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Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种驴的miRNA序列、制备方法及其应用。该miRNA序列为SEQ ID NO：1所示的序列，本发明中的miRNA序列通过特异性结合到mRNA的相应部位，影响相应mRNA的转录作用，从而影响ACADVL基因的表达。

Description

驴的miRNA序列、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种驴的miRNA序列、制备方法及其应用。
背景技术
微小RNA(MicroRNAs，简称miRNA)是一组不编码蛋白质的短序列单链RNA，长约22nt。miRNA基因主要单个或成簇地位于基因组的非编码区内。目前人们已经发现的miRNA约为数千个，大部分功能未知。据目前的研究显示，miRNA通过不完全碱基互补的方式与mRNA相应的区域结合，从而抑制蛋白质的翻译；在某些植物中，其还可以降解mRNA。通常一个基因可以被多个miRNA所调节，同时一个miRNA也可以调节多个mRNA。
miRNA表达具有高度的保守性、时序性和组织特异性。研究表明miRNA参与了几乎所有的生命活动，并起着重要作用，在动物中，包括：细胞发育、造血、脂肪代谢、器官生成、凋亡、细胞增殖与分化及肿瘤的发生。此外，在某些病毒中也发现有miRNA表达。
在动物细胞中，转录形成的miRNA的前体首先折叠成茎环结构，然后在DCL1的作用下剪切形成成熟的miRNA。在不同的动物组织、器官和不同的发育时期，miRNA的表达谱是不同的，对miRNA表达谱的研究对miRNA生物功能的研究起到巨大的推动作用。
尽管目前已经在生物体中发现了一些miRNA，然而这些miRNA仅占生物体存在的miRNA中相当少的一部分，并且研究人员对于这些miRNA的功能还了解很少。
综上所述，本领域迫切需要提供一种miRNA，以研究miRNA对生物体的调节作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种驴的miRNA序列，这种miRNA能够特异性结合到mRNA的相应部位，影响相应mRNA的转录作用，从而影响相应基因的表达。
为解决上述技术问题，本发明的实施方式提供了一种驴的miRNA序列，该miRNA序列的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的序列。
本发明的实施方式还提供了一种制备上述驴miRNA序列的方法，该方法包含以下步骤：1)取驴各个部位的若干离体组织分别放入若干个容器中，并将温度调节至：-60～-100℃；形成若干个样品组织1；2)取步骤1中样品组织1，在液氮环境中研磨，放置于若干个容器中；并加入1～3ml的总RNA抽提试剂，混合均匀后，调节温度至30～40℃孵育5～15min；调节温度至2～6℃并离心分离5～15min，取上清液加氯仿混合均匀后静置，形成若干个样品组织2；3)调节步骤2中样品组织2的温度至2～6℃，离心分离10～20min，并加入异丙醇，放置15～20min；形成若干个样品组织3；4)调节步骤3中样品组织3的温度至2～6℃，离心分离5～15min后去除上清液并洗涤沉淀；形成若干个样品组织4；5)调步骤4中样品组织4的温度至2～6℃，离心分离1～5min，室温放置，并加入15～50ul无菌无酶水，混合均匀；形成若干个样品组织5；6)取适量的步骤5中样品组织5构建Micro RNA文库；并通过测序平台测序，将测序得到的序列进行转化、处理后，即得若干个待分析纯净序列数据；7)将步骤6中待分析纯净序列数据与若干个核苷酸序列数据库进行比对，去除重复序列和干扰片段；即得通过比对的miRNA序列；8)将步骤7中通过比对的miRNA序列与数据库中的miRNA前体进行比对筛选；即得未通过比对的miRNA序列；9)将步骤8中未通过比对的miRNA序列与已知的驴基因组序列进行比对，筛选得到若干个miRNA序列；10)对步骤9中的miRNA序列进行靶基因预测；即得SEQ ID NO：1所示的序列。
本发明的实施方式还提供了一种将驴的miRNA序列用于制备抑制目的基因表达的组合物。
本发明实施方式相对于现有技术而言，通过特异性结合到mRNA的相应部位，影响相应mRNA的转录作用，从而影响ACADVL基因的表达。
进一步地，步骤1中取驴的心、肝、脾、肺、肾、脑、骨髓以及肌肉的离体组织。
进一步地，步骤2中调节温度至4℃，离心分离器的转速为：12000r/分钟，离心时间：10分钟。
进一步地，步骤2中的总RNA抽提试剂为Trizol试剂，每加入1ml的Trizol试剂相应加入0.2ml的氯仿，涡旋混匀15秒静置。
进一步地，步骤4中用75％乙醇进行洗涤沉淀，其中，每使用1ml Trizol试剂至少使用1ml 75％的乙醇。
进一步地，步骤5中调节步骤4中样品组织4的温度至2～4℃，离心分离2～4min，室温放置2～3min。
进一步地，步骤6中的各个样品组织5等量混合后RNA分子完整数大于7、浓度不小于100ng/ul、总量大于10ug。
