CN108504769A - 一种与光周期敏感的白菜类作物开花时间紧密连锁的InDel分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明选用早开花的油用型品种‘YS‑143’与晚开花的芜菁品种‘VT‑044’为试材，分别观察其在长日照和短日照两个条件下的开花时间。同时以两个材料为模板克隆这个基因的cDNA序列，并利用生物信息学技术对其氨基酸序列进行分析，发现早花型和晚花型白菜类作物CCA1基因上的差异位点，并通过生物信息学、测序比对等分析得到了初步确认，开发出一个InDel标记。所述InDel分子标记的核苷酸序列为ACCCTT，位于早花型白菜类作物CCA1基因的第六个外显子上，但不存在于晚花型白菜类作物CCA1基因编码区。最后通过验证，将其作为功能标记进行分子辅助育种工作。本发明的分子标记可简便、快速、高通量地应用于育种实践。

Description

一种与光周期敏感的白菜类作物开花时间紧密连锁的InDel 分子标记及其应用

技术领域

本发明属于基因工程及分子生物学领域，具体涉及一种与光周期敏感的白菜类作物开花时间紧密连锁的InDel分子标记及其应用。

背景技术

白菜类作物(Brassica rapa)属于十字花科(Cruciferae)芸薹属(Brassica)，是中国乃至世界范围内重要的蔬菜和油料作物，主要包括大白菜、小白菜、芜菁、菜薹、紫菜薹、白菜型油菜等多种类型[1]。油用白菜类作物包括春性和冬性欧洲生态类型、我国特有的白菜型油菜和印度的Sarson类型，以根茎膨大为主要特征的芜菁类型是较原始的白菜类作物栽培种[2]。白菜类作物在开花习性上有一年生和二年生之分，在抽薹、开花时间上存在很大的差异。因此，白菜类作物是研究抽薹、开花变异，进行育种和遗传学研究的良好体系[3]。

开花时间是白菜类作物生产中重要的农艺性状，是其从营养生长到生殖生长的重要标志，先抽薹、开花的现象直接影响了其产量和品质[4-5]。开花时间是由其内源发育信号和多种环境因素共同调控的，其中环境温度和光周期是主要影响因子[6]。Nelson等对起源于欧洲和澳大利亚的一年生夏季甘蓝型油菜进行了光周期敏感性观察，同时对不同光周期(长日照、短日照)条件下的131份双单倍体(Double Haploid)群进行了开花时间(天数)和开花时叶片数进行了观察，发现该亲本及群体开花时间受光周期影响[7]。已有研究表明，植物开花的光周期调控途径涉及复杂的昼夜节律(生物钟)调控网络，昼夜节律(生物钟)核心震荡子包括CCA1和LATEELONGATEDHYPOCOTYL(LHY)等MYB类转录因子[8]。在拟南芥中，CCA1基因通过与TIMING OF CABEXP RESSION 1(TOC1)和LHY基因相互作用形成一个生物钟的反馈环，即CCA1和LHY基因表达达到一定量会抑制TOC1基因的表达，而TOC1基因表达量升高则会促进CCA1和LHY基因表达，进而调控植物对昼夜变化做出响应，是维持生物钟节律的必需组分[9-11]。研究者已经在芸薹属的多种类型中测序发现CCA1存在多个多态性位点，表明CCA1序列变异可用于开发与育种性状相关的分子标记[12]。张志刚等利用CCA1基因在两个敏感性不同的大白菜品种上第329bp(第4外显子)处和1407bp(第7外显子)处的两段序列差异开发出两个InDel标记，用于区分两个大白菜品种的耐抽薹性[13]。Yi等对三个芜菁自交系(RCBr、Kenshin和Chiifu)的DNA序列进行分析，在CCA1基因第4内含子上开发出一个InDel标记[12]。

但是白菜类作物种类繁多，对光周期敏感性存在差异，仅在大白菜或仅在芜菁上进行克隆序列的比较和标记的开发具有一定局限性，而且一般认为外显子上的变异比内含子上的变异更有可能影响植物的表型。

在中国春季及高寒地区的秋冬白菜类作物生产中，先期抽薹、开花常常成为降低蔬菜产量和品质的重要难题[1]。因此，选育一种对光周期敏感耐抽薹、晚开花的优质新品种，已经成为白菜类作物育种中的重要目标，开发对光周期敏感的白菜类作物不同类型CCA1基因的分子标记，可为分子标记辅助育种提供一定的理论依据[14]。

发明内容

本发明为解决如何筛选对光周期敏感白菜类作物耐抽薹、晚开花的优质新品种的问题，提供一种与白菜类作物开花时间紧密连锁的InDel分子标记，方便鉴定对光周期敏感的白菜类作物开花时间以及在白菜类作物分子辅助育种中的应用。

本发明选用光周期敏感型早开花的油用型品种‘YS-143’与光周期敏感型晚开花的芜菁品种‘VT-044’为试材，同时以两个材料为模板克隆这个基因的cDNA序列，并利用生物信息学技术对其氨基酸序列进行分析，发现早花型和晚花型白菜类作物CCA1基因上的差异位点，并通过生物信息学、测序比对等分析得到了初步确认，开发出一个InDel标记，最后通过验证，将其作为功能标记进行分子辅助育种工作。本发明的分子标记可简便、快速、高通量地应用于育种实践。

本发明的第一个目的是提供一种与对光周期敏感的白菜类作物开花时间紧密连锁的InDel分子标记，所述InDel分子标记的核苷酸序列为ACCCTT。

进一步的，所述InDel分子标记的核苷酸序列存在于早花型与光周期敏感的白菜类作物CCA1基因编码区第六个外显子上，但不存在于晚花型与光周期敏感的白菜类作物CCA1基因编码区。

本发明的第二个目的是提供用于检测上述的InDel分子标记的特异性引物对，所述引物对的核苷酸序列如下所示：

正向引物：5′-CCATCATCAGTCCTTTCCTGA-3′(SEQ ID NO.5)，

反向引物：5′-AGCTAAAAGGAGCGCAGAGA-3′(SEQ ID NO.6)。

本发明的第三个目的是提供上述InDel分子标记的筛选方法，所述筛选方法包括如下步骤：

(1)以光周期敏感的早花型油用型品种‘YS-143’与晚花型芜菁品种‘VT-044’为亲本材料，提取两者的总RNA，分别反转录cDNA；

(2)以两亲本cDNA作为基因克隆所需的模板，针对CCA1基因设计引物，进行PCR扩增，得到两亲本CCA1基因扩增产物；

(3)对两亲本CCA1基因扩增产物测序验证，所述‘YS-143’的CCA1基因扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，‘VT-044’的CCA1基因扩增产物的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，将依据测序结果发现的差异位点作为候选标记；在候选标记两侧保守区设计引物；

(4)分别提取F₂代群体中早花型植株和晚花型植株的DNA，作为基因克隆所需的模板，采用步骤(3)设计的特异引物分别进行PCR扩增，将扩增产物进行测序；

(5)以候选标记基因型作为自变量，采用单因素方差分析候选标记与开花时间表型的相关性，将步骤(4)的测序结果与植株开花时间进行关联分析，确定本发明第一个目的提供的CCA1基因编码区第六个外显子上的与白菜类作物开花时间紧密连锁的InDel分子标记与材料开花时间关联显著，即油用型品种‘YS-143’的CCA1基因的第727-732个碱基的变异，即参考基因组v1.5(http://brassicadb.org/brad/index.php)5号染色体的从5’端起的第472204-472209位(A05：472204-472209)会影响白菜类作物的开花时间，为与白菜类作物开花时间紧密连锁的InDel分子标记，可以为白菜类作物开花时间的研究提供理论依据，同时，该位点可以做为功能分子标记进行辅助育种工作，加快育种进程。

本发明的第四个目的是提供上述InDel分子标记在鉴定光周期敏感性的白菜类作物开花时间中的应用。

本发明的第五个目的是提供上述的特异性引物对在鉴定光周期敏感性的白菜类作物开花时间中的应用。

本发明的第六个目的是提供上述的InDel分子标记在光周期敏感性的白菜类作物选育中的应用。

本发明的第七个目的是提供上述的特异性引物对在光周期敏感性的白菜类作物选育中的应用。

进一步的，上述任一条所述的应用，括如下步骤：

(1)提取光周期敏感的白菜类作物待测植株的基因组DNA；

(2)以待测植株的基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所述特异性引物对，进行PCR扩增反应；

(3)对PCR扩增产物测序，当测序结果显示所测白菜类作物待测植株含有所述纯合InDel标记，即基因型为ACCCTT/ACCCTT时，为早开花型；所测白菜类作物待测植株缺失所述纯合InDel标记，且所述缺失纯合InDel标记的基因型不包括杂合ACCCTT/-的情况，即待测植株基因型为-/-时，为晚开花型。

进一步的，步骤(2)中，PCR扩增体系总体积为40μL：正、反向引物各2μL、模板cDNA1μL、高保真酶MIX 20μL、ddH2O 15μL；PCR反应程序为98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸10s，35个循环；72℃延伸5min；PCR扩增产物10℃保存。

在此需要指出的是，虽然本发明的实验材料取自光周期敏感的早开花的油用型品种‘YS-143’与晚开花的芜菁品种‘VT-044’为亲本的F₂代植株，但是在白菜类作物中，各光周期敏感的品种的CCA1基因序列是基本相同的，因此，如SEQ ID NO.1所示的‘YS-143’的CCA1基因序列可以作为各品种的参考序列。

在本发明中，对光周期敏感的白菜类作物只要包含纯合的如上所述位于CCA1基因的第六个外显子上的与白菜类作物开花时间紧密连锁的InDel标记的核苷酸序列，即基因型为ACCCTT/ACCCTT时，即可确定为早花型品种；所测白菜类作物待测植株缺失所述纯合InDel标记，且所述缺失纯合InDel标记的基因型不包括杂合ACCCTT/-的情况，即待测植株基因型为-/-时，为晚开花型。

本发明技术方案的有益效果在于：

(1)本发明根据插入区域两侧保守序列设计引物，通过对基因组DNA进行PCR扩增后，对扩增产物直接测序，即可区分白菜类作物开花时间类型，准确率高于75％，不需要酶切等繁琐的步骤，避免了繁琐操作过程。

(2)本发明InDel分子标记变异稳定，适用性广，能够应用于多种光周期敏感性的白菜类作物，如：白菜、小白菜、芜菁、菜薹、紫菜薹、白菜型油菜等多种类型，是一个普遍性标记，加快了白菜类作物开花时间鉴定和验证，提高了白菜类作物的筛选效率和准确率，可对白菜类作物杂交后代进行标记辅助选择，以转育晚花性状，避免了常规育种方法中选择的盲目性，从而最大限度的加快育种进程。

(3)本发明关于CCA1基因功能标记的开发与利用，可为光周期敏感性的白菜类作物分子标记辅助育种提供一定的理论依据和现实意义，为开发通用的白菜类作物InDel标记提供了重要的一步。

附图说明

图1实施例1中不同光周期条件下亲本材料‘YS-143’与‘VT-044’的开花时间对比柱状图；

图2实施例2中‘YS-143’与‘VT-044’的CCA1基因核苷酸序列比对；

图3实施例2中‘YS-143’与‘VT-044’的CCA1基因及氨基酸序列比对；

图4实施例3中不同基因型开花时间箱型图

○表示最大值，△表示最小值，□表示平均值，*表示P值。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。以下实施例中所涉及的原料，如无特别说明均为市售，所涉及检测方法如无特别说明，则均为常规方法。

本研究选用光周期敏感型早开花的油用型品种‘YS-143’与光周期敏感型晚开花的芜菁型品种‘VT-044’为试材，同时以两个材料为模板克隆这个基因的cDNA序列，并利用生物信息学技术对其氨基酸序列进行分析，开发出一个InDel标记，最后通过验证，将其作为功能标记进行辅助育种工作。

实施例1确定光周期敏感性材料

2017年8月3号，将亲本材料种子20粒分别在铺有滤纸的培养皿里催芽，25℃暗培养36h后播种在穴盘里，分别置于长日照(光照16h/黑暗8h)、短日照(光照8h/黑暗16h)，温度22℃/18℃，相对湿度70％，光强72μmol·m-2·s-1光培箱中生长，一个月后定植花盆(17cM)。同时，将F₂代分离群体180株也播种在穴盘中，置于塑料大棚生长3周以后，于2017年8月24日至2017年12月26日定植于南京农业大学句容农博园塑料大棚里，按照单株顺序编号，正常田间管理。观察亲本和F₂代分离群体的开花时间，开花时间调查标准为从催芽到第1朵花开放所需要的时间(天数)。

10株亲本材料‘YS-143’在长日照条件下平均开花时间为(48±10)d，短日照条件下为(96±10)d；10株‘VT-044’在长日照条件下平均开花时间为(105±15)d，短日照条件下在统计时间内没有开花，记为200d。

通过t测验发现，这两个亲本在不同光周期处理下的开花时间均差异极显著(图1)。由此证明，两亲本开花时间均受光周期影响，均为光周期敏感性材料。

实施例2确定候选标记

使用RNA Simple Total RNA Kit试剂盒(TaKaRa)提取两亲本的总RNA，具体方法参照试剂盒说明书。cDNA使用PrimeScript^TMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(TaKaRa)反转录合成，作为基因克隆所需的模板。

CCA1基因序列参照已发表的大白菜基因组序列(http://brassicadb.org/brad/:Bra004503；NCBI登录号:LOC103866427)，使用在线软件Primer 3(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)设计CCA1基因特异扩增的PCR引物，

CCA1-F：ATGGAGACTAATTCGTCTGGAG(SEQ ID NO.7)，

CCA1-R：TCATGTTGAAGTTTGTGTTTCC(SEQ ID NO.8)

并由南京擎科公司合成。

PCR扩增体系总体积为40μL：正反引物各2μL、模板cDNA 1μL、高保真酶MIX 20μL、ddH2O 15μL。PCR反应程序为98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸10s，35个循环；72℃延伸5min；10℃保存。

cDNA质量的检验采用琼脂糖凝胶电泳方法，取5μLDNA加入6×loading buffer后用1.2％琼脂糖电泳检测，GelRed染色，用培清公司的JS-3000全自动凝胶成像分析仪进行凝胶照相。凝胶回收方法参照AxyPrep DNA回收试剂盒。目的片段胶回收后连接到pEAZY-Blunt载体上，转化进大肠杆菌感受态细胞DH5α中，选择阳性单克隆送擎科生物公司测序。pEAZY-Blunt载体及大肠杆菌感受态细胞DH5α购自全式金生物公司，高保真酶MIX(1.5TM2XHigh-Fidelity Master Mix)购自擎科公司，琼脂糖凝胶回收试剂盒购自Axygen公司。

测序结果表明，‘YS-143’的cDNA序列长度为1665bp(SEQ ID NO.1)，‘VT-044’的序列长度为1647bp(SEQ ID NO.2)，除了前者比后者多了四段差异位点共18bp的插入，作为4个候选标记。除此之外，整个编码区还有8处SNPs，其中2处是非同义突变。(图2)。

根据cDNA序列预测的早花类型YS-143的CCA1基因氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，晚花类型VT-044的CCA1基因氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

经预测，4个候选标记中，第一段插入使‘YS-143’的CCA1蛋白第110位后的氨基酸插入Arg和Lys两个残基；第二段插入使‘YS-143’的CCA1蛋白第242位后的氨基酸插入Thr和Leu两个残基；第三段使‘YS-143’的CCA1蛋白第263位后的氨基酸插入Gly残基；第四段使‘YS-143’的CCA1蛋白第504位后的氨基酸插入Leu残基；另外两处非同义突变分别是‘YS-143’的CCA1蛋白第158位氨基酸由Val突变为Leu，第467位氨基酸由Gln突变为Lys(图3)。

实施例3候选标记与F₂代群体开花时间相关性分析鉴定

提取F₂代群体极早和极晚开花植株各24株叶片的DNA，具体方法参照Axygen植物基因组DNA提取试剂盒。

对亲本中鉴定到的CCA1编码区4个候选标记(InDels)设计特异引物pF1、pR1；pF2、pR2；pF3、pR3(表1)；

将极早开花植株DNA和极晚开花植株DNA各分为4组，共8组，分别作为各差异位点基因克隆所需的模板，进行PCR扩增，此处4个候选标记及各组采用的引物分别为：

表1试验中所用引物序列

各组PCR扩增体系总体积为40μL：正反引物各2μL、模板cDNA 1μL、高保真酶MIX 20μL、ddH2O 15μL。PCR反应程序为98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸10s，35个循环；72℃延伸5min；10℃保存。

扩增产物送南京擎科公司测序。采用t测验分析亲本的开花时间差异显著性。以InDel标记基因型作为自变量，采用单因素方差分析候选标记(InDel)与开花时间表型的相关性，统计学分析过程中所用的软件是SPSS 19.0。

将四个InDel候选标记在极早和极晚开花植株上的测序结果与植株开花时间进行关联分析，发现位于CCA1基因第六个外显子上的第2处标记(第727-732个碱基的缺失)与材料开花时间关联显著，其余3处不显著。

测序发现在F₂代的24株极早开花的植株中，该位点基因型为ACCCTT/ACCCTT的有18株(与早花型母本‘YS-143’一致)，占总株数的75％，开花时间为25-36d，平均开花时间31d，基因型为ACCCTT/-的有3株，-/-的有3株；在24株极晚开花的植株中，该位点基因型为ACCCTT/ACCCTT的有0株，ACCCTT/-的有5株，基因型为-/-的有19株(与晚花型父本‘VT-044’一致)，占总株数的79％，开花时间为55-78d，平均开花时间为60d。因此，该位点基因型为ACCCTT/ACCCTT植株的开花时间远早于基因型为-/-植株的开花时间，两者之间呈极显著差异(P<0.01)(图4)。

该InDel标记基因型和开花时间表型的Pearson相关性分析表明，材料开花时间的早晚与基因型呈显著相关(r＝0.991，P<0.01)。表明CCA1基因第六个外显子上的变异，即油用型品种‘YS-143’的CCA1基因的第727-732个碱基的变异，参考基因组v1.5(http://brassicadb.org/brad/index.php)5号染色体的从5’端起的第472204-472209位(A05：472204-472209)与开花时间显著相关，会影响植株的开花时间，为与白菜类作物开花时间紧密连锁的InDel分子标记，可以为不结球白菜光周期影响开花时间的研究提供理论依据。同时，该位点可以做为功能分子标记进行辅助育种工作，加快育种进程。

已有研究指出在现代育种中，改良某个特定的优良性状，最有效的途径就是选择携带某一性状的目的基因的供体亲本进行回交，同时利用各种分子标记进行辅助选择，迅速地将与分子标记连锁的基因转移到另外一个品种上，从而显著加速育种年限[15]。本研究关于CCA1基因功能标记的开发与利用，可为白菜类作物分子标记辅助育种提供一定的理论依据和现实意义，为开发通用的白菜类作物InDel标记提供了重要的一步。

实施例4有效性验证

为进一步验证上述方法的有效性，对早花型品种RC-144，晚花型品种CX-58、BRO-30、WO-083采用上述方法进行检测。

(1)提取白菜类作物待测植株的基因组DNA；

(2)以待测植株的基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所述特异性引物对，进行PCR扩增反应；

(3)对PCR扩增产物测序。

PCR扩增体系总体积为40μL：正、反向引物各2μL、模板cDNA1μL、高保真酶MIX 20μL、ddH2O 15μL；PCR反应程序为98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸10s，35个循环；72℃延伸5min；PCR扩增产物10℃保存。

PCR产物测序及分析

使用分析软件SPSS 19.0直接对PCR扩增产物的测序结果进行分析，测序分析结果：早花型品种RC-144的PCR扩增产物的核苷酸序列存在与白菜类作物开花时间紧密连锁的InDel分子标记ACCCTT，且基因型为纯合ACCCTT/ACCCTT；晚花型品种CX-58、BRO-30、WO-083的PCR扩增产物的核苷酸序列不存在与白菜类作物开花时间紧密连锁的InDel分子标记ACCCTT，即基因型为-/-。测序结果与表型一致，说明此方法具有可靠性和广泛的适用性。

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序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种与光周期敏感的白菜类作物开花时间紧密连锁的InDel分子标记及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1665

<212> DNA

<213> 白菜类作物(Brassica rapa)

<400> 1

atggagacta attcgtctgg agaagatctg gttgttaaga cgagaaagcc gtatacgata 60

acaaagcaac gtgaaagatg gactgaggaa gaacataata ggttccttga tgccttgagg 120

ctctacggta gagcctggca aaagatcgaa gaacatgtag caacgaaaac tgctgtccag 180

attagaagcc atgctcagaa atttttctcc aaggtagaga aagaggctga agctaaaggt 240

gtaccagtgg ctcaaacgct agacatagct atccctcctc cgcgccctaa acgaaaacca 300

aacaatcctt atcctagaaa gaccggaact cggaagggat ctctccccat ctcaaaaccg 360

ggtctgaatg atggaaaaga gtcccttgga tcaggaaaag tttcgcttcc tgagacgacc 420

aatgaagatc tgcaggaaga caactgctca gactgtctca ctcatcaaca cctctctgct 480

gcatcaaacg caagcacttt tctagagttc ttaccttcac gggaacaggg gaataacaag 540

gagtcaaact cagccaatta cagtgaacct cagacttatc caaggcatat ccctctgcta 600

gttccattgg ggagctccat aacaacctct ctgtcacatg ctcctccttc agatccagac 660

gagaacagtc atcatcccca cacagtttca ggccatcatc agtcctttcc tgaccatatc 720

atgtccaccc ttttacaaac accagctcta tacacagctg catctttcgc ctccacgttt 780

ggtggcggcg gcccacaagg gaacttagcc gccatggctg cagccaccgt tgcagctgca 840

agtgcttggt gggccgccaa tggaatgcta cctctctgcg ctccttttag ctcaggtggt 900

ttgacctgtc accctccagc tactgcttat ggaccttccg gtgaagtaga ccacacaaaa 960

acagtggatc aagaacactc tgaggcttca aaggctagat cttcgttgga atcagaggag 1020

gctaaaaatg ggagtaaacc agattgtcat catcatcctt gtgcagcgac cgagactgat 1080

gcaaagggat cagatggagc gagggacaga aagcaagttg acaggtcttc ttgtggctcg 1140

aacactcctt cgagtagtga cgatgttgag gctgatgctt tggtggagag gcaagagaac 1200

ggtggtacca ccaatgagga agtgaaagaa gtggatgggg acactactaa caatccacaa 1260

acttcagagt ctaatgcgcg acgcagtaga atcagtagct ctaacttagc tgatccatgg 1320

aagtctgttt cagatgaggg acgaattgct tttagagctc tgtttgcaag agaagtgttg 1380

ccacaaagtt ttacatataa gagagaggag ggtcaacaac aaagatatcc aatggagctt 1440

gatcttaact cagcagctga tgatcaagaa gagaacagaa acatagcgtt tttgggtgct 1500

tcaaagcagc agctattaag tagaggaagg acaggtttca agccttacaa aagatgttca 1560

atggaagcta aagaaagtag agtcatcagc aacaccaatc ctatcatcag tgttgaacag 1620

aaagatccta agcggattcg gttggaaaca caaacttcaa catga 1665

<210> 2

<211> 1647

<212> DNA

<213> 白菜类作物(Brassica rapa)

<400> 2

atggagacta attcgtctgg agaagatctg gttgttaaga cgagaaagcc gtatacgata 60

acaaagcaac gtgaaagatg gactgaggaa gaacataata ggttccttga tgccttgagg 120

ctttacggta gagcctggca aaagatcgaa gaacatgtag caacgaaaac tgctgtccag 180

attagaagcc atgctcagaa atttttctcc aaggtagaga aagaggctga agctaaaggt 240

gtaccagtgg ctcaaacgct agacatagct atccctcctc cgcgccctaa acgaaaacca 300

aacaatcctt atcctagaaa gaccggaact ggatctctcc ccatctcaaa accgggtctg 360

aatgatggaa aagagtccct tggatcagga aaagtttctc ttcctgagac gaccaatgaa 420

gatctgcagg aagacaactg ctcagactgt ctcactcatc aacacgtctc tgctgcatca 480

aacgcaagca cttttctaga gttcttacct tcacgggaac aggggaataa caaggagtca 540

aactcagcca attacagtga acctcagact tatccaaggc atatccctct gctagttcca 600

ttggggagct ccataacaac ctctctgtca catgctcctc cttcagatcc agacgagaac 660

agtcatcatc cccacacagt ttcaggccat catcagtcct ttcctgacca tatcatgtcc 720

ttacaaacac cagctctata cacagctgca tctttcgcct ccacgtttgg tggcggccca 780

caagggaact tagccgccat ggctgcagcc actgttgcag ctgcaagtgc ttggtgggcc 840

gccaatggaa tgctacctct ctgcgctcct tttagctcag gtggtttgac ctgtcaccct 900

ccagctactg cttatggacc ttccggtgaa gtagaccaca caaaaacagt ggatcaagaa 960

cactccgagg cttcaaaggc tagatcttcg ttggaatcag aggaggctaa aaatgggagt 1020

aaaccagatt gtcatcatca tccttgtgca gcgaccgaga ctgatgcaaa gggatcagat 1080

ggagcgaggg acagaaagca agttgacagg tcttcttgtg gctcgaacac tccttcgagt 1140

agtgacgatg ttgaggctga tgctttggtg gagaggcaag agaacggtgg caccaccaat 1200

gaggaagtga aagaagtgga tggggacact actaacaatc cacaaacttc agagtctaat 1260

gcgcgacgca gtagaatcag tagctctaac ttagctgatc catggaagtc tgtttcagat 1320

gagggacgaa ttgcttttag agctctgttt gcaagagaag tgttgccaca aagttttaca 1380

tatcagagag aggagggtca acaacaaaga tatccaatgg agcttgatct taactcagca 1440

gctgatgatc aagaagagaa cagaaacata gcgtttttgg gtgcttcaaa gcagcagcta 1500

agtagaggaa ggacaggttt caagccttac aaaagatgtt caatggaagc taaagaaagt 1560

agagtcatca gcaacaccaa tcctatcatc agtgttgaac agaaagatcc taagcggatt 1620

aggttggaaa cacaaacttc aacatga 1647

<210> 3

<211> 554

<212> PRT

<213> 白菜类作物(Brassica rapa)

<400> 3

Met Glu Thr Asn Ser Ser Gly Glu Asp Leu Val Val Lys Thr Arg Lys

1 5 10 15

Pro Tyr Thr Ile Thr Lys Gln Arg Glu Arg Trp Thr Glu Glu Glu His

20 25 30

Asn Arg Phe Leu Asp Ala Leu Arg Leu Tyr Gly Arg Ala Trp Gln Lys

35 40 45

Ile Glu Glu His Val Ala Thr Lys Thr Ala Val Gln Ile Arg Ser His

50 55 60

Ala Gln Lys Phe Phe Ser Lys Val Glu Lys Glu Ala Glu Ala Lys Gly

65 70 75 80

Val Pro Val Ala Gln Thr Leu Asp Ile Ala Ile Pro Pro Pro Arg Pro

85 90 95

Lys Arg Lys Pro Asn Asn Pro Tyr Pro Arg Lys Thr Gly Thr Arg Lys

100 105 110

Gly Ser Leu Pro Ile Ser Lys Pro Gly Leu Asn Asp Gly Lys Glu Ser

115 120 125

Leu Gly Ser Gly Lys Val Ser Leu Pro Glu Thr Thr Asn Glu Asp Leu

130 135 140

Gln Glu Asp Asn Cys Ser Asp Cys Leu Thr His Gln His Leu Ser Ala

145 150 155 160

Ala Ser Asn Ala Ser Thr Phe Leu Glu Phe Leu Pro Ser Arg Glu Gln

165 170 175

Gly Asn Asn Lys Glu Ser Asn Ser Ala Asn Tyr Ser Glu Pro Gln Thr

180 185 190

Tyr Pro Arg His Ile Pro Leu Leu Val Pro Leu Gly Ser Ser Ile Thr

195 200 205

Thr Ser Leu Ser His Ala Pro Pro Ser Asp Pro Asp Glu Asn Ser His

210 215 220

His Pro His Thr Val Ser Gly His His Gln Ser Phe Pro Asp His Ile

225 230 235 240

Met Ser Thr Leu Leu Gln Thr Pro Ala Leu Tyr Thr Ala Ala Ser Phe

245 250 255

Ala Ser Thr Phe Gly Gly Gly Gly Pro Gln Gly Asn Leu Ala Ala Met

260 265 270

Ala Ala Ala Thr Val Ala Ala Ala Ser Ala Trp Trp Ala Ala Asn Gly

275 280 285

Met Leu Pro Leu Cys Ala Pro Phe Ser Ser Gly Gly Leu Thr Cys His

290 295 300

Pro Pro Ala Thr Ala Tyr Gly Pro Ser Gly Glu Val Asp His Thr Lys

305 310 315 320

Thr Val Asp Gln Glu His Ser Glu Ala Ser Lys Ala Arg Ser Ser Leu

325 330 335

Glu Ser Glu Glu Ala Lys Asn Gly Ser Lys Pro Asp Cys His His His

340 345 350

Pro Cys Ala Ala Thr Glu Thr Asp Ala Lys Gly Ser Asp Gly Ala Arg

355 360 365

Asp Arg Lys Gln Val Asp Arg Ser Ser Cys Gly Ser Asn Thr Pro Ser

370 375 380

Ser Ser Asp Asp Val Glu Ala Asp Ala Leu Val Glu Arg Gln Glu Asn

385 390 395 400

Gly Gly Thr Thr Asn Glu Glu Val Lys Glu Val Asp Gly Asp Thr Thr

405 410 415

Asn Asn Pro Gln Thr Ser Glu Ser Asn Ala Arg Arg Ser Arg Ile Ser

420 425 430

Ser Ser Asn Leu Ala Asp Pro Trp Lys Ser Val Ser Asp Glu Gly Arg

435 440 445

Ile Ala Phe Arg Ala Leu Phe Ala Arg Glu Val Leu Pro Gln Ser Phe

450 455 460

Thr Tyr Lys Arg Glu Glu Gly Gln Gln Gln Arg Tyr Pro Met Glu Leu

465 470 475 480

Asp Leu Asn Ser Ala Ala Asp Asp Gln Glu Glu Asn Arg Asn Ile Ala

485 490 495

Phe Leu Gly Ala Ser Lys Gln Gln Leu Leu Ser Arg Gly Arg Thr Gly

500 505 510

Phe Lys Pro Tyr Lys Arg Cys Ser Met Glu Ala Lys Glu Ser Arg Val

515 520 525

Ile Ser Asn Thr Asn Pro Ile Ile Ser Val Glu Gln Lys Asp Pro Lys

530 535 540

Arg Ile Arg Leu Glu Thr Gln Thr Ser Thr

545 550

<210> 4

<211> 548

<212> PRT

<213> 白菜类作物(Brassica rapa)

<400> 4

Met Glu Thr Asn Ser Ser Gly Glu Asp Leu Val Val Lys Thr Arg Lys

1 5 10 15

Pro Tyr Thr Ile Thr Lys Gln Arg Glu Arg Trp Thr Glu Glu Glu His

20 25 30

Asn Arg Phe Leu Asp Ala Leu Arg Leu Tyr Gly Arg Ala Trp Gln Lys

35 40 45

Ile Glu Glu His Val Ala Thr Lys Thr Ala Val Gln Ile Arg Ser His

50 55 60

Ala Gln Lys Phe Phe Ser Lys Val Glu Lys Glu Ala Glu Ala Lys Gly

65 70 75 80

Val Pro Val Ala Gln Thr Leu Asp Ile Ala Ile Pro Pro Pro Arg Pro

85 90 95

Lys Arg Lys Pro Asn Asn Pro Tyr Pro Arg Lys Thr Gly Thr Gly Ser

100 105 110

Leu Pro Ile Ser Lys Pro Gly Leu Asn Asp Gly Lys Glu Ser Leu Gly

115 120 125

Ser Gly Lys Val Ser Leu Pro Glu Thr Thr Asn Glu Asp Leu Gln Glu

130 135 140

Asp Asn Cys Ser Asp Cys Leu Thr His Gln His Val Ser Ala Ala Ser

145 150 155 160

Asn Ala Ser Thr Phe Leu Glu Phe Leu Pro Ser Arg Glu Gln Gly Asn

165 170 175

Asn Lys Glu Ser Asn Ser Ala Asn Tyr Ser Glu Pro Gln Thr Tyr Pro

180 185 190

Arg His Ile Pro Leu Leu Val Pro Leu Gly Ser Ser Ile Thr Thr Ser

195 200 205

Leu Ser His Ala Pro Pro Ser Asp Pro Asp Glu Asn Ser His His Pro

210 215 220

His Thr Val Ser Gly His His Gln Ser Phe Pro Asp His Ile Met Ser

225 230 235 240

Leu Gln Thr Pro Ala Leu Tyr Thr Ala Ala Ser Phe Ala Ser Thr Phe

245 250 255

Gly Gly Gly Pro Gln Gly Asn Leu Ala Ala Met Ala Ala Ala Thr Val

260 265 270

Ala Ala Ala Ser Ala Trp Trp Ala Ala Asn Gly Met Leu Pro Leu Cys

275 280 285

Ala Pro Phe Ser Ser Gly Gly Leu Thr Cys His Pro Pro Ala Thr Ala

290 295 300

Tyr Gly Pro Ser Gly Glu Val Asp His Thr Lys Thr Val Asp Gln Glu

305 310 315 320

His Ser Glu Ala Ser Lys Ala Arg Ser Ser Leu Glu Ser Glu Glu Ala

325 330 335

Lys Asn Gly Ser Lys Pro Asp Cys His His His Pro Cys Ala Ala Thr

340 345 350

Glu Thr Asp Ala Lys Gly Ser Asp Gly Ala Arg Asp Arg Lys Gln Val

355 360 365

Asp Arg Ser Ser Cys Gly Ser Asn Thr Pro Ser Ser Ser Asp Asp Val

370 375 380

Glu Ala Asp Ala Leu Val Glu Arg Gln Glu Asn Gly Gly Thr Thr Asn

385 390 395 400

Glu Glu Val Lys Glu Val Asp Gly Asp Thr Thr Asn Asn Pro Gln Thr

405 410 415

Ser Glu Ser Asn Ala Arg Arg Ser Arg Ile Ser Ser Ser Asn Leu Ala

420 425 430

Asp Pro Trp Lys Ser Val Ser Asp Glu Gly Arg Ile Ala Phe Arg Ala

435 440 445

Leu Phe Ala Arg Glu Val Leu Pro Gln Ser Phe Thr Tyr Gln Arg Glu

450 455 460

Glu Gly Gln Gln Gln Arg Tyr Pro Met Glu Leu Asp Leu Asn Ser Ala

465 470 475 480

Ala Asp Asp Gln Glu Glu Asn Arg Asn Ile Ala Phe Leu Gly Ala Ser

485 490 495

Lys Gln Gln Leu Ser Arg Gly Arg Thr Gly Phe Lys Pro Tyr Lys Arg

500 505 510

Cys Ser Met Glu Ala Lys Glu Ser Arg Val Ile Ser Asn Thr Asn Pro

515 520 525

Ile Ile Ser Val Glu Gln Lys Asp Pro Lys Arg Ile Arg Leu Glu Thr

530 535 540

Gln Thr Ser Thr

545

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccatcatcag tcctttcctg a 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agctaaaagg agcgcagaga 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atggagacta attcgtctgg ag 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tcatgttgaa gtttgtgttt cc 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agtggctcaa acgctagaca 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcgtctcagg aagcgaaact 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

acatagcgtt tttgggtgct t 21

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tccgcttagg atctttctgt tc 22

Claims (10)

1.一种与光周期敏感的白菜类作物开花时间紧密连锁的InDel分子标记，其特征在于，所述InDel分子标记的核苷酸序列为ACCCTT。

2.根据权利要求1所述的InDel分子标记，其特征在于，所述InDel分子标记的核苷酸序列存在于早花型光周期敏感的白菜类作物CCA1基因编码区第六个外显子上，但不存在于晚花型光周期敏感的白菜类作物CCA1基因编码区。

3.用于检测权利要求1或2所述的InDel分子标记的特异性引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如下所示：

正向引物：5′-CCATCATCAGTCCTTTCCTGA-3′(SEQ ID NO.5)，

反向引物：5′-AGCTAAAAGGAGCGCAGAGA-3′(SEQ ID NO.6)。

4.权利要求1或2所述InDel分子标记的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括如下步骤：

(1)以早花型油用型品种YS-143’与晚花型芜菁品种‘VT-044’为亲本材料，提取两者的总RNA，分别反转录cDNA；

(2)以两亲本cDNA作为基因克隆所需的模板，针对CCA1基因设计引物，进行PCR扩增，得到两亲本CCA1基因扩增产物；

(3)对两亲本CCA1基因扩增产物测序验证，将依据测序结果发现的差异位点作为候选标记；在候选标记两侧保守区设计引物；

(4)分别提取F₂代群体中早花型植株和晚花型植株的DNA，作为基因克隆所需的模板，采用步骤(3)设计的特异引物分别进行PCR扩增，将扩增产物进行测序；

(5)以候选标记基因型作为自变量，采用单因素方差分析候选标记与开花时间表型的相关性，将步骤(4)的测序结果与植株开花时间进行关联分析，确定权利要求1或2所述的InDel分子标记与材料开花时间关联显著。

5.权利要求1或2所述InDel分子标记在鉴定光周期敏感性的白菜类作物开花时间中的应用。

6.权利要求3所述的特异性引物对在鉴定光周期敏感性的白菜类作物开花时间中的应用。

7.权利要求1或2所述的InDel分子标记在光周期敏感性的白菜类作物选育中的应用。

8.权利要求3所述的特异性引物对在光周期敏感性的白菜类作物选育中的应用。

9.根据权利要求5至8任一条所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取光周期敏感的白菜类作物待测植株的基因组DNA；

(2)以待测植株的基因组DNA为模板，利用权利要求3所述特异性引物对，进行PCR扩增反应；

(3)对PCR扩增产物测序，当测序结果显示所测白菜类作物待测植株含有所述纯合InDel标记时，为早开花型；所测白菜类作物待测植株缺失所述纯合InDel标记，且所述缺失纯合InDel标记的基因型不包括杂合情况时，为晚开花型。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，PCR扩增体系总体积为40μL：正、反向引物各2μL、模板cDNA 1μL、高保真酶MIX 20μL、ddH2O 15μL；PCR反应程序为98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸10s，35个循环；72℃延伸5min；PCR扩增产物10℃保存。