CN103215289A - 导致西瓜两性花发育的基因a序列及其获得方法 - Google Patents
导致西瓜两性花发育的基因a序列及其获得方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103215289A CN103215289A CN2013100096508A CN201310009650A CN103215289A CN 103215289 A CN103215289 A CN 103215289A CN 2013100096508 A CN2013100096508 A CN 2013100096508A CN 201310009650 A CN201310009650 A CN 201310009650A CN 103215289 A CN103215289 A CN 103215289A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequence
- watermelon
- gene
- dna
- stage
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于基因序列及其获取方法领域,具体涉及导致西瓜两性花发育的基因a序列及其获得方法。导致西瓜两性花发育的基因a,具有序列表中的SEQ ID NO:1~6的核苷酸碱基序列,该获取方法包括以下步骤:A、供试材料选取,B、基因组DNA的提取,C、长距离PCR扩增反应与产物的检测,D、特异性扩增序列的获得,E、候选SNP的获得,F、对所述的候选SNP位点进行验证,最终获得所述的导致西瓜两性花发育的基因a序列。本发明通过F2代分离群体dCAPs分子标记检测及表型鉴定、各核心种质资源dCAPs分子标记检测及表型鉴定确认该SNP位点为共分离标记;获得的SNP位点,能够开发基因标记用于辅助育种,达到获得西瓜雌性系品种的目的。
Description
技术领域
本发明属于基因序列及其获取方法领域,具体涉及导致西瓜两性花发育的基因a序列及其获得方法。
背景技术
西瓜(Citrullus lanatus)为葫芦科黄瓜属一年生蔓生草本植物,是一种国内外广泛栽培的重要经济作物。我国自汉代以来就有种植西瓜的历史,是世界上最早栽培西瓜的国家之一,也是目前世界上西瓜栽培面积最大、产量最高的国家。
西瓜是植物性别分化机理研究的模式作物,研究西瓜性别机制有助于植物性别分化研究发展,并能提高育种效率、降低育种成本。西瓜植株的主要性型有雌雄异花同株(A-Gy-)、雄花完全花同株(雄完株,aaGy-)、雌性系(A-gygy)和完全花系(aagygy)三种,由两个主效基因控制,分别为a基因和gy基因。其中a基因主要控制雌花中雄蕊的发育,gy基因主要控制雄花中雌蕊的发育。在这两个基因的共同作用决定了西瓜植株的性别发育模式。a基因在西瓜性别发育模式中具体相当重要的作用,它直接控制着雄蕊原基是否发育,对雌雄同株植物的性别发育模式研究至关重要。且培育雌性系品种必须保证每个节位均长出纯雌花。纯雌性系品种对于降低育种人工成本、提高种子纯度有极其重要的意义,具有很强的实用价值。故对于a基因的研究具有相当大的参考意义。
比较基因组学是现代分子生物学研究的一个重要手段,通过对同源生物的同源基因进行全基因组比对,可迅速获得候选基因。在对候选基因序列分析的基础上即可获得目标性状的差异位点并设计特异性分子标记。通过遗传分离群体验证及表型分析,即可迅速锚定目标基因,大大缩短了分子标记开发进程。因此,本项研究拟利用比较基因组学方法,利用已发表的甜瓜a基因在西瓜深度序列上进行全基因组搜索,结合遗传分离群体检测及自然群体分析结果确定导致西瓜两性花发育的基因a基因序列。
但是,利用比较基因组学原理进行同源克隆的准确率一般只在50%左右。虽是获取目标基因的一种重要手段,却不能作为唯一的衡量标准。在西瓜育种的科研和实践中需要,利用同源克隆技术获取多个目标基因并对进行逐一验证,以便最终确定候选基因开展下一步工作。
发明内容
本发明的目的是提供导致西瓜两性花发育的基因a序列及其获得方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
导致西瓜两性花发育的基因a,具有序列表中的SEQ ID NO:1~6的核苷酸碱基序列。
导致西瓜两性花发育的基因a,具有翻译为序列表中的SEQ ID NO:7~8的氨基酸残基序列的核苷酸碱基序列。
本发明的目的是通过以下另一技术方案实现的:
导致西瓜两性花发育的基因a序列的获得方法,包括以下步骤:
A、供试材料选取:
选取供试体材料;
B、基因组DNA的提取:
将所述的供试材料分别进行DNA提取处理,得到供试材料基因组DNA;
C、长距离PCR扩增反应与产物的检测:
以所述的供试材料基因组DNA为模板,进行长距离PCR扩增反应,得到长距离扩增产物;
D、特异性扩增序列的获得:
将所述的长距离扩增产物进行纯化处理后与质粒载体进行连接反应,得到重组质粒;再将所述的重组质粒转入感受态细胞,再进行筛选、检测、测序,得到特异性扩增序列;
E、候选SNP的获得:
将所述的特异性扩增序列的核苷酸序列进行分析比对并结合内含子剪切预测结果,得到候选SNP位点;
F、对所述的候选SNP位点进行验证,获得所述的导致西瓜两性花发育的基因a序列。
本发明的有益效果为:
本发明应用比较基因组学原理,在西瓜深度序列上比对甜瓜CmACS-7基因序列,通过全基因组搜索获得候选基因,并利用长距离PCR技术扩增出候选基因片段并克隆、测序,通过分析其DNA序列和蛋白质序列确定目的基因;大大缩短了定位基因的时间;
本发明通过F2代分离群体dCAPs分子标记检测及表型鉴定、各核心种质资源dCAPs分子标记检测及表型鉴定确认该SNP位点为共分离标记;获得的SNP位点,能够开发基因标记用于辅助育种,达到获得西瓜雌性系品种的目的。
附图说明
图1为实施例1的亲本及重测序材料a基因DNA序列比对结果图;
图2为实施例1的亲本及重测序材料a基因蛋白质序列比对结果图;
图3为实施例1的对亲本进行长距离PCR扩增的电泳结果图;
图4为实施例1的引物a_FspBI对亲本及西瓜22个重测序材料的扩增并利用FspBI限制性酶切后的结果图;
图5为引物a_FspBI对F2群体的扩增并利用FspBI限制性酶切后的结果图。
具体实施方式
实施例1:
本实施例为导致西瓜两性花发育的基因a序列及其获得方法。
导致西瓜两性花发育的基因a,具有序列表中的SEQ ID NO:1~6的核苷酸碱基序列。
导致西瓜两性花发育的基因a,具有翻译为序列表中的SEQ ID NO:7~8的氨基酸残基序列的核苷酸碱基序列。
序列表中SEQ ID NO:1为雄花完全花同株材料长距离PCR特异性扩增的序列;
序列表中SEQ ID NO:2为雌雄异花同株材料长距离PCR特异性扩增的序列;
序列表中SEQ ID NO:3为雄花完全花同株材料CDS区的序列;
序列表中SEQ ID NO:4为雌雄异花同株材料CDS区的序列;
序列表中SEQ ID NO:5为雄花完全花同株材料dCAPs引物特异性扩增的序列;
序列表中SEQ ID NO:6为雌雄异花同株材料dCAPs引物特异性扩增的序列。
序列表中SEQ ID NO:7为雄花完全花同株材料蛋白质氨基酸残基序列;
序列表中SEQ ID NO:8为雌雄异花同株材料蛋白质氨基酸残基序列。
该获取方法包括以下步骤:
A、供试材料选取:
所述的供试体材料包括:父本阿柯克孜外,为典型雌雄完全花同株材料;母本新红宝,为典型的雄花完全同株性型材料;以二者为亲本进行杂交获取的F1代;该F1代自交获得F2代;22个西瓜基因组重测序材料(详见表1);519份西瓜种质资源构成的自然群体(详见表2);
B、基因组DNA的提取:
将所述的供试材料分别进行DNA提取处理,得到供试材料基因组DNA;
所述的DNA提取处理为参照Murry等(1980)的方法(Murray M,ThompsonW F.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J].Nucl Acid Res,1980,8:668-673.)的基础上改进而成;具体步骤如下:
a.取1.5克叶片,在液氮中研磨成粉末,再加入9ml2%CTAB提取液(2%CTAB,1.4mM NaCl,100mM Tris-HCl pH8.0,20mM EDTA pH8.0,1%PVP-40,0.2%β-巯基乙醇),混匀,于65℃水浴1小时,得到混合物A;
b.将所述的混合物A停止水浴,加入1/3体积的5M的醋酸钾溶液,混匀,冰浴20分钟;再加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)抽提两次,得到上清液A;
c.向所述的上清A中加入2/3体积异丙醇用来沉淀DNA;再用洗涤缓冲液(76%乙醇,10mM乙酸铵)洗涤一次,吹干,再加TE缓冲液(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH7.4)溶解,得到溶液A;
d.向所述的溶液A中加入RNase A,使其终浓度达100μg/ml,再混匀37℃水浴1小时;再用等体积氯仿/异戊醇(24:1)抽提一次,得到上清液B;
e.向所述的取上清液B中加入1/2体积7.5M醋酸铵、2倍体积无水乙醇,得到DNA沉淀;
f.用70%乙醇洗涤所述的DNA沉淀,吹干,加适量ddH2O溶解DNA,得到供试材料基因组DNA;
