CN103114134B - 检测小麦远缘杂交杂种中x型hmw-gs基因的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测小麦远缘杂交杂种中沙融山羊草X型高分子量谷蛋白亚基（HMW-GS）基因的方法，本发明还提供了检测沙融山羊草X型HMW-GS基因的引物，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1~2所示，利用该引物进行PCR反应能够快速准确地检测小麦远缘杂交杂种中是否含有沙融山羊草X型HMW-GS基因位点。本方法能够准确检测出小麦杂种中沙融山羊草X型HMW-GS基因的转移与存在，方便跟踪该基因，大大提高育种工作效率，加快小麦品质育种的进程，在小麦族的杂交育种领域具有良好的应用前景。

Description

检测小麦远缘杂交杂种中X型HMW-GS基因的方法

技术领域

本发明涉及分子遗传学领域，特别是涉及检测沙融山羊草X型高分子量谷蛋白亚基（high molecular weight glutenin subunit，HMW-GS）基因的引物，本发明还涉及利用该引物进行小麦远缘杂交杂种及后代中X型谷蛋白亚基基因检测的方法及检测试剂盒。

背景技术

小麦的野生近缘种中具有许多普通小麦基因库中所欠缺的优良基因资源，是可供利用的宝贵资源库。到目前为止，人们通过染色体工程技术已将黑麦、簇毛麦、中间偃麦草、披碱草、高大山羊草、大麦等近缘种质的有益基因导入小麦。如山羊草属物种具有抗条锈、叶锈、秆锈病、白粉病，耐旱、耐盐碱、耐寒、高蛋白等对小麦改良十分重要的优良基因，是小麦改良的外源基因供体。因此，通过远缘杂交把小麦的野生近缘种有利基因导入普通小麦，进而改变小麦的遗传背景，丰富小麦遗传资源具有重要意义。

小麦改良是通过对目标基因进行选择，实现优良基因集成的过程。如果在目标基因导入小麦的过程中，对被转移的基因及其载体—外源染色体或染色体片段进行有效、快速的鉴定和追踪，可以提高选择的准确性，从而缩短育种周期，提高育种效率。因此，对导入小麦的外源染色体、染色体片段或所携带的外源基因进行有效鉴定（即真杂种的鉴定）十分重要。目前，基于遗传标记系统而建立起来的鉴定外源染色体的常用方法，主要包括：形态学鉴定和细胞学鉴定等。形态学分析通过比较观察杂种F1植株与亲本在形态学上的异同而做出鉴定；细胞学鉴定通过核型分析，染色体配对分析，C-带技术等对杂种F1进行鉴别；此外，原位杂交技术也被广泛用于外源染色体或片段的鉴定，原位杂交通过将放射性或非放射性标记的外源核酸(探针)与染色体或DNA上经过变性后的单链DNA互补配对，结合成专一性的核酸分子，在经一定的检测手段将待测核酸在染色体或DNA上的位置显示出来，从而进行染色体的识别与杂种的鉴定。

然而，无论是形态学鉴定，细胞学鉴定还是原位杂交都必须通过培育F1代种子成植株，并在其合适的生长时期取材才能做分析与鉴定，形态学鉴定更是需要观察F1植株与其亲本的整个生长周期并作相应的比较。这些鉴定方法对季节与取材时间要求严格且部分操作复杂，对操作、技术及实践经验要求高，鉴定时间跨度大，不能当年进行鉴定。

高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)是小麦胚乳中的重要贮藏蛋白，占小麦总储藏蛋白的10%左右，是小麦面粉加工品质的重要决定因素。在普通小麦及其近缘物种中，高分子量谷蛋白亚基由位于第l部分同源群染色体长臂的单个个基因位点所控制，每一个HMW-GS基因位点上都包含2个紧密连锁的基因，其中分子量较大的称为X型亚基，分子量较小的称为Y型亚基。小麦近缘种野生中，编码HMW-GS的位点也位于第一同源群染色体长臂上，高分子量谷蛋白亚基的类型和组成的不同决定了小麦面粉的加工品质的优和劣。已有的研究表明，普通小麦本身含有的HMW-GS的类型较少，而在小麦近缘属物种中含有大量新的HMW-GS变异类型。

沙融山羊草是小麦的近缘物种之一，具有许多优良的抗病、抗逆及品质基因，并被用来作为亲本通过远缘杂交的方式对普通小麦进行遗传改良。从沙融山羊草中克隆鉴定出的新的高分子量谷蛋白X型亚基基因，其编码的高分子量谷蛋白亚基大小几乎超过了所有已知的其他HMW-GS，是非常独特的等位基因变异类型，而高分子量谷蛋白亚基大小与组成直接影响小麦的加工品质，因此，沙融山羊草中如此大的亚基转移进普通小麦，必将对普通小麦的品质产生影响，而且，以检测该亚基基因的存在作为判断杂交成功的标志，将比其他性状更加直观，容易检测鉴定。