进一步地，步骤6中的测序平台为Hiseq 2000测序平台。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方案。
本发明的第一实施方式涉及一种驴的miRNA序列，该miRNA序列的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的序列。
在本实施方式中，制备该miRNA序列的详细步骤如下：
1.样品采集
我们采取了一头驴的8个组织样：心、肝、脾、肺、肾、脑、骨髓、肌肉。将所取的组织放入无核糖核酸酶(RNase)的Eppendorf管中，立即投入液氮中，带回实验室后转移保存在-80℃冰箱，用于提取Total RNA与后续分析。
2.Total RNA的提取与质量评估
1)在经过液氮预冷的研钵里加入100mg组织样品，同时加入少许液氮，并迅速将样品研磨成粉末，然后转移至1.5mL的离心管；
2)加入1ml Trizol(一种总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA)并混匀做匀浆处理，为了让核酸蛋白质复合物彻底分离，室温孵育10min；
3)4摄氏度12000r/分钟离心10分钟，取上清；
4)每加入1ml Trizol相应加入0.2ml氯仿，涡旋混匀15秒，室温静置3分钟；
5)调节温度至4摄氏度，离心，调节离心的转速：12000r/分钟，离心15分钟分层后，(由于RNA主要集中在水层，取上层无色水相)并转移到新管中；
6)在水相中加入等体积的异丙醇，混匀，室温放置15-20分钟；
7)调节温度至4摄氏度，离心，调节离心的转速：12000r/分钟，离心10分钟，去除上清液；
8)加入1ml 75％乙醇洗涤沉淀，每使用1ml Trizol使用1ml75％乙醇；
9)调节温度至4摄氏度，离心，调节离心的转速：12000r/分钟，离心3分钟，倒出液体，剩余少量液体，短暂离心，吸出液体。室温放置2-3分钟，加入15-50ul无菌无酶水，混匀，溶解RNA；
10)用1％的琼脂糖凝胶电泳,检验总RNA的完整性。
具体步骤如下：取5μL总RNA与上样缓冲液(Loading Buffer)充分混匀后用1％的琼脂糖凝胶电泳在140V恒压电泳进行检测，高压快速电泳，在较短的时间内(20分钟切断电源)使RNA电泳完毕，防止RNA降解，由此来检验总RNA的完整性。结果显示，28S和18S两条亮带比较清晰，5s条带非常模糊，说明提取的样品RNA降解率较低，完整性较好，质量也较好。
利用紫外光分光光度仪分别测定样品在260nm和280nm的光密度及RNA的纯度和浓度，各样品测定结果如表1所示，均符合相关标准(纯度检测标准为，如果OD值260/280在1.8-2.0之间,260/230的值大于2.0，则说明没有DNA和蛋白的污染)。
表1：
其中，OD260/OD280、OD260/OD230代表RNA质检参数，260、280、320、230nm下的吸光度分别代表了核酸、蛋白质、盐浓度和有机溶剂的值。
3.Micro RNA文库制备与测序
每个组织样品取3μg total RNA等量混合后构建Micro RNA(miRNA)文库，动物组织样品构建MiRNA文库之前，所有样品等量混合后的RNA分子完整数(RNA integritynumber)要保证至少为7，浓度≥100ng/ul，且总量大于10ug，满足所有要求之后才可以构建文库。
值得注意的，在本实施方式中，构建Micro RNA文库的步骤如下：首先利用miRNA3′端羟基的特点加3′端接头，终止反应后，再加5′端接头，使用反转录随机引物与反转录酶合成cDNA第一链，然后用引物做12个PCR扩增循环，电泳之后切胶回收PCR产物并纯化，利用Agilent2100精确检测文库浓度和质量。检测合格后，在cBot上生成簇(Cluster)，通过Hiseq2000测序平台得到50bp的单端测序reads。
4.测序数据的质量控制
测序得到的原始图像数据经base calling转化为序列数据，称之为raw data或raw reads。随后对这些raw reads进行质量控制，得到纯净序列，称为clean reads。利用IIIumina Hiseq 2000对上述驴的miRNA文库测序，一共得到了45,947,065条raw reads。对原始序列进行去除低质量reads，5’接头及3’接头等过滤，得到44,033,167条clean reads。clean reads所占的比例分别为95.83％，反映了本实验的测序质量较高。
对miRNA数据库样品的纯净序列进行了长度统计。结果显示，测序所得序列长度主要集中在21-23nt左右，占纯净序列总量90％以上，符合Dicer酶切割产物的长度。
5.参考序列比对
通过将上述实验样品中的clean reads与miRNA、Genbank、Rfam等数据库比对，去除样品中的重复序列、rRNA、tRNA、snoRNA、snRNA及mRNA外显子内含子等干扰片段。将得到的miRNA与miRBase19.0中的miRNA前体进行了比对，能够比对上的序列有20,203,532。
6.各样品中新miRNA预测统计
值得注意的是，在本实施方式中，并非所有的片段都能比对到数据库中，有一些片段，在数据库中没有记录，同时又具有一定的结构功能，这样的miRNA片段称之为新的miRNA。应用mireap程序，在已知家驴基因组的辅助下，从测序所得的序列中预测miRNA，筛选出新的miRNA。我们一共鉴定出了133个的miRNA。
