CN109652412B

CN109652412B - 一种snp分子标记、检测甜瓜花性型的方法及应用

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Publication number: CN109652412B
Application number: CN201910057790.XA
Authority: CN
Inventors: 张显; 魏春华; 王中元
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2019-01-22
Filing date: 2019-01-22
Publication date: 2022-04-01
Anticipated expiration: 2039-01-22
Also published as: CN109652412A

Abstract

本发明公开了一种SNP分子标记、检测甜瓜花性型的方法及应用。所述的SNP分子标记的核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，所述的SEQ ID NO.1所示核苷酸序列与甜瓜两性花性状高度连锁，SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列与甜瓜单性花性状高度连锁。利用本发明获得的SNP分子标记可以在甜瓜生长的任何时期快速、准确地鉴定其花性型，具有效率高、限制因素少等优点。此外，SNP标记提高了选育甜瓜两性系的效率，缩短了育种周期，对甜瓜分子标记辅助选择育种，提高甜瓜杂交育种和制种效率，保障制种质量等方面具有重要意义，可以简便、快速、高通量地应用于甜瓜育种实践。

Description

一种SNP分子标记、检测甜瓜花性型的方法及应用

技术领域

本发明涉及分子标记技术领域，尤其涉及一种单核苷酸多态性位点(SNPs)分子标记、检测甜瓜花性型的方法及应用。

背景技术

甜瓜(Cucumis melo L.)是世界上种植比较广泛的一种重要的葫芦科作物，更是一种水果型经济作物，因其种植面积和年消费量而被评为世界第五大水果。甜瓜种最初起源于非洲埃塞俄比亚高原，中国是甜瓜种的次生起源中心，拥有丰富的甜瓜种质资源(林德佩2010)。我国甜瓜栽培历史悠久，早在3000年前就有栽培甜瓜的史迹，在晋代已培育出众多优良甜瓜品种，公元前1世纪甜瓜栽培方法就已写入《尹都尉书》一书中(中国农业科学院蔬菜花卉研究所2010)。我国作为全球甜瓜栽培大国，栽培面积位居世界第一。因此，甜瓜作为我国重要的瓜类作物之一，在农业结构产业调整和农村经济发展中发挥着重要的作用

我国一直以来是甜瓜栽培和消费大国，栽培面积和产量均居世界第一位。优质、抗病是甜瓜新品种选育的关键目标。由于甜瓜在栽培中绝大多数是雄全系(雄花完全花同株型)材料，其中，完全花是制种和收获的唯一器官。通过传统育种方对甜瓜两性花性状的选择需要在盛花期进行，存在鉴定周期长、效率低的缺点，而利用分子标记辅助选择育种(MAS,molecular marker-assisted selection)则可在苗期完成对花性型的选育，不仅省时省力，而且还可以提高选育的准确性和效率，因此建立甜瓜两性花性状的分子标记辅助选择体系，对提高育种效率和加速育种进程具有重要意义。

目前，已经报道了3个甜瓜性型控制基因：单性/两性控制基因(CmACS-7，M)(Boualem et al.2008)；纯雌控制基因(CmWIP1，G)(Martin et al.,2009)，纯雄控制基因(CmACS11，A)(Boualem et al.2015)。

甜瓜花性决定通路中，CmWIP1与CmACS11功能是对立的。Boualem等(2015)对甜瓜性型决定提出一个新的模型，在性别决定通路中CmACS11位于CmWIP1上游，同时CmWIP1位于CmACS-7上游，CmACS11表达使得雌花心皮发育，同时会抑制CmWIP1的表达；CmWIP1表达会抑制心皮发育，同时会抑制CmACS-7的表达；CmACS-7表达会抑制雄蕊的发育。单性雌花的形成是由于，CmACS11表达抑制了CmWIP1表达，使得CmWIP1不能抑制心皮发育，同时CmACS-7的表达不受抑制，导致雄蕊发育受阻；CmACS11功能缺失将导致CmWIP1表达不受抑制，心皮发育受阻，同时CmACS-7的表达被抑制，雄蕊能正常发育，形成了单性雄花；完全花的发育是由于雌花发育个体中，CmACS-7的功能缺失。

目前甜瓜雄全同株性型、完全花株性型、全雌株性型等可被Boualem提出的基因互作模型(A、G、M)解释，Boualem认为甜瓜的性别是受到A，M，G三对主效基因协同控制的，并给出了基因型与表型关系，该模型当前被普遍接受。但是甜瓜雌雄异花同株性型无法通过上述基因互作模型进行解释。

发明内容

针对上述现有技术的不足与缺陷，本发明的目的在于提供一种SNP分子标记、检测甜瓜花性型的方法及应用，提供一种与甜瓜两性花性型紧密连锁的分子标记SNP-y，在苗期可准确检测出甜瓜两性花性型和单性花性型，为甜瓜花性型分子标记辅助技术体系的建立提供帮助。

为实现上述目的，本发明采取如下的技术解决方案：

一种SNP分子标记，所述的SNP分子标记的核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2，所述的SEQ ID NO.1所示核苷酸序列与甜瓜两性花性状高度连锁，SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列与甜瓜单性花性状高度连锁。

一种检测甜瓜两性花性状的方法，以待测甜瓜的基因组DNA为模板，加入引物对，进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；

对PCR扩增产物进行测序，获得测序结果，对比所述测序结果与上述的SNP分子标记来确定所述待测甜瓜的两性花性状。

具体地，所述的引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。

进一步地，所述PCR的扩增程序为：94℃变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃保温5min。

具体的，提取待测甜瓜的基因组DNA，利用权利要求3所述的引物对对甜瓜基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；

对所述PCR扩增产物用限制性内切酶Taq I进行酶切，再通过琼脂糖凝胶电泳显示结果来确定所述待测甜瓜的两性花性状。

进一步地，对比所述测序结果与权利要求1所述的SNP分子标记来确定所述待测甜瓜的两性花性状具体操作为：

当所述测序结果的核苷酸序列和SEQ ID N0.1序列一致，表示该植株的甜瓜具有两性花性状；

当所述测序结果的核苷酸序列和SEQ ID N0.1序列不一致，与SEQ ID N0.2序列一致，表示该植株的甜瓜具有单性花性状。

进一步地，通过琼脂糖凝胶电泳显示结果来确定所述待测甜瓜的两性花性状的具体操作为：

当所述的显示结果显示出所述PCR扩增产物不可被限制性内切酶TaqI切开，出现416bp的条带，表示该植株的甜瓜具有单性花性状；

当所述的显示结果显示出所述PCR扩增产物可被限制性内切酶TaqI切开，出现307bp和109bp的两条带，表示该植株的甜瓜具有两性花性状。

本发明所述的SNP分子标记或本发明所述的检测甜瓜两性花性状的方法用于检测甜瓜两性花性状的应用。

本发明所述的SNP分子标记或本发明所述的引物对用于甜瓜育种中的应用。

本发明与现有技术相比，有益的技术效果是：

本发明通过利用第二代DNA测序技术鉴定SNPs，根据鉴定的SNPs和公布的甜瓜基因组数据开发分子标记，并扫描F₂分离群体，结合群体植株的花性型表型，开发与两性花调控基因连锁更加紧密的分子标记。本发明公开的分子标记SNP-y与两性花调控基因位点连锁紧密，对甜瓜两性花性状分子标记辅助育种体系的建立更有帮助，利用本发明获得的SNP-y分子标记可以在甜瓜生长的任何时期快速、准确地鉴定其花性型，具有效率高、限制因素少等优点。此外，SNP-y标记提高了选育甜瓜两性系的效率，缩短了育种周期，对甜瓜分子标记辅助选择育种，提高甜瓜杂交育种和制种效率，保障制种质量等方面具有重要意义，可以简便、快速、高通量地应用于甜瓜育种实践。

附图说明

图1是本发明实施例提供的两性花(Y101)和单性花(0426)的表型示意图；

图2本发明实施例提供的分子标记SNP-y在亲本(Y101和0426)、F₁及F₂代植株中的多态性电泳图谱，其中M泳道为DNA分子量标记。

以下结合附图和实施例对本发明的具体内容作进一步详细解释说明。

具体实施方式

以下给出本发明的具体实施例，需要说明的是本发明并不局限于以下具体实施例，凡在本申请技术方案基础上做的等同变换均落入本发明的保护范围。本发明在构建好的F₂分离群体中选取两性花和单性花植株各30株，抽提基因组DNA后等量混合形成混池。对混池进行基因组重测序，利于生物信息学开发SNPs设计分子标记，筛选F₂分离群体完成两性花调控基因的精细定位。通过构建遗传群体，进行甜瓜花性型遗传分析，发现了一个新的隐性控制甜瓜两性花的基因(y)，利于紧密连锁分子标记SNP-y，在苗期可准确检测出甜瓜两性花性型，为甜瓜花性型分子标记辅助技术体系的建立提供帮助。

主要包括：1.甜瓜花性型的观察及群体构建；2.甜瓜基因组DNA提取；3.二代测序技术开发SNPs；4.甜瓜两性花分子标记序列扩增及基因型分析。

实施例1

遵从上述技术方案，本实施例给出一种SNP分子标记、检测甜瓜花性型的方法。

1.甜瓜花性型的观察及群体构建

如图1所示，选择甜瓜两性花性型材料‘Y101’，其主蔓和侧蔓均着生两性花。单性花性型材料‘0426’，其主蔓着生单性雄花，侧蔓前3～5节位着生单性雌花，后续着生单性雄花。本发明以‘Y101’为父本、‘0426’为母本，杂交获得F₁代植株，F₁代植株自交构建F₂分离群体。

2.甜瓜基因组DNA提取

用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取亲本、F₁及F₂分离群体的叶片总DNA，具体操作方法为：分别取亲本、F₁及F₂分离群体的上部约1cm²幼嫩叶片，在液氮中快速研磨成粉末状，放于1.5ml的离心管中；加入预热至65℃的800μl CTAB的缓冲液中进行提取，65℃水浴抽提30min；加入等体积氯仿和异戊醇，其中氯仿与异戊醇的体积比为24:1，混匀后在8000r/min的转速下10min；将上清液转入新的离心管，加上清液2/3体积的异丙醇，上下颠倒轻轻混匀；在10000r/min的转速下离心10min；倒去上清液，用体积分数为75％的乙醇冲洗沉淀，倒掉后吸干剩余液体，室温放置3min后，用100μl ddH₂O(含0.1％RNA酶)溶解沉淀，并将得到的甜瓜基因组DNA在4℃保存备用。

3.二代测序技术开发SNPs

在F₂分离群体中，分别选取30株两性花植株和单性花植株，取上部约1cm²幼嫩叶片按步骤2的方法分别抽提总DNA，将等量DNA混合形成两个混池；用Illumina平台的Hiseq2500双末端测序技术对两个混合池进行基因组重测序(DNA-seq)；然后，用已开发好的程序(perl语言编写的脚本，Marker_SNPs_V1.pl)对两个池的DNA-seq数据进行分析，流程如下：将两个混合池的数据通过BWA软件比对甜瓜参考基因组上(http://www.icugi.org)，再利用Samtools软件寻找两个池中等位基因的SNPs。

4.甜瓜两性花分子标记序列扩增及基因型分析

根据鉴定的单核苷酸多态性位点(SNPs)及其在参考基因组上的侧翼序列设计引物对，参见SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4，以抽提的双亲本、F₁和F₂分离群体DNA(100ng)为模板进行PCR扩增，PCR扩增程序为：94℃变性5min；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸30s，35cycles；72℃保温5min。从双亲本扩增的PCR片段委托北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序，结果分析表明PCR片段总长为416bp，在309bp处存在G/A多态性位点(即SNP)，包含此多态性位点的PCR产物可用限制性内切酶TaqI进行酶切区分，经酶切的PCR产物在2％琼脂糖凝胶电泳显示序列长度的多态性，亲本、F₁和F₂子代的多态性条带具体参见图2，扩增产物的序列为SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2；按上述PCR扩增体系，从两性花性型植株中扩增的PCR产物(序列为SEQ ID N0.1)可被酶切成两个小的片段，出现307bp和109bp的两条带，如图2中的1和4-12为两性花甜瓜植株。而从单性花性型植株中扩增的PCR片段(序列为SEQ IDN0.2)无法被酶切，在琼脂糖凝胶上显示长度为416bp的条带；如图2中的F1、2和3为单性花甜瓜植株，因此即得到可区别两性花性型植株和单性花性型植株的多态性分子标记。

本发明得到分子标记(名称为SNP-y)的两条核苷酸序列SEQ ID N0.1和SEQ IDN0.2，长度都为416bp，在染色体上的具体位置为，Chr08:5430600-5431016。

本发明得到的核苷酸序列如SEQ ID N0.1与甜瓜两性花性型高度连锁；

本发明得到的核苷酸序列如SEQ ID N0.2与甜瓜单性花性型高度连锁。

本实施例还给出一种利用本发明的分子标记SNP-y检测甜瓜花性型的方法，具体包括：提取待测甜瓜的基因组DNA，利用上述设计的引物对SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4，对待测甜瓜的基因组DNA按上述PCR程序进行扩增，PCR扩增程序为：94℃变性5min；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸30s，35cycles；72℃保温5min。获得PCR扩增产物，对PCR扩增产物委托北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序，得到其核苷酸序列，比较检测得到的核苷酸序列和本发明得到分子标记SNP-y的两条核苷酸序列SEQ ID N0.1是否一致，如一致(条带可被限制性内切酶TaqI(Fermentas)切开)，表示该植株的甜瓜为两性花性型；如若不一致，而与SEQ ID N0.2序列一致(条带不可被限制性内切酶TaqI(Fermentas)切开)，则表示该植株的甜瓜为单性花性型。

利于紧密连锁分子标记SNP-y，在苗期准确检测出甜瓜两性花性型，将携带这种两性花相关基因标记的甜瓜进行繁殖，培育后代，克隆获得后代中的SNP-y基因，研究其多态性，为甜瓜花性型分子标记辅助技术体系的建立提供帮助。

本发明在现有公开的甜瓜花性型的分子标记的大的范围内，再进一步缩小甜瓜两性花性型的分子标记的序列和在染色体上的具体位点，有助于甜瓜育种选择。

SEQUENCE LISTING

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种SNP分子标记、检测甜瓜花性型的方法及应用

<160> 4

<210> 1

<211> 416

<212> DNA

<213> 甜瓜

<400> 1

TGAAAAATTGTACCGGATGACAAAATAAAAATTAAAAAGATAGTTCATAGTACATTTTTTTTGCATATTACGAATATGACAAAGATCAAATGACTGTCAAAGAGTTATTTTCTTTTAAATTTGCTATTTTTGCAATTTAGAAAATGTAATGATACGAACCTATTATCATAAGTTTTTTTGCTATTTTGAAAATCATCTCTTTTAAAATATTATAATTTTAATTTATTCAATTCACTTTATTTTAATCTCTAAATTTTAATATATAACAAATTAATTTTACTCGTAAGAGTCTATTTGTTAAACAACTCGATTATATTATCAATTTCGTTTTTTTCACATTTGAATTTTCCTTTAGAATATGTTTAAACTGATTTTTTTGCACTGCAAAACGCTAGCAGTGTGAAGTCAAACACGGT

<210> 2

<211> 416

<212> DNA

<213> 甜瓜

<400> 2

TGAAAAATTGTACCGGATGACAAAATAAAAATTAAAAAGATAGTTCATAGTACATTTTTTTTGCATATTACGAATATGACAAAGATCAAATGACTGTCAAAGAGTTATTTTCTTTTAAATTTGCTATTTTTGCAATTTAGAAAATGTAATGATACGAACCTATTATCATAAGTTTTTTTGCTATTTTGAAAATCATCTCTTTTAAAATATTATAATTTTAATTTATTCAATTCACTTTATTTTAATCTCTAAATTTTAATATATAACAAATTAATTTTACTCGTAAGAGTCTATTTGTTAAACAACTCAATTATATTATCAATTTCGTTTTTTTCACATTTGAATTTTCCTTTAGAATATGTTTAAACTGATTTTTTTGCACTGCAAAACGCTAGCAGTGTGAAGTCAAACACGGT

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 甜瓜

<400> 3

TGAAAAATTGTACCGGATGACAAAA 25

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 甜瓜

<400> 4

ACCGTGTTTGACTTCACACTGCT 23

Claims

1.一种SNP分子标记，其特征在于，所述的SNP分子标记的核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，所述的SEQ ID NO.1所示核苷酸序列与甜瓜两性花性状高度连锁，SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列与甜瓜单性花性状高度连锁。

2.一种检测甜瓜两性花性状的方法，其特征在于，以待测甜瓜的基因组DNA为模板，加入引物对，进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；

对PCR扩增产物进行测序，获得测序结果，对比所述测序结果与权利要求1所述的SNP分子标记来确定所述待测甜瓜的两性花性状；

所述的引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；

具体操作为：当所述测序结果的核苷酸序列和SEQ ID N0.1序列一致，表示该植株的甜瓜具有两性花性状；

3.根据权利要求2所述的检测甜瓜两性花性状的方法，其特征在于，对所述PCR扩增产物用限制性内切酶TaqI进行酶切，再通过琼脂糖凝胶电泳显示结果来确定所述待测甜瓜的两性花性状；

具体操作为：

4.根据权利要求2或3所述的检测甜瓜两性花性状的方法，其特征在于，所述PCR的扩增程序为：94℃变性5 min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃保温5min。

5.权利要求1所述的SNP分子标记或权利要求2-4任一所述的检测甜瓜两性花性状的方法用于检测甜瓜两性花性状的应用。

6.权利要求1所述的SNP分子标记或权利要求2-4任一所述的检测甜瓜两性花性状的方法用于甜瓜育种中的应用。