CN101848724A - Trl-2拮抗剂在治疗再灌注损伤和组织损伤中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于治疗和预防缺血再灌注损伤的化合物和方法。特别的，本发明所提供化合物的作用在于抑制Toll样受体2的生物学功能或表达。

Description

TRL-2拮抗剂在治疗再灌注损伤和组织损伤中的用途

技术领域

本发明涉及一种用于缺血再灌注损伤治疗和预防的方法。特别的，本发明确定Toll样受体2为一种用于治疗或预防缺血再灌注损伤的新靶标。利用拮抗剂阻断Toll样受体2的功能活性，可下调与再灌注损伤有关的炎性过程，对于给药Toll样受体2拮抗剂的受体，可改善其治疗结果。

背景技术

心力衰竭是一种病理生理性状态，其中心脏不能以足够高的速率泵血来通过身体的循环系统。该病症可引起充血性心力衰竭，其由于心脏泵血功能降低导致过量液体堆积而发生。心肌梗塞则是由于心脏组织的供血中断引起丧失供血区域的组织坏死而发生。

当器官或部分身体不能接受充足的供血时引起缺血。据称缺乏足量供血的器官会产生缺氧。短暂缺失后当血流重新回至器官时即发生再灌注。

再灌注损伤指当缺血一段时间供血再次恢复至组织时，组织或器官发生的损伤。缺血期间的氧和营养素缺乏使得当循环恢复时引起一段时间的炎症和氧化性损伤。缺血再灌注损伤的实例包括低氧、中风、心脏病发作、慢性肾衰或器官移植。

再灌注损伤的病因是多方面的，尽管其与促炎性免疫应答密切相关。特别的，血流恢复至之前血流缺乏的区域可产生多种促炎性过程如白细胞粘附和浸润、自由基释放和细胞因子生成。而且，发生缺血的区域中细胞膜的损伤可引起自由基进一步释放。还可发生程序化细胞死亡(凋亡)，而白细胞迁移至缺血区域可引起毛细血管阻塞，从而导致血流限制以及进一步缺血的伴随风险。因此，实际上，缺血期后的血流恢复可能比缺血本身更具有损伤性。

用于心肌梗塞治疗的治疗策略，不论是药物或机械，目的均在于开放闭塞的冠状动脉或者使其保持开放，以恢复心肌组织的血流和灌注。梗塞的相关动脉中血流的早期恢复以及濒危的存活心肌的再灌注改善了临床结果，然而，自相矛盾的是，再灌注本身引起心肌坏死以及凋亡加速，称为缺血/再灌注(I/R)损伤。因为由存活心肌组织丧失引起的并发症在心肌梗塞后仍然比较普遍，仅再灌注看来不足以拯救濒危心肌。

再灌注激活了由固有免疫系统介导的炎症反应，由于促炎性细胞因子的释放以及中性粒细胞与心肌细胞之间有害的细胞间相互作用，该固有免疫系统的激活也引起了心肌细胞的死亡。细胞内核因子-κB(NF-κB)信号通路介导心肌缺血/再灌注(I/R)损伤中促炎性基因的转录。此外，氧的再引入导致有害自由基的生成增加，促炎性介质增加以及与此相关的坏死。再灌注的严重性可由于多个因素如缺血持续时间、缺血的严重程度以及再灌注的速度等而有所变化。

Toll样受体(TLRs)构成一个模式识别受体家族，其在激活固有免疫应答时具有关键的作用。迄今已在人类中鉴定了11种Toll样受体。Toll样受体家族的成员高度保守，大多数哺乳动物种属均具有10-15种Toll样受体。每一种Toll样受体均识别特异病原体相关的分子标记。Toll样受体2(TLR2、CD282、TLR-2)可利用粘肽、脂蛋白和脂膜酸而活化。

迄今为止的研究尚未能充分阐明缺血和再灌注过程中激发的调节性和炎性机制之间的复杂相互作用。而且，在不同动物样本、不同受体和不同组织中，缺血再灌注损伤表现出的性质和变异性对于鉴定用于缺血再灌注的治疗性干预和预防的方法造成了进一步的障碍。

经过深入的实验后，本发明人惊人的鉴定出Toll样受体2在固有免疫应答的启动和进展中发挥重要作用，而其与经过缺血期的组织或器官中的缺血再灌注损伤有关。本发明者还鉴定出，具有Toll样受体2结合特异性且作为Toll样受体2激动剂发挥作用的化合物在预防有害促炎性免疫应答(其与再灌注损伤的形成有关)方面非常有用。本发明者因此鉴定出，一种用于缺血再灌注损伤预防和治疗的治疗途径，通过抑制Toll样受体2的激活和信号传导而介导，可能非常有效，特别是由于Toll样受体2的保守性提示该治疗途径在多种种属、组织和细胞类型中治疗该病症提供一种通用方法。

发明内容

根据本发明的第一方面，提供了一种降低缺血再灌注损伤中相关TLR2表达细胞或组织中一种或多种Toll样受体2(TLR2)生物学活性的方法，包括：

-使该细胞或组织与至少一种TLR2活性或表达的拮抗剂相接触，其量足以降低细胞或组织中的一种或多种生物学活性。

如本文中定义的，术语“与缺血再灌注损伤相关的TLR2表达细胞或组织”表示一种可引起缺血再灌注损伤发病或进展的细胞或组织或者一种正经历缺血再灌注损伤的细胞类型或组织。

在某些实施方式中，所述TLR2表达细胞或组织是心肌的细胞或组织。在某些实施方式中，该TLR2表达细胞或组织是与再灌注诱发的心脏炎性疾病相关的细胞或组织，该疾病选自由(但不限于)心肌缺血、缺血性心脏病、高血压性心肌缺血、充血性心力衰竭、组织缺血、器官缺血、急性冠状动脉综合征、肥大、脑梗塞、心肌梗塞、心律失常和缺血再灌注损伤(I/R损伤)组成的组。

在某些实施方式中，使组织和/或细胞与TLR2拮抗剂相接触的步骤在细胞裂解物、重组系统或培养的细胞中实施。在某些实施方式中，该接触步骤在受体体内存在的细胞或组织上实施。在某些实施方式中，该TLR2可能是人TLR2或鼠TLR2。

在某些实施方式中，该方法在正患有缺血再灌注损伤或有患缺血再灌注损伤风险的人类个体上实施。

在某些实施方式中，至少一种TLR2拮抗剂选自由(但不限于)蛋白、肽、拟肽、核酸、碳水化合物、脂质和小分子化合物组成的组。

在某些实施方式中，该TLR2拮抗剂是一种抗体分子。典型的，该抗体具有对人TLR2上所存在抗原表位(抗原决定部位，epitope)的结合特异性，特别是包含已确定的TLR2胞外域中氨基酸残基的抗原表位的结合特异性。在某些实施方式中，该TLR2拮抗剂结合至包含源自人TLR2氨基酸序列中氨基和羧基末端的氨基酸残基的非连续性抗原表位。在某些实施方式中，该TLR2拮抗剂结合至包含SEQ ID NO：1中氨基酸残基19-39或538-549的TLR2上的抗原表位。

在某些实施方式中，所述抗体选自由(但不限于)人的、人源化的、嵌合的、合成的、骆驼科的、鲨鱼的或体外的抗体组成的组，其具有对TLR2的结合特异性。在某些其他实施方式中，可采用结合片段，所述结合片段源自前述抗体中的任何一种。在某些实施方式中，所述抗体是抗体结合片段，选自由Fab、scFv、Fv、dAb和片段组成的组。在某些实施方式中，所述抗体分子包括两条完整重链和两条完整轻链或者它们的抗原结合片段。在某些实施方式中，所述抗体是同种型IgG、IgA、IgM。在某些所述抗体是同种型IgG抗体的实施方式中，该抗体可以为亚型IgG1、IgG2或IgG3。

在某些实施方式中，所述抗体是鼠IgG1抗TLR2抗体(小鼠Toll样受体2(TLR2)抗体，源自杂交瘤克隆T2.5，HyCult Biotechnology b.v.，CellSciences，Canton，USA：目录号1054)或者其人源化抗体。

在某些实施方式中，所述TLR2拮抗剂抑制至少一种编码TLR2蛋白的核酸的表达。在某些实施方式中，所述TLR2拮抗剂选自由(但不限于)反义寡核苷酸、三螺旋分子、反义DNA、反义RNA、核酶、iRNA、miRNA、siRNA、shRNA分子组成的组。

在某些实施方式中，将一种以上的TLR2拮抗化合物给药细胞、组织或受体。例如，可给药TLR2特异性TLR2拮抗性抗体来预防TLR2激活，还可同时给药抑制性核酸来抑制TLR2表达。

根据本发明的另外一方面，提供了一种用于治疗和/或预防缺血再灌注损伤或由其引起或与其相关的病症的方法，该方法包括以下步骤：

-提供治疗有效量的调节Toll样受体2功能的试剂，以及

-将所述化合物给药需要该治疗的受体。

如本文中所定义的，术语“调节功能”表示该试剂改变或变更一种或多种Toll样受体2生物学功能活性。在某些实施方式中，Toll样受体2的调节表示该试剂在结合TLR2特异性配体后抑制Toll样受体2的功能性激活和/或在利用TLR2配体激活后抑制或阻遏Toll样受体2介导的下游细胞内信号传导，等等。TLR2功能的调节还可以进一步延伸为抑制或阻遏Toll样受体2蛋白表达或者抑制或阻断编码Toll样受体2的基因表达，因此，调节TLR2功能的试剂可进一步抑制TLR2蛋白的表达或者阻断TLR2基因产物的表达。

如本文中所定义的，调节TLR2的“试剂”是一种抑制或阻断Toll样受体2激活或功能的化合物。该“试剂”可以是一种抑制或阻断配体或结合化合物与Toll样受体2结合的拮抗性化合物。例如，该“试剂”可以是一种结合至Toll样受体2胞外域的Toll样受体2结合试剂，所述试剂抑制激活性配体(其具有对TLR2的结合特异性)的结合。此外，该“试剂”可以是一种在配体结合和/或Toll样受体2激活后抑制或阻遏Toll样受体2所介导的胞内信号传导的化合物。该“试剂”还可以是一种调节Toll样受体2蛋白或基因表达的化合物，例如通过抑制编码Toll样受体2蛋白的基因的表达。这种化合物还可称为TLR2调节剂。

在某些实施方式中，所述调节TLR2功能的“试剂”可以是一种具有结合特异性或特异性结合Toll样受体2的结合化合物。在某些实施方式中，该结合化合物可选自由(但不限于)蛋白、肽、拟肽、核酸、多核苷酸、多糖、寡肽、碳水化合物、脂质、适体(适配子)、小分子化合物和天然存在的化合物，如植物源性化合物或其模拟物、类似物或衍生物组成的组。

在某些实施方式中，所述试剂是一种在除已知TLR2配体结合位点之外的结合位点结合Toll样受体2的结合化合物，且其一旦结合于TLR2即引起Toll样受体2的构象变化，从而引起Toll样受体2激活和/或TLR2激活性配体结合的抑制。

术语“特异性结合”或“结合特异性”指与结合非靶抗原表位相比，TLR2调节剂或TLR2结合化合物结合至TLR2上靶抗原表位具有更高亲和力的能力。在某些实施方式中，特异性结合指以高于与非靶抗原表位亲和性至少10、50、100、250、500或1000倍的亲和性结合TLR2上存在的特定靶抗原表位。在某些实施方式中，结合特异性通过亲和性ELISA分析来测定。在某些实施方式中，亲和性通过BIAcore分析来测定。在某些实施方式中，通过动力学方法来测定结合亲和性。在某些实施方式中，亲和性通过平衡/液吸附法(equilibrium/solution method)来测定。

根据一种实施方式，TLR2调节剂(包括TLR2结合试剂)如TLR2拮抗剂以高亲和性结合TLR2，这可定义为结合亲和性，其例如具有至少约107M-1，通常约108M-1，更典型的约109M-1至1010M-1或更强的亲和性常数，且其调节，例如降低和/或抑制TLR2反应性细胞和/或组织中的一种或多种TLR2生物学活性。

在某些实施方式中，所述TLR2调节剂靶向于在缺血期后可能发生再灌注的细胞或组织上表达的Toll样受体2。这种靶向可以是本领域中熟练技术人员已知的任何恰当方式，如定位递送、采用递送载体或定向方式，如对在所靶向的细胞或组织上表达的细胞表面靶标具有结合特异性的抗体。可利用本发明所述方法和组合物进行调节，如抑制或降低的示例性TLR2活性的实例包括但不限于以下一种或多种：(i)抑制或阻遏TLR2表达，(ii)抑制TLR2配体结合和相关的TLR2激活，以及(iii)抑制或阻遏由TLR2介导的细胞内信号传导。

因此，在另一方面，本发明提供一种调节TLR2反应性细胞和/或组织(例如已发生缺血或可能发生缺血或者可能发生再灌注的组织)中功能(例如，改变TLR2的一种或多种生物学活性)的方法。该方法包括使TLR2反应性细胞/或TLR2反应性组织与TLR2调节剂如TLR2结合剂(例如人TLR2活性或表达的拮抗剂，以足以调节TLR2反应性细胞或组织的功能的量)相接触。在一种实施方式中，该接触步骤可在体外例如在细胞裂解物或重组系统中实现。可替代的，该受体方法(subject method)可在例如体外或离体培养的细胞中实施。例如，细胞，诸如纯化或重组细胞可在体外培养，该接触步骤可通过将TLR2调节剂加入培养基中而实现。典型的，所述TLR2反应性细胞是哺乳动物细胞，如人细胞。在某些实施方式中，该TLR2反应性组织是已发生缺血和可能发生再灌注的组织或者与其相关的细胞群。在其他实施方式中，该方法可作为体内流程的一部分在受体或者动物受体(包括如人类受体或者体内动物样本)体内存在的细胞上实施样本。该体内流程可为治疗性或预防性的，且该炎性样本可为例如遗传改性的样本，如具有过表达TLR2或TLR2受体突变或缺失的动物样本。对于体内方法，所述TLR2调节剂，可单独或与另一种试剂一起给药患自身免疫性疾病如类风湿性关节炎的受体，其量足以调节受体体内一种或多种TLR2介导的活性或功能。在某些实施方式中，所给药的TLR2调节剂的量或剂量可在给药前通过体外或离体检测，对改变如降低或抑制一种或多种TLR2功能活性所需TLR2调节剂的量而确定，所述功能活性为本文所述的一种或多种TLR2生物学活性。

在某些实施方式中，其中需要抑制、降低或减少一种或多种TLR2生物学活性，通过例如给药受体TLR2拮抗剂而使该TLR2反应性细胞和/或组织与TLR2拮抗剂相接触。在一种实施方式中，所述TLR2拮抗剂与TLR2蛋白表达相关的TLR2多肽或mRNA相互作用(如结合)。典型的，所拮抗的TLR2是哺乳动物TLR2(或其功能性变异体)，如人TLR2或鼠TLR2。在某些实施方式中，所拮抗的TLR2包括如图12中定义的人TLR2序列(SEQ ID NO：1)(包括如基因库登录号AAC 34133(URLwww.ncbi.nlm.nih.gov)定义的784个氨基酸的全长人Toll样受体序列)或者包括图13中所定义氨基酸序列的鼠TLR2序列(SEQ ID NO：2)(基因库登录号NP_036035(小鼠))，或者它们的一部分，和/或与它们基本同源的氨基酸序列，特别具有至少90％序列同源一致性，或与核苷酸序列编码的氨基酸序列基本同源的氨基酸序列。