再用紫外分光光度计(Shimadzu UV-1201,日本)以OD260值测定所述的供试材料基因组DNA的浓度,再用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测供试材料基因组DNA的提取质量;
C、长距离PCR扩增反应与产物的检测:
以所述的供试材料基因组DNA为模板,进行长距离PCR扩增反应,得到长距离扩增产物;
所述的长距离PCR扩增反应选用的引物由上海生工公司北京合成部合成,序列如下:
上游引物序列:5’-CCAATTTCTATCAAATATGGGCAATG-3’
下游引物序列:5’-TCTCTGGATCTTAAAACCCGATT-3’;
所述的长距离PCR扩增反应的反应体系(25μL)中含有:
2.5μL含15mM MgCl2的10×long PCR Buffer;2.5μL浓度为2.5mM的dNTPs;0.4U long PCR Taq DNA聚合酶;1μL10mM上游引物,1μL10mM下游引物,;50ng模板DNA;ddH2O补足到25μL;其中,Taq DNA聚合酶及反应缓冲液购自Fermantas公司,dNTPs购自TaKaRa公司;
反应程序为:阶段1:94℃预变性5min;阶段2:94℃30s,55℃30s,68℃2min,共10个循环;阶段3:94℃30s,55℃30s,68℃2min,第一个循环的时间为2分钟,从第二个循环开始,时间在前一个循环的基础上增加5秒,共25个循环;阶段4:68℃延伸10min;阶段5:4℃保存;其中,PCR仪为购自Applied Biosystems公司的Veriti96well Thermal Cycler;
取上述长距离扩增产物5μL与载样缓冲液(6×Loading Buffer,北京全式金生物技术有限公司)1μL混匀,再加入1.2%的琼脂糖凝胶中,180V/90A进样,90V/100A电泳;其中,琼脂糖为:Agarose RA(购自amresco公司);缓冲液为:1×TAE缓冲液;电泳仪为购自JINGYI公司的JY600电泳仪;扩增结果如图3所示;
D、特异性扩增序列的获得:
将所述的长距离扩增产物进行纯化处理后与pEASY-T1载体进行连接反应,得到重组质粒;再将所述的重组质粒转入感受态细胞,再进行筛选、检测、测序,得到特异性扩增序列;该特异性扩增序列的核苷酸碱基含有序列表SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2;
步骤如下:
a.纯化处理:用刀片将电泳后上述琼脂糖上的目的条带切下,分别放入标记好的2ml离心管中,用购自北京全式金生物技术有限公司的切胶回收纯化试剂盒Easy Pure Quick Gel Extraction Kit对产物进行回收纯化,操作方法详见产品说明书;
b.将所述的纯化后的长距离扩增产物与pEASY-T1载体连接反应,得到重组质粒;该连接反应采用北京全式金生物技术有限公司的pEASY-T1Cloning Kit试剂盒;
c.将所述的重组质粒转入感受态细胞,再进行筛选、检测、测序,得到特异性扩增序列;
具体操作如下:
将所述的重组质粒转入购自北京全式金生物技术有限公司的Trans-T1Phage Resistant Chemically Competent Cell感受态细胞中,再在SOC液体培养基中,37℃、200rpm/m的条件下培育1小时后,将菌液均匀涂抹于预先涂抹了IPTG(8μL,500mM)、X-gal(40μL,20mg/ml)的LB/Amp+(100mg/ml)固体培养基中,在37℃条件下培养过夜;之后用10μL枪头挑取呈白色的单菌落加入1mlLB/Amp+液体培养基中,在37℃、200rpm/m下培育8小时后,取1μL利用通用引物M13进行菌液PCR检测,若为阳性克隆则将对应菌液送北京诺赛基因组研究中心有限公司测序;其中菌液PCR所用的M13引物由上海生工公司北京合成部合成,DNA聚合酶为Trans easy Taq DNA Polymerase;
E、候选SNP的获得:将所述的特异性扩增序列的核苷酸碱基序列进行分析比对并结合内含子剪切预测结果,得到候选SNP位点;
如图1所示,将所述的特异性扩增序列的核苷酸序列利用DNA MAN软件对测序所得DNA序列全长比对,获得共分离标记;图1为22个重测序材料与亲本阿柯克孜外、新红宝母本a基因DNA序列比对图,由图1可知在a基因CDS区里共有五个候选SNP,其中只有两个候选SNP处于ORF区(该ORF区的核苷酸碱基序列含有序列表SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4),只有一个SNP位点(即G1477C)是aa基因型特有的SNP。
