CN103589727B - 抑制人免疫细胞TLR2基因表达的siRNA及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种抑制人免疫细胞TLR2基因表达的siRNA，所述的siRNA的正义链序列为5’-CUUGACCUGUCCAACAACAUU-3’，反义链序列为3’-UUGAACUGGACAGGUUGUUGU-5’。本发明能够明显地抑制人免疫细胞的TLR2基因的表达，由于TLR2受体介导多种细菌或病毒感染，因此，本发明合成的siRNA能够应用于生物药物制剂，植入细菌或病毒感染的病人，治疗细菌性或病毒性感染疾病，提高人体的免疫力。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学与生物医药技术领域，具体是一种抑制人免疫细胞TLR2基因表达的siRNA及其应用。
背景技术
RNA干扰能够简单、有效、特异地下调细胞中基因的表达，作为调节细胞功能的有力工具，其能够直接参与机体细胞功能的调节，为机体细胞特异性基因治疗提供了新的技术手段。而TLR2（Toll-like receptor2）作为一类模式识别受体(Pattern recognition receptor，PRR)，参与生物体天然免疫系统对病原体的识别，在机体通过免疫应答抗病毒感染中发挥重要的作用。目前尚未有针对TLR2设计siRNA来抑制TLR2的表达，以达到治疗某种细菌感染性疾病或病毒性疾病的公开报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抑制人免疫细胞TLR2基因表达的siRNA及其应用，通过设计并合成小分子RNA干扰来抑制人免疫细胞TLR2基因的表达，且设计合成的小分子RNA能够应用于病毒性或细菌感染性疾病的基因治疗中。
本发明实现上述目的所采取的技术方案是：
一种抑制人免疫细胞TLR2基因表达的siRNA，所述的siRNA的正义链序列为5’-CUUGACCUGUCCAACAACAUU-3’，反义链序列为3’-UUGAACUGGACAGGUUGUUGU-5’。
本发明还提供所述的siRNA在抑制人免疫细胞TLR2基因的表达中的应用。
本发明具有的有益效果是：所述的抑制人免疫细胞TLR2基因的表达的siRNA具有重大价值，能够明显地抑制人免疫细胞的TLR2基因的表达，由于TLR2受体介导多种细菌或病毒感染，因此，本发明合成的siRNA能够应用于生物药物制剂，植入细菌或病毒感染的病人，则能够治疗细菌性或病毒性感染疾病，提高人体的免疫力。
附图说明
图1为10×10倍镜下观察到的分化后的人-单核巨噬细胞结构图。
图2为10×20倍镜下观察到的分化后的人-单核巨噬细胞结构图。
图3为10×10倍镜下观察到的人MT4淋巴细胞结构图。
图4为10×20倍镜下观察到的人MT4淋巴细胞结构图。
图5和图6为本发明所述的siRNA转染到分化的人-单核巨噬细胞和人MT4淋巴细胞后，TLR2基因表达的荧光定量曲线图。
图7为TLR2表达扩增后的电泳图。
图8为人-单核巨噬细胞与MT4淋巴细胞转染siRNA后TLR2蛋白的表达图。
图9为人-单核巨噬细胞与MT4淋巴细胞转染siRNA后TLR2/β-actin的灰度比值图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用到的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
试验材料如下：
siRNA合成：英骏生物技术有限公司。
人-单核巨噬细胞：贴壁生长，从健康人外周血分离单核巨噬细胞，培养7-10天分化成巨噬细胞。
人MT4淋巴细胞：悬浮、成团生长，由中国军科院细胞实验室惠赠。
Lipofectamine2000：购自Invitrogen，Cat No：11668-019。
荧光定量PCR仪:购自美国伯乐公司，Cat No：CFX35。
逆转录试剂盒：TaKaRa公司，Cat No：DDR37
荧光定量试剂盒：TaKaRa公司，Cat No：DDR081
实施例1：siRNA分子的设计与合成