如本文中定义的，术语“Toll样受体2激活”表示用配体结合Toll样受体2，其中该配体作为激动剂起作用并激活Toll样受体2以诱发细胞内信号传导的级联反应。Toll样受体2激活和信号传导后介导的细胞内信号传导引起转录因子的活化以及介导促炎性免疫应答的基因的表达。

在某些实施方式中，所述TLR2调节剂抑制Toll样受体2与Toll样受体2激动配体之间的相互作用。

在某些实施方式中，阻遏Toll样受体2激活和/或传导的TLR2调节剂是一种作为Toll样受体2拮抗剂发挥作用的化合物。典型的，Toll样受体2功能的拮抗通过Toll样受体2调节剂与Toll样受体2的结合从而防止配体与Toll样受体2结合而实现。该Toll样受体2配体结合的抑制可通过多种方式而实现，例如通过部分或全部阻断Toll样受体2的配体结合位点或通过与Toll样受体2结合或连接后诱发构象变化从而引起Toll样受体2的配体结合位点改变来防止Toll样受体2的配体结合，例如由于Toll样受体2配体结合位点的三级结构发生构象变化而防止TLR2配体结合。

在某些实施方式中，所述TLR2调节剂结合至TLR2上存在的至少一个抗原表位，其中该抗原表位引起TLR2功能，最常见的是TLR2激活或者TLR2所介导下游信号传导，的抑制。如本文中定义的，“抗原表位(抗原决定部位，抗原决定基，epitope)”指编码TLR2蛋白的多种氨基酸残基，其能够被结合化合物如配体、小分子、抗体等识别或结合。抗原表位通常包括化学活性表面基团且具有特异性三维结构特征，以及特异性电荷特征，前述均促成该抗原表位的三维结构。

典型的，所述TLR2调节剂拮抗TLR2的功能活性，且本身结合至称为抑制或抑制性抗原表位的抗原表位。“抑制”或“抑制性”抗原表位表示TLR2上存在的抗原表位，当由结合化合物，如小分子或抗体，结合时引起TLR2生物学活性的丧失，例如由于TLR2激动剂，结合化合物阻断TLR2的结合。存在于TLR2上且由结合化合物结合以拮抗TLR2功能的抗原表位，可包括5个或更多个氨基酸残基。

在某些实施方式中，本发明所述的TLR2调节剂识别连续性抗原表位。在其他实施方式中，所述抗原表位是不连续性抗原表位，其包含源自成熟Toll样受体2(TLR2)蛋白的N末端(氨基端)和C末端(羧基端)部分的残基。在某些实施方式中，该抗原表位可包括残基19-39，如从SEQ ID NO：3(图14)中示出的Toll样受体2胞外域的586个氨基酸序列限定的。这种抗原表位可进一步参照其所包含的氨基酸来定义，所述抗原表位至少包含SEQ ID NO：3中定义的TLR2胞外域氨基酸残基keessnqaslscdrngickgs(SEQ ID NO：4)。此外，该结合抗原表位可进一步包含如存在于SEQ ID NO：1氨基酸序列中C端区域的Toll样受体2中的氨基酸残基538-549，该序列包含氨基酸CSCEFLSFTQEQQ(SEQ ID NO：5)。该TLR2调节剂结合位点可进一步通过SEQ ID NO：1中的氨基酸残基19-39或538-549来限定，或者通过SEQ ID NO：1中的氨基酸残基19-39和538-549来定义。

不论Toll样受体2是否与另一个Toll样受体，如Toll样受体1、Toll样受体6或者另一种Toll样受体，如Toll样受体4或Toll样受体10，形成异源二聚体，均可发生Toll样受体2功能活性的降低、抑制或拮抗。术语“Toll样受体2激活及下游介导的信号传导”表示任何由TLR2激活诱导的细胞内信号传导通路。所述信号传导通路可以是TLR2特异性通路或者可以为“共有”信号通路，例如其中该信号通路可有其他来源通过例如除TLR2之外的受体(其促进免疫应答介质如转录因子NF-κB的激活)活化而激活。

已知TLR2二聚合为2功能性异源二聚体。特别的，已知TLR2与Toll样受体1或Toll样受体6形成异源二聚体，可能与Toll样受体4(TLR4，TLR-4)和Toll样受体10(TLR10，TLR-10)形成其他异源二聚体。可认为，二聚合与鉴别有关，由不同微生物源配体引起TLR2的结合。此外，TLR2的胞外域可与循环系统中及哺乳动物乳汁中的CD14形成可溶性异源二聚体。

本发明者已经认识到，为了提供能广泛阻遏缺血后再灌注期间或其后TLR2介导性炎症的治疗途径，需要提供具有TLR2结合特异性的结合化合物，不论TLR2与另一种TLR如TLR1、TLR6、TLR4或TLR10之间是否形成异源二聚体。在这方面，经过广泛实验后，本发明者已经确定了一种由存在于TLR2蛋白N末端和C末端的氨基酸残基构成的构象性不连续抗原表位，其结合后即阻遏TLR2的功能活性。该抗原表位被TLR2拮抗性结合化合物结合可阻遏TLR2的功能，不论TLR2是否与TLR1、TLR6、TLR4或TLR10形成异源二聚体。

因此，在某些其他方面，本发明提供的TLR2调节剂具有下列特征中的至少一种：(i)是一种单克隆抗体，(ii)是一种人源或体外生成的抗体，(iii)结合至包含氨基酸SEQ ID NO：4和/或SEQ ID NO：5的人或鼠TLR2的构象性不连续性抗原表位并介导TLR2的功能阻遏，不论TLR2与TLR1、TLR6、TLR4或TLR10之间是否形成异源二聚体，(iv)以至少10-6M的亲和常数(Ka)结合TLR2胞外域上存在的抗原表位。

在某些实施方式中，所述阻遏或抑制Toll样受体2功能和/或信号传导和/或表达的TLR2调节剂选自由(但不限于)蛋白、肽、拟肽、核酸、多核苷酸、多糖、寡肽、碳水化合物、脂质、小分子化合物和天然存在化合物组成的组中的至少一种。

典型的，所述调节TLR2功能的试剂是一种TLR2拮抗剂。在某些实施方式中，该TLR2拮抗剂是一种结合化合物，选自由蛋白、肽、拟肽、核酸、碳水化合物、脂质和小分子化合物组成的组。

在某些实施方式中，所述TLR2拮抗剂是一种抗体或源自该抗体的结合片段。在某些实施方式中，该抗体选自由单克隆抗体、多克隆抗体或合成抗体组成的组。在某些其他实施方式中，该抗体选自由人、人源化、骆驼科、针对人TLR2的体外生成抗体组成的组。该抗体可为一种选自由IgG、IgA、IgM和IgE组成的组的同种型。该抗体可以约10-7M至约10-11M的解离常数(Kd)结合TLR2上存在的抑制性抗原表位。

在某些实施方式中，所述TLR2调节剂是一种可溶形式的重组Toll样受体2。特别的，该可溶形式的TLR2是一种融合蛋白，基本上包括连接于次级蛋白(第二蛋白，secondary protein)的TLR2蛋白上的胞外域。在某些实施方式中，次级蛋白可以为抗体的Fc域或其片段。

在某些其他实施方式中，所述TLR2调节剂是一种抑制TLR2蛋白表达的抑制性核酸。在某些实施方式中，该抑制性核酸选自由反义寡核苷酸、三螺旋分子、反义DNA、反义RNA、核酶、iRNA、miRNA、siRNA和shRNA组成的组。

在某些实施方式中，本发明所述方法用来将治疗有效量的TLR2调节剂给药需要该治疗的受体，以降低或抑制心肌的TLR2表达细胞或组织中一种或多种TLR2生物学活性，从而治疗该病症。

在某些实施方式中，本发明所述方法可用于治疗或预防缺血再灌注损伤，其可能来自于至少一种选自由受体体内低氧、中风、心脏病发作、慢性肾衰或器官移植组成的组的病症。

在某些实施方式中，所述方法可进一步包括一个步骤即给药至少一种治疗有效量的用于治疗或预防缺血/再灌注损伤或相关病症的次级治疗化合物。典型的，所述次级治疗化合物可选自由糖皮质激素(glucocorticoid)、细胞增殖抑制药(cytostatic)、抗代谢药、抗CD2抗体或相关的结合片段、抗CD20抗体、抗-TNF-α抗体，环孢霉素(cyclosporine)、他克莫司(tacrolimus)西罗莫司(sirolimus)或FTY720组成的组。

在某些其他实施方式中，所述次级治疗化合物可选自由HMG-CoA还原酶抑制剂、扩血管剂、利尿剂、血管紧张素转化酶抑制剂、β-阻滞剂、血管紧张素II受体拮抗剂、钙通道阻滞剂、抗凝血剂、二磷酸腺苷受体拮抗剂如噻氯匹啶(ticlopidine)或氯吡格雷硫酸氢盐、糖蛋白IIb/IIIa受体拮抗剂如比伐卢定(bivalirudin)、阿戈托班或肝素、β-肾上腺素能受体激动剂、抗血栓药、抗氧化剂和α阻滞剂组成的组。

在某些实施方式中，所述次级治疗剂可与至少一种TLR2调剂试剂同时、依次或独立给药。

在某些实施方式中，所述TLR2调节化合物在受体经历手术操作之前、期间或之后给药该受体，所述手术操作选自由血管成形术、心脏搭桥术、溶栓术、动脉内膜切除术、器官移植和冠状动脉搭桥术(CABG)组成的组。在某些实施方式中，该方法于细胞或组织内发生缺血事件之前、期间或之后在受体身上实施。在某些实施方式中，该方法于再灌注发生之后在受体身上实施。在某些实施方式中，该方法在急性窗口期在受体身上实施，该时段于缺血经历后在临床上确定。

在某些实施方式中，本发明该方面所述方法可预防缺血再灌注损伤从而抑制再灌注之后或期间抑制器官损伤。在某些其他实施方式中，本发明该方面所述方法通过遏制或抑制促炎性免疫应答来预防缺血再灌注损伤，该促炎性免疫应答由通过Toll样受体2(TLR2、TLR-2、CD282)的信号传导来介导，并且是细胞、组织或器官缺血后再灌注期间或之后细胞、组织或器官损伤的原因。

根据本发明另外一方面，提供了一种用于治疗和预防缺血再灌注损伤或与其相关病症的药物组合物，其包含一种调节Toll样受体2功能或表达的试剂以及至少一种药学可接受的载体、稀释剂、助溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。

在某些实施方式中，该TLR2调节剂是一种作为TLR2拮抗剂的化合物，其选自由多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体或抗体片段、适配体、融合蛋白和拟肽组成的组。

在某些实施方式中，该TLR2调节剂是一种可溶形式的TLR2受体。所述可溶形式的TLR2可以是重组的。

在某些实施方式中，该TLR2调节剂是一种基于抑制性核酸的化合物，其抑制TLR2的表达。

在某些实施方式中，所述药物组合物可进一步包含次级治疗性试剂，例如但不限于，免疫抑制剂，其可为由(但不限于)糖皮质激素特别是阻遏细胞活素表达的糖皮质激素；细胞增殖抑制药如烷化剂、抗代谢药如甲氨蝶呤；抗体或相关结合片段如抗CD3抗体如OKT-3、抗CD20抗体、抗TNF-α抗体英夫利昔单抗(REMICADETM)、依那西普(ENBRELTM)或阿达木单抗(HUMIRATM)；对亲免疫因子起作用的药物复合物如环孢霉素、他克莫司或西罗莫司；或小分子如FTY720或治疗性心血管复合物组成的组中的至少一种，其中该治疗性心血管复合物包含HMG-CoA还原酶抑制剂、扩血管剂、利尿剂、血管紧张素转化酶抑制剂、β-阻滞剂、血管紧张素II受体拮抗剂、钙通道阻滞剂、抗凝血剂、二磷酸腺苷受体拮抗剂如噻氯匹啶(ticlopidine)或氯吡格雷硫酸氢盐、糖蛋白IIb/IIIa受体拮抗剂如比伐卢定(bivalirudin)、阿戈托班或肝素、β-肾上腺素能受体激动剂、抗血栓药、抗氧化剂和α阻滞剂中的至少一种或多种。

在某些实施方式中，所述Toll样受体2调节剂以约1mg/kg至约10mg/kg受体体重/天的剂量口服给药受体。在某些实施方式中，所述Toll样受体2调节剂的剂量为约100mg/天至约1000mg/天。在某些其他实施方式中，所述Toll样受体2调节剂的剂量为约200mg/天至约300mg/天。

在某些实施方式中，所述Toll样受体2调节剂以约0.001mg/kg至约1.0mg/kg哺乳动物体重的剂量范围经胃肠外给药该受体。

在某些实施方式中，所述Toll样受体2调节剂在足以下调Toll样受体2水平和/或活性的条件下给药受体一段时间。

本发明另外一方面提供一种用于治疗或预防心脏病或与其相关疾病症状的方法，该方法包括以下步骤：

-提供治疗有效量的调节Toll样受体2功能的试剂，以及

-将所述化合物给药需要该治疗的受体。

在某些实施方式中，所述心脏炎性病症选自，但不限于，由心肌缺血、缺血性心脏病、高血压性心肌缺血、充血性心力衰竭、组织缺血、器官缺血、急性冠状动脉综合征、肥大、脑梗塞、心肌梗塞、心律失常和缺血再灌注损伤(I/R)组成的组。

在某些实施方式中，调节TLR2功能的试剂是一种TLR2拮抗剂。在某些实施方式中，该TLR2拮抗剂是一种结合化合物，选自由(但不限于)蛋白、肽、拟肽、核酸、碳水化合物、脂质和小分子化合物组成的组。

在某些实施方式中，该TLR2调节剂是一种作为TLR2拮抗剂的化合物，其选自由多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体或抗体片段、适配体、融合蛋白和拟肽组成的组。

在某些实施方式中，该TLR2调节剂是一种可溶形式的TLR2受体。所述可溶形式的TLR2可通过重组技术而生成。

在某些实施方式中，所述TLR2调节剂是一种基于抑制性核酸、抑制TLR2表达的化合物。在某些实施方式中，该抑制性核酸选自由反义寡核苷酸、三螺旋分子、反义DNA、反义RNA、核酶、iRNA、miRNA、siRNA和shRNA组成的组。

在某些实施方式中，所述TLR2拮抗剂是一种抗体或源自该抗体的结合片段。该抗体可选自由单克隆抗体、多克隆抗体或合成抗体组成的组。

在某些实施方式中，该方法可包括一个给药如上文所述次级治疗化合物的步骤。

因此，本发明的另一方面提供一种预防再灌注所引起组织或器官损伤的方法，该方法包括以下步骤：

-提供一种治疗有效量抑制性核酸，其阻断Toll样受体2蛋白表达，以及

-将其给药需要该治疗的受体。

在某些实施方式中，该抑制性核酸可包括但不限于：反义寡核苷酸、反义DNA、反义RNA、核酶、iRNA、miRNA、siRNA、shRNA。

在某些实施方式中，再灌注在所述器官或组织缺血一段时间后发生。

如本文中定义的，当术语“阻断”和“阻遏”与Toll样受体2基因表达相关应用时，表示沉默至少一种基因的表达，该基因引起Toll样受体2蛋白表达。

基因沉默是通过除遗传修饰之外的机理关闭基因的表达。基因沉默可在转录水平或在转录后水平介导。转录性基因沉默可导致基因不能进入转录机制，且可通过例如组蛋白修饰的方式来介导。转录后基因沉默是由于基因的mRNA被破坏，从而阻断了活性基因产物如蛋白(在本发明中，为TLR2蛋白)而产生的。

