CN103030685A - 一个水稻基因在培育温敏不育系中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一个水稻基因在培育温敏不育系中的应用。本发明人通过构建LOC_Os02g12290基因的RNA或基因沉默表达载体，转化水稻，获得LOC_Os02g12290基因表达水平下降的突变体，所述突变体表现温敏不育。这一方法对于加快我国杂交水稻的新品种的选育、提高水稻产量、解决我国粮食问题具有重要的意义。

Description

一个水稻基因在培育温敏不育系中的应用

技术领域

本发明涉及一个水稻基因的应用，具体涉及一个水稻基因在培育温敏不育系中的应用。

背景技术

随着世界人口的不断增长以及工业的发展，人们对粮食的需求量日益增加，水稻作为主要的粮食作物之一，普遍受到人们的欢迎。据报道，世界上近一半人口，包括几乎整个东亚和东南亚的人口，都以稻米为食。同样，水稻作为我国主要粮食作物之一，是我国人民最受欢迎的日常食物。随着人口的增长和耕地面积的减少，提高水稻产量成为解决我国粮食问题的重要途径。

现代生物技术是培育高产水稻的重要手段之一，中国的杂交水稻为粮食增产作出了重要贡献。目前，中国杂交水稻年种植面积占水稻种植总面积的５１％，产量约占水稻总产的６０％，中国亚种间杂交稻一般比品种间杂交稻具有２０％以上的增产潜力。利用水稻亚种间杂交优势是现阶段战略重点，二系法杂交水稻是突破亚种间水稻杂交困难的重要方法。

水稻光、温敏两系不育资源的发现和在杂交水稻上的广泛应用，为利用两系法选育超级杂交水稻打开了新的局面。由于光温敏两系不育系受隐性核基因控制，与三系不育系相比，两系不育系具有自我繁殖，配组范围广，基因资源丰富等特点。因此，利用两系不育系选育超级杂交稻成为我国杂交水稻育种的主攻方向和发展趋势。

根据光周期和温度对育性的影响，两系不育系分为光敏型、温敏型和光温敏互作型等三个主要类型。农垦58S及其衍生的粳稻不育系属于典型的光敏型核不育系，在长日照条件下表现为不育，短日照条件下又可以恢复育性。而安农S-1、Y58S、株1S等则属于典型的温敏性不育系，即在高温不育，低温可育。另外，还有一些不育系既受光照影响同时也受到温度的调控，这类不育系称为光温互作型，如培矮64S等。

    株1S和陆18S是在生产实践中广泛应用的两系不育系，属于典型的温敏型不育系。株1S和陆18S是从遗传距离较远的不同生态型水稻杂交组合F2群体中发现的不育株，经“自然环境和人工环境双重压力选择法”选育的新低不育起点温度核不育系。由于淘汰了低世代变异群体中不育起点温度高和短期低温引起的育性波动不育类型，株1S和陆18S不育起点温度低，不育性稳定。其中，株1S的育性转育温度在22.6℃左右，陆18S在23℃左右；并且对连续6天日平均23℃的低温不敏感，是国内不育起点温度低，不育性稳定的优良两系不育系。在实际生产中，株1S和陆18S生殖生长期耐低温能力强，大面积制种安全可靠，繁殖产量高，解决了低不育起点温敏不育系的繁殖难题。株1S和陆18S综合农艺性状好，抗性强，米质较优，分别于1999、2000年通过湖南省品种鉴定。目前，株1S已成为培育两系不育系的重要不育基因资源，利用株1S已转育成湘陵628S、潭农S等6个新不育系。株1S和陆18S配合力强，亲和谱广，已育成48个组合通过审定，其中国审早稻组合10个，省审早稻组合34个，分别占同期长江流域国审和省审两系早稻组合的62.5%和44.2%。株1S和陆18S所配组合亚种间优势明显，其中株两优819比对照增产10%，被农业部认定为首个早熟超级杂交早稻，并作为南方稻区区试对照和农业主导品种。陆两优819比对照增产8.08%，也被农业部认定为超级杂交早稻。截止到2010年，株1S及陆18S所配品种在我国的累计种植面积超过9100万亩，利用两系培育超级水稻的重要不育资源。但是目前的优良的不育性比较少，为了加快水稻育种的步伐，特别是为了加快两系水稻育种，迫切需要新的温敏不育性，但是，常规的温敏不育系一般由天然突变造成，育种家从天然突变体中筛选得到，这种获得温敏不育系的方法需要很大的运气，而且温敏不育系的种类比较少，远远不能满足现代水稻育种的需要。

本发明提供提供了一种利用基因工程获得温敏不育系的方法，对于加快我国杂交水稻的新品种的选育、提高水稻产量、解决我国粮食问题具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一个水稻基因在培育温敏不育系中的应用。

本发明所提供的基因，来源于水稻 (Oryza sativa L．），名称为LOC_Os02g12290，是如下（a）的蛋白质：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

其中，序列表中的序列1由303个氨基酸残基组成。

所述LOC_Os02g12290的编码基因，具体可为如下1）或2）的基因：

1）其核苷酸序列是序列表中的序列2； 

2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码LOC_Os02g12290蛋白的DNA分子。

所述严格条件可为在0.1×SSPE (或 0.1×SSC)，0.1% SDS的溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。

序列表中的序列2由909个脱氧核糖核苷酸组成，是LOC_Os02g12290的CDS基因序列。

一种转化载体，所述载体是包括编码上述水稻LOC_Os02g12290蛋白的基因全部或部分序列的重组基因沉默或RNAi表达载体，优选为如图1所示的pCAMBIA2300-Actin1-ocs-XF003。

一种细菌菌株，所述菌株含有编码上述水稻LOC_Os02g12290蛋白基因序列的重组表达载体。

一种水稻的转化细胞、组织或器官，在所述水稻的转化细胞、组织或器官中，LOC_Os02g12290基因的表达水平下降。

下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。

 

附图说明

图1为 LOC_Os02g12290恢复株1S的育性。

图2为pCAMBIA2300-Actin1-ocs-XF003图谱。

图3为. RNAi敲除LOC_Os02g12290使日本晴不育。

 

具体实施方式

实施例1、株1S温敏不育基因的图位克隆

首先，我们将株1S与93-11进行杂交，获得F₁种子。F₁种植以后自交，得到F₂群体。在～7500株F₂群体中，我们一共鉴定出1872株不育单株。通过SSR引物进行连锁分析，我们将控制株1S育性的基因初步定位在标记RM7575与RM5897之间。进一步加密标记，最终将控制株1S育性的基因定位在标记RMZ-17与RMZ-11之间。对这两个标记之间的基因组片段进行测序，结果发现LOC_Os02g12290的编码区出现了一个单碱基突变，该突变造成了一个终止密码子，使翻译提前终止。这证明LOC_Os02g12290为造成株1S温敏不育系的主要候选基因。

 

实施例2、LOC_Os02g12290基因组片段恢复株1S的育性

我们利用酶切的方法从BAC上克隆了包含LOC_Os02g12290的基因组DNA片段，并将其构建进pCAMBIA2300的双元表达载体。通过农杆菌介导的方法，我们将LOC_Os02g12290的基因组片段导入株1S的基因组中。在高温条件下，株1S完全不育，没有花粉产生；而转基因互补植株能够恢复株1S的育性，并且能够很好地结实。这证明LOC_Os02g12290是控制株1S温敏不育的育性基因。如图1所示。

 

实施例3、植物表达载体的构建

从水稻花序中提取总RNA，反转录作为模板，以ATCggatccTCGAGATTGGTCAGGAGCAC和TGCgtcgacTCTCAAACAGATGGGTGTGC为引物进行PCR反应，PCR产物回收以后，经BamH I和Sal I酶切。

体系如下：

10×NEB buffer 4：   4.0 uL 

BamH I            0.5 uL 

Sal I               0.5 uL 

PCR产物          10.0 uL 

用H₂O 补充到     40.0 uL

37℃反应1h。

同时用相同的酶来酶切载体pUCCRNAi。酶切完成后，对酶切产物进行回收，进行连接。

室温放置1h，然后用热激法转化大肠杆菌DH5a，涂氨苄青霉素抗性培养基，在37℃培养，直到有菌斑长出。用PCR的方法鉴定阳性菌斑，PCR引物如前所示，可以扩增出360bp的特异性条带。然后再用Bgl II和Xho I分别对前一步回收的360bp PCR产物和新鉴定出阳性克隆进行酶切。酶切完成后，对酶切产物进行回收，进行连接。室温放置1h，然后用热激法转化大肠杆菌DH5a，涂氨苄青霉素抗性培养基，在37℃培养，直到有菌斑长出。在对新长出的菌斑重新摇菌，提取质粒（按分子克隆进行标准操作），然后用Pst I对质粒进行酶切验证。

对酶切产物进行电泳，并回收正确大小的酶切片段，同时用Pst I酶切带Actin1启动子的pCAMBIA2300。电泳并回收正确的DNA片段，再用T4 DNA连接酶进行连接。室温放置1h，然后用热激法转化大肠杆菌DH5a，涂卡那霉素抗性培养基，在37℃培养，直到有菌斑长出。对新长出的菌斑重新摇菌，提取质粒（按分子克隆进行标准操作），然后对质粒进行Pst I酶切验证。对酶切产物进行电泳，鉴定正确的阳性克隆，得到植物表达载体，如图2所示。

实施例4、新温敏不育系的获得

将实施例3构建好的RNAi表达载体，利用电击法转化农杆菌菌株AGL1，并涂布在卡那霉素和利福平抗性的培养基上，进行培养，获得农杆菌菌株。经转基因获得RNAi植株，从表型看和野生型的日本晴没有什么区别，尤其是在营养生长期。到生殖生长期，野生型日本晴能够正常开花，花粉经1% I₂/KI染色正常，表明花粉的育性正常。而RNAi转基因植株的花粉经1% I₂/KI染色，绝大部分花粉不能被染色，花粉呈典败状态，仅有少数花粉能够被染色。到野生型日本晴灌浆成熟的时候，RNAi转基因植株仍然不能结实，表明RNAi转基因植株不育。如图3所示。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  湖南亚华种业科学研究院

       中国科学院遗传与发育生物学研究所

 

<120>  一个水稻基因在培育温敏不育系中的应用

 

<130>  1

 

<160>  3    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  302

<212>  PRT

<213>  Oryza sativa

 

 

<220>

<221>  PEPTIDE

<222>  (1)..(302)

 

<400>  1

 

Met Ala Asn Ser Gly Lys Ser Ser Pro Ala Ala Thr Ser Thr Thr Ala

1               5                   10                  15     

 

 

Pro Pro Pro Gly Arg Pro Lys Ala Lys Ala Pro Pro Leu Thr Val Glu

            20                  25                  30         

 

 

Gly Tyr Pro Val Glu Gly Ile Ser Ile Gly Gly Gln Glu Thr Cys Val

        35                  40                  45             

 

 

Ile Phe Pro Thr Leu Ser Ala Ala Phe Asp Ile Gly Arg Cys Pro Gln

    50                  55                  60                 

 

 

Arg Ala Val Ser Gln Glu Phe Leu Phe Ile Ser His Ala His Leu Asp

65                  70                  75                  80 

 

 

His Ile Gly Gly Leu Pro Met Tyr Val Ala Thr Arg Gly Leu Tyr Arg

                85                  90                  95     

 

 

Gln Arg Pro Pro Thr Ile Phe Ile Pro Ala Cys Leu Arg Asp Pro Val

            100                 105                 110        

 

 

Glu Arg Leu Phe Glu Leu His Arg Ser Met Asp Gln Ser Glu Leu Ser

        115                 120                 125            

 

 

His Asn Leu Val Pro Leu Glu Ile Gly Gln Glu His Glu Leu Arg Arg

    130                 135                 140                

 

 

Asp Leu Lys Val Lys Ala Phe Lys Thr Tyr His Ala Ile Pro Ser Gln

145                 150                 155                 160

 

 

Gly Tyr Val Ile Tyr Thr Val Lys Gln Lys Leu Lys Pro Glu Tyr Leu

                165                 170                 175    

 

 

Gly Leu Pro Gly Ser Glu Ile Lys Gln Leu Lys Leu Ser Gly Val Glu

            180                 185                 190        

 

 

Ile Thr Asn Thr Leu Thr Val Pro Glu Ile Ala Phe Thr Gly Asp Thr

        195                 200                 205            

 

 

Met Ala Asp Phe Ile Leu Asp Pro Asp Asn Ala Asp Val Leu Lys Ala

    210                 215                 220                

 

 

Lys Ile Leu Val Val Glu Ser Thr Phe Val Asp Asp Ser Val Thr Ile

225                 230                 235                 240

 

 

Glu His Ala Arg Glu Tyr Gly His Thr His Leu Phe Glu Ile Leu Asn

                245                 250                 255    

 

 

Gln Cys Asp Lys Leu Glu Asn Lys Ala Ile Leu Leu Ile His Phe Ser

            260                 265                 270        

 

 

Ala Arg Tyr Thr Ala Glu Glu Ile Asp Ile Ala Ile Asn Lys Leu Pro

        275                 280                 285            

 

 

Pro Ser Phe Arg Ser Arg Val His Ala Leu Lys Glu Gly Phe

    290                 295                 300        

 

 

<210>  2

<211>  909

<212>  DNA

<213>  Oryza sativa

 

 

<220>

<221>  CDS

<222>  (1)..(909)

 

<400>  2

atg gcg aac agc ggc aag tca tcg ccg gcg gcg acc tcc acc acc gcg         48

Met Ala Asn Ser Gly Lys Ser Ser Pro Ala Ala Thr Ser Thr Thr Ala          

1               5                   10                  15                

 

ccg cca ccg ggt cgg ccg aag gcg aag gcg ccg ccc ctc acc gtc gag         96

Pro Pro Pro Gly Arg Pro Lys Ala Lys Ala Pro Pro Leu Thr Val Glu          

            20                  25                  30                   

 

ggc tac ccc gtg gag ggc atc tcc atc ggc ggg cag gag acc tgc gtc        144

Gly Tyr Pro Val Glu Gly Ile Ser Ile Gly Gly Gln Glu Thr Cys Val          

        35                  40                  45                       

 

atc ttc ccg acg ctg agc gcc gcc ttc gac atc ggc cgg tgc ccg cag        192

Ile Phe Pro Thr Leu Ser Ala Ala Phe Asp Ile Gly Arg Cys Pro Gln          

    50                  55                  60                           

 

cgc gcc gtc tcg cag gag ttc ctc ttc atc tcc cac gcc cac ctc gac        240

Arg Ala Val Ser Gln Glu Phe Leu Phe Ile Ser His Ala His Leu Asp          

65                  70                  75                  80           

 

cac atc ggc ggc ctc ccc atg tac gtc gcc acc cgg ggc ctc tac cgg        288

His Ile Gly Gly Leu Pro Met Tyr Val Ala Thr Arg Gly Leu Tyr Arg          

                85                  90                  95               

 

cag cgc ccg ccc acc atc ttc atc ccc gcc tgc ctc agg gac ccc gtg        336

Gln Arg Pro Pro Thr Ile Phe Ile Pro Ala Cys Leu Arg Asp Pro Val          

            100                 105                 110                  

 

gag cgc ctc ttc gag ctc cac cgc tcc atg gac cag tcc gag ctc agc        384

Glu Arg Leu Phe Glu Leu His Arg Ser Met Asp Gln Ser Glu Leu Ser          

        115                 120                 125                      

 

cac aac ctc gtc ccc ctc gag att ggt cag gag cac gag ctc agg agg        432

His Asn Leu Val Pro Leu Glu Ile Gly Gln Glu His Glu Leu Arg Arg          

    130                 135                 140                          

 

gac ctc aag gtg aag gcc ttc aag acc tac cac gcc att ccc agc cag        480

Asp Leu Lys Val Lys Ala Phe Lys Thr Tyr His Ala Ile Pro Ser Gln          

145                 150                 155                 160          

 

ggg tat gtg ata tac acg gtg aag caa aag ctc aag cca gag tat ctt        528

Gly Tyr Val Ile Tyr Thr Val Lys Gln Lys Leu Lys Pro Glu Tyr Leu          

                165                 170                 175              

 

ggc ctc cct ggg agc gag atc aag cag ctg aag ctg tca ggt gtg gag        576

Gly Leu Pro Gly Ser Glu Ile Lys Gln Leu Lys Leu Ser Gly Val Glu          

            180                 185                 190                  

 

att acg aat aca ttg acg gtg cct gag att gct ttt acc gga gat acg        624

Ile Thr Asn Thr Leu Thr Val Pro Glu Ile Ala Phe Thr Gly Asp Thr          

        195                 200                 205                      

 

atg gca gat ttc att ctt gat cct gat aat gcg gat gtt ttg aag gcg        672

Met Ala Asp Phe Ile Leu Asp Pro Asp Asn Ala Asp Val Leu Lys Ala          

    210                 215                 220                          

 

aaa att ctt gta gtg gag agt act ttt gtt gat gac tct gtt aca att        720

Lys Ile Leu Val Val Glu Ser Thr Phe Val Asp Asp Ser Val Thr Ile          

225                 230                 235                 240          

 

gag cat gca aga gaa tat ggg cac acc cat ctg ttt gag ata ctg aat        768

Glu His Ala Arg Glu Tyr Gly His Thr His Leu Phe Glu Ile Leu Asn           

                245                 250                 255              

 

cag tgt gac aaa ctt gaa aac aaa gct att ctg cta atc cac ttt tct        816

Gln Cys Asp Lys Leu Glu Asn Lys Ala Ile Leu Leu Ile His Phe Ser          

            260                 265                 270                  

 

gct cgt tat acc gca gag gaa att gat ata gca atc aat aag ttg cca        864

Ala Arg Tyr Thr Ala Glu Glu Ile Asp Ile Ala Ile Asn Lys Leu Pro          

        275                 280                 285                       

 

ccc tct ttc aga agt aga gtt cat gca ttg aag gaa ggt ttc tga            909

Pro Ser Phe Arg Ser Arg Val His Ala Leu Lys Glu Gly Phe                  

    290                 295                 300                          

 

 

 

Claims (6)

1.一个水稻基因在培育温敏不育系中的应用，其特征在于所述水稻基因其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述，一个水稻基因在培育温敏不育系中的应用，其特征在于所述水稻基因的DNA序列在严谨条件下与所述序列SEQ ID NO:2杂交且编码所述序列1的DNA分子。

3.根据权利要求1或2所述的一种转化载体，其特征在于所述载体是包括编码序列1蛋白的基因全部或部分序列的重组基因沉默或RNAi表达载体。

4.根据权利要求4所述的转化载体，其特征在于所述载体优选为pCAMBIA2300-Actin1-ocs-XF003。

5.根据权利要求1或2所述的一种细菌菌株，其特征在于所述菌株是包括编码序列1蛋白的基因全部或部分序列的重组基因沉默或RNAi表达载体的细菌菌株。

6.根据权利要求1或2所述的一种水稻的转化细胞、组织或器官，其特征在于所述水稻的转化细胞、组织或器官中，编码序列1的基因的表达水平低于野生型水稻中该基因的表达水平。

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