设计体外合成21nt siRNA的方法是：在基因库中寻找TLR2基因的mRNA序列，并从起始密码后的第75位碱基开始寻找AA+N19+UU序列或AA+N19序列，其中N19为任意19nt的mRNA核苷酸序列；然后设计选定序列中的G+C的比例为30％～70％；对确定的序列用Blast搜寻EST基因库，确定所靶向的基因是惟一的；设计21个反义RNA序列，并用化学合成方法合成RNA链。将由21个核苷酸合成的siRNA分别转染人单核巨噬细胞与MT4淋巴细胞，作用于TLR2基因，使这些基因的表达均受到明显的抑制。
设计出的siRNA的正义链序列为5’-CUUGACCUGUCCAACAACA UU-3’，反义链序列为3’-UU GAACUGGACAGGUUGUUGU-5’。
把设计出的siRNA由生物合成公司invitrogen合成，使用化学合成方法，不做任何碱基、荧光或特殊修饰。
实施例2：人-单核巨噬细胞分离和培养
1.经对象同意后，采集健康成年人外周血50ml，准备50ml离心管2支，每支加入20ml Ficoll分离液（GE Healthcare，Lot：10077202），每管加入25ml健康成年人外周血。600g/min，4℃离心46分钟。
2.在离心过程中，往明胶培养瓶里加入10ml新鲜的DMEM（Gibco，Lot：8112379），37℃培养箱放置45分钟。
3.从分层界面把细胞移到（包含Ficoll在内）无菌的试管里。
4.从明胶培养瓶内抽去DMEM，然后往培养瓶里加入6-10ml的细胞，加入等量的新鲜的DMEM。放到37℃培养箱里培养60分钟。目的是从明胶培养瓶里分离出单核细胞。
5.用新鲜的DMEM清洗明胶培养瓶6-7次，直到在显微镜下观察不到可移动的细胞（淋巴细胞）为止，在最后一次清洗时尽可能抽完所有的DMEM。
6.加入5ml新鲜的DMEM和5ml10mM EDTA（Solarbio，Cat No：E1170），加入FBS（Gibco，Lot：989267）使其浓度为20%。把培养瓶平放于37℃培养箱里培养15分钟。
7.从培养箱里拿出培养瓶，镜下观察细胞分离情况，用手拍拍瓶子4-6次。用移液管把细胞移进50ml的离心管里，并加入10ml的DMEM来洗遗留下的细胞，把清洗后的液体倒进刚才装细胞的离心管里。2000转/分钟，4℃离心10分钟。
8.在管底得到细胞的片状沉淀物，去掉上清。加入1ml含10%FBS的DMEM到装有片状沉淀物的离心管里，用枪混匀，避免产生气泡，再加入1ml同样的DMEM。
9.取20ul单核细胞溶液和20ul的台盼蓝液混匀，即1：1稀释，在细胞计数器里计数。每毫升单核细胞液1：1稀释的公式=16个小格子的细胞数量×2×104。
10.加入10%FBS的DMEM使每孔细胞数为25×104（48孔板，Costar，Lot：06111004）。
11.培养7天以使单核细胞分化。10×10倍镜下观察到的分化后的人-单核巨噬细胞结构图如图1所示。10×20倍镜下观察到的分化后的人-单核巨噬细胞结构图如图2所示。
实施例3：人MT4淋巴细胞复苏与培养
1.从液氮中取出细胞株，置于37℃水浴到完全融化，立即将细胞液移到15ml离心管，并加入8ml含10%FBS的RPMI-1640培养液（Gibco，Lot：8113085），1600转/分钟，离心6分钟。
2.倒弃上清，加入1ml含10%FBS的RPMI-1640培养液，轻轻吹打，混匀细胞沉淀后，移到75cc细胞培养瓶中，加入15ml含10%FBS的RPMI-1640培养液。
3.37℃、5%CO2的培养箱进行培养，完成复苏。
4.次日进行换液，步骤：首先将培养瓶倾斜7分钟，此时细胞会沉淀在底部，然后去掉上层培养液约14ml，再加入20ml含10%FBS的RPMI-1640新培养液。
5.期间换液一次，步骤同上。
6.待细胞生长四天，此时细胞已成熟、数量多，换液，此时加入10ml新培养液，将细胞吹打混匀后对其进行计数。
7.取20ul单核细胞溶液和20ul的台盼蓝液混匀，即1：1稀释，在细胞计数器里计数。每毫升单核细胞液1：1稀释的公式=16个小格子的细胞数量×2×104。
8.种板：每孔细胞数为40×104（6孔板，Costar，Lot：3516），培养两天后进行转染。10×10倍镜下观察到的分化后的人MT4淋巴细胞结构图如图3所示。10×20倍镜下观察到的分化后的人MT4淋巴细胞结构图如图4所示。
实施例4：siRNA转染至人-单核巨噬细胞
待单核细胞分化为巨噬细胞的比率达到或大于80%，可进行转染。
1.转染前1天，将原48孔板中细胞的培养液去掉，重新换为250ul不含抗生素（链霉素、青霉素），而含10%FBS的DMEM培养液，过夜。