7.miRNA靶基因预测
为了获取这些miRNA的生物学功能，对所获得的新的miRNA进行了靶基因预测。应用软件miranda程序，以驴基因组为目标序列进行靶基因预测。得到其中一个miRNA序列即为SEQ ID NO：1所示的序列，将其命名为序列eas-m0041-3p。
本发明的第二实施方式涉及一种驴的miRNA序列具有抑制目的基因表达的功能，在本实施方式中，该目的基因为ACADVL，具体实验步骤如下：
1.合成eas-m0041-3p的模拟物(miRNA mimics)
成熟的eas-m0041-3p模拟物(miRNA mimics)可以自己合成也可以从市面上购买获取。使用前用灭菌的RNase-free H2O或者灭菌的ddH2O，配制成20μM溶液。
2.转染
1)细胞培养：取家驴的耳尖皮肤组织，清洗消毒后，用眼科剪剪成1mm3左右的小块，在卡氏瓶中贴壁培养。当贴壁细胞铺满瓶子的底部时，用胰酶消化法传代培养；
2)转染前一天，接种适当数量的细胞至24孔细胞培养板中，每孔中加入不含抗生素的培养基，使转染时的细胞密度能够达到30～50％(不同细胞生长速度不一样，因此，接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验)。
值得注意的是：转染时，细胞密度是影响转染效率的关键因素之一，细胞生长过度会削弱细胞活力，从而降低细胞的转染效率。
3)在24孔板中，设置两组对照。一组用于转染，另一组不转染。每组各有6个平行对照；
4)稀释miRNA mimics：
a.用50μl不含血清培养基 Ⅰ(v2)稀释25pmol miRNA mimics(加入细胞中的RNA总浓度为50nM)，轻轻混匀，室温孵育5min；
b.稀释lipo2000：用50μl不含血清培养基 Ⅰ(v2)稀释1μl lipo2000，轻轻混匀并室温孵育5min；
c.将a与b轻轻混匀，室温孵育20min(溶液可能会有浑浊，但不会影响转染)；
5)将miRNA mimics与lipo2000的混合液加入含有细胞以及培养液(v1)(即上述步骤2)中的培养基)的培养孔中，轻轻混匀；
6)将培养板置于37℃的CO2培养箱中培养24～96h。培养4～6h后，可以将孔里含有mimics-lipo2000混合液的培养基移去，更换新鲜培养基。
3.定量
1)引物设计
选取GAPDH用作相对定量PCR的看家基因。利用Primer3.0设计ACADVL基因的特异性引物。
2)总RNA的提取
按照RNAprep pure微量样品总RNA提取试剂盒说明书进行操作。吸取2μL总RNA利用酶标仪检测质量和浓度。
3)反转录合成cDNA第一链
取提取的总RNA，在PCR管中配制cDNA第一条链合成反应混合液，具体反应体系如表2所示。
表2：
轻轻混匀，调节温度至37℃，反转录反应15min；再次调节温度至85℃，反转录酶失活反应5s；产物在-20℃保存备用。
4)Real-time PCR体系的建立
按照表3中所示组分配制PCR反应液，同时配制阴性对照。每个样品做3个重复：
表3：
成分 加样量(μL)
SYBR Premix Ex TaqTM(2×) 10μl
PCR Forward Primer(10μM) 0.4μl
PCR Reverse Primer(10μM) 0.4μl
cDNA模版 1.0μl
ddH20(灭菌双蒸水) 8.2μl
总计 20μl
按照如表4中所示的反应条件，采用三步法PCR扩增程序：
表4：
上面PCR运行结束后，立即运行如下程序：94℃30s，55℃30s至95℃30s连续扫描，以0.5℃作为一个梯度，扫描0.06s，绘制熔解曲线。各基因熔解曲线均只有单一的尖峰，表明扩增产物单一，无非特异性扩增干扰。
5)结果与分析
实时荧光定量RT-PCR获取基因转染前后达到荧光阈值所对应的Ct值，以GAPDH为内参基因，2△Ct计算出ACADVL基因转染前后的相对表达量。结果如表5所示：
表5：
序号 转染 不转染
1 0.006 0.03
2 0.007 0.032
3 0.006 0.044
4 0.0043 0.041
5 0.004 0.051
6 0.0052 0.063
结果表明，转染组与对照组相比，转染组的ACADVL的表达量有显著的下降。说明eas-m0041-3p能够抑制ACADVL的表达。
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110>内蒙古农业大学
<120>驴的miRNA序列、制备方法及其应用
<130>2016
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>22
<212>miRNA
<213>驴
<400>1
tgaactttgc agtagcctcc ta 22

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1.SEQ ID NO：1所示的miRNA序列在制备抑制驴的ACADVL基因表达的组合物中的应用。
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