因此，在连续杂交育种的过程中有必要建立一种简单、高效、快速的检测沙融山羊草与其他小麦族物种远缘杂交杂种中属于沙融山羊草X型谷蛋白亚基基因的方法，但是，形态学与细胞学的观察鉴定方法，操作繁琐、评价标准不易准确把握，不能快速对外源转入的目的基因进行追踪与鉴定，据此，我们依据已知的沙融山羊草高分子量X型谷蛋白亚基基因序列，开发了特异性引物，不但扩增筛选鉴定出了以沙融山羊草为亲本的不同杂交及回交后代材料中属于沙融山羊草X型亚基的编码基因条带，而且能在连续的杂交世代中追踪检测沙融山羊草X型谷蛋白亚基基因的转移情况，这不但减少了杂交育种的工作量，而且结果可靠，将极大的促进对远缘杂交后代的研究工作而加快品质育种的进程。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供用于检测沙融山羊草X型HMW-GS基因的引物。

本发明的第二个目的在于提供通过检测沙融山羊草X型HMW-GS基因的引物，鉴定小麦远缘杂交杂种中是否有沙融山羊草X型谷蛋白亚基基因的方法，加快小麦品种的选择进度。

本发明的第三个目的在于提供检测小麦远缘杂交杂种中X型HMW-GS基因的试剂盒。

基于以上目的，本发明根据Jiang et al.（BMC plant biology2012，12:73）对沙融山羊草的研究结果，从NCBI数据库中获得沙融山羊草高分子量X型谷蛋白亚基完整的编码基因，并对基因序列结构进行分析。运用DNAMAN软件对沙融山羊草X型谷蛋白亚基编码基因及二粒小麦，普通小麦的HMW-GS基因进行序列比对分析，分析沙融山羊草HMW-GS基因序列的特异性位点，筛选确定沙融山羊草高分子量X型高分子量谷蛋白亚基编码基因序列12-32bp，429-447bp，处为该基因的特异性位点，据此，设计了一对检测沙融山羊草X型HMW-GS基因的特异性引物。

本发明提供了检测小麦远缘杂交杂种中沙融山羊草X型HMW-GS基因的引物，是RX1

上游引物序列，5’-GTTAGTCCTCTTTGTAGCGA-3’（SEQ IDNO.1）

下游引物序列，5’-ATATCCTTGTTGTCTTTGTCCT-3’（SEQ IDNO.2）。

进一步地，提供了上述引物在检测小麦远缘杂交杂种中沙融山羊草X型HMW-GS基因的应用。

进一步地，提供了上述引物在小麦杂交鉴定中的应用。

进一步地，提供了上述引物在小麦选育中的应用。

本发明提供了一种检测小麦远缘杂交杂种中X型HMW-GS基因的方法，用引物RX1进行PCR方法扩增待检小麦基因组DNA，如果用引物RX1能够扩增出439bp的扩增片段，则标志着该待检小麦存在X型谷蛋白亚基基因，所述RX1引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.1~2所示。

其中，所述PCR方法的反应程序为：预变性94~96℃，5~8min；94~96℃变性45~60s，60~63℃退火30~40s，72~74℃延伸40~50s，共30~35个循环；终延伸72~74℃8~10min。

优选地，所述PCR方法的反应程序为：预变性94℃，5min；94℃变性45s，60℃退火30s，72℃延伸40s，共30个循环；终延伸72℃8min。

本发明提供了上述方法在小麦育种中的应用。

本发明还提供了一种检测小麦远缘杂交杂种中沙融山羊草X型谷蛋白亚基基因的试剂盒，含有引物RX1，

上游引物序列，5’-GTTAGTCCTCTTTGTAGCGA-3’