2.用50ul Opti-MEM低血清培养基（Gibco，Lot：1161191）稀释20pmol siRNA，轻轻混匀；
3.按1ul Lipofectamine2000：50ul Opti-MEM培养基比例配置混合液共51ul，室温孵育5分钟。
4.将前两步所得的混合液再进一步混合，则可称之为转染液，轻轻混匀，室温放置20分钟。
5.将转染液加入一个细胞孔中，轻轻摇匀。转染18h后将培养液换成含双抗10%FBS的DMEM培养液。
6.37℃，5%CO2条件下培养72小时后，收细胞提取RNA，接着检测基因表达。
7.设立6-羧基荧光素标记的siRNA(NC-FAM)为阴性对照组。操作同上。转染到分化的人-单核巨噬细胞后，人-单核巨噬细胞TLR2基因表达的荧光定量曲线图如图5和图6所示。
实施例5：siRNA转染至人MT4淋巴细胞
1.转染前1天，将原6孔板中细胞的培养液去掉，重新换为1ml不含抗生素（链霉素、青霉素），而含10%FBS的1640培养液，过夜。
2.用400ul Opti-MEM低血清培养基（Gibco，Lot：1161191）稀释80pmolsiRNA，轻轻混匀；
3.按1ul Lipofectamine2000：50ul Opti-MEM培养基比例配置混合液共204ul，室温孵育5分钟。
4.将前两步所得的混合液再进一步混合，则可称之为转染液，轻轻混匀，室温放置20分钟。
5.将转染液加入一个细胞孔中，轻轻摇匀。转染18h后将培养液换成含双抗10%FBS的1640培养液。
6.37℃，5%CO2条件下培养72小时后，收细胞提取RNA，接着检测基因表达。
7.设立6-羧基荧光素标记的siRNA(NC-FAM)为阴性对照组。操作同上。转染人MT4淋巴细胞后，人MT4淋巴细胞TLR2基因表达的荧光定量曲线图如图5和图6所示。
实施例6：TLR2受体表达测定，即siRNA抑制率测定。
1.按以下比例配制单样品逆转录反应液（冰上操作）。
2.逆转录反应条件：37℃15min，85℃5s，一个循环，4℃下保存。此步骤后我们得到cDNA模板。
3.按以下比例配制单孔PCR反应液（冰上操作，每样品设立重复孔）。
4.PCR扩增条件：95℃30s预变性，95℃3s变性，60℃30s退火及延伸，每个循环到此进行拍照，40个循环后，再于95℃15s、60℃1min、95℃15s条件溶解。电泳图如图7所示，其中GAPDH基因的扩增片段长度为127bp，TLR2基因的扩增片段长度为300bp。
5.采用实时荧光定量PCR分析程序分析CT值，然后计算同一样品其相应△CT值，一次实验取两孔的平均CT值，TLR-2基因CT值减去内参GAPDH的CT值即为△CT。以2-△CT表示各基因mRNA的相对表达量，siRNA TLR2基因抑制率（RNAi%）=（1-siRNA组2-△CT/阴性组2-△CT）×100%，结果以X±SD表示。如表1和表2所示。
表1：siRNA分子抑制人-单核巨噬细胞TLR2表达的抑制率结果
表2：siRNA分子抑制人MT4淋巴细胞TLR2表达的抑制率结果
表1和表2中，阴性对照组siRNA（NC-FAM）：其正义链序列为5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反义链序列为3’-TTAAGAGGCUUGCACAGUGCA-5’；由生物合成公司Invitrogen提供。
实施例7：TLR2mRNA蛋白水平检测
通过Western blot法检测人-单核巨噬细胞与MT4细胞转染siRNA后TLR2蛋白的表达。与阴性对照组比较，三次重复实验siRNA组的TLR2蛋白水平明显降低，差异有统计学意义（P<0.05），人-单核巨噬细胞与MT4细胞转染siRNA后TLR2蛋白的表达图如图8所示；人-单核巨噬细胞与MT4细胞转染siRNA后TLR2/β-actin的灰度比值图如图9所示。
Claims (2)
1.一种抑制人免疫细胞TLR2基因表达的siRNA，其特征在于，所述的siRNA的正义链序列为5’-CUUGACCUGUCCAACAACAUU-3’，反义链序列为3’-UU GAACUGGACAGGUUGUUGU-5’。
2.权利要求1所述的siRNA在制备用于抑制人免疫细胞TLR2基因表达药物的应用。
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