因此，在一个实施方式中，本发明这个方面适于给药受体有效量的抑制性核酸分子如RNAi(RNA干扰)试剂，例如干扰性核糖核酸(如siRNA或shRNA)或其转录模板如编码shRNA的DNA至受体体内至少一种细胞类型、组织或器官以阻断TLR2蛋白的表达。

在某些其他实施方式中，所述抑制性核酸分子可以为反义RNA分子。反义引起基因表达的抑制，并包含可物理性结合mRNA(这可阻断mRNA转译)的单链RNA片段。制备用作抑制性核酸的恰当核酸的技术为本领域中的熟练技术人员所熟知。

根据本发明的另外一方面，提供了阻断Toll样受体2蛋白表达的抑制性核酸在制备用于治疗由再灌注所引起细胞、组织或器官损伤的药剂中的用途。

本发明的另外一方面提供一种用于阻断Toll样受体2表达的抑制性核酸，用于治疗由再灌注引起的细胞、组织或器官损伤。

在某些实施方式中，再灌注发生于缺血一段时间后。

在某些实施方式中，所述抑制性核酸选自由反义寡核苷酸、反义DNA、反义RNA、核酶、iRNA、miRNA、siRNA、shRNA组成的组。

根据本发明另外一方面，提供一种用于治疗缺血/再灌注损伤引起的细胞、组织或器官损伤的药物组合物，该组合物包含治疗有效量的抑制性核酸(其阻断Toll样受体2的表达)以及至少一种药学可接受的载体、稀释剂、助溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。

在某些实施方式中，该抑制性核酸选自由(但不限于)反义寡核苷酸、反义DNA、反义RNA、核酶、iRNA、miRNA、siRNA、shRNA组成的组。

在某些实施方式中，所述药物组合物可进一步包含至少一种免疫抑制化合物。在某些实施方式中，该免疫抑制剂(也称为免疫抑制药)可为由(但不限于)糖皮质激素特别是阻遏细胞活素表达的糖皮质激素；细胞增殖抑制药如烷化剂、抗代谢药如甲氨蝶呤；抗体或相关结合片段如抗-CD3抗体如OKT-3、抗-CD20抗体、抗TNF-α抗体英夫利昔单抗(REMICADETM)、依那西普(ENBRELTM)或阿达木单抗(HUMIRATM)；对亲免疫因子起作用的药物复合物如环孢霉素、他克莫司或西罗莫司；或小分子如FTY720组成的组中的至少一种。

制备用作抑制性核酸(其阻断Toll样受体2表达)的恰当核酸的技术为本领域中的熟练技术人员所熟知。

在某些实施方式中，所述抑制性核酸在受体经历手术操作之前、期间或之后给药该受体，所述手术操作选自由(但不限于)血管成形术、心脏搭桥术、溶栓术、动脉内膜切除术、器官移植和冠状动脉搭桥术(CABG)组成的组。

在某些实施方式中，所述抑制性核酸于缺血之前、期间或之后给药受体。在某些实施方式中，该抑制性核酸在再灌注发生期间或之后给药受体。在某些实施方式中，该抑制性核酸在缺血事件后的急性窗口期给药受体。

在某些实施方式中，所述抑制性核酸在受体经历手术操作之前、期间或之后给药该受体，该手术操作是细胞、组织或至少一种器官的移植或与其相关。典型的，实施所述方法是为了预防或限制TLR2介导的免疫应答，其引起组织损伤特别是由来自再灌注的细胞或组织损伤。

在另外一方面，本发明扩展至提供至少一种具有Toll样受体2结合特异性的适配体，其导致Toll样受体2功能活性的阻断或抑制。用于选择恰当适配体的技术为本领域的熟练技术人员所熟知，例如采用SELEX技术。

因此，在多种其他实施方式中，本发明提供一种鉴定并分离具有Toll样受体2结合特异性的核酸配体，该方法包括以下步骤：

(a)提供一种候选的核酸混合物

(b)表达Toll样受体2的细胞与该候选核酸混合物接触

(c)选择比其他候选核酸，对Toll样受体2的亲和性有所增强的核酸

(d)扩增所选定的核酸，以提供至少一种具有Toll样受体2亲和性的核酸，以及

(e)从中选择至少一种具有较高Toll样受体2亲和性和特异性的核酸。

本发明者还进一步确定，Toll样受体2功能的抑制可通过降低配体的量来获得，该配体可用于结合至并激活膜结合Toll样受体2。可用于结合膜结合Toll样受体2的配体的量引起Toll样受体2介导的信号传导下调，以及因此引起TLR2介导的促炎性免疫应答的激活。特别的，本发明者确定了可溶性肽(其为一种可溶形式的Toll样受体2或其功能片段)在抑制Toll样受体2介导的促炎性反应应答方面的用途。所述抑制是由于可溶形式Toll样受体2或截取型非膜形式Toll样受体2与膜结合形式的TLR2对TLR2特异性结合配体的竞争引起的。该竞争性结合使得可溶或截取形式的TLR2有效“清理”可利用的Toll样受体2配体。伴随着膜结合Toll样受体2结合和激活的降低引起Toll样受体2介导的促炎性免疫应答下调。

因此，给药可溶形式的Toll样受体2在用于抑制促炎性免疫应答的方法中比较有用，该炎性免疫应答是缺血再灌注期间或之后的组织损伤的原因之一。

因此，本发明的另外一方面提供一种用于治疗和/或预防细胞、组织或器官的缺血再灌注损伤的方法，该方法包括以下步骤：

-提供一种治疗有效量的能够结合Toll样受体2配体的可溶形式Toll样受体2或其可溶性片段，以及

-将治疗有效量的所述化合物给药需要该治疗的受体。

本文中如SEQ ID NO：3(图14)提供人Toll样受体2胞外域(胞外域)的氨基酸序列。人类Toll样受体2形式的胞外域包含587个氨基酸残基，特别是如基因库登录号AAC 34133(URL www.ncbi.nlm.nih.gov)所定义的784个氨基酸的全长人Toll样受体序列中的氨基酸1-587。如本文中所定义的，TLR2的胞外域是膜结合形式TLR2中延伸入细胞外间隙的部分。

在某些实施方式中，可溶形式的TLR2通过重组技术制备。可溶形式的Toll样受体2通常仅包含TLR2的胞外域，因此缺乏如基因库登录号AAC34133中所定义的Toll样受体2的胞内域和跨膜域。在某些实施方式中，可溶形式的Toll样受体2可包含所定义Toll样受体2序列中的氨基酸1-587。可溶的Toll样受体2序列可通过添加、缺失或取代1个或多个氨基酸残基而加以修饰。因此，在某些实施方式中，可溶形式的Toll样受体2来源于已确定的膜结合形式Toll样受体2的胞外域，如本文在SEQ ID NO：3中定义的。在其他实施方式中，可溶形式的Toll样受体2来源于截取形式的全长膜结合形式Toll样受体2的氨基酸序列，如本文在SEQ ID NO：3(图14)中定义的，其中所述截取形式表现出以下功能特征(i)可溶，以及(ii)能够由配体结合，该配体对膜结合形式Toll样受体2上存在的至少一种抗原表位具有结合特异性。

在某些实施方式中，除了从膜结合形式TLR2限定的胞内和/或跨膜域相关的氨基酸残基缺失和/或取代，还可进一步对胞外域的氨基酸残基进行缺失和/或取代。只要修饰形式的TLR2能够结合到结合膜结合形式TLR2上存在的至少一个抗原表位的配体，可对TLR2胞外域氨基酸残基进行任何这种缺失和/或取代。

在某些实施方式中，该可溶形式的Toll样受体2(sTLR2)可靶向于已经历缺血后再灌注或正经历缺血后再灌注的器官、组织或细胞，或者靶向于至少一种正经历缺血且可能在适当时机经历再灌注的特异性细胞类型。这种方式的sTLR2靶向比较有利，因为全身给药sTLR2可能引起TLR2受体的全身性免疫抑制以及由此产生的TLR2介导的信号传导，其在某些情况下是不需要的。

可溶形式的sTLR2靶向作用可通过形成融合蛋白而提供，其中所述融合蛋白由TLR2受体的可溶部分通常是胞外域或其一部分连接于另一种肽而构成，通常该Fc受体结合蛋白源自免疫球蛋白(典型的，人免疫球蛋白)的重链。该Fc域已广泛用来延长治疗性蛋白的循环半衰期。

在某些实施方式中，可溶形式的sTLR2可在受体经历手术操作之前、期间或之后给药，该手术操作选自由(但不限于)血管成形术、心脏搭桥术、溶栓术、动脉内膜切除术、器官移植和冠状动脉搭桥术(CABG)组成的组。

在某些实施方式中，可溶形式的sTLR2可在缺血之前、期间或之后给药受体。在某些实施方式中，该可溶形式的sTLR2可在发生再灌注期间或之后给药受体。在某些实施方式中，该可溶形式的sTLR2可在缺血后的急性窗口期给药受体。

在某些实施方式中，所述可溶形式的sTLR2在受体经历手术操作之前、期间或之后给药该受体，该手术操作是细胞、组织或至少一种器官的移植或与其相关。典型的，实施所述方法是为了预防或限制可引起组织损伤的TLR2介导的免疫应答。

在某些实施方式中，建议详细说明，该制剂应该在手术操作之前、期间或之后给药受体，该手术操作选自由(但不限于)搭桥术、溶栓术、内膜切除术和血管形成术组成的组。

本发明进一步扩展至用于鉴定能够预防再灌注后细胞、组织或器官再灌注损伤的化合物的筛查分析，其中所述再灌注损伤通过TLR2激活或借助于抑制Toll样受体2功能穿过TLR2通路的信号传导来介导。

本发明另外一方面提供一种用于鉴定可抑制Toll样受体2介导的炎症及再灌注期间或之后出现的相关细胞、组织或器官损伤的化合物的筛查方法，该方法包括：

-提供膜结合Toll样受体2受体以及一种对其具有结合特异性的配体，

-候选化合物与Toll样受体2接触，

-Toll样受体2暴露于Toll样受体2配体，

-测定Toll样受体2配体与Toll样受体2的结合，

其中，Toll样受体2与Toll样受体2配体结合的抑制表明，所述候选化合物是一种Toll样受体2激活和信号传导的调节剂。

在某些实施方式中，可抑制Toll样受体2所介导炎症及再灌注期间或之后相关的细胞、组织或器官损伤的化合物是TLR2激动剂。

本发明另外一方面提供一种按照本发明前述方面鉴定用于抑制TLR2所介导炎症应答的调节剂，用于预防或治疗再灌注损伤。

如本文中定义的，再灌注损伤指缺血期后当供血恢复至组织时引起的组织损伤。可认为再灌注损伤与大脑的缺血级联反应(这一点与中风和脑创伤有关)有关，因此本发明所述用于预防再灌注损伤的TLR2调节剂还可用来预防中风和/或脑创伤。

本发明者还进一步认识到本发明所述方法和TLR2调节剂通过预防受者体内对已移植供者细胞或组织的免疫排斥而用于改善受体的细胞、组织或器官移植的用途。

通常，在移植操作过程中，由于缺少供血，供者器官、组织或细胞团(cell mass)会经历较长时间的缺血，且因此减少了供者器官、组织或细胞团内的氧水平。据信免疫应答是再灌注损伤的一个主要作用因素，其可进一步引起更广泛的免疫应答，从而导致移植操作后宿主发动的移植物排斥。

因此，本发明的另外一方面提供一种用于抑制有害免疫应答(其可使移植的组织、器官或细胞团被受者排斥)的方法，该方法包括以下步骤：

-提供治疗有效量的调节Toll样受体2激活和/或信号传导的试剂，以及

-将治疗有效量的所述化合物给药需要该治疗的受体。

本发明的另外一方面提供阻遏Toll样受体2功能的试剂在制备用于预防有害免疫应答的药剂中的用途，该有害免疫应答可引起移植手术操作后受者所接受供者器官的排斥。

本发明者还进一步鉴定了本发明所述方法和化合物用于治疗与再灌注相关或与涉及其的心脏病的用途。

因此，本发明的另外一方面提供一种用于治疗或预防心脏病或与其有关的疾病症状的方法，该方法包括以下步骤：

-提供一种治疗有效量的Toll样受体2抑制剂，以及

-将其给药需要所述治疗的受体。

在某些实施方式中，所述心脏炎性病症可为至少一种选自由心肌缺血、缺血性心脏病、高血压性心肌缺血、充血性心力衰竭、组织缺血、器官缺血、急性冠状动脉综合征、肥大、脑梗塞、心肌梗塞、心律失常和缺血再灌注损伤(I/R)组成的组的病症。

根据本发明的另外一方面，提供了一种用于治疗心脏病或与其有关疾病或炎性病症的药物组合物，该组合物包含对Toll样受体2具有结合特异性且抑制其功能的结合化合物以及至少一种药学可接受的载体、稀释剂、助溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。

在某些实施方式中，所述心脏病或与其有关的疾病症状可为至少一种选自由心肌缺血、缺血性心脏病、高血压性心肌缺血、充血性心力衰竭、组织缺血、器官缺血、急性冠状动脉综合征、肥大、脑梗塞、心肌梗塞、心律失常、缺血再灌注损伤(I/R)、动脉粥样硬化、同种异体移植物血管病变、高血压、充血性心力衰竭组成的组的病症。

在某些实施方式中，所述药物组合物可进一步包含次级治疗剂，例如但不限于：免疫抑制剂，其可为由(但不限于)糖皮质激素特别是阻遏细胞因子表达的糖皮质激素；细胞生长抑制药如烷化剂、抗代谢药如甲氨蝶呤；抗体或相关结合片段如抗CD3抗体如OKT-3、抗CD20抗体、抗TNF-α抗体英夫利昔单抗(REMICADETM)、依那西普(ENBRELTM)或阿达木单抗(HUMIRATM)；对亲免疫因子起作用的药物复合物如环孢霉素、他克莫司或西罗莫司；或小分子如FTY720或治疗性心血管复合物组成的组中的至少一种，其中该治疗性心血管复合物包含HMG-CoA还原酶抑制剂、扩血管剂、利尿剂、血管紧张素转化酶抑制剂、β-阻滞剂、血管紧张素II受体拮抗剂、钙通道阻滞剂、抗凝血剂、二磷酸腺苷受体拮抗剂如噻氯匹啶(ticlopidine)或氯吡格雷重磷酸盐、糖蛋白IIb/IIIa受体拮抗剂如比伐卢定(bivalirudin)、阿戈托班或肝素、β-肾上腺素能受体激动剂、抗血栓药、抗氧化剂和α阻滞剂。

本发明另外一方面提供一种结合剂的用途，其对Toll样受体2具有结合特异性且可阻遏Toll样受体2的功能，可用于制备治疗心脏病相关炎症的药剂。

附图说明

接下来，本发明将参照下列实例加以阐述，实例仅是为了阐述而非限制本发明，其中：

图1示出了给药p38抑制剂(SB239063)后的心脏切片，作为阳性对照；

图2示出了给药PBS后的心脏切片；

图3示出了给药IgGT同种型抗体后的心脏切片，作为阴性对照；

图4示出了给药实验性抗TLR2拮抗性单克隆抗体OPN-301后的心脏切片；

图5示出了危险区(AAR)占整个左心室(LV)百分比的图表；

图6示出了梗塞面积占危险区(AAR)的百分比；

图7示出了梗塞面积占整个左心室(LV)的百分比；

图8示出了梗塞面积占整个左心室(LV)的百分比；

图9示出了梗塞面积占危险区(AAR)的百分比；

图10示出了危险区(Aar)占左心室的百分比；

图11示出了梗塞面积占危险区的百分比；

图12示出了人Toll样受体2的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)；

图13示出了人Toll样受体2的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)；

图14示出了人Toll样受体2的胞外域(SEQ ID NO：3)；

图15示出了给药p38抑制剂(SB239063)后的第二心脏切片，作为阳性对照；

图16示出了给药PBS后的第二心脏切片；

图17示出了给药IgGT同种型抗体后的第二心脏切片，作为阴性对照；

图18示出了给药实验性抗TLR2拮抗性单克隆抗体OPN-301后的第二心脏切片；

图19示出了危险区(AAR)占整个左心室(LV)百分比的第二图表；

图20示出了梗塞面积占危险区(AAR)百分比的第二图表；

图21示出了另一个梗塞面积占整个左心室(LV)的百分比；

图22示出了梗塞面积占整个左心室(LV)的百分比；

图23A示出了缺血30分钟并再灌注24小时后，血液KO和器官KO嵌合小鼠的心脏切片中巨噬细胞数量的图表。针对巨噬细胞(具有蓝核的红色细胞)染色的心脏切片的代表性图片。膜染色的细胞的密度差异；

图23B示出了针对小噬细胞染色的心脏切片的代表性图片，针对巨噬细胞(具有蓝核的红色细胞)染色的心脏切片的代表性图片。细胞密度差异在于染色的膜；以及

图24示出了基线(t＝0)和梗塞后(t＝28)的心脏功能和形态。

具体实施方式

本发明涉及特异于Toll样受体2(TLR2)的调节剂，其抑制TLR2的生物学功能或阻断TLR2表达，用于预防缺血后再灌注引起的组织或器官损伤。

如本文中定义的，Toll样受体2还可称为TLR2、TLR-2或CD282。典型的，该Toll样受体2是人Toll样受体2。可替代的，该Toll样受体2是鼠Toll样受体2。在其他实施方式中，该Toll样受体2是人TLR2的同系物或直系同源物，其源自任何除人或小鼠之外的哺乳动物如牛或猫。在某些其他实施方式中，所述阻遏TLR2功能的化合物是交叉反应性的，因为其介导对源自不同种属的Toll样受体2中的Toll样受体2功能的阻遏。

如本文中使用的，术语“抗原表位”指大分子中能够被特异性结合配体结合的部分，在本文中，指多肽特别是Toll样受体2的一部分。抗原表位可从多肽序列中包含的相邻或非相邻氨基酸残基序列而确定。术语“相邻抗原表位”指包括多肽内部可确定该抗原表位的线性氨基酸残基序列的抗原表位。“非相邻抗原表位”是包括一系列排列呈非线性的氨基酸残基的抗原表位，使得所述残基沿着全长多肽序列以非连续性方式间隔开或成组。非连续性抗原表位可以是一种不连续抗原表位，其中该氨基酸残基分为两个线性序列组，或者可替代的该非连续性抗原表位可为一种不连续分散分布的抗原表位，其中对该抗原表位起作用的残基在沿多肽全长排布的3组或更多组线性氨基酸序列中提供。

抗体

“抗体”是一种天然或者部分或完全合成而得到的免疫球蛋白。该术语还涵盖任何具有结合区的多肽、蛋白或肽，该结合区是抗体结合区或与其同源。这些抗体可为天然来源，或者其可通过部分或全部合成而得到。抗体实例是免疫球蛋白同种型和其同种亚型和片段(其包含抗原结合区如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd)及双特异性抗体。

在某些实施方式中，该抗体可为骆驼科抗体特别是骆驼科重链抗体。此外，该抗体片段可为源自骆驼科重链抗体的域抗体或纳米抗体。在某些实施方式中，该抗体可为鲨鱼抗体或鲨鱼源抗体。

在某些实施方式中，该抗体是“分离的抗体”，这表示该抗体(1)游离于至少部分常见的蛋白，(2)基本游离于相同来源如相同种属的其他蛋白，(3)由不同种属的细胞表达，或(4)自然界中不存在。

抗体可以多种方式加以修饰，术语“抗体”应该理解为涵盖任何包含具所需特异性的结合区的结合成员或物质。本发明所述抗体可以为单克隆抗体或者其片段、衍生物、功能等价物或同系物。该术语包括任何包含免疫球蛋白结合区的多肽，无论其是天然的还是全部或部分合成的。因此，还包括那些包含免疫球蛋白结合区或等价物(融合于另一种多肽)的嵌合分子。嵌合抗体的克隆和表达在第EP 0,120,694号欧洲专利申请公开案和第EP 0,125,023号欧洲专利申请公开案中有所阐述。

抗体恒定区可为任何恰当的免疫球蛋白亚型，然而，优选抗体亚型是IgG1。不过，在替代性实施方式中，当采用人免疫球蛋白分子时，该抗体亚型可为IgA，IgM，IgD和IgE。这种抗体还可属于任何亚类例如IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgG4。

完整抗体的片段可发挥结合抗体的功能。这种结合片段的实例为：Fab片段，包括VL、VH、CL和CH1抗体区；Fv片段，包括单个抗体的VL和VH区；F(ab’)2片段，是一种包括两个相连接Fab片段的二价片段；单链Fv分子(scFv)，其中VH区和VL区由肽连接子连接使得这两个区域连接形成抗原结合位点；或者双特异性抗体，其可为通过基因融合构建的多价或多特异性片段。

用于本发明中的抗体或多肽片段例如TLR2特异性抗体片段，通常表示一系列氨基酸残基，至少5-7个相邻氨基酸，常常至少约7-9个相邻氨基酸，典型的至少约9-13个相邻氨基酸，较优选至少约20-30个或更多个相邻氨基酸，最优选至少约30-40个或更多个连续氨基酸。

这种抗体或多肽或者TLR2特异性抗体片段的“衍生物”表示通过改变该蛋白的氨基酸序列而进行修饰的抗体或多肽，例如通过修改编码该蛋白的核酸或者通过改变蛋白本身。这些天然氨基酸序列的衍生物可涉及到插入、添加、缺失和/或取代一个或多个氨基酸，优选同时提供具有TLR2结合活性的肽。优选这些衍生物涉及到插入、添加、缺失和/或取代25个或更少的氨基酸，较优选15个或更少，甚至较优选10个或更少，更为优选4个或更少，最优选仅1个或2个氨基酸。

在某些实施方式中，还提供人源化抗体。人源化抗体可通过例如如第No 5,585,089号美国专利中描述的Winter法而生成。

人源化抗体可为一种具有单克隆抗体诸如TLR2特异性抗体的超变区和人抗体恒定区的改良抗体。因此，所述结合成员可包含人恒定区。

除超变区之外的可变区也可源自人抗体可变区，和/或还可源自单克隆抗体诸如TLR2特异性抗体。在这种情况下，整个可变区均可源自鼠单克隆抗体如TLR2特异性抗体，且该抗体据称为嵌合的。用于制备嵌合抗体的方法在本领域中是已知的。这些方法包括例如Boss(Celltech)和Cabilly(Genentech)的美国专利中阐述的那些方法。分别参见第4,816,397和4,816,567号美国专利。

可能采取单克隆抗体和其他抗体并采用重组DNA技术生成其他保持原始抗体特异性的抗体或嵌合分子。这些技术可涉及到将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补决定区(CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区，或恒定区外加框架区。参见例如第0,184,187号欧洲专利申请、第2,188,638A号英国专利申请或第0,239,400号欧洲专利申请。可对杂交瘤或其他生成抗体的细胞进行遗传突变或其他变化，其可能改变或不改变所生成抗体的结合特异性。

在某些实施方式中，其中所述TLR2抑制性化合物或TLR2结合化合物是一种抗体或抗体结合片段，其中该抗体以治疗有效量给药受体。在某些实施方式中，该治疗有效量包含剂量范围选自1μg/kg至20mg/kg、1μg/kg至10mg/kg、1μg/kg至1mg/kg、10μg/kg至1mg/kg、10μg/kg至100pg/kg以及500pg/kg至1mg/kg的抗体。

抗体的生成

本发明所提供的抗体可通过多种技术而提供。例如，可采用组合筛选技术如基于噬菌体展示的生物扫描分析来鉴定对本发明所述结合抗原表位具有结合特异性的氨基酸序列。这种噬菌体展示生物扫描技术涉及到通过在丝状细菌表面上展示抗体结合片段而应用噬菌体展示文库，其在模拟免疫选择的过程中鉴定恰当抗原表位结合配体的方法中利用。选择具有特异结合活性的噬菌体。随后，所选择的噬菌体可用于生成嵌合、CDR移植、人源化或人的抗体。

在其他实施方式中，该抗体是单克隆抗体，其可采用任何通过连续培养细胞系生成抗体分子的适合方法而生成。适合的方法为本领域中的熟练技术人员所熟知，包括例如Kohler和Milstein的方法(Kohler et al.Nature，256，495-497.1975)。嵌合抗体或CDR移植抗体也包括在本发明的范围内。在某些实施方式中，本发明所述抗体可通过在宿主细胞中表达重组DNA而生成。

在某些实施方式中，单克隆抗体可为人抗体，通过转基因动物如转基因小鼠而生成，所述转基因动物已通过遗传修饰以缺失或阻遏内源性鼠免疫球蛋白基因的表达，优先表达编码人重链和轻链的基因座，这样可生成完整人抗体。

在某些实施方式中，该结合化合物是一种源自抗体的结合片段，例如抗体结合片段，如Fab、F(ab’)2、Fv或单链Fv(scFV)。

在某些实施方式中，该结合化合物包括天然或合成化合物或拟肽的多克隆抗体、嵌合抗体、合成抗体、融合蛋白或其片段。下文将阐述用于生成对TLR2抗原表位具有亲和性和结合特异性的抗体的方法学。

本发明所述抗体或抗体片段以及用于本发明的抗体或抗体片段还可全部或部分通过化学合成而生成。所述抗体按照已确定的标准液相、优选固相肽合成法进行制备，这些方法的一般性描述广泛存在且为本领域中的熟练技术人员所熟知。此外，其可通过液相法或通过液相、固相和溶液化学的任意组合在溶液中制备。

另一种生成适用于本发明的抗体或抗体片段的便利方式是通过利用表达系统中的核酸来表达编码抗体或抗体片段的核酸。

按照本发明应用的核酸可包括DNA或RNA，且可全部或部分是合成的。在一个优选的方面，用于本发明的核酸编码如上文定义的本发明所述抗体或抗体片段。熟练技术人员将能够确定对这些核酸进行取代、缺失和/或添加，其仍将提供本发明所述抗体或抗体片段。

考虑到可利用的核酸序列和克隆，编码本发明所用抗体或抗体片段的核酸序列可易于由熟练技术人员利用本文中包含的信息和参考文献以及本领域中已知的技术(例如，参见Sambrook et al.(1989)和Ausubel et al，(1992))进行制备。这些技术包括(i)采用聚合酶链反应(PCR)从例如基因组来源扩增这些核酸样品，(ii)化学合成或(iii)制备cDNA序列。编码抗体片段的DNA可以本领域中熟练技术人员已知的任何适合方式生成并应用，包括获得编码DNA、鉴定待表达部分两侧的恰当内切酶识别位点以及从该DNA切去所述部分。随后将该部分可操作性连接于标准市售表达系统中的恰当启动子。另一种重组途径是通过恰当的PCR引物扩增该DNA中的相关部分。可利用定点突变对该序列进行修饰，以在用来表达该核酸的宿主细胞中表达该修饰肽或者考虑密码子偏爱性。

该核酸可以质粒、载体、转录或表达盒，其包含至少一种如上文所述核酸，的形式作为结构体而包括在本发明中。所述结构体可包含在重组宿主细胞内，该宿主细胞包含一种或多种如上所述的结构体。表达则可通过在恰当条件下培养包含该核酸的重组宿主细胞而轻易实现。通过表达而生成后，该抗体或抗体片段可利用任何恰当技术分离和/或纯化，然后适当应用。

用于在多种不同宿主细胞中克隆并表达多肽的系统已为人熟知。适合的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、酵母、昆虫和杆状病毒系统。本领域中现存可用于表达异源性多肽的哺乳动物细胞系包括中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、海拉细胞(HeLa cell，宫颈癌传代细胞)、幼仓鼠肾细胞、NS0小鼠骨髓瘤细胞。一种通用、优选的细菌宿主是E.coli。本领域中已经很好的建立了抗体和抗体片段在原核细胞诸如E.coli中的表达。在培养的真核细胞中表达也可为本领域中的熟练技术人员所用，作为一种生成结合成员的选择。

用于抗体生成的通用技术为本领域中的熟练技术人员所熟知，这些方法在例如Kohler and Milstein(1975)Nature 256：495-497；US Patent No.4,376,110；Harlow and Lane，Antibodies：a Laboratory Manual，(1988)ColdSpring Harbor中有所论述，其内容结合于此供参考。用于制备重组抗体分子的技术在上述参考文献以及例如EP 0,623,679和EP 0,368,684(其结合于此供参考)中有所阐述。

在本发明某些实施方式中，应用了包含编码抗体的重链可变区和/或轻链可变区的插入子的重组核酸。按照定义，这些核酸包括编码单链核酸、双链核酸(由所述编码核酸以及其互补核酸组成)或者这些互补(单链)核酸本身。

此外，编码抗体重链可变区和/或轻链可变区的核酸可为利用酶合成或化学合成的核酸，具有编码天然存在的重链可变区和/或轻链可变区，或其突变体的确定(真实，authentic)序列。

重组DNA技术还可用来改善本发明所述抗体。因此，可构建嵌合抗体以降低其在诊断或治疗性应用中的免疫原性。而且，可通过用一种类似于使抗体人源化的技术进行CDR移植而将转基因生物如猪中的免疫原性降到最低。这些技术的实例在Winter的EP 0,239,400中有所阐述。为了降低受者体内的免疫原性，本发明可应用包含编码抗体重链可变区(融合于人恒定区)的插入子的重组核酸。同样，本发明涉及包含编码抗体轻链可变区(融合于人恒定区κ或λ区)的插入子的重组核酸。

此外，抗体还可通过抗体基因致突变而生成，以得到5个人工抗体库(抗体谱)。该技术可制备抗体文库。抗体文库也可购买。因此，本发明有利的采用人工免疫球蛋白库，优选人工scFv库作为免疫球蛋白来源鉴定对本发明所述抗原表位具有特异性的结合分子。

抗体选择系统

能够结合本发明所述抗原表位并因此应用于本发明所述方法中的免疫球蛋白可利用熟练技术人员已知的任何技术加以鉴定。这些免疫球蛋白可方便的从包含人工免疫球蛋白多肽库的文库中分出。“库”指一组通过一个或多个模板分子在核酸水平进行随机、半随机或定向变异而生成的一组分子，以提供结合特异性的多样性。生成库(repertoires)的方法已在本领域中得到了很好的描述。

任何文库选择系统均可与本发明结合应用。用于分离较大文库中所需成员的选择流程在本领域中是已知的，如通过噬菌斑展示技术所代表的。这些系统中，多种肽序列展示于丝状噬菌体表面上，已证实对于创建抗体片段(以及编码它们的核苷酸序列)文库用于体外选择并扩增可结合靶抗原的特异性抗体片段非常有用。编码VH和VL区的核苷酸序列可连接于编码引导信号(可引导其进入E.coli的壁膜间隙)的基因片段，因此，可将所得到的抗体片段展示于噬菌体表面上，常常作为噬菌体外壳蛋白的融合体(例如pIII或pVIII)。可替代的，抗体片段向外展示于λ噬菌体衣壳蛋白(噬菌体主体)上。噬菌体基展示系统的一个优势在于，因为其是生物学系统，因此所选择的文库成员可简单的通过在细菌细胞中培育包含所选文库成员的噬菌体而扩增。此外，因为编码多肽文库成员的核苷酸序列包含于噬菌体或噬菌粒载体上，因此，测序、表达和随后的基因操作相对比较简单。

用于构建噬菌体抗体展示文库和λ噬菌体表达文库的方法在本领域中为人熟知(例如，McCafferty et al.(1990)Nature 348552-554.)。一种特别有利的方法为采用scFv噬菌体文库(参见例如Huston et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci USA)。

应用噬菌体或其他克隆文库的一种备选方案，是采用源自动物B细胞的核酸，优选RNA，该动物已用所选靶标，例如本发明所述TLR2抗原表位进行免疫。

分离V区和C区mRNA可使抗体片段如Fab或Fv在细胞内表达。简单而言，从免疫动物的B细胞中分离RNA，例如从免疫小鼠的脾脏或骆马(美洲驼)的循环B细胞，并采用PCR引物从RNA池中选择性扩增VH和VL cDNA。将这样得到的VH和VL序列进行连接而制备scFv抗体。PCR引物序列可基于已发表的VH和VL序列。

拟肽

肽类似物如拟肽或肽模拟物是具有模板肽的代表性特征的非肽化合物。典型的，这些肽类似物利用计算机分子模拟来开发。结构类似于肽(其对本发明所述TLR2结合抗原表位具有亲和性和结合特异性)的拟肽可用来介导类似的诊断、预防和治疗效应。

通常，拟肽结构类似于模板肽，但一个或多个肽键通过本领域中熟知的方法而用可替代的键取代。例如，对本发明所述TLR2抗原表位具有结合特异性的肽可加以修饰，使其包含酰胺键取代、掺入非肽部分或者骨架环化。恰当的，如果存在半胱氨酸，则该残基的巯基可加以帽化而避免游离硫酸酯(盐)基团的破坏。肽可进一步从天然序列进行修饰以保护该肽不受蛋白酶攻击。

适当的，本发明的肽以及用于本发明的肽可进一步利用C和/或N末端帽化和/或半胱氨酸残基帽化中的至少一种进行修饰。恰当的，本发明的肽以及用于本发明的肽可用乙酰基在N末端残基进行帽化。恰当的，本发明的肽以及用于本发明的肽可用酰胺基在C末端残基进行帽化。恰当的，半胱氨酸的巯基可用乙酰氨甲基进行帽化。

确定本发明所述抗原表位的多肽及其片段的表达、分离和纯化可通过任何恰当的技术而实现。用于生产多肽的方法包括：在可促进该多肽表达的条件下，培养用编码多肽的重组表达载体进行转化的宿主细胞，然后从培养物中回收所表达的多肽。本领域中的熟练技术人员将认识到，纯化所表达多肽的步骤可根据某些因素加以变更，如所采用宿主细胞的类型以及该多肽是细胞内的、膜结合的还是可溶形式(其从该宿主细胞而分泌)的。

任何恰当的表达系统均可应用。载体包括编码本发明所述多肽或片段的DNA，可操作地连接于恰当的转录或翻译调节性核苷酸序列，如那些源自哺乳动物、禽类、微生物、病毒、细菌或昆虫基因的调节性核苷酸序列。当该调节性序列与该DNA序列功能相关时，即可操作性连接该核苷酸序列。因此，如果启动子核苷酸序列控制DNA序列的转录时，即可将启动子核苷酸序列可操作性连接于该DNA序列。赋予可在所需(E.coli)宿主细胞中进行复制的能力的复制起始点以及通过其鉴定转化体的筛选基因，通常均包含入表达载体中。

此外，编码合适信号肽(天然或异源的)的序列也可包含入表达载体中。用于信号肽(分泌性先导肽)的DNA序列可以框架形式融合于本发明所述核酸序列，使得DNA开始转录，且mRNA翻译为包含该信号肽的融合蛋白。在预期宿主细胞中有功能的信号肽促进该多肽的细胞外分泌。翻译过程中，该信号肽从该多肽切割，但可从细胞分泌该多肽。

用于表达多肽的恰当宿主细胞包括高级真核动物细胞和酵母。原核系统也适用。特别优选哺乳动物细胞特别是CHO细胞用作宿主细胞。哺乳动物、原核、酵母、真菌和昆虫细胞宿主应用的恰当克隆和表达载体在例如Pouwels et al.Cloning Vectors：A Laboratory Manual，Elsevier，New York，(1986)(ISBN 0444904018)中有所阐述。

小分子

在多个其他方面，本发明涉及到用于鉴定拮抗TLR2活性或表达的小分子化合物的筛选和分析方法。某些其他方面扩展至由此鉴定的化合物，其中所述结合化合物对一种结合后即抑制TLR2功能活性的抗原表位具有亲和性和结合特异性。

鉴定为TLR2受体拮抗剂的物质，可以为肽或自然界中的非肽，如上文所述的拟肽。然而，非肽“小分子”常常优先用于多种体内药学用途。因此，用于本发明的TLR2结合化合物模拟物或模仿物可设计用于药学用途。

将模拟物设计为一种已知的药学活性化合物是一种已知的基于“前导”化合物开发药品的途径。如果活性化合物难以合成或者合成费用比较昂贵时，或者其不适于特定给药方法时，该途径则比较理想。例如，由于其可被消化道中存在的蛋白酶降解，因此肽不适于作为口服组合物及口服给药的活性物质。对于目标属性，采用模拟设计、合成和测试可避免随机筛选大量分子。

从具有特定目标属性的化合物设计模拟物通常需采取几个步骤。首先，确定化合物中对于决定该目标属性比较关键和/或重要的特定部分。对于肽而言，这一点可通过系统性改变该肽中的氨基酸残基例如通过依次取代每一个氨基酸残基而实现。这些构成该化合物活性区的部分或残基称为其“药效团”。

一旦确定了该药效团，则利用来自多种来源如光谱技术、X射线衍射数据和NMR的数据，根据其物理性质如立体化学、键合、大小和/或电荷而模拟其结构。该模拟过程中还可应用计算机分析、相似度映射(其模拟药效团的电荷和/或体积而非原子之间的键)和其他技术。

在该途径的一个变型中，对TLR2结合化合物的三维结构进行模拟。这一点在配体和/或结合蛋白(结合伴侣)改变结合的构象时尤其有用，使该样本考虑模拟物的设计。

随后选择模拟该药效团的化学基团可移植其上的模板分子。所述模板分子及移植其上的化学基团可方便的进行选择，因此该模拟物易于合成，且是药理学可接受的，在体内不会降解，同时保留该先导化合物的生物学活性。随后可筛选通过该途径发现的模拟物，观察其是否具有目标属性或者其表现出目标属性的程度。接下来可进一步优化或改良以得到一种或多种用于体内或临床检测的最终模拟物。

在某些实施方式中，该模拟结合化合物可为用于药物筛选项目中的天然或合成的化合物。还可采用包含几种已鉴定或未鉴定组分的植物提取物。

在另外的方面，本发明扩展至组合文库技术(Schultz，JS(1996)Biotechnol.Prog.12：729-743)的用途，该技术提供一种高效方式，检测大量不同物质结合抗原表位或调节可结合该抗原表位的配体活性的能力。筛选活性调节之前或筛选时，可在例如酵母双杂交系统(其要求在酵母中，多肽及待测物质均可从编码核酸表达而来)中筛选待测物质与该多肽相互作用的能力，可用作测试该物质调节多肽活性的实际能力之前的粗筛。

待测物质或可加入本发明分析中的化合物的量通常将通过反复试验根据所采用的化合物类型而确定。典型的，可采用浓度从约0.01至100nM的公认的抑制化合物，例如从0.1至10nM。当待测物质是肽时，可采用较大的浓度。

组合药剂

如上文所述，本发明扩展至组合疗法，其中组合物或方法涉及到抑制TLR2功能活性的结合化合物可与至少一种其他可用来阻遏免疫应答(其对再灌注损伤起作用)或治疗心脏病的治疗剂联合给药。

典型的，首要治疗组合物和次级治疗组合物同时期给药。在某些实施方式中，首要治疗组合物(即拮抗TLR2功能活性的结合化合物)和次级治疗化合物同时给药。在某些其他实施方式中，它们可依次给药。

在某些实施方式中，所述组合疗法可包含一种TLR2功能抑制剂，其可与下列试剂其中之一同时给药受体：细胞因子抑制剂(如但不限于IL-1、IL-6、IL-8和IL-15的抑制剂)，以及肿瘤坏死因子抑制剂、生长因子抑制剂、免疫抑制剂、消炎药、酶抑制剂、代谢抑制剂、细胞毒性试剂或者细胞增殖抑制剂。

本领域中的相关技术人员将认识到，给药受体一种组合疗法将是有益的，因为其可使得给药受体较低剂量的治疗药物而获得相似的治疗效果。给药较低的组合剂量也可使受体暴露的源自所给药化合物的毒性水平较低。此外，由于作为本发明所提供组合疗法的一部分而给药的次级治疗化合物针对不同的方向，因此可能引起整体疗效的协同性增强。疗效增强还将引起对待给药剂量的要求较低以及本身伴随的毒性降低。

在鉴定和选择与本发明所述TLR2抑制性化合物一起给药的适合的次级治疗化合物时，所述次级治疗化合物可根据这些在免疫应答(其引起与再灌注损伤有关的炎症)的不同阶段调节免疫应答的化合物而加以选择。这些次级化合物可包括但不限于：可溶性受体、肽抑制化合物、小分子、融合蛋白或配体、抗体以及介导抗炎效应的细胞因子。

给药

本发明所述单克隆抗体或融合蛋白可单独给药，但优选作为一种药物组合物给药，通常该组合物将包括恰当的药学可接受赋形剂、稀释剂或载体，根据希望给药的途径而选择。恰当药学载体的实例包括：水、甘油、乙醇或其他GRAS试剂。

本发明所述单克隆抗体或融合蛋白可通过任何恰当途径给药需要进行治疗的受体。如本文中所详述的，优选该组合物优先胃肠外注射或输注给药。用于胃肠外给药的优选途径包括但不限于：静脉内、贲门内、动脉内、腹膜内、肌内、腔内、皮下、经粘膜、吸入或经皮给药。

给药途径还可进一步包括局部和肠内，例如粘膜(包括肺)、口服、鼻、直肠给药。

在某些实施方式中，该组合物可作为注射组合物递送。对于静脉内、肌内、皮内或皮下的应用，活性成分将为胃肠外可接受的水性溶液形式，其为无热原的，且具有恰当的pH、等张性和稳定性。本领域中的相关技术人员可利用等张赋形剂如氯化钠注射液、林格注射液或乳酸钠林格注射液等熟练制备恰当溶液。如果需要，还可包含防腐剂、稳定剂、缓冲液、抗氧化剂和/或其他添加剂。

所述化合物还可通过微球、脂质体、其他微颗粒递送系统或置于某些组织包括血液中的缓释制剂而给药。

上文提到的技术和流程以及其他可按照本发明应用的技术和流程实例可在Remington’s Pharmaceutical Sciences，18th edition，Gennaro，A.R.，Lippincott Williams & Wilkins；20th edition ISBN 0-912734-04-3andPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems；Ansel，H.C.et al.7th Edition ISBN 0-683305-72-7中查到，其整个披露案均结合于此供参考。

该组合物优选以“治疗有效量”给药个体，这个量足以向给药该组合物的个体表现出成效。所给药的实际剂量以及给药速率和时程将依赖于且可适当参照所治疗病症的性质和严重程度以及诸如年龄、性别和待治疗受体体重以及给药途径而确定。且应进一步对该组合物属性如其结合活性和体内血浆寿命、该制剂中融合蛋白的浓度以及递送途径、位点和速率等加以合理考虑。

给药方案可包括单次给药本发明所述组合物或多次给药该组合物。该组合物还可与其他治疗剂和药剂(其用于治疗给药本发明所述融合蛋白所治疗的病症)依次或独立给药。

可给予受体的给药方案实例可从包括但不限于1μg/kg/天至20mg/kg/天、1μg/kg/天至10mg/kg/天、10μg/kg/天至1mg/kg/天的组中加以选择。

本发明所述TLR2调节剂优选以“治疗有效量”给药个体，这个量足以使该个体受益。所给药的实际剂量以及给药速率和时程将依赖于正治疗病症的性质和严重程度。开具该疗法例如决定剂量等，最终在全科医生和其他内科医生的职责范围内，应慎重决定，且通常考虑待治疗疾患、受体个体的病症、递送位点、给药方法以及执业医生所知的其他因素。

除非另有定义，本文中应用的所有技术和科学术语具有本发明领域中熟练技术人员通常所理解的含义。

在整个说明书中，除非上下文另有要求，术语“包含”或“包括”或者其变形均应理解为提示涵盖所述整数或一组整数，但不排除任何其他整数或一组整数。

如本文中使用的，术语如“一”、“一个”和“所述”包括单数或复数个指示物，除非上下文另外明确指出。因此，例如提到“一种活性试剂”或“一种药理学活性试剂”时，包括单种活性试剂以及两种或更多种不同活性试剂联用，而提到“一种载体”则包括两种或更多种载体的混合物以及单种载体等。

用来描述本发明所述融合蛋白中多肽组分的命名法遵循传统惯例，其中氨基(N)位于每一个氨基酸残基的左侧，羧基则位于右侧。

如本文中使用的，术语“氨基酸”用来既包括天然和合成的氨基酸，又包括D和L氨基酸。合成的氨基酸还涵盖化学修饰的氨基酸，包括但不限于盐类以及氨基酸衍生物如酰胺。本发明所述多肽内存在的氨基酸可通过甲基化、酰胺化、乙酰化或用其他可改变循环半衰期但不会负面影响其生物学活性的化学基团取代而修饰。

本文中，术语“肽”、“多肽”和“蛋白”可互相交换使用，来描述一系列至少两个通过肽键或其他修饰肽键如电子等排体共价连接的氨基酸。构成肽或蛋白的氨基酸最大数目未加限制。此外，术语多肽扩展至肽的片段、类似物和衍生物，其中所述片段、类似物或衍生物保留与该片段、衍生物或类似物所来源的肽相同的生物学功能活性。

此外，如本文中使用的，术语“融合蛋白”还可用来表示融合多肽、融合肽或相似物，或者可称为免疫交联物。术语“融合蛋白”指一种分子，其中两个或多个亚单位分子，通常为多肽，可共价或非共价连接。

如本文中使用的，术语“治疗有效量”表示阻遏TLR2介导炎症所需本发明试剂、结合化合物、小分子、融合蛋白或拟肽的量，其中该炎症是再灌注损伤的起因，而再灌注损伤则来自于至少一种选自由但不限于受体低氧、中风、心脏病发作、慢性肾衰或器官移植组成的组的病症。

如本文中使用的，术语“预防有效量”指预防TLR2介导炎症最初发病、进展或复发所需组合物的量，其中该炎症是再灌注损伤的起因，而再灌注损伤则来自于至少一种选自由但不限于受体低氧、中风、心脏病发作、慢性肾衰或器官移植组成的组的病症。

如本文中使用的，术语“治疗”以及相关术语表示TLR2介导炎症或其至少一种症状进展、严重度和/或持续时间的减慢或减少，其中所述减少或减慢是由于给药一种对本发明所述TLR2结合抗原表位具有特异性的结合化合物。因此，术语“治疗”指任何可有利于受体的方案。所述治疗可针对现有病症或为预防性的(预防性治疗)。本文中提到“治疗性”和“预防性”治疗时，可在最宽泛的范围内加以考虑。术语“治疗性”并非必须表示受体经治疗达到完全康复。类似的，“预防性”并非必须表示该受体将最终染上一种疾病症状。

如本文中使用的，术语“受体”指动物，优选哺乳动物，特别是人。在一个特定实施方式中，受体是哺乳动物尤其是人。术语“受体”如本文中使用的“病人”可相互交换使用。

实施例

实施例1-TLR2拮抗性抗体对心脏内再灌注损伤的效果

材料和方法

(i)动物&实验设计

雄性C57BL6小鼠(8-12周大，重25-30克)经历30分钟缺血随后再灌注24小时。

实验化合物于再灌注前5分钟通过尾静脉给药。小鼠给药400-450μl的汤药(库存料，stock)，10mg/kg IgG同种型抗体作为阴性对照(n＝10)或0.5mg/kg的SB239063((Alexis Corporation，目录号ALX-270-351)，SB239063也称为反式-1-(4-羟基环己基)-4-(氟代苯基)-5-(2-甲氧嘧啶-4-基)咪唑，一种有效的透细胞性p38MAP激酶抑制剂(重组纯化的人p38α的IC50＝44nM)，其抑制LPS刺激的人外周血单核细胞中IL-1和TNF-α的生成(IC50分别为120nM和350nM)，作为阳性对照(n＝10)，PBS(n＝11)以及实验性OPN-301单克隆抗体15mg/kg(n＝6)10mg/kg(n＝10，n＝5)，10mg/kg(n＝5)。OPN-301(OPN301)是鼠IgG1抗-TLR2抗体(小鼠Toll样受体2(TLR2)抗体，克隆T2.5，HyCult Biotechnology b.v.，Cell Sciences，Canton，USA：目录号1054)。

将小鼠用FENTANYLTM(N-(1-苯乙基-4-哌啶基)-N-苯基-丙酰胺)0.05mg/kg，DORMICUMTM(咪唑安定，8-氯-6-(2-氟代苯基)-1-甲基-4H-咪唑[1，5-a][1，4]苯(并)二氮卓类)5mg/kg和DOMITORTM(盐酸美托咪定)0.5mg/kg(腹膜内注射)的混合物进行麻醉。冠脉结扎前，皮下给药0.05mg/kg阿托品((8-甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基)3-羟基-2-苯基丙酸)。手术过程中，通过用直肠体温计持续监控以及自动加热毯使中心体温保持在36℃与37.5℃之间。培育小鼠并通入100％氧气(Harvard Apparatus Inc.)。左前降支(LAD)冠状动脉利用8-0vicryl缝线与置于LAD上的一段聚乙烯-10插管相连接。

缺血通过心肌脱色而确认。再灌注通过解开结扎线并移走聚乙烯-10插管而启动。濒危心肌的再灌注通过最初几分钟内的典型充血而鉴定。留置一条松弛的缝线以确定缺血区。闭合胸壁，动物皮下接受ANTISEDANTM(盐酸阿替美唑，一种替代DOMITORT(盐酸美托咪定)的镇静催醒试剂)2.5mg/kg，ANEXATETM(氟马西尼(也称为flumazepil))0.5mg/kg和TEMGESICTM(丁丙诺啡叔丁啡)0.1mg/kg。

梗塞面积

梗塞面积(IS)表示为占危险区(AAR)和整个左心室(LV)的百分比。AAR/LV的比值是心肌组织缺血和再灌注(即危险区)程度的一个测量指标。比值AAR/LV是一种用来测定危险心肌内梗塞面积的准确测量指标，且是从治疗发挥效果开始的第一个终点。第二个终点IS/LV比值是梗塞面积占整体左心室壁的百分比。

为了确定AAR，再次结扎LAD(在由留置于适当位置的缝线所标记的水平)，并通过以逆行方式注射4％Evans蓝染料。迅速移出心脏，用0.9％盐水冲洗并包裹在干净的食品包装膜中，于-20℃冷冻1小时。随后用机器将心脏切成5个1mm的切片。心脏切片在1％氯化三苯基四氮唑(Sigma-Aldrich)中于37℃培育15分钟，然后再置于甲醛中15分钟。存活组织染为红色而梗塞组织呈白色。心脏切片在显微镜(CARL ZEISSTM)下进行数字化成像(CANON EOS 400D)。IS、AAR和总LV面积利用ImageJ软件(版本1.34)进行测量。

统计分析

全部数据均表示为均值±SD。用偏态(skewness)±SD和峰态(kurtosis)±SD确定正态性后，利用含邦弗朗尼(Bonferroni)校正的单因素方差分析(ANOVA)(表2)和Dunnett’s T检验(2侧)(表4)检测组间差异。如果疑似呈非正态分布，则进行Kolmogorov-Smirnov检验(柯尔莫诺夫-斯米尔诺夫检验)(即，当峰态和偏态值两倍于其标准差时)。所有的统计分析均采用Windows的SPSS 13.0(SPSS，Chicago，USA)进行，p＜0.05可认为具有显著性。

结果

生存-所有动物均活过了30分钟缺血期以及随后的24小时再灌注期。

心脏切片-图1至4示出了不同组中心脏切片的代表性实例。

描述性统计-表1、表3及图5、6、7、8和9示出了数据及其分布。所有数据均呈正态分布。疑似p38抑制剂组为非正态分布，但Kolmogorov-Smirnov检验证实了其正态性(p＝0.077)。

整个左心室内的危险区(AAR)-组间的AAR/LV无显著性差别，意味着组之间操作对左心室的影响相等(图5)。

梗塞面积-表2和表4示出了实验组之间均值的比较。相比于其他组，mAb是唯一一个平均IS/AAR表现出显著性差异的组。与IgG同种型(p＝0.007)和p38抑制剂处理的小鼠(p＝0.006)相比，用OPN-301单克隆抗体进行处理引起AAR内的梗塞面积(IS/AAR)降低43％。与PBS(硫酸盐缓冲溶液)处理小鼠相比，IS/AAR的降低更加显著，50％(p＜0.001)(图6)。

在实验性抗TLR2的OPN-301单克隆抗体处理的小鼠中，梗塞面积占整个左心室的百分比(IS/LV)也有所降低：与IgG同种型相比降低53％(p＝0.01)、与p38抑制剂相比，降低49％(p＝0.032)，与PBS处理的小鼠相比，降低65％(p＜0.001)(图7)。

p38抑制剂与IgG同种型处理的小鼠及PBS处理的小鼠之间平均IS/LV的差异(分别是降低26％和降低31％)无显著性(图7)。

表1：

表1.独立变量的描述性统计

表2：

^*平均差在.05水平具有显著性。

表3：独立变量的描述性分析(修正表包括IS/LV数据，而TLR2KO、血液KO和器官KO数据未预先包括在表3中)

表4：

Dunnettt(双侧)

^*平均差在.05水平具有显著性。

Dunnettt检验以一个组为对照，其他所有组均与其进行比较。

已证实，对TLR2具有结合特异性的实验性OPN-301单克隆抗体引起的梗塞面积降低比较显著。

实验性化合物于再灌注前5分钟给药，这可解释为什么阳性对照(SB239063)不能降低梗塞面积。在已证实阳性对照有效的研究中，可在缺血之前和/或再灌注期间给药p38抑制剂(SB239063或SB203580)。临床使用时，该流程由于几个原因而不大可行。首先，心肌梗塞不可预测，因此受体无法在缺血期前服用p38抑制剂。p38抑制剂可能需要一段较长的时间发挥其作用，因为其在整个缺血期一直给药。这使得其不适于作为一种用于心肌缺血/再灌注的疗法，其中血流的早期恢复对于受体有益：该药物不具有足够的时间起效。甚至在这些情况下，所述抗TLR2单克隆抗体OPN-301也不能降低梗塞面积。

现在存在一个趋势，即p38抑制剂SB239063降低梗塞面积占整个左心室百分比(IS/LV)的效应(p＝0.059，Table 2)。这可由以下原因引起：a)PBS组中数据比较分散；b)SB239063的确具有轻微效应，但当缺血期之前给药时不如前期研究中那么大或c)动物对SB239063的反应性存在变异性。

图9表明，相比于盐水组的34.5％，给药15mg/kg，10mg/kg和5mg/kg的抗TLR2单克隆抗体OPN-301引起的梗塞分别占危险区的21％、21％和25％。经统计，给药10mg/kg(n＝5)时与图6中获得的结果(用OPN-301单克隆抗体时，梗塞为19％)类似。然而，5mg/kg组与盐水组之间的梗塞面积差异不能达到统计学显著性(p＝0.131)。

综上，相比于10mg/kg或15mg/kg的鼠IgG1抗TLR2抗体OPN-301的剂量，5mg/kg的鼠IgG1抗TLR2抗体OPN-301不能显著性降低梗塞面积。15mg/kg的鼠IgG1抗TLR2抗体OPN-301的效应表明了该抗体的较强效力，因为对于10mg/kg而言，相比于n＝10，相对较少数量的小鼠即n＝5足以获得正态分布的数据，具有同样大小的标准差。因此，15mg/kg的鼠IgG1抗TLR2抗体OPN-301与10mg/kg的鼠IgG1抗TLR2抗体OPN-301同等有效。

实施例2-对TLR2拮抗性抗体对心脏再灌注损伤效应的进一步研究

重复实施例1中的实验，如下文所示以及图15-23中进一步展示的。

生存

所有动物均活过了30分钟缺血期/24小时再灌注期。除了2只用IgG同种型处理的小鼠之外，所有动物还存活过了MI/R损伤后的28天。死因与操作和/或感染性原因无关。

心脏切片

图15、16、17和18示出了不同组中心脏切片的代表性实例。

描述性统计

表5及图19、20和21示出了数据及其分布情况。所有数据均呈正态分布。疑似p38抑制剂组呈非正态分布，但Kolmogorov-Smirnov检验证实了其正态性(p＝0.077)。

整个左心室内的危险区

AAR/LV在不同组间没有差别，表明左心室受不同组间操作的影响相等(图1)。

梗塞面积

表5示出了与PBS处理的多个比较。TLR2敲除处理及鼠IgG1抗TLR2抗体OPN-301处理引起梗塞面积的显著性降低。用鼠IgG1抗TLR2抗体OPN-301处理引起AAR内的梗塞面积(IS/AAR)降低45％(p＝0.001)。TLR2敲除(KO)小鼠引起梗塞面积降低33.3％(p＝0.025)。预期的阳性对照p38抑制剂处理的小鼠未表现出梗塞面积降低(p＝0.956)(图20)。

梗塞面积占整个左心室的百分比(IS/LV)在OPN-301处理的小鼠中也有所降低：与盐水处理相比下降了52％(p＝0.001)。而且，IgG同种型处理与p38抑制剂处理未观察到梗塞面积的差异(图21)。

仅循环细胞上缺少TLR2的小鼠由于整体敲除的受益于类似程度的心脏保护。血液敲除小鼠中的梗塞面积类似于TLR2整体敲除的小鼠(AAR内的梗塞降低33.3％；p＝0.019)。相反，实质细胞上缺乏TLR2的小鼠不能得到保护而免于MI/R损伤(图22)。按照我们的假设及TLR2介导MI/R损伤中的炎症反应，再灌注24小时后，血液敲除小鼠的心肌中巨噬细胞流入少2.5倍(p＝0.0005；图23)。这些数据支持一个观点即循环细胞上的TLR2表达介导MI/R损伤。

心脏功能&形态

图24和表6示出了梗塞28天后心功能和形态的变化。舒张末期容积和收缩末期容积随着盐水和IgG同种型处理而增加，而OPN-301处理则引起两个参数的降低。此外，射血分数在用盐水和IgG同种型处理的小鼠中较差。相反，鼠IgG1抗TLR2抗体OPN-301则于梗塞后28天仍然保持了心功能，如通过射血分数的轻微增加而证实的。这些数据表明，OPN-301处理引起的梗塞面积降低转变为MI/R损伤后的心功能以及心脏形态的保持。

表5：危险区和梗塞面积的多重比较

^*平均值差异在.05水平呈显著性。

a Dunnettt检验以一组为对照，所有其他组均与其进行比较。

表6：基线(t＝0)及梗塞后(t＝28)的心功能&形态

将功能结果与盐水处理进行比较。

p＜0.05；与盐水处理相比，有显著性差异；NS：与盐水处理相比，无显著性差异。

实施例3-猪血液样品中TLR2活性的抑制

猪血液样品将在肝素化管中提供(n＝4-5)，在室温保存，且将测定OPN-301单克隆抗体拮抗TLR2功能的抑制性潜能。TLR-2/TLR-4抑制性肽和TLR-4抑制性肽还将在用特定TLR激动剂刺激纯化的猪PBMC后进行评估。

实验流程

猪PBMC将在鼠IgG1抗TLR2抗体OPN-301(剂量范围：1000-0.01ng/ml)或TLR阻断性肽存在或不存在时用TLR-2激动剂Pam3CSK4和FSL-1或TLR-4激动剂LPS进行刺激。细胞将刺激6和24小时，并检测上清液中TNF-α的存在情况。

猪的品系之间可存在显著性差异，即在血栓形成研究中，小型猪可能不对鼠IgG1抗TLR2抗体OPN-301起反应，而其他品系则起反应。

在大鼠或恒河猴的PBMC中，鼠IgG1抗TLR2抗体OPN-301对TLR2配体诱导的TNF-α生成几乎未表现出抑制或根本无抑制。然而，短尾猴的PBMC中的结果则与最初开展的参照研究中不一致，因此进一步的工作利用短尾猴的PBMC而开展。

这些额外研究的确证实，鼠IgG1抗TLR2抗体OPN-301结合上短尾猴的PBMC的TLR2(通过FACS分析)，而猴淋巴细胞上则观察到的TLR2表达极少。此外，浓度高达2000ng/ml时，在短尾猴的PBMC中仅观察到TLR2配体诱导的TNF-α生成的极微弱抑制或无抑制。因此，短尾猴中似乎存在相当微弱的鼠IgG1抗TLR2抗体OPN-301交叉反应性，该种属PBMC的效力分析中观察到的低活性表明与人和小鼠制剂相比，其生物学活性极低。

由于小鼠不是用于开展安全性研究的有用种属，因此鼠IgG1抗TLR2抗体OPN-301将需要更广泛的毒理学程序以符合管理机构的要求。由于器官体积和代谢类似，因此猪的急性病症如缺血及安全性研究与人类病症更加相关。因此，本实验确认了鼠IgG1抗TLR2抗体OPN-301是一种用于猪缺血再灌注损伤样本将来可能的毒理学研究中的恰当治疗剂。

实施例4-兔中TLR2活性的抑制

兔PBMC将在鼠IgG1抗TLR2抗体OPN-301(剂量范围：1000-0.01ng/ml)或TLR阻断性肽存在或不存在时用TLR-2激动剂Pam3CSK4和FSL-1或TLR-4激动剂LPS进行刺激。细胞将刺激6和24小时，并检测上清液中TNF-α的存在情况。

该实验将确认鼠IgG1抗TLR2抗体OPN-301是否是一种用于兔动脉生成样本中的恰当治疗剂。

小鼠可用于这些研究，但对于人类的疾病症状，认为兔是一种更适当的样本。然而，为了实施兔动脉生成，必须证实抗体或肽在体外能够阻断TLR激动剂所介导的来自于兔PBMC的炎症反应。

实施例5-缺血鼠的机制性研究

之前的实验已证实了鼠IgG1抗TLR2抗体OPN-301在鼠缺血再灌注损伤中的治疗性效应。一个更彻底确定鼠IgG1抗TLR2抗体OPN-301作用机制的研究将是有益的。将采用与之前在小鼠中开展的缺血研究相同的流程，但还将测定其他参数如免疫组化、炎症、中性粒细胞、细胞因子、凋亡和基质更新。

该实验将确定该治疗性鼠IgG1抗TLR2抗体OPN-301对免疫系统的作用机制。此外，还将采用嵌合小鼠研究，其将确定药物给药的最佳途径。具有野生型小鼠血液的TLR2敲除小鼠将与具有野生型心脏的TLR2敲除小鼠进行比较，以确定该抗体/肽是否通过最血液中免疫细胞(浸润性单核细胞等)或心脏上皮细胞起作用而发挥其治疗性效应。这些研究的结果将确定静脉内(i.v.)还是冠脉内途径给药该本发明的治疗性化合物是最佳的。

实施例6-双重干预性研究

缺血再灌注将联用TLR-2和TLR4抑制剂进行评估，这个过程将在猪体内实施，假设鼠IgG1抗TLR2抗体OPN-301在该动物样本中表现出功能性。之前开展的研究已清楚的证实了TLR4在心脏缺血性炎症反应中的功能。考虑到前期用鼠IgG1抗TLR2抗体OPN-301开展的研究已证实了阻断TLR2的治疗性效应，因此联合治疗途径可能更加有益。

实施例7-TLR-2阻断对动脉粥样硬化的效应

我们将通过实验评估鼠IgG1抗TLR2抗体OPN-301在特异性小鼠样本1(ApoE-/-cuff样本)中是否具有治疗性效应。动脉粥样硬化斑块形成的一系列事件中，最初步骤之一是募集单核细胞至血管损伤部位。TLR家族的10个成员中，TLR1、TLR2和TLR4的表达在人动脉粥样硬化斑块中显著增强。最近，观察到TLR4与TLR2的连接加速了小鼠动脉中新内膜的形成。此外，还证实了TLR2表达增强可使斑块不稳。因此，该实验过程将检测OPN-301和TLR阻断性肽在降低斑块大小和形成方面的治疗性潜能，以及评估小鼠动脉粥样硬化样本中的斑块稳定性。

实施例8-涂布TLR2拮抗性化合物的支架

放置支架后，炎症反应是已植入支架的受体免疫系统经常遇到的问题。典型的，动脉阻塞将由于该炎性免疫应答而形成。这些实验将检测新型治疗方案的治疗潜能，其中，支架涂布了鼠IgG1抗TLR2抗体OPN-301或类似的TLR阻断性肽。该方式的优势在于其将为炎症局部提供一个急性的强烈的局部，并防止新内膜形成，且可能稳定更下游的其他斑块。

实施例9-抗TLR2单克隆抗体处理对梗塞面积的影响

该实施例考虑抗TLR2单克隆抗体OPN-301有效降低小鼠梗塞面积的机制。该实验将充分考虑炎症反应标志物、凋亡程度及存活通路的激活。

嵌合小鼠实验将评估局部还是全身性Toll样受体抑制对于降低梗塞面积更加有效。为了上述目标，将于再灌注1、24和72小时后对小鼠的对照和实验组加以评估。最后，评估处理前和处理后28天的心功能。

该抗Toll样受体2(TLR2)的实验性单克隆抗体在缺血30分钟并再灌注24小时后显著降低梗塞面积。一旦激活，Toll样受体即启动炎性级联反应；释放细胞因子和其他促炎性化学引诱因子，活化中性粒细胞和巨噬细胞。还阐述了TLR与促存活通路PI3K/Akt之间的交叉。

由于Toll样受体既在循环(炎性)细胞又在驻留(器官特异性)细胞上表达，因此，那些引起I/R损伤中有害效应的受体仍有待于处理。这个问题从临床角度考虑也非常重要，因为Toll样受体抑制可发生于全身和局部。全身性给药抗TLR2的OPN-301将既抑制循环细胞又抑制驻留细胞，但将需要较多的化合物。局部(即冠脉内)注射单克隆抗体主要抑制冠脉内皮细胞和心肌细胞上的TLR，需要的化合物较少。

该研究的目标是为了阐明通过给药OPN-301而降低梗塞面积的潜在过程。将研究对照组和实验组在炎症活性、凋亡和存活通路激活之间的差异。在两个时间点移出小鼠心脏进行免疫组化和细胞因子分析，以研究时间依赖性生物化学过程。嵌合小鼠实验将解决实质或循环细胞表达的TLR2对心肌再灌注损伤的相对贡献。此外，我们将利用磁共振成像(MRI)技术揭示该抗TLR单克隆抗体OPN-1对心功能的影响。

材料和方法

再灌注前5分钟，通过尾静脉给药10mg/kg的同种型对照或实验性抗TLR2OPN-301单克隆抗体(mAb)，每组6只小鼠。

处理组如下：

组别                     处理

1.媒剂对照               PBS

2.实验性mAb              10mg/kg OPN301

3.阴性对照               10mg/kg IgG同型对照

4.假手术                 PBS

5.嵌合体-全身性          10mg/kg OPN 301

6.嵌合体-心脏               10mg/kg OPN 30

再灌注后1、24和72小时处死小鼠，进行免疫组化、细胞因子和趋化因子分析。心肌缺血/再灌注损伤之前或之后，评价盐水处理、OPN-301抗TLR单克隆抗体处理及模拟手术小鼠中的心功能。

小鼠中缺血再灌注的步骤

C57/BL6小鼠(25-30g)经历了30分钟心肌缺血和24小时再灌注或模拟手术。简单来说，小鼠用Fentanyl-Dormicum-Domitor的混合物进行麻醉(如前所述)。按需要给药额外剂量以保持麻醉状态。小鼠进行插管并通100％氧气。缺血通过利用8-0丝缝线结扎左冠状动脉(LCA)而实现，其中一段PE-10管置于LCA正上方距正常定位的左心房顶端1mm的位置。阻塞30分钟后，通过解开结扎线并移开该PE-10插管而启动再灌注。在模拟手术的小鼠中，放置丝缝线但未结扎LCA。

小鼠在再灌注期保持麻醉状态1小时。其后，移出心脏并迅速用盐水冲洗。通过梗塞区将心脏切为2半：一半用福尔马林包埋用于免疫组化分析，并分离另一半的梗塞区与远端区域，并储存于液氮中用于分离蛋白RNA/cDNA。

在存活达24和72小时的小鼠中，解开结扎线后关闭胸壁，动物进行插管并通过采用37℃加热板保持体温。生存24和72小时后，在这些动物中重复上述终止过程。

免疫组化分析

为了进行免疫组化分析，将心脏于4％福尔马林溶液中固定过夜，并用石蜡包埋。切4μm切片，并用苏木素和伊红染色以评价形态及损伤征象。免疫组织学染色剂包括：抗小鼠MAC-3(#550292，Pharmingen，Clone M3/84，兔抗小鼠IgG1)，CD45抗体(#550539，Pharmingen，Clone 30-F11，兔抗小鼠IgG2b)和中性粒细胞特异性GR-1(#Ab34345，Abcam，Clone 7/4，兔抗小鼠IgG2a)。采用适当的独立二抗检测阳性结合。利用种属和同种型匹配的抗体检测对第一抗体的特异性。

核氧化应激利用一种特异于8-羟基-2`-脱氧鸟苷(8-OHdG)(一种DNA氧化应激的产物)的免疫染料进行评价。组织切片用10％正常马血清孵育30分钟，用0.1％PBSA 1∶20稀释的小鼠抗-8-OHdG(OXIS internat.，FosterCity，CA，USA)in 4℃孵育过夜，1∶500稀释的生物素标记马抗小鼠(VectorLab.，Burlingame，CA，USA)孵育1小时，并用1∶1000稀释的抗生物素蛋白链菌素-HRPO孵育1小时。最后，切片用H₂O₂-二氨基联苯胺四盐酸盐孵育10分钟。每片随机挑选4个视野(200倍放大)，用数字成像显微软件(Olympos，Munster，Germany)对8-OHdG阳性核进行定量。

细胞因子分析

通过检测关键生物学标志物TNF-α，IL-1b/6/8，ICAM-1和VCAM-1的表达。其他相关分析包括评估巨噬细胞炎性蛋白(MIP)、单核细胞化学引诱蛋白(MCP)-1和存活通路蛋白的磷酸化(例如MAPK，PI3K/Akt)。

总RNA按照制造商的说明书利用Tripure试剂(Roche)从梗塞和远端心肌中提取，转化为cDNA并进行定量逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)。利用来自uperarray Bioscience Corporation的引物在mRNA水平上测定TNFα，ICAM and VCAM。利用市售cytoflowmix multiplex array(BenderMedSystems)在蛋白水平测定MCP-1、白介素和MIP(通用参照Tripureisolation，Roche)。用OPN-301单克隆抗体抑制后，Akt磷酸化和TLR2蛋白的量将利用Western Blotting进行定量。

嵌合小鼠实验

通过用含10％FCS、100IU/ml青霉素和100ug/ml链霉素(InvitrogenCorp.)的无菌PBS冲洗股骨和胫骨而从雄性TLR2+/+或TLR2-/-小鼠收集总骨髓。为了确保受者的短期生存，通过一个40μm细胞过滤网在含10％FCS、青霉素和链霉素的PBS中挤压脾脏而获得雄性TLR2+/+或TLR2-/-小鼠同系基因型脾脏的单细胞悬液。雄性TLR2+/+和TLR2-/-小鼠在人计算机断层扫描中以7Gy的剂量进行致死性照射。照射后，将悬于无菌PBS中的5x10⁶个TLR2+/+或TLR2-/-骨髓细胞和2×10⁵TLR2+/+或TLR2-/-脾细胞注射入受照的受者小鼠尾静脉内。将该小鼠在微隔离笼中饲育6周，以完成供者骨髓的移入，其后诱导心肌的I/R损伤并在TTC染色24小时后测定梗塞面积。还可利用上文提到的免疫组化分析实施病理生理学评估。

磁共振成像

心肌缺血/再灌注损伤之前和其后28天，通过高分辨率磁共振成像(MRI，9.4T，Bruker，Rheinstetten，Germany)对心肌大小和功能实施连续评价。得到切片之间具有1.0mm间隔的长轴和短轴图像并用来计算舒张末期容积(EDV)、收缩末期容积(ESV)、心搏出量(SV)和心输出量(CO)，射血分数(EF)以100*(EDV-ESV)/EDV计算，而SV是EDV与ESV之间的绝对差。心输出量是1分钟内的总输出体积，计算为SV*平均每分钟心跳次数。所有MRI数据均利用Qmass数字成像软件(Medis，Leiden，theNetherlands)进行分析。

结果

我们将利用用于Windows v15.0的SPSS软件包进行数据分析和统计分析。

(i)梗塞后的MRI心功能

基线时不存在差异。梗塞后28天，用OPN-301抗TLR2单克隆抗体处理的小鼠心功能优于盐水处理，因为终末舒张和收缩体积(EDV、ESV)较低，且OPN-301处理的小鼠中心搏出量(SV)和射血分数(EF)较高。左心室(LV质量)在各组之间没有差别(这一点比较好，因为否则心脏增大时可能引起功能增强)。

然而，假手术组被排除了该分析，因为在基线时，它们与其他组差异太大，而不能用生物学变异解释。我们疑似可能与小鼠的不同批次/背景有关。我们将检验误差或者新订一批C57B16J小鼠进行模拟手术。

表7-分组统计：

表8(独立样本检验)

(ii)嵌合小鼠的实验结果

已证实嵌合是成功的。一只小鼠由于梗塞极低而被排除该分析。在两组中均观察到了梗塞面积降低。然而，血液中缺乏TLR2的小鼠降低更多。似乎TLR2阳性的循环细胞与再灌注损伤的相关性更强。由于样本量小，梗塞面积降低之间的差别未能达到显著性差异。

表9

表10(多重比较)

Dunnettt(2侧)

^*在.05的水平，平均值呈显著性差异。

Dunnettt检验将一个组作为对照，所有其他组均与其进行比较。

表9中示出的结果进一步在图10和11中进行阐释。图10示出了危险区占左心室的百分比(AAR_LV)。图11示出了梗塞面积占危险区的百分比(IS_AAR)。

本说明书中提到的所有文献均结合于此供参考。对于本领域中的熟练技术人员来说，对本发明所述实施例进行多种改良和变动将是显而易见的，而不背离本发明的范围。尽管本发明已结合特别优选的实施例进行了阐述，但应该理解如所声明的，本发明不应过分限于这些特殊实施例。事实上，对所述执行本发明的模式进行多种改良，对于本领域熟练技术人员来说是很明显的，也希望涵盖在本发明的范围内。

Claims (99)

1.一种降低缺血再灌注损伤中表现出的TLR2表达细胞或组织中Toll样受体2(TLR2)的一种或多种生物学活性的方法，包括：

使所述细胞或组织与TLR2活性或表达的拮抗剂相接触，拮抗剂的量足以降低该细胞或组织中的TLR2的一种或多种生物学活性。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述TLR2表达细胞或组织是与再灌注诱发的心脏炎性疾病相关的细胞或组织，该疾病选自由心肌缺血、缺血性心脏病、高血压性心肌缺血、充血性心力衰竭、组织缺血、器官缺血、急性冠状动脉综合征、肥大、脑梗塞、心肌梗塞、心律失常和缺血再灌注损伤(I/R)组成的组。

3.根据权利要求1或2中所述的方法，其中所述接触步骤在细胞裂解物、重组系统或培养的细胞中进行。

4.根据权利要求1或2中所述的方法，其中所述接触步骤在受体内存在的细胞或组织上进行。

5.根据权利要求4中所述的方法，其中所述受体是患有肾衰竭或肾病或者有患肾衰竭或肾病风险的人类患者。

6.根据前述任一权利要求中所述的方法，其中所述TLR2是人或鼠TLR2。

7.根据前述任一权利要求中所述的方法，其中所述TLR2拮抗剂结合于人TLR2。

8.根据前述任一权利要求中所述的方法，其中所述TLR2拮抗剂选自由蛋白、肽、拟肽、核酸、碳水化合物、脂质和小分子化合物组成的组。

9.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述TLR2拮抗剂是单克隆抗体。

10.根据权利要求8中所述的方法，其中所述TLR2拮抗剂是具有对TLR2的结合特异性的抗体。

11.根据权利要求10中所述的方法，其中所述抗体选自由人的、人源化的、嵌合的、合成的、骆驼科的、鲨鱼的或体外的抗体组成的组，所述抗体具有对TLR2的结合特异性，或者来自上述抗体中任何一种的结合片段。

12.根据权利要求10中所述的方法，其中所述抗体是抗体结合片段，选自由Fab，scFv，Fv，dAb和片段组成的组。

13.根据权利要求10中所述的方法，其中所述抗体分子包含两条完整的重链以及两条完整的轻链，或者它们的抗原结合片段。

14.根据前述任一权利要求中所述的方法，其中所述TLR2拮抗剂结合于由人TLR2胞外域确定的抗原表位。

15.根据权利要求1-13中任何一项所述的方法，其中所述TLR2拮抗剂结合于非连续性抗原表位，所述抗原表位包含源自人TLR2氨基酸序列中氨基和羧基末端的氨基酸残基。

16.根据权利要求14所述的方法，其中所述TLR2拮抗剂结合于TLR2上包含SEQ ID NO：1中氨基酸残基19-39或538-549的抗原表位。

17.根据权利要求14所述的方法，其中所述TLR2拮抗剂抑制编码TLR2蛋白的核酸的表达。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述TLR2拮抗剂选自由反义寡核苷酸、三螺旋分子、反义DNA、反义RNA、核酶、iRNA、miRNA、siRNA、shRNA分子组成的组。

19.一种用于缺血再灌注损伤或由缺血再灌注损伤所引起病症的治疗和/或预防的方法，所述方法包括下列步骤：

-提供治疗有效量的调节Toll样受体2功能的试剂，以及

-将所述化合物给药需要该治疗的受体。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述调节TLR2功能的试剂是TLR2拮抗剂。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述TLR2拮抗剂是结合化合物，选自由蛋白、肽、拟肽、核酸、碳水化合物、脂质和小分子化合物组成的组。

22.根据权利要求20所述的方法，其中所述TLR2拮抗剂是抗体或源自该抗体的结合片段。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述抗体选自由单克隆抗体、多克隆抗体或合成抗体组成的组。

24.根据权利要求22所述的方法，其中所述抗体选自包括针对人TLR2的人的、人源化的、骆驼科的、体外生成的抗体组成的组。

25.根据权利要求22所述的方法，其中所述抗体是一种同种型，选自由IgG，IgA，IgM和IgE组成的组。

26.根据权利要求22所述的方法，其中所述抗体以解离常数(Kd)pf为约10-7M至约10-11M结合TLR2上存在的抑制性抗原表位。

27.根据权利要求22所述的方法，其中所述抗体结合由人TLR2细胞外域确定的抗原表位。

28.根据权利要求22所述的方法，其中所述抗体结合包含源自人TLR2氨基酸序列的氨基和羧基末端的氨基酸残基的非连续性抗原表位。

29.根据权利要求22所述的方法，其中所述抗体结合TLR2上包含SEQID NO：1中氨基酸残基19-39或538-549的抗原表位。

30.根据权利要求22所述的方法，其中所述TLR2拮抗剂结合TLR2上包含SEQ ID NO：1中氨基酸残基19-39或538-549的抗原表位。

31.根据权利要求19所述的方法，其中所述TLR2调节剂是可溶形式的重组Toll样受体2。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述可溶形式的TLR2是包含TLR2蛋白的胞外域的融合蛋白，所述TLR2蛋白的胞外域包含连接于次级蛋白的SEQ ID NO：3氨基酸序列。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述次级蛋白是抗体的Fc区域或其片段。

34.根据权利要求19所述的方法，其中所述TLR2调节剂是抑制TLR2基因产物表达的抑制性核酸。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述抑制性核酸选自由反义寡核苷酸、三螺旋分子、反义DNA、反义RNA、核酶、iRNA、miRNA、siRNA和shRNA组成的组。

36.根据权利要求19所述的方法，其中将所述TLR2调节剂给药受体以降低或抑制心肌的TLR2表达细胞或组织中的一种或多种TLR2生物学活性，从而治疗疾病。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述缺血再灌注损伤是由于至少一种选自由受体缺氧、中风、心脏病发作、慢性肾衰或器官移植组成的组的疾病。

38.根据权利要求19所述的方法，其中所述TLR2是人TLR2或鼠TLR2。

39.根据权利要求19所述的方法，进一步包括给药治疗有效量的至少一种次级治疗化合物的步骤，所述次级治疗化合物是免疫抑制化合物。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述次级治疗化合物选自由糖皮质激素、细胞生长抑制药、抗代谢药、抗CD2抗体或相关的结合片段、抗CD20抗体、抗抗体TNF-α抗体，环孢霉素A、他克莫司，西罗莫司或FTY720组成的组。

41.根据权利要求39所述的方法，其中所述次级治疗化合物选自由HMG-CoA还原酶抑制剂、扩血管剂、利尿剂、血管紧张素转化酶抑制剂、β-阻滞剂、血管紧张素II受体拮抗剂、钙通道阻滞剂、抗凝血剂、二磷酸腺苷受体拮抗剂如噻氯匹啶或氯吡格雷重磷酸盐、糖蛋白IIb/IIIa受体拮抗剂如比伐卢定、阿戈托班或肝素、β-肾上腺素能受体激动剂、抗血栓药、抗氧化剂和α阻滞剂组成的组。

42.根据权利要求39所述的方法，其中所述试剂与次级治疗化合物同时给药。

43.根据权利要求39所述的方法，其中所述试剂与次级治疗化合物依次给药。

44.根据权利要求39所述的方法，其中所述试剂与次级治疗化合物的给药分别进行。

45.根据权利要求19所述的方法，其中所述TLR2调节化合物在受体接受外科手术之前、期间或之后预先给药该受体，所述外科手术选自由血管成形术、心脏搭桥术、溶栓术、动脉内膜切除术、器官移植和冠状动脉搭桥术(CABG)组成的组。

46.根据权利要求19所述的方法，其中所述方法在细胞或组织内发生缺血事件之前、期间或之后在受体身上实施。

47.根据权利要求19所述的方法，其中所述方法在再灌注发生期间或之后在受体身上实施。

48.根据权利要求19所述的方法，其中所述方法在急性窗口期在受体身上实施，所述急性窗口期于缺血事件后在临床上确定。

49.一种用于缺血再灌注损伤或缺血再灌注损伤相关病症治疗和预防中的药物组合物，包含一种调节Toll样受体2功能或表达的试剂以及至少一种药学可接受的载体、稀释剂、助溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。

50.根据权利要求49所述的药物组合物，其中所述TLR2调节剂是一种TLR2拮抗剂化合物，选自由多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体或抗体片段、适配体、融合蛋白和拟肽组成的组。

51.根据权利要求50所述的药物组合物，其中所述TLR2调节剂是可溶形式的TLR2受体。

52.根据权利要求50所述的药物组合物，其中所述TLR2调节剂是抑制TLR2表达的基于抑制性核酸的化合物。

53.根据权利要求50所述的药物组合物，其中所述组合物还包括次级治疗化合物。

54.根据权利要求53所述的药物组合物，其中所述次级治疗化合物是免疫抑制剂，选自由糖皮质激素、细胞生长抑制药、抗代谢药、抗CD2抗体或相关的结合片段、抗CD20抗体、抗TNF-α抗体，环孢霉素A、他克莫司，西罗莫司或FTY720组成的组。

55.根据权利要求53所述的药物组合物，其中所述次级治疗化合物是心血管治疗药，选自由HMG-CoA还原酶抑制剂、扩血管剂、利尿剂、血管紧张素转化酶抑制剂、β-阻滞剂、血管紧张素II受体拮抗剂、钙通道阻滞剂、抗凝血剂、二磷酸腺苷受体拮抗剂如噻氯匹啶或氯吡格雷重磷酸盐、糖蛋白IIb/IIIa受体拮抗剂如比伐卢定、阿戈托班或肝素、β-肾上腺素能受体激动剂、抗血栓药、抗氧化剂和α阻滞剂组成的组。

56.一种用于治疗或预防心脏病或与心脏病相关疾病症状的方法，该方法包括以下步骤：

-提供治疗有效量的调节Toll样受体2功能的试剂，以及

-将所述化合物给药需要该治疗的受体。

57.根据权利要求56所述的方法，其中所述心脏炎性病症选自由心肌缺血、缺血性心脏病、高血压性心肌缺血、充血性心力衰竭、组织缺血、器官缺血、急性冠状动脉综合征、肥大、脑梗塞、心肌梗塞、心律失常和缺血再灌注损伤(I/R)组成的组。

58.根据权利要求56所述的方法，其中所述调节TLR2功能的试剂是TLR2拮抗剂。

59.根据权利要求58所述的方法，其中所述TLR2拮抗剂是结合化合物，选自由蛋白、肽、拟肽、核酸、碳水化合物、脂质和小分子化合物组成的组。

60.根据权利要求56所述的方法，其中所述TLR2调节剂是可溶形式的重组Toll样受体2。

61.根据权利要求60所述的方法，其中所述可溶形式的TLR2是包括连接于次级蛋白的TLR2蛋白上的胞外域的融合蛋白。

62.根据权利要求60所述的方法，其中所述次级蛋白是抗体的Fc区或其片段。

63.根据权利要求56所述的方法，其中所述TLR2调节剂是抑制TLR2蛋白表达的抑制性核酸。

64.根据权利要求63所述的方法，其中所述抑制性核酸选自由反义寡核苷酸、三螺旋分子、反义DNA、反义RNA、核酶、iRNA、miRNA、siRNA和shRNA组成的组。

65.根据权利要求58所述的方法，其中所述TLR2拮抗剂是抗体或源自该抗体的结合片段。

66.根据权利要求58所述的方法，其中所述抗体选自由单克隆抗体、多克隆抗体或合成抗体组成的组。

67.根据权利要求56所述的方法，进一步包括给药次级治疗剂的步骤。

68.根据权利要求67所述的方法，其中所述次级治疗剂是免疫抑制剂化合物，选自由糖皮质激素、细胞生长抑制药、抗代谢药、抗CD2抗体或相关的结合片段、抗CD20抗体、抗TNF-α抗体，环孢霉素A、他克莫司，西罗莫司或FTY720组成的组。

69.根据权利要求67所述的方法，其中所述次级治疗剂化合物是心血管治疗药，选自由HMG-CoA还原酶抑制剂、扩血管剂、利尿剂、血管紧张素转化酶抑制剂、β-阻滞剂、血管紧张素II受体拮抗剂、钙通道阻滞剂、抗凝血剂、二磷酸腺苷受体拮抗剂如噻氯匹啶或氯吡格雷重磷酸盐、糖蛋白IIb/IIIa受体拮抗剂如比伐卢定、阿戈托班或肝素、β-肾上腺素能受体激动剂、抗血栓药、抗氧化剂和α阻滞剂组成的组。

70.根据权利要求67所述的方法，其中所述试剂与所述次级治疗剂同时、独立或依次给药。

71.一种调节Toll样受体2功能或表达的试剂在制备治疗再灌注损伤的药剂中的用途。

72.根据权利要求71所述的用途，其中所述再灌注损伤进一步引起至少一种病症，所述病症选自由心肌缺血、缺血性心脏病、高血压性心肌缺血、充血性心力衰竭、组织缺血、器官缺血、急性冠状动脉综合征、肥大、脑梗塞、心肌梗塞、心律失常和缺血再灌注损伤(I/R)组成的组。

73.根据权利要求71所述的用途，其中所述试剂选自由蛋白、肽、拟肽、核酸、碳水化合物、脂质和小分子化合物组成的组。

74.根据权利要求71所述的用途，其中所述试剂是具有人TLR2结合特异性的抗体。

75.根据权利要求74所述的用途，其中所述抗体选自由人的、人源化的、嵌合的、合成的、骆驼科的、鲨鱼的或体外的抗体组成的组，所述抗体具有对TLR2的结合特异性，或者来自上述抗体中任何一种的结合片段。

76.根据权利要求74所述的用途，其中所述抗体是抗体结合片段，选自由Fab、scFv、Fv、dAb和片段组成的组。

77.根据权利要求74所述的用途，其中所述抗体分子包括两条完整重链和两条完整轻链，或者它们的抗原结合片段。

78.根据权利要求71所述的用途，其中所述试剂是TLR2拮抗剂，结合于由人TLR2胞外域确定的抗原表位。

79.根据权利要求71所述的用途，其中所述试剂是TLR2拮抗剂，结合于一个非连续性抗原表位，所述抗原表位包含源自人TLR2氨基酸序列中氨基和羧基末端的氨基酸残基。

80.根据权利要求71所述的用途，其中所述试剂是TLR2拮抗剂，结合于TLR2上包含SEQ ID NO：3中氨基酸残基19-39或538-549的抗原表位。

81.根据权利要求71所述的用途，其中所述试剂抑制编码该TLR2蛋白的核酸表达。

82.根据权利要求71所述的用途，其中所述试剂选自由反义寡核苷酸、三螺旋分子、反义DNA、反义RNA、核酶、iRNA、miRNA、siRNA、shRNA分子组成的组。

83.根据权利要求71所述的用途，其中所述试剂是可溶形式的Toll样受体2。

84.根据权利要求73所述的用途，其中所述可溶形式的Toll样受体2包含如SEQ ID NO：5中所定义的氨基酸序列。

85.一种调节Toll样受体2功能或表达的用于治疗再灌注损伤的试剂。

86.根据权利要求85所述的试剂，其中所述再灌注损伤来自于至少一种病症，所述病症选择由心肌缺血、缺血性心脏病、高血压性心肌缺血、充血性心力衰竭、组织缺血、器官缺血、急性冠状动脉综合征、肥大、脑梗塞、心肌梗塞、心律失常和缺血再灌注损伤(I/R)组成的组。

87.根据权利要求85所述的试剂，其中所述试剂选自由蛋白、肽、拟肽、核酸、碳水化合物、脂质和小分子化合物组成的组。

88.根据权利要求85所述的试剂，其中所述试剂是具有人TLR2结合特异性的抗体。

89.根据权利要求88所述的试剂，其中所述抗体选自由人的、人源化的、嵌合的、合成的、骆驼科的、鲨鱼的或体外的抗体组成的组，所述抗体具有对TLR2的结合特异性，或者来自上述抗体中任何一种的结合片段。

90.根据权利要求88所述的试剂，其中所述抗体是抗体结合片段，选自由Fab、scFv、Fv、dAb和片段组成的组。

91.根据权利要求88所述的试剂，其中所述抗体分子包括两条完整重链和两条完整轻链，或者它们的抗原结合片段。

92.根据权利要求88所述的试剂，其中所述试剂是TLR2拮抗剂，结合于由人TLR2胞外域确定的抗原表位。

93.根据权利要求88所述的试剂，其中所述试剂是TLR2拮抗剂，结合于一个非连续性抗原表位，所述抗原表位包含源自人TLR2氨基酸序列中氨基和羧基末端的氨基酸残基。

94.根据权利要求88所述的试剂，其中所述试剂是TLR2拮抗剂，结合于TLR2上包含SEQ ID NO：3中氨基酸残基19-39或538-549的抗原表位。

95.根据权利要求85所述的试剂，其中所述试剂抑制编码该TLR2蛋白表达的核酸表达。

96.根据权利要求85所述的试剂，其中所述试剂选自由反义寡核苷酸、三螺旋分子、反义DNA、反义RNA、核酶、iRNA、miRNA、siRNA、shRNA分子组成的组。

97.根据权利要求85所述的试剂，其中所述试剂是可溶形式的Toll样受体2。

98.根据权利要求87所述的试剂，其中所述可溶形式的Toll样受体2包含如SEQ ID NO：3中所定义的氨基酸序列。

99.一种用于鉴定可抑制Toll样受体2所介导炎症及再灌注期间或之后相关的细胞、组织或器官损伤的化合物的筛查方法，所述方法包括：

-提供膜结合Toll样受体2受体以及对其具有结合特异性的配体，

-将候选化合物与Toll样受体2相接触，

-Toll样受体2暴露于Toll样受体2配体，

-测定Toll样受体2配体与Toll样受体2的结合，

其中，所述Toll样受体2与所述Toll样受体2配体结合的抑制表明，所述候选化合物是Toll样受体2激活和信号传导的调节剂。

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