CN112740965A - 不结球白菜“黄玫瑰”的周年转色方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种不结球白菜品种“黄玫瑰”的周年转色方法，属于农业技术领域。本发明通过采用Gabaculine水溶液对“黄玫瑰”幼苗进行浇灌，实现了在常温环境（5‑30℃）控制“黄玫瑰”植株叶片颜色变化，以便该商业品种可以不受季节限制，随时随地栽培种植。

Description

不结球白菜“黄玫瑰”的周年转色方法

技术领域

本发明属于农业技术领域，具体涉及一种不结球白菜品种“黄玫瑰”的周年转色方法。

背景技术

不结球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis Makino)，十字花科芸薹属白菜亚种，又名青菜、小白菜等，因其产量高、生长周期短、营养价值高，深受江淮流域消费者的喜爱。不结球白菜新品种“黄玫瑰”是近年来由南京农业大学侯喜林教授研究团队历经18年育成的高营养、高观赏性新品种，其特征特性为：植株半直立、不束腰，株高18cm，开展度26cm；叶片黄绿色，阔椭圆形，叶面泡状程度强，内叶呈现黄色，宛如绽放的玫瑰，属于观赏型蔬菜，可以达到“今天是花，明天是菜”的喜人效果。在此基础上，“黄玫瑰”的营养价值很高，100g鲜重叶片中Vc含量约156mg，是一般小白菜的3倍多；抗病性强，可以有效抗霜霉病、黑斑病和芜菁花叶病毒(TuMV)等多类蔬菜“顽疾”；耐寒性强是其突出特点，可耐-9.6℃低温；在2℃到-6℃范围内，温度下降，叶片呈现黄色，且Vc含量升高。然而，由于其表型的出现对温度的严格要求，“黄玫瑰”只能在9月10日-9月25日穴盘育苗，10月5日-10月20日定植，翌年1月1日-2月28日采收，季节性较强，一年之中只有冬季适宜栽种。

对于白菜类叶菜作物来说，植株叶片中的叶绿素合成途径至关重要。一方面，叶绿素合成的正常运行保证了植株的正常生长与物质代谢；另一方面，充足的叶绿素可以使叶片维持其本身的绿色，从而维持其稳定的光合能力。谷氨酸-1-半醛转氨酶(GSA-AT)催化谷氨酸-1-半醛生成盐酸氨基乙酰丙酸(5-aminolaevulinic acid，ALA)，ALA是叶绿素合成途径中的第一个中间产物。不结球白菜“黄玫瑰”的黄色叶片正是因为其叶绿素合成不足所导致，发明人的前期研究表明低温诱导可促使不结球白菜叶片变色，从而发育成为“黄玫瑰”，但是是否可以打破低温诱导的局限，使“黄玫瑰”的栽培和种植不再收到季节的限制，则需要进一步研究。

发明内容

基于当前市场需求以及种植条件的特殊性，本发明所要解决的问题是提供一种无需低温诱导也可以促使不结球白菜叶片变色的方法，使不结球白菜“黄玫瑰”的栽培和种植不再受到季节的限制，降低栽培成本，增加经济效益。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

Gabaculine作为不结球白菜“黄玫瑰”叶片转色诱导剂的应用。

一种不结球白菜“黄玫瑰”叶片转色诱导剂，有效成分为Gabaculine。

一种不结球白菜“黄玫瑰”的周年转色方法，采用Gabaculine水溶液对不结球白菜“黄玫瑰”的幼苗进行浇灌，然后按常规条件在5-30℃温度条件下进行培养，即可实现不结球白菜“黄玫瑰”的周年转色。

进一步地，所述Gabaculine水溶液中Gabaculine的浓度为5-50μM。

进一步地，所述浇灌是每隔3-5天浇灌一次、共浇灌4次。

进一步地，所述幼苗为一月龄幼苗。

采用本发明所提供的控制“黄玫瑰”植株叶片颜色变化的方法，可以实现该商业品种的栽培种植不受季节限制，随时随地栽培种植。该方法无需调节环境温度，直接使用Gabaculine水溶液，对“黄玫瑰”幼苗进行浇灌，操作方便，节约设备成本。

附图说明

图1为0μM和5μM Gabaculine水溶液对内外叶片总叶绿素含量的影响。

图2为0μM和5μM Gabaculine水溶液对内外叶片叶绿素a含量的影响。

图3为0μM和5μM Gabaculine水溶液对内外叶片叶绿素b含量的影响。

图4为0μM和5μM Gabaculine水溶液对内外叶片总类胡萝卜素含量的影响。

图5为0μM和25μM Gabaculine水溶液对内外叶片总叶绿素含量的影响。

图6为0μM和25μM Gabaculine水溶液对内外叶片叶绿素a含量的影响。

图7为0μM和25μM Gabaculine水溶液对内外叶片叶绿素b含量的影响。

图8为0μM和25μM Gabaculine水溶液对内外叶片总类胡萝卜素含量的影响。

图9为0μM和50μM Gabaculine水溶液对内外叶片总叶绿素含量的影响。

图10为0μM和50μM Gabaculine水溶液对内外叶片叶绿素a含量的影响。

图11为0μM和50μM Gabaculine水溶液对内外叶片叶绿素b含量的影响。

图12为0μM和50μM Gabaculine水溶液对内外叶片总类胡萝卜素含量的影响。

图13为0μM和100μM Gabaculine水溶液对内外叶片总叶绿素含量的影响。

图14为0μM和100μM Gabaculine水溶液对内外叶片叶绿素a含量的影响。

图15为0μM和100μM Gabaculine水溶液对内外叶片叶绿素b含量的影响。

图16为0μM和100μM Gabaculine水溶液对内外叶片总类胡萝卜素含量的影响。

图17为不同浓度Gabaculine水溶液对内外叶片ALA含量的影响。

图18为0μM和50μM Gabaculine水溶液处理前后的植株表型。

具体实施方式

植物在生长过程中，外界环境如盐胁迫、水分胁迫、低温胁迫等，均会下调叶绿素代谢途径中相关基因的表达，从而影响酶的翻译后修饰。其中，低温胁迫往往会导致叶绿素合成的相关酶活性受到抑制，干扰正常的叶绿素合成途径，从而导致叶绿素含量降低，影响植物的代谢、生长、光合能力、表型以及产量。在不结球白菜“黄玫瑰”中，其内部叶片颜色在低温处理之后呈现黄色，是该品种最为显著的特征之一，然而，这种特殊表型产生的机理仍然无法得知。针对不结球白菜“黄玫瑰”的特殊表型，发明人在前期对低温处理之后植株内部黄色叶片和外部绿色叶片进行了比较和分析。通过叶片色素的测定和透射电镜分析表明，不结球白菜“黄玫瑰”的内部叶片黄色表型与叶绿体中叶绿素含量降低和类囊体发育受损密切相关。进一步对低温处理之后植株内部黄色叶片和外部绿色叶片取样，进行转录组和代谢组测序。转录组数据显示，黄色叶片和绿色叶片中的4887个差异表达基因大部分富集于叶绿体和叶绿素相关类别，这表明叶绿素的生物合成主要受低温影响。结合代谢组学数据可知，黄色内叶中盐酸氨基乙酰丙酸(ALA)的合成受阻，从而抑制了叶绿素的生物合成。通过ALA的补充和抑制实验，进一步证实了这一点。这些结果都说明，低温影响不结球白菜“黄玫瑰”中叶绿素合成的相关基因表达，阻碍叶绿素合成途径中ALA的合成，导致叶绿素含量下降，从而导致内叶出现黄色表型。因此，在不结球白菜“黄玫瑰”种植的过程中，低温一直被认为是导致其叶色变化的关键因素。而是否有其他可以调节叶色的方法，有待进一步研究。

根据文献报道，Gabaculine可强烈抑制GSA-AT的活性，从而抑制ALA的合成，导致叶绿素合成途径中断，使植物出现白化现象。在以往的研究中，Gabaculine曾作为筛选抗性植株的除草剂被人们熟知，或是利用Gabaculine研究叶绿素合成途径中的物质代谢等，尚未出现通过施加Gabaculine控制植株叶色变化的研究。

本发明通过采用Gabaculine水溶液对“黄玫瑰”幼苗进行浇灌，实现了在常温环境(5-30℃)控制“黄玫瑰”植株叶片颜色变化，以便该商业品种可以不受季节限制，随时随地栽培种植。

所述Gabaculine的结构式为：

Gabaculine的化学名为3-Amino-2,3-dihydrobenzoic acid hydrochloride，CAS号为59556-17-1。

Gabaculine的生化性质为：固体粉末，分子量175.61g/mol，在水中的溶解度为25mg/mL，易溶于DMSO和甲醇。储存条件2-8℃，熔点为198-200℃，pKa:3.75,pKb:8.86。

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。

将不结球白菜“黄玫瑰”种子用蒸馏水冲洗后，置于培养皿中室温催芽1-2天之后，移栽至含有草炭：蛭石＝3:1培养基质的穴盘中，置于光/暗时间为16h/8h，光/暗温度为22℃/18℃条件下培养。待苗子长到两周龄，移栽至含有草炭：蛭石＝3:1培养基质的10cm×10cm方形花盆中，置于光/暗时间为16h/8h，光/暗温度为22℃/18℃条件下继续培养，直至苗子长到一月龄，开始处理。

将0.0088g Gabaculine溶于50mL蒸馏水中，配制成1mM的母液，置于4℃冰箱备用。在浇灌之前，用蒸馏水分别稀释200、40、20、10倍，使其终浓度分别为5μM、25μM、50μM、100μM，再以50mL离心管分装浇灌植株，同时，以50mL蒸馏水作为对照组进行浇灌，每隔三天浇灌一次。

实施例1

以蒸馏水作为对照组，5μM Gabaculine水溶液作为实验组，浇灌4次(处理12天后)，测定“黄玫瑰”内外叶片中的叶绿素含量，总类胡萝卜素含量。

实施例2

以蒸馏水作为对照组，25μM Gabaculine水溶液作为实验组，浇灌4次(处理12天后)，测定“黄玫瑰”内外叶片中的叶绿素含量，总类胡萝卜素含量。

实施例3

以蒸馏水作为对照组，50μM Gabaculine水溶液作为实验组，浇灌4次(处理12天后)，测定“黄玫瑰”内外叶片中的叶绿素含量，总类胡萝卜素含量。

实施例4

以蒸馏水作为对照组，100μM Gabaculine水溶液作为实验组，浇灌4次(处理12天后)，测定“黄玫瑰”内外叶片中的叶绿素含量，总类胡萝卜素含量。

按照实施例1-4方法处理后，选取“黄玫瑰”内外叶片进行取样，擦去表面污物避开叶脉部分进行取样，不同植株尽量选取相同位置，分别称取0.10g(长、宽均为0.2-0.3cm)叶片，剪碎，置于干净的50mL离心管中，加入15mL萃取液(丙酮：酒精＝1:1混合液)，避光浸泡，置于50rpm/min的摇床上振荡24h，保证萃取液颜色均匀，直至看到叶片材料完全失去绿色为止。将50mL离心管置于离心机中，10000rpm，2min，取上清液待测。

以萃取液作为空白对照，使用全波长酶标仪(CYTATION3,BioTek,USA)，在470nm、485nm、642nm、649nm、665nm波长下测定叶绿素、总类胡萝卜素提取液的吸光值，计算叶绿素和总类胡萝卜素的含量。叶绿素含量包括叶绿素a(Chl a)、叶绿素b(Chl b)和总叶绿素，以及总类胡萝卜素(Carotenoids)含量其计算公式为(mg·g^-1)：

Total Chl＝27.9×A₆₄₉

Chl a＝13.95×A₆₆₅-6.88×A₆₄₉

Chl b＝24.96×A₆₄₉-7.32×A₆₆₅

Carotenoids＝(1000×A470–2.05×Chl a+14.8×Chl b)/245。

结果如图1-16所示，随着Gabaculine水溶液浓度的增大，植株内部叶片的总叶绿素、叶绿素a、叶绿素b、总类胡萝卜素含量均有所下降，而外部叶片的总叶绿素、叶绿素a、叶绿素b、总类胡萝卜素含量则出现上升趋势。

实施例5

以蒸馏水作为对照组，5μM、25μM、50μM、100μM Gabaculine水溶液作为实验组，浇灌4次(处理12天后)，测定“黄玫瑰”内外叶片中ALA含量。

测定ALA含量的方法为：选取“黄玫瑰”的内叶片和外叶片进行取样，擦去表面污物避开叶脉部分进行取样，不同植株尽量选取相同位置，分别称取0.10g(长、宽均为0.2-0.3cm)叶片，剪碎，液氮速冻后，60Hz，3min进行磨样。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(Cat No:KT7958-B,江苏科特生物科技有限公司)，根据试剂盒使用说明，测定“黄玫瑰”内外叶片中ALA浓度，单位为μg·g^-1。

结果如图17所示，随着Gabaculine水溶液浓度的增大，内部叶片中的ALA含量呈持续下降趋势，而外部叶片中的ALA含量则呈现先下降再上升的趋势。

实施例6

以蒸馏水作为对照组，选择既可以改变叶片颜色，又能保证植株生长的最适Gabaculine HCl水溶液浓度，浇灌实验组，比较两组表型差异并记录。

结果如图18所示，Gabaculine水溶液对于植株内部叶片所起到的作用更稳定，且对内部叶片表型影响较大。

由以上结果可知，尽管随着Gabaculine水溶液浓度的增大，植株内部叶片ALA水平下降，叶绿素含量降低，但是过高的Gabaculine水溶液浓度，如100μM，往往导致植株本身生长受到抑制。故选择既可以改变叶片颜色，又能保证植株生长的最适Gabaculine水溶液浓度，如50μM，对植株进行浇灌，并且得到了需要的表型。

Claims (6)

1.Gabaculine作为不结球白菜“黄玫瑰”叶片转色诱导剂的应用。

2.一种不结球白菜“黄玫瑰”叶片转色诱导剂，其有效成分为Gabaculine。

3.一种不结球白菜“黄玫瑰”的周年转色方法，其特征在于：采用Gabaculine水溶液对不结球白菜“黄玫瑰”的幼苗进行浇灌，然后按常规条件在5-30℃温度条件下进行培养，即可实现不结球白菜“黄玫瑰”的周年转色。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述Gabaculine水溶液中Gabaculine的浓度为5-50 μM。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述浇灌是每隔3-5天浇灌一次、共浇灌4次。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述幼苗为一月龄幼苗。

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