下游引物序列，5’-ATATCCTTGTTGTCTTTGTCCT-3’；

本发明开发的沙融山羊草高分子量X型谷蛋白亚基基因的特异性引物，直接对杂交后代材料进行目的基因的扩增检测，不但能从基因分子水平上对杂交后代的真假做出确认鉴定，而且在连续的自交与回交育种过程中能够追踪检测基因的转移与存在，弥补了形态学鉴定的粗放，细胞学鉴定的繁琐等不足，并且鉴定方法简单，结果可靠，这对以通过远缘杂交育种来改良普通小麦的育种方式来说将是一种很好的辅助育种手段。经过本发明的方法鉴定后，将使后面对杂种的研究能够更有目的性与针对性，并且随着对沙融山羊草的继续深入研究，其各种优良性状被用来改良小麦族其他作物，，本发明的以沙融山羊草X型亚基基因为标记基因的分子鉴定，标记方法将能够推广到沙融山羊草与所有小麦族物种的杂交后代真假鉴定中，并将极大地方便杂交育种工作，实现作物的遗传改良。

附图说明

图1为四倍体小麦（Z636）与二倍体沙融山羊草（R7）杂交所得种子SDS-PAGE电泳检测图，检测结果发现一个为真杂种一个为假杂种，箭头表示沙融山羊草中的X型高分子量谷蛋白亚基。

图2为经检测为真杂种的F1(Z636×R7)与其亲本的植株生长对比图。

图3为经检测为真杂种的F1(Z636×R7)与其亲本的穗形对比图。

图4为经检测为真杂种的F1(Z636×R7)与其亲本的穗形对比图。

图5为远缘杂交组合Z636×R7后代F1与普通小麦csph2a回交后代（BC1）SDS-PAGE电泳检测图，数字代表所获得BC1F1代种子编号，箭头表示沙融山羊草中的X型高分子量谷蛋白亚基。

图6为利用RX1引物对杂交后代进行基因特异性扩增的检测图，其中，M2为DNA markerⅡ，父本R7为沙融山羊草，F1、BC1、F2及相应数字分别代表杂交子一代，回交子一代，F1自交后代所得种子编号，母本1（♀1）为四倍体小麦Z636，母本2（♀2）为回交轮回亲本六倍体小麦川农16。

图7为引物RX1分别检测远缘杂交F1，F2，BC1扩增片段克隆测序的序列比对图。JN001485为沙融山羊草中X型高分子量谷蛋白亚基基因在GenBank的登录号，R7为沙融山羊草的扩增片段序列，F1-1，F1-3，F1-4为R7与Z636杂交F1代植株的扩增片段序列，F2-1和F2-2是自交F2代植株的扩增片段序列，BC1-1，BC1-4为回交F1代植株的扩增片段序列，RX1F为上游引物，RX1R为下游引物。

图8为对RX1引物对进行特异性验证的检验图，其中，M2为DNA markerⅡ，R7为沙融山羊草，F1、F2、BC1分别代表杂交第一代、F1自交后代、F1回交一代；编号1-5分别代表5个四倍体小麦：Z636、Z606、Z639、JR-11-48、S24，编号6-12分别代表7个普通小麦：川农16、良麦2号、良麦4号、绵麦37、蜀麦482、川育12、中国春。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明使用的四倍体小麦Z636，六倍体小麦csph2a、川农16，沙融山羊草R7，均可从四川农业大学小麦研究所得到。本发明所用生化试剂均为市售。

本发明各试剂配方如下：

蛋白提取缓冲液配方为：62.5mM Tris-HCL pH6.8，2％(W/V)SDS，10％(V/V)甘油，1.5％(W/V)DTT，0.002%(W/V)溴酚蓝。

染色液配方为：0.001%考马斯亮蓝R-250（W/V），10%冰醋酸，25%异丙醇；脱色液配方为：10%冰醋酸，25%异丙醇。

凝胶制备方法为：采用不连续缓冲系统，分离胶用10%SDS-PAGE（pH8.9），浓缩胶用3%SDS-PAGE（pH6.8）；

聚丙烯酰胺凝胶配方：

其中Resolving gel缓冲液配方：1.25M Tris-HCL，1%SDS（W/V），3.8%（W/V）硼酸，pH8.9；Stacking gel缓冲液配方：1.0M Tris-HCL，pH6.8，10%SDS（W/V）；电极缓冲液配方：将Resolving gel缓冲液稀释10倍。

实施例1检测沙融山羊草X型谷蛋白亚基基因引物的确定

根据文献（Jiang Q T,Ma J,Wei Y M,et al.Novel variants ofHMW glutenin subunits from Aegilops section Sitopsis species inrelation to evolution and wheat breeding.BMC Plant Biology,2012,12:73.）对沙融山羊草的研究结果，从NCBI数据库中获得沙融山羊草X型HMW-GS完整的编码基因，并对基因序列结构进行分析。本发明对沙融山羊草X型谷蛋白亚基编码基因及二粒小麦，普通小麦中普遍存在的HMW-GS基因（沙融山羊草谷蛋白X型亚基编码基因登录号分为JN001485；二粒小麦，普通小麦中常见亚基为1Ax，1Bx7，1By8，1Dx2，1Dx5，1Dy10，1Dy12其编码基因登录号分别为EF055262、BK006773、JN255519、BK006460、HM050419、EU287437、BK006459）进行序列比对分析，经过反复观察分析，确定沙融山羊草高分子量X型谷蛋白亚基编码基因序列12-32bp和429-447bp处为该基因的特异性位点，并设计了一对沙融山羊草X型亚基基因的特异性引物RX1，其核苷酸序列如下：

