後に投与されるためのものである、請求項1〜14のいずれかに記載の使用。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IE20070558 | 2007-08-03 | ||
IE2007/0558 | 2007-08-03 | ||
US3855508P | 2008-03-21 | 2008-03-21 | |
US61/038,555 | 2008-03-21 | ||
PCT/EP2008/060249 WO2009019260A2 (en) | 2007-08-03 | 2008-08-04 | Composition and method for treatment of reperfusion injury and tissue damage |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2010535707A JP2010535707A (ja) | 2010-11-25 |
JP2010535707A5 JP2010535707A5 (ja) | 2011-09-15 |
JP5576275B2 true JP5576275B2 (ja) | 2014-08-20 |
Family
ID=40341809
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010518699A Active JP5576275B2 (ja) | 2007-08-03 | 2008-08-04 | 再灌流障害および組織損傷を処置するためのtlr−2拮抗薬の使用 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8734788B2 (ja) |
EP (1) | EP2170366B1 (ja) |
JP (1) | JP5576275B2 (ja) |
CN (1) | CN101848724A (ja) |
AU (1) | AU2008285626B2 (ja) |
CA (1) | CA2693237C (ja) |
WO (1) | WO2009019260A2 (ja) |
Families Citing this family (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
MX2010011050A (es) | 2008-04-09 | 2010-11-01 | Univ North Carolina | Metodos para regular el reodernamiento citoesqueletico de actina y la formacion de aberturas intercelulares. |
CN102458113A (zh) * | 2009-04-09 | 2012-05-16 | 北卡罗来纳大学查珀尔希尔分校 | 与缺血再灌注相关的水肿的治疗方法 |
IE20090514A1 (en) * | 2009-07-06 | 2011-02-16 | Opsona Therapeutics Ltd | Humanised antibodies and uses therof |
AU2011281192A1 (en) | 2010-07-19 | 2013-02-28 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Peptides based on the transmembrane domain of a Toll-like receptor (TLR) for treatment of TLR-mediated diseases |
CN102127593A (zh) * | 2010-11-30 | 2011-07-20 | 陈志强 | 抑制Ppif基因的表达减轻肾缺血再灌注损伤的试验方法 |
CA2828544A1 (en) * | 2011-03-03 | 2012-09-07 | Quark Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotide modulators of the toll-like receptor pathway |
JP6000287B2 (ja) | 2011-03-03 | 2016-09-28 | クォーク ファーマシューティカルズ インコーポレーティッドQuark Pharmaceuticals,Inc. | 肺疾患および損傷を治療するための組成物および方法 |
WO2013082458A1 (en) | 2011-12-02 | 2013-06-06 | The Regents Of The University Of California | Reperfusion protection solution and uses thereof |
EP2822594A4 (en) | 2012-03-08 | 2016-02-17 | Medimmune Llc | METHODS OF TREATMENT WITH ANTI-ANGIOPOIETIN-2 ANTIBODIES |
CN103589727B (zh) * | 2013-11-07 | 2015-09-09 | 广西医科大学 | 抑制人免疫细胞TLR2基因表达的siRNA及其应用 |
WO2016195194A2 (ko) * | 2015-05-29 | 2016-12-08 | 아주대학교산학협력단 | 신규한 tlr2 길항제 |
KR101745524B1 (ko) | 2015-05-29 | 2017-06-12 | 아주대학교산학협력단 | 신규한 tlr2 길항제 |
US10617756B2 (en) * | 2017-01-05 | 2020-04-14 | Shimojani, LLC | Drug regimen for treatment of cerebral ischemia |
US11897969B2 (en) | 2017-10-26 | 2024-02-13 | The Regents Of The University Of California | Inhibition of oxidation-specific epitopes to treat ischemic reperfusion injury |
WO2020011869A2 (en) | 2018-07-11 | 2020-01-16 | Roche Innovation Center Copenhagen A/S | Antisense oligonucleotides targeting tlr2 |
CN109833480B (zh) * | 2019-03-22 | 2021-09-07 | 中国科学院上海巴斯德研究所 | 靶向nk细胞免疫检查点治疗感染性疾病的方法 |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4376110A (en) | 1980-08-04 | 1983-03-08 | Hybritech, Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
GB8308235D0 (en) | 1983-03-25 | 1983-05-05 | Celltech Ltd | Polypeptides |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
JPS61134325A (ja) | 1984-12-04 | 1986-06-21 | Teijin Ltd | ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法 |
GB8607679D0 (en) | 1986-03-27 | 1986-04-30 | Winter G P | Recombinant dna product |
WO1988009344A1 (en) | 1987-05-21 | 1988-12-01 | Creative Biomolecules, Inc. | Targeted multifunctional proteins |
AU634186B2 (en) | 1988-11-11 | 1993-02-18 | Medical Research Council | Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors |
US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
US7220723B2 (en) * | 2001-05-15 | 2007-05-22 | The Feinstein Institute For Medical Research | Inhibitors of the interaction between HMGB polypeptides and toll-like receptor 2 as anti-inflammatory agents |
EP1293566A1 (en) | 2001-09-17 | 2003-03-19 | Societe Des Produits Nestle S.A. | A soluble toll-like receptor |
ATE510853T1 (de) | 2003-09-23 | 2011-06-15 | Univ Muenchen Tech | Tlr2-antagonistischer antikörper und dessen verwendung |
EP1697389A4 (en) * | 2003-10-24 | 2008-12-24 | Eisai R&D Man Co Ltd | COMPOUNDS AND METHODS FOR TREATING ILLNESS AND SUFFERING TOLL-LIKE RECEPTOR 2 RELATED DISORDERS |
JP5118491B2 (ja) * | 2004-12-10 | 2013-01-16 | ノビミューン エスアー | toll様レセプターを標的とする併用療法およびその使用 |
AU2008270218B2 (en) * | 2007-07-05 | 2012-09-20 | Neuramedy Co., Ltd. | Compounds and methods for the treatment of renal disease |
-
2008
- 2008-08-04 WO PCT/EP2008/060249 patent/WO2009019260A2/en active Application Filing
- 2008-08-04 CN CN200880101561A patent/CN101848724A/zh active Pending
- 2008-08-04 EP EP08786862.6A patent/EP2170366B1/en active Active
- 2008-08-04 JP JP2010518699A patent/JP5576275B2/ja active Active
- 2008-08-04 AU AU2008285626A patent/AU2008285626B2/en active Active
- 2008-08-04 CA CA2693237A patent/CA2693237C/en active Active
- 2008-08-04 US US12/671,810 patent/US8734788B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20110293601A1 (en) | 2011-12-01 |
CA2693237A1 (en) | 2009-02-12 |
US8734788B2 (en) | 2014-05-27 |
EP2170366B1 (en) | 2013-11-06 |
WO2009019260A2 (en) | 2009-02-12 |
AU2008285626B2 (en) | 2013-09-12 |
WO2009019260A3 (en) | 2010-02-04 |
US20120141466A9 (en) | 2012-06-07 |
AU2008285626A1 (en) | 2009-02-12 |
CA2693237C (en) | 2016-11-01 |
JP2010535707A (ja) | 2010-11-25 |
EP2170366A2 (en) | 2010-04-07 |
CN101848724A (zh) | 2010-09-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5576275B2 (ja) | 再灌流障害および組織損傷を処置するためのtlr−2拮抗薬の使用 | |
US11344605B2 (en) | Therapeutic use of inhibitors of t cell activation or stimulation | |
JP6649941B2 (ja) | Fstl1を利用した抗がん剤・転移抑制剤およびその併用剤 | |
AU2022218493A1 (en) | Compounds and compositions useful for treating or preventing cancer metastasis, and methods using same | |
KR20220152554A (ko) | 코로나바이러스-유도된 급성 호흡 곤란 증후군의 치료 및/또는 예방을 위해 masp-2를 억제하는 방법 | |
EP2909236B1 (en) | Methods and compositions for the treatment of pancreatic cancer | |
JP4768440B2 (ja) | 開腹手術後の癒着の予防剤 | |
US10047164B2 (en) | Methods and compositions for the treatment of pancreatic cancer | |
TWI834025B (zh) | 用於治療和/或預防冠狀病毒誘導的急性呼吸窘迫症候群的抑制masp-2的方法 | |
US20220073600A1 (en) | Methods for treating disease using psmp antagonists | |
US9868792B2 (en) | Methods of enhancing anti-tumor immunity by administering antibodies to the CCRL2 chemerin receptor | |
RU2779308C2 (ru) | Терапевтическое применение ингибиторов активации или стимуляции т-клеток | |
US20150023920A1 (en) | Novel compositions and methods for preventing or treating cancer metastasis | |
US20120121588A1 (en) | Modulation of pilr receptors to treat sepsis |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110801 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20110801 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130528 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130826 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140114 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140414 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140527 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140529 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20140624 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20140703 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5576275 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |