CN106701750B - 一种鉴定地方驴品种的方法及其专用试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴定地方驴品种的方法及其专用试剂盒。本发明所提供的方法包括如下步骤：提取待测样本的总DNA并检测在SNP位点组合的基因型，根据检测结果判断待测样本是否来源于地方驴品种的后代；SNP位点组合由组合Ⅰ、组合Ⅱ、组合Ⅲ、组合Ⅳ、组合Ⅴ、组合Ⅵ、组合Ⅶ、组合Ⅷ和组合Ⅸ组成，依次含有2个、6个、3个、1个、7个、4个、4个、1个和2个特异性SNP位点。实验证明，本发明提供的方法鉴定待测样本是否来源于地方驴品种的后代具有较高的准确率，并可方便、快捷鉴定驴品种或纯度。本发明具有重要的应用价值。

Description

一种鉴定地方驴品种的方法及其专用试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种鉴定地方驴品种的方法及其专用试剂盒。

背景技术

驴在分类学上隶属于哺乳纲、奇蹄目、马科、马属。野驴与家驴属于不同的物种。现存的野驴分为亚洲野驴和非洲野驴两大类。亚洲野驴有5个亚种。非洲野驴有努比亚野驴和索马里野驴2个亚种。家驴分布于全世界五大洲，其中亚洲和欧洲较多。据最新的研究显示，全世界的家驴都是由努比亚野驴和索马里野驴经人工驯化产生的。家驴在汉通西域后，开始大规模从非洲东北部经丝绸之路传入我国。首先传入我国的是西北地区的小型驴，毛色属于浅色，含鹰膀和腿斑；在五代十国时期，逐渐在中原以及黄河中下游省份出现了大体型驴，毛色属于黑色。随着对不同生态环境的适应和以及人工选种的结果，我国形成了多个地方品种驴，主要品种有泌阳驴、广灵驴、和田驴、佳米驴、库伦驴、西藏驴、吐鲁番驴、新疆驴和云南驴。

在中国，家驴除了劳役用之外，主要还有两个商业用途：一是驴皮，其是生产阿胶的主要原料，一般选用大型黑驴的驴皮生产的阿胶最为正宗；二是食用，在山东、河北地区非常流行食用驴肉。驴品种的差异可直接导致产品品质的不同，因此鉴别驴的品种非常重要；而且在驴的育种过程中，种公驴的品种纯度也很重要，不同品种纯度的种公驴和母驴交配产生的后代的品质也是不一样的。

目前，驴品种的鉴定主要依靠外形观测法。例如对德州驴的鉴定有一套专门行业标准，具体如下：(1)体质和整体结构：体质结实紧凑，皮薄毛细，体格高大，体形多呈正方形；(2)头部：中等大小，眼大，耳立，上下唇闭合良好；(3)颈部：颈长适中，颈肌发达；(4)躯干：警甲明显，肋拱圆，背腰平直，腹部充实，尻稍斜；(5)四肢：四肢坚实，关节明显，蹄质坚实；(6)毛色：主要分为两类毛色，一类是黑三粉(即驴的毛色为鼻、嘴、眼周围和腹下被毛为白色、其它部分纯黑)，另一类是乌头(驴的全身被毛为纯黑)。但在采用外形观测法进行鉴别时，存在主观性差异，导致鉴别结果不准确。而且采用外形观测法无法鉴别驴的品种纯度。

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸变异所引起的DNA序列的多态性。DNA分子单个核苷酸的变异有碱基替换、插入和缺失等形式,而SNP不包括碱基的插入和缺失。随着技术的发展，SNP检测方法越来越多，检测费用也越来越经济，使它成为继SSR之后的新一代分子标记。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何鉴定待测样本是否来源于地方驴品种的后代。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了与地方驴品种相关的SNP位点组合。

本发明所提供的与地方驴品种相关的SNP位点组合，可由组合Ⅰ、组合Ⅱ、组合Ⅲ、组合Ⅳ、组合Ⅴ、组合Ⅵ、组合Ⅶ、组合Ⅷ和组合Ⅸ组成；

所述组合Ⅰ可为下表所示G575532T SNP和/或C205837G SNP；所述组合Ⅱ可为下表所示C286365T SNP和/或A577920T SNP和/或T4278863C SNP和/或C1780143G SNP和/或G9705930A SNP和/或T15607C SNP；所述组合Ⅲ可为下表所示A9988646C SNP和/或G8455434T SNP和/或A67309G SNP；所述组合Ⅳ可为下表所示A1071158T SNP；所述组合Ⅴ可为下表所示C476169T SNP和/或C10558T SNP和/或C92015A SNP和/或A3881378T SNP和/或A57130G SNP和/或G1252207C SNP和/或A1607561C SNP；所述组合Ⅵ可为下表所示G2035082A SNP和/或C678969T SNP和/或G41443A SNP和/或T41444C SNP；所述组合Ⅶ可为下表所示C1802540G SNP和/或A63800G SNP和/或A5164328G SNP和/或C1884753T SNP；所述组合Ⅷ可为下表所示C462432G SNP；所述组合Ⅸ可为下表所示T156997C SNP和/或G1362413T SNP；

为解决上述技术问题，本发明还提供了成套引物。

本发明所提供的成套引物，可由引物对Ⅰ、引物对Ⅱ、引物对Ⅲ、引物对Ⅳ、引物对Ⅴ、引物对Ⅵ、引物对Ⅶ、引物对Ⅷ和引物对Ⅸ组成；

所述引物对Ⅰ可为下表所示by-1或by-2；所述引物对Ⅱ可为下表所示gl-1、gl-2、gl-3、gl-4、gl-5或gl-6；所述引物对Ⅲ可为下表所示ht-1、ht-2或ht-3；所述引物对Ⅳ可为下表所示jm-1；所述引物对Ⅴ可为下表所示kl-1、kl-2、kl-3、kl-4、kl-5、kl-6或kl-7；所述引物对Ⅵ可为下表所示xz-1、xz-2、xz-3或xz-4；所述引物对Ⅶ可为下表所示tlf-1、tlf-2、tlf-3或tlf-4；所述引物对Ⅷ可为下表所示xj-1；所述引物对Ⅸ可为下表所示yn-1或yn-2；

所述成套引物的应用也属于本发明的保护范围。所述成套引物的应用可为a-1)至a-8)中的任一种：

a-1)制备用于鉴定纯种的地方驴品种的试剂盒；a-2)制备用于鉴定地方驴品种的后代的试剂盒；a-3)制备用于鉴定待测样本是否来源于纯种的地方驴品种的试剂盒；a-4)制备用于鉴定待测样本是否来源于地方驴品种的后代的试剂盒；a-5)鉴定待测驴是否为候选的纯种的地方驴品种；a-6)鉴定待测驴是否为候选的地方驴品种的后代；a-7)鉴定待测样本是否来源于纯种的地方驴品种；a-8)鉴定待测样本是否来源于地方驴品种的后代；所述地方驴品种为泌阳驴、广灵驴、和田驴、佳米驴、库伦驴、西藏驴、吐鲁番驴、新疆驴或云南驴。

上述应用中，所述待测样本可为驴皮。

含有所述成套引物的试剂盒也属于本发明的保护范围。所述试剂盒的用途可为a-5)或a-6)或a-7)或a-8)：a-5)鉴定待测驴是否为候选的纯种的地方驴品种；a-6)鉴定待测驴是否为候选的地方驴品种的后代；a-7)鉴定待测样本是否来源于纯种的地方驴品种；a-8)鉴定待测样本是否来源于地方驴品种的后代；所述地方驴品种为泌阳驴、广灵驴、和田驴、佳米驴、库伦驴、西藏驴、吐鲁番驴、新疆驴或云南驴。所述待测样本可为驴皮。

所述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。所述试剂盒的制备方法可包括将各条引物单独包装的步骤。

为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定待测样本是否来源于地方驴品种的后代的方法。

本发明所提供的鉴定待测样本是否来源于地方驴品种的后代的方法，具体可为方法甲，可包括如下步骤：提取待测样本的总DNA并检测在所述SNP位点组合的基因型，然后进行如下判断：

(r-1)如果待测样本的总DNA中在所述G575532T SNP位点为GG纯合型和/或所述C205837G SNP位点为CC纯合型，则待测样本来源于泌阳驴的后代；

(r-2)如果待测样本的总DNA中在所述C286365T SNP位点为CC纯合型和/或所述A577920T SNP位点为AA纯合型和/或所述T4278863C SNP位点为TT纯合型和/或所述C1780143G SNP位点为CC纯合型和/或所述G9705930A SNP位点为GG纯合型和/或所述T15607C SNP位点为TT纯合型，则待测样本来源于广灵驴的后代；

(r-3)如果待测样本的总DNA中在所述A9988646C SNP位点为AA纯合型和/或所述G8455434T SNP位点为GG纯合型和/或所述A67309G SNP位点为AA纯合型，则待测样本来源于和田驴的后代；

(r-4)如果待测样本的总DNA中在所述A1071158T SNP位点为AA纯合型，则待测样本来源于佳米驴的后代；

(r-5)如果待测样本的总DNA中在所述C476169T SNP位点为CC纯合型和/或所述C10558T SNP位点为CC纯合型和/或所述C92015A SNP位点为CC纯合型和/或所述A3881378TSNP位点为AA纯合型和/或所述A57130G SNP位点为AA纯合型和/或所述G1252207C SNP位点为GG纯合型和/或所述A1607561C SNP位点为AA纯合型，则待测样本来源于库伦驴的后代；

(r-6)如果待测样本的总DNA中在所述G2035082A SNP位点为GG纯合型和/或所述C678969T SNP位点为CC纯合型和/或所述G41443A SNP位点为GG纯合型和/或所述T41444CSNP位点为TT纯合型，则待测驴为西藏驴的后代；

(r-7)如果待测样本的总DNA中在所述C1802540G SNP位点为CC纯合型和/或所述A63800G SNP位点为AA纯合型和/或所述A5164328G SNP位点为AA纯合型和/或所述C1884753T SNP位点为CC纯合型，则待测样本来源于吐鲁番驴的后代；

(r-8)如果待测样本的总DNA中在所述C462432G SNP位点为CC纯合型，则待测样本来源于新疆驴的后代；

(r-9)如果待测样本的总DNA中在所述T156997C SNP位点为TT纯合型和/或所述G1362413T SNP位点为GG纯合型，则待测样本来源于云南驴的后代；

(r-10)如果待测样本的总DNA中不满足上述(r-1)、(r-2)、(r-3)、(r-4)、(r-5)、(r-6)、(r-7)、(r-8)和(k-9)中的任何一种情况，则待测样本来源于非地方驴品种的后代；所述地方驴品种为泌阳驴、广灵驴、和田驴、佳米驴、库伦驴、西藏驴、吐鲁番驴、新疆驴或云南驴。

本发明所提供的鉴定待测样本是否来源于地方驴品种的后代的方法，具体可为方法乙，可包括如下步骤：以待测样本的总DNA为模板，采用所述引物对Ⅰ、所述引物对Ⅱ、所述引物对Ⅲ、所述引物对Ⅳ、所述引物对Ⅴ、所述引物对Ⅵ、所述引物对Ⅶ、所述引物对Ⅷ或所述引物对Ⅸ进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，然后进行如下判断：

t-1)如果采用所述by-1得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：61和/或采用所述by-2得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：62所示的DNA区段，则待测样本来源于泌阳驴的后代；

t-2)如果采用所述gl-1得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：63和/或采用所述gl-2得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：64和/或采用所述gl-3得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：65和/或采用所述gl-4得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：66和/或采用所述gl-5得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：67和/或采用所述gl-6得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：68所示的DNA区段，则待测样本来源于广灵驴的后代；

t-3)如果采用所述ht-1得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：69和/或采用所述ht-2得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：70和/或采用所述ht-3得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：71所示的DNA区段，则待测样本来源于和田驴的后代；

t-4)如果采用所述jm-1得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：72所示的DNA区段，则待测样本来源于佳米驴的后代；

t-5)如果采用所述kl-1得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：73和/或采用所述kl-2得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：74和/或采用所述kl-3得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：75和/或采用所述kl-4得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：76和/或采用所述kl-5得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：77和/或采用所述kl-6得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：78和/或采用所述kl-7得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：79所示的DNA区段，则待测样本来源于库伦驴的后代；

t-6)如果采用所述xz-1得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：80和/或采用所述xz-2得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：81和/或采用所述xz-3得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：82和/或采用所述xz-4得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：83所示的DNA区段，则待测样本来源于西藏驴的后代；

t-7)如果采用所述tlf-1得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：84和/或采用所述tlf-2得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：85和/或采用所述tlf-3得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：86和/或采用所述tlf-4得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：87所示的DNA区段，则待测样本来源于吐鲁番驴的后代；

t-8)如果采用所述xj-1得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：88所示的DNA区段，则待测样本来源于新疆驴的后代；

t-9)如果采用所述yn-1得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：89和/或采用所述yn-2得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：90所示的DNA区段，则待测样本来源于云南驴的后代；

t-10)如果PCR扩增产物不满足上述(t-1)、(t-2)、(t-3)、(t-4)、(t-5)、(t-6)、(t-7)、(t-8)和(t-9)中的任何一种情况，则待测样本来源于非地方驴品种的后代；所述地方驴品种为泌阳驴、广灵驴、和田驴、佳米驴、库伦驴、西藏驴、吐鲁番驴、新疆驴或云南驴。

上述方法中，所述后代可为纯种或杂种。

上述方法中，所述待测样本具体可为驴皮。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种鉴定待测驴属于地方驴品种中的哪个品种的方法。

本发明所提供的鉴定待测驴属于地方驴品种中的哪个品种的方法，可包括如下步骤：

w-1)以待测驴的基因组DNA为模板，采用所述引物对Ⅰ、所述引物对Ⅱ、所述引物对Ⅲ、所述引物对Ⅳ、所述引物对Ⅴ、所述引物对Ⅵ、所述引物对Ⅶ、所述引物对Ⅷ或所述引物对Ⅸ进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；以标准地方驴品种群中的各个标准地方驴品种的基因组DNA为模板，采用所述引物对Ⅰ、所述引物对Ⅱ、所述引物对Ⅲ、所述引物对Ⅳ、所述引物对Ⅴ、所述引物对Ⅵ、所述引物对Ⅶ、所述引物对Ⅷ或所述引物对Ⅸ进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；所述标准地方驴品种群由泌阳驴、广灵驴、和田驴、佳米驴、库伦驴、西藏驴、吐鲁番驴、新疆驴和云南驴组成；

w-2)将待测驴得到的PCR扩增产物与每个标准地方驴品种得到的PCR扩增产物进行比对，比对结果中待测驴与哪个标准地方驴品种一致，该待测驴与该标准地方驴品种即为同一个品种。

实验证明，本发明提供的方法鉴定待测样本是否来源于地方驴品种的后代具有较高的准确率，并可方便、快捷鉴定驴品种或纯度。任何可提取基因组DNA的驴的器官组织、皮毛等均可作为待鉴定材料。本发明具有重要的应用价值。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的泌阳驴、广灵驴、和田驴、佳米驴、库伦驴、西藏驴、吐鲁番驴、新疆驴和云南驴均由东阿阿胶股份有限公司提供。

动物血液DNA提取试剂盒为Invitrogen公司的产品，产品目录号为10974020。

实施例1、试剂盒的制备

一、特异性SNP位点的发现

本实验中36头驴分别为4头纯种泌阳驴、4头纯种广灵驴、4头纯种和田驴、4头纯种佳米驴、4头纯种库伦驴、4头纯种西藏驴、4头纯种吐鲁番驴、4头纯种新疆驴和4头纯种云南驴。每头驴均经专家鉴定为相应的纯种的驴品种，鉴定方法为外形观测法。

以关中驴的基因组(Huang J，Zhao Y，Bai D，et al.Donkey genome and insightinto the imprinting of fast karyotype evolution[J].Scientific reports，2015，5.)为参考，采用GATK软件(https://software.broadinstitute.org/gatk)对36头驴的全基因组重测序结果进行分析，获得约3000万个SNP位点。如果某SNP位点在某驴品种的4个样本中完全相同，而与其它驴品种的样本中完全不同，则该SNP位点即为该驴品种的特异性SNP位点。经筛选，共获得30个特异性SNP位点(基本信息详见表1)，每个驴品种的特异性SNP位点从1个到7个不等。

由于基因组DNA为由反向互补的两条单链DNA分子组成双链DNA分子，因此一般将编码蛋白质的DNA分子，也就是具有起始密码子至终止密码子的DNA分子，命名为正义DNA分子；将与正义DNA分子的反向互补的DNA分子命名为反义DNA分子。需要指明的是上述30个特异性SNP位点处的脱氧核糖核苷酸均为正义DNA的脱氧核糖核苷酸。

表1. 30个特异性SNP位点的基本信息

注：G为GG纯合型。T为TT纯合型。C为CC纯合型。A为AA纯合型。

二、正向引物和反向引物的合成

特异性SNP位点为G575532T SNP、C205837G SNP、C286365T SNP、A577920T SNP、T4278863C SNP、C1780143G SNP、G9705930A SNP、T15607C SNP、A9988646C SNP、G8455434TSNP、A67309G SNP、A1071158T SNP、C476169T SNP、C10558T SNP、C92015A SNP、A3881378TSNP、A57130G SNP、G1252207C SNP、A1607561C SNP、G2035082A SNP、C678969T SNP、G41443A SNP、T41444C SNP、C1802540G SNP、A63800G SNP、A5164328G SNP、C1884753TSNP、C462432G SNP、T156997C SNP或G1362413T SNP。

1、正向引物和反向引物的设计

设计用于扩增含有特异性SNP位点的靶序列的正向引物和反向引物，具体步骤如下：

(1)首先根据特异性SNP位点在染色体上的位置，截取特异性SNP位点前后各200bp的序列，获得长为401bp的DNA序列(以下简称目标序列)。

(2)针对目标序列设计正向引物和反向引物。将目标序列输入软件Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？LINK_LOC＝BlastHome)，设置正向引物从目标序列自5’末端起第1至150位之间获取，反向引物从目标序列自5’末端起第251至401位之间获取，正向引物和反向引物的Tm值均为60℃，然后选取排名第一的作为正向引物和反向引物。

正向引物和反向引物组成引物对。正向引物和反向引物之间的DNA序列即为含有特异性SNP位点的靶序列。

2、人工合成正向引物和反向引物

人工合成的正向引物和反向引物。正向引物的核苷酸序列见表2中第3列。反向引物的核苷酸序列见表2中第4列。引物对的名称见表2中第2列。靶序列的相关信息见表3，靶序列即采用正向引物和反向引物扩增获得的PCR扩增产物。

表2.引物对的信息

表3.采用引物对扩增的PCR扩增产物的信息

三、试剂盒的制备

试剂盒由九个引物对组成。每个引物对用于鉴定一种驴品种。

鉴定泌阳驴的引物对为by-1或by-2。鉴定广灵驴的引物对为gl-1、gl-2、gl-3、gl-4、gl-5或gl-6。鉴定和田驴的引物对为ht-1、ht-2或ht-3。鉴定佳米驴的引物对为jm-1。鉴定库伦驴的引物对为kl-1、kl-2、kl-3、kl-4、kl-5、kl-6或kl-7。鉴定西藏驴的引物对为xz-1、xz-2、xz-3或xz-4。鉴定吐鲁番驴的引物对为tlf-1、tlf-2、tlf-3或tlf-4。鉴定新疆驴的引物对为xj-1。鉴定云南驴的引物对为yn-1或yn-2。

使用该试剂盒可鉴定待测驴为纯种驴还是杂种驴；如果是纯种驴，可以鉴定出待测驴为哪一种驴品种；如果是杂种驴，可以鉴定出待测驴是哪几种驴品种杂交的后代。

实施例2、准确性实验

一、鉴定纯种驴的准确性

本实验中45头驴分别为5头纯种泌阳驴、5头纯种广灵驴、5头纯种和田驴、5头纯种佳米驴、5头纯种库伦驴、5头纯种西藏驴、5头纯种吐鲁番驴、5头纯种新疆驴和5头纯种云南驴。每头驴均经专家鉴定为相应的纯种的驴品种，鉴定方法为外形观测法。

1、采用动物血液DNA提取试剂盒分别提取45头驴的基因组DNA并其为模板，以表2中第2列所示的引物对分别进行PCR扩增，获得相应的PCR扩增产物。反应程序为：94℃变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min。

2、完成步骤1后，对获得的PCR扩增产物分别进行测序，然后根据表3中第6列所示的特异性SNP位点在PCR扩增产物中的位置，记录每头驴在每一特异性SNP位点处的脱氧核糖核苷酸是A、T、G还是C。

3、根据步骤2的实验结果，以表1作为鉴定标准，确定45头驴的驴品种。

5头纯种泌阳驴、5头纯种广灵驴、5头纯种和田驴、5头纯种佳米驴、5头纯种库伦驴、5头纯种西藏驴、5头纯种吐鲁番驴、5头纯种新疆驴和5头纯种云南驴的实验结果依次见表4至表12，鉴定结果与实际情况完全一致。

结果表明，利用本发明提供的试剂盒鉴定纯种驴的驴品种，结果准确可靠。

表4. 5头泌阳驴的实验结果

表5. 5头广灵驴的实验结果

表6. 5头和田驴的实验结果

表7. 5头加米驴的实验结果

表8. 5头库伦驴的实验结果

表9. 5头西藏驴的实验结果

表10. 5头吐鲁番驴的实验结果

表11. 5头新疆驴的实验结果

表12. 5头云南驴的实验结果

二、鉴定杂种驴的准确性

待测驴为待测驴1、待测驴2或待测驴3；待测驴1为纯种泌阳驴和纯种广灵驴的杂交后代；待测驴2为纯种西藏驴和纯种吐鲁番驴的杂交后代；待测驴3为纯种泌阳驴和纯种库伦驴的杂交后代。

1、采用动物DNA提取试剂盒分别提取待测驴的基因组DNA并其为模板，以表2中第2列所示的引物对分别进行PCR扩增，获得相应的PCR扩增产物。反应程序为：94℃变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min。

2、完成步骤1后，对获得的PCR扩增产物分别进行测序，然后根据表3中第6列所示的特异性SNP位点在PCR扩增产物中的位置，记录待测驴在每一特异性SNP位点处的脱氧核糖核苷酸是A、T、G还是C。

3、根据步骤2的实验结果，以表1作为标准，鉴定待测驴的驴品种。

结果表明，鉴定结果与实际情况完全一致。可见，利用本发明提供的试剂盒可鉴定杂种驴的驴品种，结果准确可靠。

实施例3、应用

从山东东阿阿胶股份有限公司随机选取3张驴皮，分别命名为待测驴皮一、待测驴皮二和待测驴皮三。

1、采用动物DNA提取试剂盒提取待测驴皮(待测驴皮一、待测驴皮二或待测驴皮三)的基因组DNA并其为模板，以by-1、gl-2、ht-2、jm-1、kl-1、xz-1、tlf-1、xj-1或yn-2进行PCR扩增，获得相应的PCR扩增产物。反应程序为：94℃变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min。

2、完成步骤1后，对获得的PCR扩增产物分别进行测序，然后根据表3中第6列所示的特异性SNP位点在PCR扩增产物中的位置，记录待测驴皮在G575532T SNP、A577920T SNP、G8455434T SNP、A1071158T SNP、C476169T SNP、G2035082A SNP、C1802540G SNP、C462432GSNP或G1362413T SNP处的脱氧核糖核苷酸是A、T、G还是C。

3、根据步骤2的实验结果，以表1作为标准，鉴定待测驴皮来源于哪一种驴品种或哪几种驴的杂交后代。

待测驴皮一、待测驴皮二和待测驴皮三的在上述特异性SNP位点处的脱氧核糖核苷酸见表13。

结果表明，待测驴皮一含有广灵驴的A577920T SNP，说明待测驴皮一来源于纯种广灵驴；待测驴皮二含有新疆驴的C462432G SNP，说明待测驴皮二来源于纯种新疆驴；待测驴皮三含有泌阳驴的G575532T SNP和库伦驴的C476169T SNP，说明待测驴皮三来源于泌阳驴和库伦驴的杂交后代。可见，利用本发明提供的试剂盒可鉴定驴皮，具有重要的应用价值和商业价值。

表13. 3种待测驴皮的特异性SNP位点的信息

<110>深圳华大基因股份有限公司 山东省农业科学院奶牛研究中心 东阿阿胶股份有限公司

<120>一种鉴定地方驴品种的方法及其专用试剂盒

<160> 90

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

cgaatgttag ctcagggcca 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

cggccactca tctgtgttgt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

ctgtttgttt ggggcacgtc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

tctgaggctc tgtccttggt 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

gagcccacct gcactgatac 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

gctgccatgg agacaggac 19

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 7

tgactcacga cccagagaga 20

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 8

gcatgaaact taagcctttc agca 24

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 9

agtggagcga gctgaagtta 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 10

cccgtggctg agtggttaag 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 11

aggcaatctc ggggactgta 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 12

gtcatgtcac ggaggatgga 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 13

acagaagagg gaaatcccag c 21

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 14

tctctgattg agtcccacat gttt 24

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 15

tccctgcacc ctgttcattc 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 16

caaaagacag gggcgatcca 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 17

ctctacggag agatacgccg 20

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 18

cctgagctaa gatccatgcc c 21

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 19

tttgtgtgtg ttgtggtggc a 21

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 20

gcactgccag gcatatagtg t 21

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 21

gcagtcagga gcctgtgtag 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 22

tcagtcctgc ttttcacggg 20

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 23

tagccagcta tttctccagc at 22

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 24

tcttgctgtc tgggactcg 19

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 25

gactcgacca ctacaccacc 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 26

gcccagtgtt tcgttggttc 20

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 27

atactcatag ccagccagca c 21

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 28

aagagtggga gggagcctac 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 29

gacgcactga ccaaatccca 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 30

ccgagtggtt aagttcacgc 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 31

gccacaacta gaaggaccca 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 32

tagccccaga tctcaaccca 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

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ggaatcctgg ccctgaacta 20

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 34

aaatatacct gaagaggggc cg 22

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 35

cttggttcct aagggagcgg 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

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ggagtaacct tcgagctggg 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 37

ctggcctcca ccaacacaat 20

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<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 38

gctgctgtaa tagagagacc tca 23

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 39

tggcagagag ttattctagc agag 24

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

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tccatgccca gcttcctcta 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

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tgacccagtg tttcgttggt 20

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

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gggctgtggg atctctaagg 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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tactgtctca cagcttggca 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 44

aagtcaggtg agagtgcctg 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 45

cctggtcaag atcagcccac 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 46

cacagcttgg cagggttttt 20

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 47

taaatccggt ttggaggggc 20

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 48

ctagtcccac tcagctgcac 20

<210> 49

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 49

tgtctgtgtt catgcgccta t 21

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 50

agggcctgtg atttgctgtc 20

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 51

gtttgctgga atgcactgtg a 21

<210> 52

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 52

aacacaaatg tggtcctgag t 21

<210> 53

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 53

agtgaatgca gcacgtagtc a 21

<210> 54

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 54

cggacctagc actgctcatc 20

<210> 55

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

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ggaagaaacg ggaatgccaa g 21

<210> 56

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 56

acacccatta agtcagcctc tg 22

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<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 57

ggaaggtgcc gtcaggg 17

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 58

gggaggaaac tcgagaacgg 20

<210> 59

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 59

agcataatgc ctggctccat 20

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 60

ggttaagttt gcgcactccg 20

<210> 61

<211> 315

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 61

cgaatgttag ctcagggcca tccttcctca gcaaaaaaga ggaggattgg cagcagatgt 60

tagctgaggg ttaatcttac tcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa ttaggtatca 120

gaatctccta ggggagtttc ttaaaaatat catgttgggt tcaaaccccc ggagagctgg 180

acgcaggagg tttcgggtag cctgggcttt ggtatttctc agaacatatc cccagatgaa 240

aaccactggt ttagaaaaaa acagttcaac ctgagggttc aaagacaacc tctagacaac 300

acagatgagt ggccg 315

<210> 62

<211> 276

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 62

ctgtttgttt ggggcacgtc cagaaagcag caaaacatgt ggtttgctgg gccccttcca 60

accctttcca ttgtgcccta aggaatccct catgctacta cccgcccccc ccaaaaagca 120

aacaataaca aaaaaccaac aatatcacca aaccaacaca aagaagtccc catcctctga 180

atcttctcag catcctctct ctccatcccc ttgtttatta ttacagataa tggggaaagt 240

gcaaagaaga gaagagacca aggacagagc ctcaga 276

<210> 63

<211> 273

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 63

gagcccacct gcactgatac cattttaacc ttttttcata ctctttcgtt tgtcttgtaa 60

ggagatggct cacataccta tcccttaaat ttagccttac tctccaccca tgtttgcagc 120

agaagcagca gcagcagctc tgactgcctg tgggccctgt ccccatgcag cagctctgac 180

tgcccatggg tcctgtcccc atgcccgtgg caacagcagc tccccatgcc agcagcagct 240

ctgactgccc atgggtcctg tctccatggc agc 273

<210> 64

<211> 187

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 64

tgactcacga cccagagaga atgtaattaa tttcagctga tttgtttgat attttgatgt 60

aacttttgca cagcttaaaa aaaatttttt tttttttttg agtatcgtaa gagtgaatag 120

ttcttcaact tccacactag gctctaaaat tctgtgattt ttatgctgaa aggcttaagt 180

ttcatgc 187

<210> 65

<211> 275

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 65

agtggagcga gctgaagtta accactaggc aatggggcca gcccctcaag tttgattttt 60

ttttttttaa agattttatt ttatcctttt tctctccaaa gcccccctgg tacatagttg 120

tatattgttt gttgtgggtc cctctagttg tggcatgtgg gacactgcct cagcgtggtt 180

tgatgagcag tgccatgtcc gcgcccagga ttcaaaccaa cgaaacactg ggccacctgc 240

agcggagcgc gcgaacttaa ccactcagcc acggg 275

<210> 66

<211> 310

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 66

aggcaatctc ggggactgta tcaggaaact gctatcttca gaagatcgta gcaaacaact 60

actgtctctt ggccccttac ctgggcagct agtccagaga acacgcgtgc cacacagagg 120

cggggcatcg catgcacctg ggggagaggg acgcagcgtc cgagaccccg cagcgtccga 180

gaccccgcac ctgcgctccc cctgcacctg ggccagacgc tcctcccaca gggcctctct 240

ctctgaggca actgtgaaat ggagttgttg tagctctgac attctgtcca tccatcctcc 300

gtgacatgac 310

<210> 67

<211> 256

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 67

acagaagagg gaaatcccag ctttacacat cttcaaacag agaattaaca aggaccactc 60

tattaattcc catattttaa gggtgaagta tacagaatga aggagttggt ctgtaaaata 120

ttttcctaaa ttctcaagct cttttataaa aaaggacacc tggctgccca tatgttacat 180

tttaatttga acacttaagg tagtatctta tttacataat ggccaaagat taaaacatgt 240

gggactcaat cagaga 256

<210> 68

<211> 272

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 68

tccctgcacc ctgttcattc actctgtctt taggcaatga tctttttctt aaagacagac 60

tatatagaca taatttcgct ctcagataaa ggccacatac tgcacgccct gttctgcagt 120

cttccttctg tgtgactctc tgtcccaagg atgctcccca gcagggcctt ctcctcactc 180

ctctcacgct gcctagttat ctgtgacggg gctgcagtac agccaagaca gctgtccctc 240

cggatggctg tttggatcgc ccctgtcttt tg 272

<210> 69

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 69

ctctacggag agatacgccg tacaatcacc ctaagtctcc ttaacttcac ctattcccag 60

aacaccaagt ttgagtctca tgaaaggaat tagaataact catgttgtac gtaatgctca 120

aaaatgaaca gctccaaggt gggtatggag attcaaacat aagtaatttg tggggccagc 180

ccggtgatgc agcaattacg tttgcacact tcagtggtct ggggttcccc ggtcgggatc 240

ctgggtgcag tcatggcact gctcagcaag ccatgctgtg gcagggatgc cacatataaa 300

gtagaggaag atgggcatgg atcttagctc agg 333

<210> 70

<211> 371

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 70

tttgtgtgtg ttgtggtggc agtgggcata gagagatctg ttaacagtat ggccatctgt 60

catgacagaa gctacctgat tatatcattt tattcaaggt gatattggaa gtcagactat 120

gatttggatt aattggcaat aacaaaaacc atggaagcaa aatatatata tatagatata 180

aatatagata tagatatata tatatagata gatataattg ttactcataa tctaaagggt 240

ggaatgggag tggagggagg attgttcact tagaggctca gttgtgttct agagggaagg 300

gttttctggg gcctatctcc cttgtgagtt ggttactgct cagttctctt acactatatg 360

cctggcagtg c 371

<210> 71

<211> 168

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 71

gcagtcagga gcctgtgtag taatcacggt gggagtggat gaacctgagc taagtggggg 60

ggagtggggc ggggcacagc gggagggtga gcagggagca ggctgtacac gcctgtgtgc 120

ctggcactca cgagggttgg gttggtgccc cgtgaaaagc aggactga 168

<210> 72

<211> 107

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 72

tagccagcta tttctccagc ataaatgggt ttattcagga tcagcaaaaa attgcaattc 60

aggatctgca accatggtaa gccacgtgcg agtcccagac agcaaga 107

<210> 73

<211> 251

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 73

gactcgacca ctacaccacc aggctggccc ctctccttca tttttgaagg tcctttttgc 60

cagatgtaat attctttttt ttttttaagg attttatttt tttccttttt ctccccaaag 120

ctccccagta catagctgta tattcttcgt tgtggatcct tctagttgtg gcatgtggga 180

cgctgcctca gcgtggtttg atgagcagtg ccatgcccat gcccaggatt tgaaccaacg 240

aaacactggg c 251

<210> 74

<211> 257

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 74

atactcatag ccagccagca ccacctatcc aaagaaccac taatccgaaa aaaactctac 60

atcactatgc tagccatact tcaaactttc ctaatcataa cctttaccgc cacagaacta 120

atctccttct atatcctatt tgaagccaca ttagttccaa cactaattat catcacccgc 180

tgaggtaacc aaacagaacg cctaaacgca ggcctctact ttctattcta cacgctagta 240

ggctccctcc cactctt 257

<210> 75

<211> 265

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 75

gacgcactga ccaaatccca cagtcttttc tttttttttt taataaagat ttattttttc 60

ctttttctcc ccaaagcccc ccagtacata gttgtgtatt attcgttgtg ggtccttcta 120

gttgtggcat gtgggacgct gcctcagcgt ggtttgatga gcagtgccat gtccgcgccc 180

aggactcgaa ccaacgaaac actgggctgc ctgcagcgga gcacgcgaac ttcctgcagc 240

ggagcgcgtg aacttaacca ctcgg 265

<210> 76

<211> 340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 76

gccacaacta gaaggaccca caactaagaa tatacaacta tgtactgggg ggctttgggg 60

agaaaaagga aaaaaataaa atcttaaaaa aaaaaaaaaa agaatagctt ggaggtaaaa 120

aggtatggaa ttgcaagtac ccaggctttg aacctcagaa actataccta aagaactcaa 180

agcaaaaaaa aaaaaaaata tccaggtaga ctggagagaa aataggtgaa gagttctaat 240

gattactgaa aaagagaaga gagtcaaagg gaagagtaat gggggtaggc attgatctat 300

gtttctgcaa agggtcctct tgggttgaga tctggggcta 340

<210> 77

<211> 189

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 77

ggaatcctgg ccctgaacta acatcctgcc catcttcctc tactttatat gtgggacgcc 60

taccatggcg tgccaagtgg tgccatgtcc gcacctggga tccgggcctg tgaaccccgg 120

gccgccgaga agcagaacat gcgaaattaa ccactgcacc accgggccgg cccctcttca 180

ggtatattt 189

<210> 78

<211> 271

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 78

cttggttcct aagggagcgg tcaccagtgc catgagctcc cagatggcac catcctctgg 60

aggaatcctc agctccccat tgtggcctgc ctttccctgt ctcgggtccc ccctcccctg 120

catcgtctgt gctctggcct cagtggtccc ttgcatttcc tccagtgggt cccatccttg 180

gacttgctgg ttctggttgg ggcatgtgtg cccctttctt tgcctaatta accatggctc 240

accctccaga tcccagctcg aaggttactc c 271

<210> 79

<211> 295

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 79

ctggcctcca ccaacacaat gccaaggaag tgacatgtgc cacttctggg taattctgtc 60

aaatatgaag ccacttgctc tcaccccacc tccctccttc ctcttcccgt tggctggaat 120

gcgaatgtgg agggtaccta gctctgacaa aaaccctaag aggaaatgga acagtaagat 180

gtaaacagaa caccccccag ctgagcaatg cctccagact atagaaggag aaaaaccctc 240

tatattattc catattaatt aagtctgtat tttgaggtct ctctattaca gcagc 295

<210> 80

<211> 390

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 80

tggcagagag ttattctagc agagtcatga aaactagctt agatgtaagg ctcaggatta 60

cacaaattgt cattcagtca gtccacaaat atttagagtg cccattaggt gtcaggtact 120

atagtacgtt gactttactc tttctgtatg tttactggca gatactagat cattctgatt 180

actttggata gggacaagaa gacttcaaat ttaaaaaaaa aaaacaaaaa aaagaggggc 240

cagcccggtg gcacagcagt taagtgcaca cattccactt tggcggccca gggttcgcca 300

gttcggatcc tgggtgtggt catggcactg cttggcaagc catgctgtgg taggcatccc 360

acatataaag tagaggaagc tgggcatgga 390

<210> 81

<211> 256

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 81

tgacccagtg tttcgttggt tcgaatcctg ggcacggaca tggcactgct catcaaacca 60

cgctgaggca gcgtcccaca taccacaaat ggaaggaccc acaacaaaga atatacaact 120

atgacaaatg gaaggaccca caacaaagaa tatacaacta tgtaccgggg ggctttgggg 180

aggaaaagga aaaaataaaa tcttttaaaa aaaaggtatt ttagggctaa aagtgacctt 240

agagatccca cagccc 256

<210> 82

<211> 329

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 82

tactgtctca cagcttggca gggtttttat ttcacttcct ttagagggtc tttgtaggcc 60

ctctaattct agcatctttg acgtaggagg aaatgtctat gccttgtgct cagttgtaac 120

tgcttactga gacctcagaa agccagtggt taccttaaaa attgtgtacc cttccgactg 180

accttattgg aatggcccct agaaaatcat cttatgtctc ttctttggct gtccatggag 240

aaacatgaat ctctgcccct cagaaatgtt attaatgtag aaacactgtt aacatgggct 300

gatcttgacc aggcactctc acctgactt 329

<210> 83

<211> 305

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 83

cctggtcaag atcagcccac attaacagtg tttctacatt aataacattt ctgaggggca 60

gagattcatg tttctccatg gacagccaaa gaagagacat aagatgattt tctaggggcc 120

attccaataa ggtcagtcgg aagggtacac aacttttaag gtaaccactg gctttctgag 180

gtctcagtaa gcagttacaa ctgagcacaa ggcatagaca tttcctccta catcaaagat 240

gctagaatta gagggcctac aaagaccctc taaaggaagc gaaataaaaa ccctgccaag 300

ctgtg 305

<210> 84

<211> 193

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 84

taaatccggt ttggaggggc ctcagcacta ttggctacaa agtctatcag cccactctta 60

ttgcaattgt cctcttaatt gggttggtac ccagtgtagc tggttgctag gctcaggggc 120

gtacagttgt gataggcctg aggccaaaaa ggctgttgtc agttctctta ggagtgcagc 180

tgagtgggac tag 193

<210> 85

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 85

tgtctgtgtt catgcgccta ttgaccgtct ccccaaatga aaggccggct ccctggggca 60

gggggttttg tcccattcac ggcggtcacc cagcgccgag cacagcgctc agcgcacagt 120

aggtgcttga ggaactgcag gtgtcgatgg gacctaggat cggggagcac cagaggaggg 180

gcggggggga tgggggcgga cggggaagca cgaggacaac agagaaggga cagtgtgaca 240

ctgtgggggt ggagccccct cggggtccgg acaaaagccg ggatctgccc ccacccacac 300

ccctacgcct cttggagccc cggcccagcc cgcttctcag ccggacagca aatcacaggc 360

cct 363

<210> 86

<211> 247

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 86

gtttgctgga atgcactgtg aagctagaaa aagaaaaaca gggaaatatt tgtgagttca 60

aaaagctttt tgacatctgt tttttttttt tttttttaag atagtgcaga aaatgtgcct 120

tttctttcca tctgattcca gccgacacaa tgccggaggc ctgggtggag cacacagtag 180

gcccgcagca ggtgctggag aaatgagtct gaagtattgt aacattactc aggaccacat 240

ttgtgtt 247

<210> 87

<211> 355

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 87

agtgaatgca gcacgtagtc atggattttc tttggctaga aagaagatta tagggaccat 60

tggcaaaatc tgagtaaggc ttatggatta gataactgta ttacatcaac gttaatatca 120

tgatttaaat aattgtattg tggttttgag aagcaggatg atttttttct ttctttcttt 180

cttttctttt ttttttcttt ttttttggtg aggaagagtg gccctaccta acatctgttg 240

ccaatattcc tctttttgct tgaggaagag tgtcattgag ttaacatcta tgccagtcct 300

tctctacttt atgtgggatg ccgccagtgt ggcttgatga gcagtgctag gtccg 355

<210> 88

<211> 299

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 88

ggaagaaacg ggaatgccaa gtcatgatag tctgtgataa gtactattat gaaattctat 60

gcaaaagtgt atgggaacaa tttacgagag ttttcctttt taagataagg aacttgcatt 120

gagtctgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtaact gacacattta agccaataaa 180

tagttaagag gaaaacctat ttcttcatct gtagtattaa agcaattact cttaatcctt 240

gggaatgttg ggatgaaatg aacgtgtgat agcatctcag aggctgactt aatgggtgt 299

<210> 89

<211> 263

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 89

ggaaggtgcc gtcagggcgg cgcccccgcc cgcgctcacc agggggccct cctccggccc 60

gcgccccgag tcggccctca tggcgcgccc ccgcaaccgc cgccgccagc cccagcccgg 120

gtccacggca ggcgagcccc gcggccaggt ctccgccccg cgcagccccg gttccagcgt 180

cggaggcggg caccctcgcg gcgcggttcg cacgcacgtg tgcggcgtgt gtgttgacac 240

gggccgttct cgagtttcct ccc 263

<210> 90

<211> 374

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 90

agcataatgc ctggctccat agtaactgct ctataatggc agcaattatt gttattaata 60

taatgactat gagtgctact gctgtttaat tcaccattgt atcttcagtg cctgacacag 120

tagaaactta ttgatacttg tagaatggat ggatggatgg acccatgtca catctgcagg 180

tttttggggt tttttttttc gctttttctc cccaaatagc cgagtacata gttgtatatt 240

ttagtcgtgg gtccttctag gtgtggcatg tgggatgctg cctcagcatg gcctgatgag 300

cggtgccacg tccgccccca ggatctgaac tggcgaaacc ctgggccgcc gaagcggagt 360

gcgcaaactt aacc 374

Claims (10)

1.一种SNP位点组合在鉴定地方驴品种中的应用；所述SNP位点组合由组合Ⅰ、组合Ⅱ、组合Ⅲ、组合Ⅳ、组合Ⅴ、组合Ⅵ、组合Ⅶ、组合Ⅷ和组合Ⅸ组成；

所述组合Ⅰ为下表所示G575532T SNP和/或C205837G SNP；所述组合Ⅱ为下表所示C286365T SNP和/或A577920T SNP和/或T4278863C SNP和/或C1780143G SNP和/或G9705930A SNP和/或T15607C SNP；所述组合Ⅲ为下表所示A9988646C SNP和/或G8455434TSNP和/或A67309G SNP；所述组合Ⅳ为下表所示A1071158T SNP；所述组合Ⅴ为下表所示C476169T SNP和/或C10558T SNP和/或C92015A SNP和/或A3881378T SNP和/或A57130GSNP和/或G1252207C SNP和/或A1607561C SNP；所述组合Ⅵ为下表所示G2035082A SNP和/或C678969T SNP和/或G41443A SNP和/或T41444C SNP；所述组合Ⅶ为下表所示C1802540GSNP和/或A63800G SNP和/或A5164328G SNP和/或C1884753T SNP；所述组合Ⅷ为下表所示C462432G SNP；所述组合Ⅸ为下表所示T156997C SNP和/或G1362413T SNP；

2.成套引物，由引物对Ⅰ、引物对Ⅱ、引物对Ⅲ、引物对Ⅳ、引物对Ⅴ、引物对Ⅵ、引物对Ⅶ、引物对Ⅷ和引物对Ⅸ组成；

所述引物对Ⅰ为下表所示by-1或by-2；所述引物对Ⅱ为下表所示gl-1、gl-2、gl-3、gl-4、gl-5或gl-6；所述引物对Ⅲ为下表所示ht-1、ht-2或ht-3；所述引物对Ⅳ为下表所示jm-1；所述引物对Ⅴ为下表所示kl-1、kl-2、kl-3、kl-4、kl-5、kl-6或kl-7；所述引物对Ⅵ为下表所示xz-1、xz-2、xz-3或xz-4；所述引物对Ⅶ为下表所示tlf-1、tlf-2、tlf-3或tlf-4；所述引物对Ⅷ为下表所示xj-1；所述引物对Ⅸ为下表所示yn-1或yn-2；

3.权利要求2所述成套引物的应用，为a-1)至a-8)中的任一种：

a-1)制备用于鉴定纯种的地方驴品种的试剂盒；a-2)制备用于鉴定地方驴品种的后代的试剂盒；a-3)制备用于鉴定待测样本是否来源于纯种的地方驴品种的试剂盒；a-4)制备用于鉴定待测样本是否来源于地方驴品种的后代的试剂盒；a-5)鉴定待测驴是否为候选的纯种的地方驴品种；a-6)鉴定待测驴是否为候选的地方驴品种的后代；a-7)鉴定待测样本是否来源于纯种的地方驴品种；a-8)鉴定待测样本是否来源于地方驴品种的后代；所述地方驴品种为泌阳驴、广灵驴、和田驴、佳米驴、库伦驴、西藏驴、吐鲁番驴、新疆驴或云南驴。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述待测样本为驴皮。

5.含有权利要求2所述成套引物的试剂盒；所述试剂盒的用途为a-5)或a-6)或a-7)或a-8)：a-5)鉴定待测驴是否为候选的纯种的地方驴品种；a-6)鉴定待测驴是否为候选的地方驴品种的后代；a-7)鉴定待测样本是否来源于纯种的地方驴品种；a-8)鉴定待测样本是否来源于地方驴品种的后代；所述地方驴品种为泌阳驴、广灵驴、和田驴、佳米驴、库伦驴、西藏驴、吐鲁番驴、新疆驴或云南驴。

6.权利要求5所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。

7.一种鉴定待测样本是否来源于地方驴品种的后代的方法，包括如下步骤：提取待测样本的总DNA并检测在权利要求1所述应用中所述SNP位点组合的基因型，然后进行如下判断：

(r-1)如果待测样本的总DNA中在所述G575532T SNP位点为GG纯合型和/或所述C205837G SNP位点为CC纯合型，则待测样本来源于泌阳驴的后代；

(r-2)如果待测样本的总DNA中在所述C286365T SNP位点为CC纯合型和/或所述A577920T SNP位点为AA纯合型和/或所述T4278863C SNP位点为TT纯合型和/或所述C1780143G SNP位点为CC纯合型和/或所述G9705930A SNP位点为GG纯合型和/或所述T15607C SNP位点为TT纯合型，则待测样本来源于广灵驴的后代；

(r-3)如果待测样本的总DNA中在所述A9988646C SNP位点为AA纯合型和/或所述G8455434T SNP位点为GG纯合型和/或所述A67309G SNP位点为AA纯合型，则待测样本来源于和田驴的后代；

(r-4)如果待测样本的总DNA中在所述A1071158T SNP位点为AA纯合型，则待测样本来源于佳米驴的后代；

(r-5)如果待测样本的总DNA中在所述C476169T SNP位点为CC纯合型和/或所述C10558T SNP位点为CC纯合型和/或所述C92015A SNP位点为CC纯合型和/或所述A3881378TSNP位点为AA纯合型和/或所述A57130G SNP位点为AA纯合型和/或所述G1252207C SNP位点为GG纯合型和/或所述A1607561C SNP位点为AA纯合型，则待测样本来源于库伦驴的后代；

(r-6)如果待测样本的总DNA中在所述G2035082A SNP位点为GG纯合型和/或所述C678969T SNP位点为CC纯合型和/或所述G41443A SNP位点为GG纯合型和/或所述T41444CSNP位点为TT纯合型，则待测驴为西藏驴的后代；

(r-7)如果待测样本的总DNA中在所述C1802540G SNP位点为CC纯合型和/或所述A63800G SNP位点为AA纯合型和/或所述A5164328G SNP位点为AA纯合型和/或所述C1884753T SNP位点为CC纯合型，则待测样本来源于吐鲁番驴的后代；

(r-8)如果待测样本的总DNA中在所述C462432G SNP位点为CC纯合型，则待测样本来源于新疆驴的后代；

(r-9)如果待测样本的总DNA中在所述T156997C SNP位点为TT纯合型和/或所述G1362413T SNP位点为GG纯合型，则待测样本来源于云南驴的后代；

所述地方驴品种为泌阳驴、广灵驴、和田驴、佳米驴、库伦驴、西藏驴、吐鲁番驴、新疆驴或云南驴。

8.一种鉴定待测样本是否来源于地方驴品种的后代的方法，包括如下步骤：以待测样本的总DNA为模板，采用权利要求2中所述引物对Ⅰ、所述引物对Ⅱ、所述引物对Ⅲ、所述引物对Ⅳ、所述引物对Ⅴ、所述引物对Ⅵ、所述引物对Ⅶ、所述引物对Ⅷ或所述引物对Ⅸ进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，然后进行如下判断：

t-1)如果采用所述by-1得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：61和/或采用所述by-2得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：62所示的DNA区段，则待测样本来源于泌阳驴的后代；

t-2)如果采用所述gl-1得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：63和/或采用所述gl-2得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：64和/或采用所述gl-3得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：65和/或采用所述gl-4得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：66和/或采用所述gl-5得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：67和/或采用所述gl-6得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：68所示的DNA区段，则待测样本来源于广灵驴的后代；

t-3)如果采用所述ht-1得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：69和/或采用所述ht-2得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：70和/或采用所述ht-3得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：71所示的DNA区段，则待测样本来源于和田驴的后代；

t-4)如果采用所述jm-1得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：72所示的DNA区段，则待测样本来源于佳米驴的后代；

t-5)如果采用所述kl-1得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：73和/或采用所述kl-2得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：74和/或采用所述kl-3得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：75和/或采用所述kl-4得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：76和/或采用所述kl-5得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：77和/或采用所述kl-6得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：78和/或采用所述kl-7得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：79所示的DNA区段，则待测样本来源于库伦驴的后代；

t-6)如果采用所述xz-1得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：80和/或采用所述xz-2得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：81和/或采用所述xz-3得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：82和/或采用所述xz-4得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：83所示的DNA区段，则待测样本来源于西藏驴的后代；

t-7)如果采用所述tlf-1得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：84和/或采用所述tlf-2得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：85和/或采用所述tlf-3得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：86和/或采用所述tlf-4得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：87所示的DNA区段，则待测样本来源于吐鲁番驴的后代；

t-8)如果采用所述xj-1得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：88所示的DNA区段，则待测样本来源于新疆驴的后代；

t-9)如果采用所述yn-1得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：89和/或采用所述yn-2得到的PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：90所示的DNA区段，则待测样本来源于云南驴的后代；

所述地方驴品种为泌阳驴、广灵驴、和田驴、佳米驴、库伦驴、西藏驴、吐鲁番驴、新疆驴或云南驴。

9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述后代为纯种或杂种。

10.一种鉴定待测驴属于地方驴品种中的哪个品种的方法，包括如下步骤：

w-1)以待测驴的基因组DNA为模板，采用权利要求2中所述引物对Ⅰ、所述引物对Ⅱ、所述引物对Ⅲ、所述引物对Ⅳ、所述引物对Ⅴ、所述引物对Ⅵ、所述引物对Ⅶ、所述引物对Ⅷ或所述引物对Ⅸ进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；以标准地方驴品种群中的各个标准地方驴品种的基因组DNA为模板，采用权利要求2中所述引物对Ⅰ、所述引物对Ⅱ、所述引物对Ⅲ、所述引物对Ⅳ、所述引物对Ⅴ、所述引物对Ⅵ、所述引物对Ⅶ、所述引物对Ⅷ或所述引物对Ⅸ进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；所述标准地方驴品种群由泌阳驴、广灵驴、和田驴、佳米驴、库伦驴、西藏驴、吐鲁番驴、新疆驴和云南驴组成；

w-2)将待测驴得到的PCR扩增产物与每个标准地方驴品种得到的PCR扩增产物进行比对，比对结果中待测驴与哪个标准地方驴品种一致，该待测驴与该标准地方驴品种即为同一个品种。