CN103290028B - 一个水稻温敏核不育基因tms9及其功能标记 - Google Patents
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Abstract
一个水稻温敏核不育基因tms9及其功能标记，属于生物技术领域。本发明公开了水稻温敏核不育基因tms9，并且开发了水稻温敏核不育基因tms9的功能标记。这些功能标记的开发将有助于将tms9导入不同的水稻遗传背景中进而利用分子标记辅助选择技术快速高效地筛选到新的水稻温敏两用核不育系。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一个水稻温敏核不育基因tms9及其功能标记。
背景技术
水稻作为世界上主要的粮食作物之一，其产量的高低直接影响全球粮食安全。杂交水稻的研制及成功应用显著地提高了水稻单产，为保证粮食安全做出巨大贡献。现有的杂交水稻技术体系包括三系杂交水稻和两系杂交水稻，相比三系杂交水稻，两系法杂交水稻具有一系两用，不需要保持系、配组自由不存在恢保关系的制约，不受细胞质负效应的影响、育种程序简单，经济高效等明显的优势。基于两系法杂交水稻的诸多优势，以致其在中国乃至全世界发展迅速。
相比两系法杂交水稻应用研究的长足发展，其理论研究则略显薄弱。然而随着现代分子生物学和分子遗传学的快速发展，对于鉴定、定位、克隆和分离水稻光温敏核不育基因的研究则越来越受到众多学者的青睐。截止目前许多水稻温敏核不育基因已被定位如：tms1, tms2, tms3, tms4, tms5, tms6(t), TGMS, and tms6; 还有一些水稻反温敏核不育基因也被定位到了如：rtms1。此外，一些水稻光敏雄性核不育基因和光温敏雄性核不育基因也被定位到了，比如：光敏雄性核不育基因pms1，pms2，pms3；光温敏雄性核不育基因ptgms2-1，pms1(t)；反光敏雄性核不育基因rpms1和 rpms2。虽然众多的水稻光温敏核不育基因被定位，有些甚至被图位克隆，然而到目前为止对于水稻光温敏核不育基因如何调控水稻光温敏核不育性状还知之甚少，因而对水稻光温敏雄性核不育机理的阐明还有待进一步深入研究。
现有的水稻光温敏核不育系的选育主要根据抽穗期育性鉴定，包括花粉镜检、套袋自交结实率、自然结实率；同时结合农艺性状，异交特性等决选优良的水稻光温敏核不育系。现有的水稻光温敏核不育系的选育方法费时费力。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一个水稻温敏核不育基因tms9及其功能标记的技术方案。
所述的一个水稻温敏核不育基因tms9，其特征在于该基因位于第2染色体短臂上，被功能标记Indel91和Indel101精细定位于30.2Kb的染色体片段内；
上述的功能标记Indel91的正向引物序列如SEQ ID No.1所示，功能标记Indel91的反向引物序列如SEQ ID No.2所示；
上述的功能标记Indel101的正向引物序列如SEQ ID No.3所示，功能标记Indel101的反向引物序列如SEQ ID No.4所示。
所述的一种用于标记水稻温敏核不育基因tms9的功能标记，其特征在于所述的功能标记Indel91的正向引物序列如SEQ ID No.1所示，功能标记Indel91的反向引物序列如SEQ ID No.2所示；所述的功能标记Indel101的正向引物序列如SEQ ID No.3所示，功能标记Indel101的反向引物序列如SEQ ID No.4所示。
所述的一种用于标记水稻温敏核不育基因tms9的功能标记在筛选水稻温敏两用核不育系中的应用。
本发明利用水稻温敏核不育基因tms9开发了新的水稻温敏核不育基因tms9的功能标记。这些功能标记的开发将有助于将tms9导入不同的水稻遗传背景中进而利用分子标记辅助选择技术快速高效地筛选到新的水稻温敏两用核不育系。
附图说明
图1水稻株1S温敏核不育基因tms9所表现出的花粉败育特征；
图2 水稻株1S温敏核不育基因tms9的精细定位及功能标记位点示意图。
图1中：A，株1S无花粉型败育；B，株1S在23℃条件下处理5天的花粉育性；C，株1S在低于23℃条件下处理3天的花粉育性；D，F2群体中不育株的花粉育性；E，F2群体中可育株的花粉育性；F，F2群体的父本的花粉育性。
图2中：A，tms9初步定位；B、C,tms9精细定位及功能标记位置；D，定位区域内的候选基因。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步说明本发明。
实施例1：一个新的水稻温敏核不育基因tms9的遗传规律分析
（1）水稻材料：株1S，D50，R173，IRH5802， 3个F2群体（株1S/D50， 株1S/R173， 株1S/IRH5802）。光学显微镜（莱卡），I2-KI 溶液。
（2）tms9遗传规律分析：在各F2群体中，随机选取300个左右的单株用于tms9遗传规律研究。各单株逐一编号，便于育性调查。于齐穗期，取各单株刚破口的稻穗，在穗子上中下各部取一朵颖花将其花药用镊子夹出置于滴有I2-IK溶液的载玻片上捣碎，在显微镜下观察，考察其花粉育性（图1）。将各群体中可育单株数与不育单株数进行卡平方检验，分析其育性分离规律，结果tms9在各F2群体中可育株数：不育株数均表现3：1的分离比，进而表明水稻株1S温敏核不育性状受1对隐性核基因控制。
实施例2：一个新的水稻温敏核不育基因tms9的精细定位（如图2）
（1）水稻材料：株1S，D50，R173，株1S/R173，株1S/D50 F2 群体。
（2）一个新的水稻温敏核不育基因tms9的初步定位。
采用分离群体分池法(BSA)和极端隐性类型法(RCA)连锁分析株1S温敏核不育基因tms9。利用568对SSR引物标记在株1S和R173之间筛选多态性，结果102对SSR标记在株1S和R173之间表现多态性，多态性比例较低，表明株1S和R173在基因组序列上差异较小。利用筛选出的在株1S和R173之间表现多态性的102对SSR标记分析株1S/R173 F2群体的可育基因池与不育基因池，结果表明：位于第2染色体上的6个SSR标记RM12387，RM12540，RM589，RM12745，RM12752，RM12769 与株1S温敏核不育性状存在连锁关系。进一步采用极端隐性个体分析法，将这6个SSR标记用于逐个分析株1S/R173 F2群体中的极端不育株的基因型，最终将目标基因初步定位于SSR标记RM589 和RM12745之间，各自相距2.06cM和4.10cM（图2 B）。由于株1S与R173之间的分子标记多态性较差，故在株1S温敏核不育基因tms9精细定位时采用株1S/D50 F2群体进行精细定位。
（3）一个新的水稻温敏核不育基因tms9的精细定位
在株1S温敏核不育基因tms9初步定位的基础上，利用株1S/D50 F2 群体近7000个单株对其进行精细定位。同时在SSR标记RM589与RM12745之间的染色体区段上设计开发了100多对In-Del标记，其中31对In-Del标记在株1S和D50之间表现多态性，利用这些多态性标记引物进一步分析株1S/D50 F2 群体中的极端不育株的基因型，结果株1S温敏核不育基因tms9被精细定位于In-Del标记Indel91和Indel101之间，两标记之间的物理距离约为30.2Kb（图2 C）。
Indel91: 正向引物序列（5’-3’）：TAAACAAGCAGGAGCTCTGTC（SEQ ID No.1）
反向引物序列（5’-3’）：CGACATAAAATGTTTGAGGAAAT（SEQ ID No.2）
Indel101:正向引物序列（5’-3’）：GATGATGATCCGGGTGAC（SEQ ID No.3）
反向引物序列（5’-3’）：ATATTTAACTCAAATCTCCAGCA（SEQ ID No.4）。
实施例3：利用tms9 功能标记在株1S/R8006 F2群体中筛选新的温敏不育单株
R8006 为一个株叶形态优良，高抗稻瘟病，米质优良的水稻常规品系。利用株1S/R8006 F2群体旨在筛选矮杆株叶形态优良，高抗稻瘟病，米质优良的水稻温敏核不育系。利用常规选育手段，一般在高温抽穗期逐株观察并结合花粉镜检筛选水稻温敏核不育单株，该方法费时费力。
利用tms9功能标记首先在两亲本株1S和R8006之间筛选多态性，结果tms9功能标记在两亲本株1S和R8006之间表现良好的多态性；进而利用tms9功能标记于株1S/R8006 F2群体分蘖期筛选染色体片段带型与株1S一致的单株即为目标温敏核不育单株。
具体方法：于株1S/R8006 F2群体分蘖期将各单株编号，取各单株叶片提取DNA，利用tms9功能标记采用PCR方法扩增两亲本（株1S和R8006）及各单株，各单株DNA带型与亲本株1S DNA带型一致的单株很可能为新的温敏核不育株，将田间此类单株做好标记，以待抽穗期检验。
结果：株1S/R8006 F2群体总共有1231个单株，其中检测到DNA带型与株1S带型一致的单株数有298株；在抽穗期观察上述298株DNA带型与株1S带型一致单株的育性；结果，其中281株在高温条件下表现典败不育与同时期的株1S败育类型相似，另外17株花粉镜检出现部分染败花粉，这可能是遗传背景差异导致其不育起点温度较高所致。此外，在该群体其他单株中发现15株温敏不育单株；由此利用tms9功能标记检测到的温敏核不育单株数为281株，实际存在的温敏核不育单株数为296株，错误检测到的温敏不育单株数为17株，检测成功率为94.9%，检测错误率为5.7%。
因而，利用tms9功能标记可以在水稻生长发育早期在很大程度上快速高效地筛选到符合目标性状新的水稻温敏核不育株。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国水稻研究所
<120> 一个水稻温敏核不育基因tms9及其功能标记
<130> 1
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
taaacaagca ggagctctgt c 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
cgacataaaa tgtttgagga aat 23
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
gatgatgatc cgggtgac 18
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
atatttaact caaatctcca gca 23
Claims (2)
1.一种用于标记水稻温敏核不育基因tms9的功能标记Indel91和Indel101，其特征在于基因tms9被功能标记Indel91和Indel101精细定位于30.2Kb的染色体片段内；功能标记Indel91的正向引物序列如SEQ ID No.1所示，功能标记Indel91的反向引物序列如SEQ ID No.2所示；功能标记Indel101的正向引物序列如SEQ ID No.3所示，功能标记Indel101的反向引物序列如SEQ ID No.4所示。
2.如权利要求1所述的一种用于标记水稻温敏核不育基因tms9的功能标记Indel91和Indel101在筛选水稻温敏两用核不育系中的应用。
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