上游引物：5’-GTTAGTCCTCTTTGTAGCGA-3’；

下游引物：5’-ATATCCTTGTTGTCTTTGTCCT-3’。

实施例2检测小麦远缘杂交杂种中沙融山羊草X型HMW-GS基因方法的建立

1、小麦远缘杂交杂种的获得与鉴定

以四倍体小麦（Z636）为母本，进行人工去雄（剪去上部老的小穗和基部太嫩的小穗，只留中间10-15个小穗，套袋）。2-3d后授以新鲜的沙融山羊草（R7）花粉（剪取正在扬花的穗子，抖动花药落入去雄的母本小花上），然后套袋直到收获，得到少量种子。

取上述远缘杂交所得的种子每粒用刀将其横切成两半，取含有胚乳的半粒种子研磨成细粉，置于1.5ml的离心管中，按每毫克细粉加25μl蛋白提取缓冲液于室温下浸提2.5h，期间涡旋混匀3次；将浸提后的样品在沸水中煮8min，8000r/min离心5min，上清液即为蛋白提取样品。

吸取蛋白提取样品8μl点样，采用BIO-RAD的Mini-PROTEANTetra System电泳仪进行电泳，用Tris-硼酸作电极缓冲液，恒流20mA电泳，待溴酚蓝跑出分离胶25min后结束电泳，电泳大概需要3h。

电泳结束后，取下胶，将凝胶置于有染色液的大培养皿中进行染色，并将大培养皿放在摇床，轻摇染色，染色2～3h；染色后，用蒸馏水或者脱色液脱色至背景清晰，此时即可观察，照相或做成干胶长期保存；

Z636×R7的杂种鉴定结果如图1。

由图1可看出杂种与亲本高分子量谷蛋白条带差异明显，真假杂种易于辨别。说明获得Z636×R7的真杂种，即为F1。F1（Z636×R7）与亲本的植株生长和穗形对比情况见图2-4。

2、F1(Z636×R7)与六倍体小麦的回交种子的获得与鉴定

为实现将沙融山羊草中的高分子量谷蛋白亚基向普通小麦转移而达到品质育种的目的，按照步骤1中的去雄授粉方法以已检测为真杂种的远缘杂交组合F1(Z636×R7)为母本，六倍体普通小麦csph2a为父本的杂交，将所得到的种子进行蛋白提取，凝胶电泳与观察，方法同上述步骤1；F1(Z636×R7)×csph2a的杂种鉴定结果如图5。

由图2可看出杂种与亲本高分子量谷蛋白条带差异明显，真假杂种易于鉴别。说明通过回交获得了F1(Z636×R7)与六倍体小麦的回交真杂种种子。

3、基因组DNA提取

将经过SDS-PAGE检测后的杂种F1，F1自交后代F2，F1与普通小麦回交后代F1BC1及其亲本种植于田间，待生长茂盛时取叶片进行基因组DNA提取。提取方法采用CTAB法，具体提取步骤如下：

a)将检测后的杂交种子种植，植株长大后取2g新鲜幼嫩叶片，液氮研磨成细粉后加预热至65℃的CTAB提取液(2%CTAB；1.4M NaCl；0.1M Tris-HCl，pH=8.0；0.1M EDTA，pH=8.0；使用前加2%β-巯基乙醇)15ml，混匀。

b)65℃水浴40min，其间轻摇混匀。

c)冷却至室温后加等体积的氯仿：异戊醇(24∶1)，轻轻混匀至上清液呈牛奶状，4000r/min离心10min。

d)取上清液，加等体积异丙醇，置于冰浴中沉淀DNA。

e)勾出DNA，用70%酒精洗2次，无水乙醇洗一次，气干DNA，溶于适量pH=8.0的1×TE溶液中。加入RNA酶至终浓度100μg/μl。

f)琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度及质量。

4、PCR特异性扩增

采用实施例1的引物RX1对上述各种子的基因组进行PCR扩增。

RX1上游引物：5’-GTTAGTCCTCTTTGTAGCGA-3’；

下游引物：5’-ATATCCTTGTTGTCTTTGTCCT-3’。

PCR反应体系：

PCR反应程序：

RX1引物扩增片段长度为439bp。

扩增结果见图6，由图可看出，引物RX1能特异性扩增沙融山羊草X型高分子量谷蛋白亚基目的片段，能对杂交后代进行追踪检测，引物特异性好。

5、特异片段的验证：

使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（TIANGEN）进行PCR产物的回收与纯化。扩增产物回收并纯化后连接到T载体，按照pMD19-T试剂盒（TaKaRa）使用说明书进行，反应液于16℃水浴连接过夜。转化大肠杆菌感受态细胞，挑取培养过夜的平板上生长良好的白色单菌落，在含有氨苄青霉素（50μg/mL）的LB固体培养基平板上划线，扩大培养（37℃培养12h）。挑取重组菌进行PCR扩增，扩增使用载体上的引物M13:

M13F(RV-M):5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’

M13R(M13-47):5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’

PCR反应总体积为25μL，其中含10×PCR buffer2.5μL，1.5mmol/LMgCl₂1.5μL，4种dNTP各200μmol/L共1μL，引物各75ng，0.75UTaq酶，少许白斑菌体。PCR反应程序同上。获得阳性克隆后，送大连宝生物公司进行测序。测序结果见图7，表明利用RX1引物在杂种以及回交后代中扩增的片段序列与沙融山羊草X型谷蛋白亚基基因目标区域序列完全一致。说明本发明建立的检测小麦远缘杂交杂种中X型谷蛋白亚基基因的方法准确、可靠。

实施例3检测小麦远缘杂交杂种中沙融山羊草X型HMW-GS基因引物的特异性验证

为确保所本发明开发的引物能够真正检测到沙融山羊草X型HMW-GS基因的转移与存在，有必要对引物的特异性进行验证。按照实施例2中的植物基因组DNA提取方法及PCR扩增方法，提取5个四倍体小麦（Z636、Z606、Z639、JR-11-48、S24，由四川农业大学小麦研究所提供），7个普通小麦（川农16、良麦2号、良麦4号、绵麦37、蜀麦482、川育12、中国春，由四川农业大学小麦研究所提供）的基因组DNA并利用所设计的引物RX1进行PCR扩增检测，扩增检测方法同实施例2；

扩增检测结果见图8，由图可看出，本发明的引物只能在沙融山羊草（R7）作为亲本参与过杂交的杂交后代材料中扩出目的条带，而在其他品种材料（5个四倍体小麦和7个普通小麦品种）中没有扩增条带出现，因此进一步表明，所开发的检测沙融山羊草高分子量X型谷蛋白亚基编码基因引物特异性良好，达到100%特异，能够在小麦育种中进行应用。由此说明，利用本发明提供的引物能够准确跟踪并检测出含有沙融山羊草X型谷蛋白亚基基因的小麦杂种，从而有利于大大提高小麦育种效率。

虽然，上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.检测沙融山羊草X型HMW-GS基因的引物对，其特征在于，其为RX1，

上游引物序列，5’-GTTAGTCCTCTTTGTAGCGA-3’

下游引物序列，5’-ATATCCTTGTTGTCTTTGTCCT-3’。

2.权利要求1所述引物对在检测小麦远缘杂交杂种中沙融山羊草X型HMW-GS基因的应用。

3.权利要求1所述引物对在小麦杂交鉴定中的应用。

4.权利要求1所述引物对在小麦选育中的应用。

5.一种检测小麦远缘杂交杂种中沙融山羊草X型HMW-GS基因的方法，其特征在于，用引物对RX1进行PCR方法扩增待检小麦基因组DNA，如果用引物对RX1能够扩增出439bp的扩增片段，则标志着该待检小麦存在X型HMW-GS基因，所述RX1引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR方法的反应程序为：预变性94～96℃，5～8min；94～96℃变性45～60s，60～63℃退火30～40s，72～74℃延伸40～50s，共30～35个循环；72～74℃终延伸8～10min。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR方法的反应程序为：预变性94℃，5min；94℃变性45s，60℃退火30s，72℃延伸40s，共30个循环；72℃终延伸8min。

8.权利要求5～7任一所述的方法在小麦育种中的应用。

9.一种检测小麦远缘杂交杂种中X型HMW-GS基因的试剂盒，其特征在于，含有引物对RX1，

上游引物序列，5’-GTTAGTCCTCTTTGTAGCGA-3’

下游引物序列，5’-ATATCCTTGTTGTCTTTGTCCT-3’。

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