如图2所示,对基因全长序列进行分析,获得基因的CDS序列,进一步分析获得一个位于CDS序列上的SNP位点;图2为a基因编码蛋白质序列(该蛋白质序列的氨基酸残基含有序列表SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8)比对图,C364W为序列唯一差异位点,该位点由图1中的G1477C造成的。
再结合蛋白质结构预测结果,确定该SNP位点(C364W)为候选SNP;
以上步骤A-E中,在西瓜全基因组深度序列上比对甜瓜CmACS-7基因序列,获取候选基因。通过linux系统上已构建西瓜全基因组数据库,对比甜瓜CmACS-7基因序列,针对各比对结果进行分析,最终获得可能性最大的基因序列,进行下一步试验验证。上述西瓜全基因组数据库的网站为http://www.iwgi.org;
F、对所述的候选SNP位点进行验证,获得所述的导致西瓜两性花发育的基因a序列;
本步骤提取验证材料基因组DNA,所述的验证是利用dCAPs技术,针对该候选SNP位点设计dCAPs标记特异性引物a_dCAPs,在所述的验证材料材料上进行验证,得到扩增序列,以确定该段DNA序列(该扩增序列的核苷酸碱基含有序列表SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6),为影响西瓜两性花发育的基因a的DNA序列;
所述的验证材料包括:父本阿柯克孜外,为典型雌雄完全花同株材料;母本新红宝,为典型的雄花完全同株性型材料;以二者为亲本进行杂交获取的F1代;该F1代自交获得的F2代;22个西瓜基因组重测序材料(详见表1);519份西瓜种质资源构成的自然群体(详见表2);
以上F2代分离群体及BC群体于2010年秋在海南培育、采种,于2011年8月在大棚中催芽直播,其中:父本、母本、F1各取20粒种子播种,F2群体取300粒种子播种,定植于北京市农林科学院蔬菜技术研究中心四季青试验基地,其中父本、母本、F1各定植15株,F2定植278株。
步骤如下:
a.以所述的验证材料基因组DNA为模板,进行PCR扩增反应,得到PCR扩增产物;
所述的验证材料基因组DNA的提取方法参见步骤B;
该PCR扩增反应选用的dCAPs引物a_dCAPs由上海生工公司北京合成部合成,序列如下:
上游引物序列:5’-CAATAACGGGCTTAAATTCATCCG-3’,
下游引物序列:5’-CATGTTGTCGAACCGGAAGTTTAC-3’;
所述的PCR扩增反应的反应体系(20μL)中含有:
10×TransStart buffer2.0μL,0.8μL2.5mM dNTPs,0.75U TransStart Taq DNAPolymerase,2μL dCAPs引物mix,50ng模板DNA,ddH2O补足到20μL;TransStart Taq DNA Polymerase购自北京全式金生物技术有限公司,dNTPs购自TaKaRa公司;
反应程序为:阶段1:94℃预变性5min;阶段2:94℃30s,55℃30s,72℃30s,共35个循环;阶段3:72℃延伸8min;阶段4:4℃保存;
b.将该PCR扩增产物进行酶切反应,得到酶切产物;
所述的酶切反应的反应体系(15μL)中含有:
1μL10×Buffer TangoTM,0.5μL FspBI DNA内切酶(购自Fermantas公司),5μLPCR扩增产物;
所述的酶切反应程序为:37℃酶切反应12~16小时,然后68℃变性20分钟,于4℃保存。所述的酶切反应结果如图4、图5所示。图为4基因标记a_dCAPs扩增阿柯克孜外(P1)XHBF(P2)F1(P1×P2)与22个重测学材料的电泳图(GS1-GS22);图5为为基因标记a_dCAPs检测阿柯克孜外(P1)XHBF(P2)所得F1(P1×P2)自交后获得的F2代群体单株基因型的电泳图。
本实施例中的验证结果与分析如下:
1、a基因DNA序列及蛋白序列分析
E步骤中,对雌雄异花同株性型亲本材料XHBF、雄花完全花同株性型材料阿柯克孜外及22个西瓜重测序材料进行a基因扩增、克隆及测序后,测序结果显示有一个重要SNP位点,它是一个存在于a基因CDS区的AA G→C aa突变,其转化为蛋白质序列后的变异为C364W。
通过比对甜瓜CmACS-7蛋白质序列后并结合蛋白质结构分析结果,发现该位点使西瓜a基因所编码的ACS合成酶蛋白第364个氨基酸残基由半胱氨酸转变色氨酸。其中,半胱氨酸是含巯基的极性氨基酸,它在蛋白质内部形成二硫键可能减弱蛋白质的结构稳定性,而色氨酸是一种芳香族非极性氨基酸,其苯环结构的改变极有可能造成a基因编码蛋白质结构的变化。当ACS合成酶第364个氨基酸残基由色氨酸变成半胱氨酸时,其空间结果极可能变化导致蛋白质稳定性减低,致使酶失活。
ACS合成酶在植物乙烯合成路径中的主要作用是催化S-腺苷甲硫氨酸(SAM)氧化成1-氨基环丙烷1-羧酸(ACC)在对a基因编码的ACS合成酶蛋白进行结构分析后,发现其该位点变化之后,蛋白质的亲水性发生了较大的变异。后对其三维结果进行预测发现,SNP位点所编码氨基酸残基位于酶结合PLP的活性区域。而SAM氧化成ACC的生理过程依赖于PLP,故认为该SNP位点(C364W)为导致西瓜两性花发育的基因a基因的SNP位点。
2、a基因研究F2代群体遗传规律分析
F步骤中,对雌雄异花同株亲本新红宝、雄花完全花同株亲本阿柯克孜外、F1、F2的278个单株进行花性型表型鉴定,其结果表明:新红宝为典型雌雄异花同株性型,阿柯克孜外为典型雄花完全花同株性型,F1为典型雌雄异花同株性型,而F2群体鉴定结果表明278个株系有205个雌雄异花同株单株和73株雄花完全花同株单株,卡平方检验χ2=0.23<α2 0.05,1=3.84,符合3:1分离比例。
通过a基因dCAPs标记对F2群体进行基因型分析,发现其AA基因型植株为70株,Aa基因型植株为135株,aa基因型为73株,符合1:2:1分离比率。结合表型鉴定结果分析,其表型与基因型的符合率为100%。
综合双亲、F1、F2的278个单株性型表型与基因型鉴定结果,表明影响西瓜雌花上雄蕊发育的基因a基因为隐性单基因。
3、22个西瓜基因组重测序材料及519份自然群体a基因验证
F步骤中,利用西瓜a基因长距离PCR扩增特异性引物p60_4对西瓜基因组22个重测序材料进行全长扩增并测序比对结果,发现其中有3个材料:BlackDiamond、PI482271、PI500301具有a基因SNP位点。结合表型鉴定结果发现这3个材料均为雄花完全花系材料。同时,对22个重测序材料进行a基因a_dCAPs标记扩增,其结果与表型相符。
利用a基因dCAPs标记对本试验室519份种质资源构成的自然群体进行基因型验证,并结合表型分析结果显示:在自然群体中,共有204个材料为异花同株材料、315个材料为雄完株材料,其表型与基因型的符合比率为100%。
综上所述,dCAPs标记a_FspBI为导致西瓜两性花发育的基因a基因的基因标记,其所在基因全长序列为的DNA序列导致西瓜两性花发育的基因a基因全长序列。
附表:
表1:步骤A和步骤F中,西瓜22个基因组重测序材料:
材料编号 | 材料名称 | 性别表型 |
GS1 | 97103 | 雌雄异花同株 |
GS2 | RZ-900 | 雌雄异花同株 |
GS3 | RZ-901 | 雌雄异花同株 |
GS4 | Sugarlee | 雌雄异花同株 |
GS5 | JX-2 | 雌雄异花同株 |
GS6 | JLM | 雌雄异花同株 |
GS7 | JXF | 雌雄异花同株 |
GS8 | XHBFGM | 雌性系 |
GS9 | Calhoum Gray | 雌雄异花同株 |
GS10 | Black Diamond | 雄完株 |
GS11 | PIa96341-FR | 雌雄异花同株 |
GS12 | PI595203 | 雌雄异花同株 |
GS13 | PI386019 | 雌雄异花同株 |
GS14 | PI482271 | 雄完株 |
GS15 | PI482303 | 雌雄异花同株 |
GS16 | PI482276 | 雌雄异花同株 |
GS17 | PI904304 | 雌雄异花同株 |
GS18 | PI249010 | 雌雄异花同株 |
GS19 | PI248178 | 雌雄异花同株 |
GS20 | PI189317 | 雌雄异花同株 |
GS21 | PI500301 | 雄完株 |
GS22 | PI482326 | 雌雄异花同株 |
表2:步骤A和步骤F中,部分种质资源材料
材料编号 | 材料名称 | 性别表型 |
E1 | 周绿网 | 雌雄异花同株 |
E2 | 京欣6母本 | 雌雄异花同株 |
E3 | 新102 | 雌雄异花同株 |
E4 | 京丽母本 | 雌雄异花同株 |
E5 | 印度母本-1 | 雌雄异花同株 |
E6 | 印度大籽父本 | 雄完株 |
E7 | PI500307-① | 雄完株 |
E8 | 303 | 雌雄异花同株 |
E9 | ENGA | 雄完株 |
E10 | 旧102杂瓜 | 雌雄异花同株 |
E11 | 198 | 雌雄异花同株 |
E12 | PM2 | 雌雄异花同株 |
E13 | 花皮克仑生 | 雌雄异花同株 |
注:上述父本、母本、西瓜基因组重测序材料及自然群体材料均为北京市农林科学院蔬菜研究中心西瓜种质资源库保存的种质资源材料。
Claims (10)
1.导致西瓜两性花发育的基因a,其特征在于:具有序列表中的SEQ ID NO:1~6的核苷酸碱基序列。
2.导致西瓜两性花发育的基因a,其特征在于:具有翻译为序列表中的SEQ ID NO:7~8的氨基酸残基序列的核苷酸碱基序列。
3.导致西瓜两性花发育的基因a基因序列的获得方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
A、供试材料选取:
选取供试体材料;
B、基因组DNA的提取:
将所述的供试材料分别进行DNA提取处理,得到供试材料基因组DNA;
C、长距离PCR扩增反应与产物的检测:
以所述的供试材料基因组DNA为模板,进行长距离PCR扩增反应,得到长距离扩增产物;
D、特异性扩增序列的获得:
将所述的长距离扩增产物进行纯化处理后与质粒载体进行连接反应,得到重组质粒;再将所述的重组质粒转入感受态细胞,再进行筛选、检测、测序,得到特异性扩增序列;
E、候选SNP的获得:
将所述的特异性扩增序列的核苷酸序列进行分析比对并结合内含子剪切预测结果,得到候选SNP位点;
F、对所述的候选SNP位点进行验证,获得所述的导致西瓜两性花发育的基因a序列。
4.根据权利要求3所述的导致西瓜两性花发育的基因a序列的获得方法,其特征在于:
步骤C的长距离PCR扩增反应中,
上游引物的核苷酸序列:
5’-CCAATTTCTATCAAATATGGGCAATG-3’,
下游引物的核苷酸序列:
5’-TCTCTGGATCTTAAAACCCGATT-3’。
5.根据权利要求3或4所述的导致西瓜两性花发育的基因a序列的获得方法,其特征在于:
步骤C的长距离PCR扩增反应中,反应程序为:
阶段1:94℃预变性5min;阶段2:94℃30s,55℃30s,68℃2min,共10个循环;阶段3:94℃30s,55℃30s,68℃2min,第一个循环的时间为2分钟,从第二个循环开始,时间在前一个循环的基础上增加5秒,共25个循环;阶段4:68℃延伸10min;阶段5:4℃保存。
6.根据权利要求3所述的导致西瓜两性花发育的基因a序列的获得方法,其特征在于:步骤F中的验证中,利用基因标记a_dCAPs进行PCR扩增反应中,
上游引物的核苷酸序列:
5’-CAATAACGGGCTTAAATTCATCCG-3’,
下游引物的核苷酸序列:
5’-CATGTTGTCGAACCGGAAGTTTAC-3’。
7.根据权利要求3或6所述的导致西瓜两性花发育的基因a序列的获得方法,其特征在于:步骤F中的验证中,利用基因标记a_dCAPs进行PCR扩增反应中,反应程序为:
反应程序为:阶段1:94℃预变性5min;阶段2:94℃30s,55℃30s,72℃30s,共35个循环;阶段3:72℃延伸8min;阶段4:4℃保存。
8.根据权利要求7所述的导致西瓜两性花发育的基因a序列的获得方法,其特征在于:步骤F中的验证,酶切反应采用的DNA内切酶为FspBI。
反应程序为:将步骤F所得PCR产物37℃酶切12-16个小时,再68℃变性20min,于4℃保存。
9.根据权利要求3所述的导致西瓜两性花发育的基因a序列的获得方法,其特征在于:
B步骤的基因组DNA的提取包括以下步骤:
a.取叶片在液氮中研磨成粉末,再加入2%CTAB提取液,混匀,于65℃水浴1小时,得到混合物A;
b.将所述的混合物A停止水浴,加入1/3体积的5M的醋酸钾溶液,混匀,冰浴20分钟;再加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)抽提两次,得到上清液A;
c.向所述的上清A中加入2/3体积异丙醇用来沉淀DNA;再用洗涤缓冲液(76%乙醇,10mM乙酸铵)洗涤一次,吹干,再加TE缓冲液(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH7.4)溶解,得到溶液A;
d.向所述的溶液A中加入RNase A,使其终浓度达100μg/ml,再混匀37℃水浴1小时;再用等体积的氯仿/异戊醇(24:1)抽提一次,得到上清液B;
e.向所述的取上清液B中加入1/2体积7.5M醋酸铵、2倍体积无水乙醇,得到DNA沉淀;
f.用70%乙醇洗涤所述的DNA沉淀,吹干,加适量ddH2O溶解DNA,得到供试材料基因组DNA。
10.根据权利要求3所述的导致西瓜两性花发育的基因a序列的获得方法,其特征在于:A步骤的供试材料选取中,所述的供试体材料包括:父本阿柯克孜外,母本新红宝,该父本和母本杂交后的F1代;该F1代交获得的F2代;西瓜基因组重测序材料;西瓜种质资源构成的自然群体。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201310009650.8A CN103215289B (zh) | 2013-01-10 | 2013-01-10 | 导致西瓜两性花发育的基因a序列及其获得方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201310009650.8A CN103215289B (zh) | 2013-01-10 | 2013-01-10 | 导致西瓜两性花发育的基因a序列及其获得方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103215289A true CN103215289A (zh) | 2013-07-24 |
CN103215289B CN103215289B (zh) | 2014-06-25 |
Family
ID=48813446
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201310009650.8A Active CN103215289B (zh) | 2013-01-10 | 2013-01-10 | 导致西瓜两性花发育的基因a序列及其获得方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN103215289B (zh) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104711349A (zh) * | 2015-03-11 | 2015-06-17 | 中蔬种业科技(北京)有限公司 | 与菠菜性别基因y紧密连锁的分子标记d4.3及其应用 |
CN106755401A (zh) * | 2016-12-21 | 2017-05-31 | 北京市农林科学院 | 一株西瓜雌性突变株及西瓜雌性系的检测方法 |
CN109439790A (zh) * | 2018-12-11 | 2019-03-08 | 中国农业科学院郑州果树研究所 | 一种鉴定甜瓜性型InDel分子标记及其引物和应用 |
CN109652412A (zh) * | 2019-01-22 | 2019-04-19 | 西北农林科技大学 | 一种snp分子标记、检测甜瓜花性型的方法及应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101591708A (zh) * | 2009-06-11 | 2009-12-02 | 上海交通大学 | 黄瓜snp标记及其检测方法 |
CN102165067A (zh) * | 2008-07-28 | 2011-08-24 | 国家农艺研究院 | 用于控制双子叶植物花发育的两个遗传元件的组合及在检测和选择方法中的应用 |
-
2013
- 2013-01-10 CN CN201310009650.8A patent/CN103215289B/zh active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102165067A (zh) * | 2008-07-28 | 2011-08-24 | 国家农艺研究院 | 用于控制双子叶植物花发育的两个遗传元件的组合及在检测和选择方法中的应用 |
CN101591708A (zh) * | 2009-06-11 | 2009-12-02 | 上海交通大学 | 黄瓜snp标记及其检测方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
《GENBANK》 20080820 Boualem A "Genbank登录号:ACG70849" , * |
《中国优秀硕士学位论文全文数据库(农业科技辑)》 20110615 胡宝刚 "西瓜ACC合成酶基因的表达分析与克隆" , 第6期 * |
BOUALEM A: ""Genbank登录号:ACG70849"", 《GENBANK》, 20 August 2008 (2008-08-20) * |
胡宝刚: ""西瓜ACC合成酶基因的表达分析与克隆"", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库(农业科技辑)》, no. 6, 15 June 2011 (2011-06-15) * |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104711349A (zh) * | 2015-03-11 | 2015-06-17 | 中蔬种业科技(北京)有限公司 | 与菠菜性别基因y紧密连锁的分子标记d4.3及其应用 |
CN106755401A (zh) * | 2016-12-21 | 2017-05-31 | 北京市农林科学院 | 一株西瓜雌性突变株及西瓜雌性系的检测方法 |
CN106755401B (zh) * | 2016-12-21 | 2019-09-06 | 北京市农林科学院 | 一株西瓜雌性突变株及西瓜雌性系的检测方法 |
CN109439790A (zh) * | 2018-12-11 | 2019-03-08 | 中国农业科学院郑州果树研究所 | 一种鉴定甜瓜性型InDel分子标记及其引物和应用 |
CN109652412A (zh) * | 2019-01-22 | 2019-04-19 | 西北农林科技大学 | 一种snp分子标记、检测甜瓜花性型的方法及应用 |
CN109652412B (zh) * | 2019-01-22 | 2022-04-01 | 西北农林科技大学 | 一种snp分子标记、检测甜瓜花性型的方法及应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN103215289B (zh) | 2014-06-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106086216B (zh) | 一种与马氏珠母贝生长性状关联的snp标记及引物和应用 | |
CN110295246A (zh) | 与对非生物胁迫的响应相关联的基因座 | |
CN103789306A (zh) | 一种稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子标记及其方法与应用 | |
Doleželová et al. | Physical mapping of the 18S-25S and 5S ribosomal RNA genes in diploid bananas | |
CN103937785B (zh) | 西瓜雌性系基因ClWIP1与染色体易位及连锁标记 | |
CN102140506B (zh) | 与甜瓜抗蔓枯病基因Gsb-2连锁的分子标记及其应用 | |
CN103215289B (zh) | 导致西瓜两性花发育的基因a序列及其获得方法 | |
CN104672315B (zh) | 控制黄瓜无卷须性状的基因及与黄瓜卷须性状相关的snp标记 | |
CN112159858A (zh) | 与花椰菜紫色基因紧密连锁的分子标记及应用 | |
CN109735648B (zh) | 一种筛选不同千粒重小麦的方法及其专用试剂盒 | |
CN107400715A (zh) | 十倍体长穗偃麦草专化分子标记与探针的开发及其应用 | |
Beser et al. | Marker-assisted introgression of a broad-spectrum resistance gene, Pi40 improved blast resistance of two elite rice (Oryza sativa L.) cultivars of Turkey | |
CN107475390A (zh) | 十倍体长穗偃麦草串联重复序列特异探针的开发与应用 | |
CN104328119A (zh) | 团头鲂生长性状相关的微卫星分子标记及应用 | |
CN106755465B (zh) | 与小麦旗叶长QTL QFll.sicau-2D紧密连锁的分子标记及应用 | |
US20190380295A1 (en) | Targeted modification of maize roots to enhance abiotic stress tolerance | |
CN103114134B (zh) | 检测小麦远缘杂交杂种中x型hmw-gs基因的方法 | |
CN112522290B (zh) | 一个海岛棉纤维品质关联的类钙调磷酸酶b互作蛋白激酶基因 | |
CN111334597B (zh) | 用于检测西瓜白粉病抗性的snp位点、kasp标记及其应用 | |
CN108396026A (zh) | 十倍体长穂偃麦草蓝粒性状专化分子标记和荧光原位杂交探针的开发及应用 | |
CN108517374A (zh) | 一种snp标记及其应用 | |
Lan et al. | Application of molecular marker assisted selection in gene pyramiding and selection of new cultivars | |
CN113278723A (zh) | 合成芥菜中导入的白菜基因组片段或遗传多样性分析的组合物及应用 | |
CN108179222B (zh) | 与水稻高产相关的分支酸变位酶核苷酸序列及其应用 | |
CN111733273A (zh) | Dna条形码序列及其鉴定枸杞种属的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |