CN108948169A

CN108948169A - 一种促进棉花纤维绿色色素合成的蛋白质、基因及其编码序列和应用

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Publication number: CN108948169A
Application number: CN201810928996.0A
Authority: CN
Inventors: 肖月华; 张正圣; 张悦; 严倩; 刘德新; 罗明; 滕中华
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2018-08-15
Filing date: 2018-08-15
Publication date: 2018-12-07
Anticipated expiration: 2038-08-15
Also published as: CN108948169B

Abstract

本发明提供了一种促进棉花纤维绿色色素合成的蛋白质、基因及其编码序列和应用，属于基因工程和遗传工程技术领域。本发明提供了一种促进棉花纤维绿色色素合成的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明利用上述编码基因或编码序列转染棉花，可显著提高被转染棉花的纤维绿色色素合成水平，同时能避免常规杂交手段导致的非靶标性状导入。

Description

一种促进棉花纤维绿色色素合成的蛋白质、基因及其编码序列和应用

技术领域

本发明属于基因工程和遗传工程技术领域，具体涉及一种促进棉花纤维绿色色素合成的蛋白质、基因及其编码序列和应用。

背景技术

天然彩棉与普通棉花相比具有色泽自然柔和、古朴典雅、质地柔软等特点。用彩色棉花制成的纺织品不需化学染料染色，在加工生产过程不会产生对土地、水源的污染。在纺织品中不含甲醛、偶氮染料等有害物质，并具有防静电、止骚痒的功能，是名副其实的“绿色产品”，被誉为“生态服装”、“植物羊绒”，是适应世界各国人民保护生存环境、实现可持续发展要求的新型纺织原料，顺应了人们追求纯天然时尚、环保与健康的时代潮流。

天然彩棉品种较少，传统育种一般通过杂交的方法将绿色纤维基因转育到新材料中，使转育后的棉花长出绿色的棉纤维。然而，传统杂交方法在转育绿色纤维基因的同时，不可避免地会将部分非靶标性状导入到新材料中，进而影响新材料的其他优良性状。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种促进棉花纤维绿色色素合成的蛋白质及其编码基因和应用，利用转基因手段，通过在棉花纤维中表达Gh3622基因，特定地改变棉花纤维中的绿色色素合成和积累，在不带入非靶标性状的情况下获得绿色纤维，同时也为改变纤维中绿色色素积累水平奠定基础。

本发明提供了一种促进棉花纤维绿色色素合成的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明提供了一种编码上述蛋白质的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明提供了上述蛋白质的编码序列，所述编码序列的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示。

本发明提供了一种用于扩增上述基因或编码序列的引物对，所述引物对的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述引物对的反向引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.5所示。

本发明提供了一种含有上述基因或编码序列的重组载体，所述重组载体还包括棉花纤维次生壁合成期特异表达启动子。

本发明提供了一种重组菌，所述重组菌包括宿主细菌和上述重组载体。

本发明还提供了上述蛋白质、基因、编码序列、重组载体和重组菌在促进棉花纤维绿色色素合成中的应用。

优选的，所述促进棉花纤维绿色色素合成的方法，包括如下步骤：

(1)将编码序列、棉花纤维次生壁合成期特异表达启动子pFb12A和植物表达载体重组，得到重组载体；

(2)将所述重组载体导入宿主细菌中，得到重组菌；

(3)利用所述重组菌对棉花进行遗传转化。

优选的，所述步骤(1)中棉花纤维次生壁合成期特异表达启动子由扩增得到，扩增所述棉花纤维次生壁合成期特异表达启动子用引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.6和SEQID No.7所示。

优选的，所述步骤(2)宿主细菌包括根瘤农杆菌。

有益效果：本发明提供了一种促进棉花纤维绿色色素合成的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明提供了编码上述蛋白质的基因和编码序列。利用上述基因或编码序列转染棉花材料，可显著提高被转染棉花的纤维绿色色素合成水平，同时能避免常规杂交手段导致的非靶标性状导入。

附图说明

图1为本发明实施例1所述绿色纤维基因的精细定位图。其中，图1-A为绿色色素水平(Lg)区段的遗传连锁图，标记间的交换株用x+数字显示；图1-B是对用Lg区段的雷蒙德氏棉基因组区段及注释基因；图1-C表示开花后20天的绿色和白色RIL纤维中Gh3622表达水平；图1-D表示开花后20天的绿色和白色RIL纤维中绿色色素水平；

图2为本发明实施例3所述Gh3622基因的编码序列构建入植物表达载体pLGN的流程图；

图3为本发明实施例5所述棉花Gh3622基因转录水平的检测结果及棉花纤维色泽及绿色色素水平结果；其中，图3-A为转基因绿色棉(FLgT1、16和19)、分离的非转基因系(Null)以及野生绿色棉(WT)的成熟籽棉照片；图3-B为开花后20天后转基因纤维中的Gh3622基因表达水平；图3-C表示转基因绿色棉(FLgT1)及分离的非转基因系(Null)在不同时期的纤维中Gh3622基因的表达水平；图3-D表示转基因绿色棉(FLgT1)及分离的非转基因系(Null)在不同时期的纤维中的绿色色素水平变化。

具体实施方式

在本发明中，所述基因是由绿色纤维材料(RIL051)和白色纤维材料渝棉1号杂交构建的F2代分离群体经SSR标记精细定位获得。所述RIL051来源于绿色纤维材料T586和白色纤维材料渝棉1号的重组近交系(RIL)。所述SSR标记包括C2-0120、PGML4063、HAU3033、CGR5015、NBRI0087、SWU07324、SWU01713、SWU01715、SWU16607和SWU01720。本发明提取F2代分离群体的叶片DNA后，鉴定各个单株各分子标记的基因型，最后用joinmap软件构建绿色纤维(Lg)区段的遗传连锁图。在本发明中，各分子标记检测用引物如SEQ ID No.8～27所示。

本发明提供了一种上述蛋白质的编码序列，所述编码序列的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示。所述编码序列为上述基因在合成SEQ ID No.1所示氨基酸序列的蛋白质时转录的mRNA的互补单链。

本发明中，所述编码序列的制备方法优选包括以下步骤：以开花后20天的绿色纤维总RNA为模板，利用3’-RACE试剂盒(TaKaRa，大连，中国)，扩增得到编码序列。在本发明中，所述3’-RACE扩增用特异性引物的序列如SEQ ID No.32所示。

本发明还提供了上述编码基因或编码序列的PCR用扩增引物对，所述PCR用扩增引物对的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。利用上述PCR用扩增引物对，可扩增上述编码基因或编码序列，进一步对3’-RACE法扩增得到的编码序列进行验证。

本发明提供了一种含有上述基因或编码序列的重组载体。所述重组载体优选包括上述编码序列和棉花纤维次生壁合成期特异表达启动子。所述棉花纤维次生壁合成期特异表达启动子优选利用SEQ ID No.6所示的正向引物和SEQ ID No.7所示的反向引物联合扩增棉花基因组获得。

本发明还提供了一种重组菌，所述重组菌包括上述重组载体和宿主细菌。在本发明中，所述宿主细菌优选为根瘤农杆菌。利用本发明提供的重组菌转染棉花新材料，能显著提高棉花新材料纤维绿色色素的合成，同时能避免常规杂交手段导致的非靶标性状导入。

本发明提供了上述蛋白质、编码基因、编码序列、引物对、重组载体和/或重组菌在促进棉花纤维绿色色素合成中的应用。

在本发明中，所述促进棉花纤维绿色色素合成的应用方法优选包括如下步骤：

(2)将所述重组载体导入宿主细菌中，得到重组菌；

(3)利用所述重组菌对棉花进行遗传转化。

本发明对所述编码序列、棉花纤维次生壁合成期特异表达启动子pFb12A的扩增方法和连接方法不作特别限定，本领域常规方法即可。在本发明的实施例中，优选在启动子两端加上HindⅢ和BamHⅠ位点，利用HindⅢ和BamHⅠ酶切位点连接启动子和载体；再用BamHⅠ和KpnⅠ将编码基因的编码序列插入到载体的相应位点上。具体扩增程序见如下常规实验操作3。

本发明对步骤(2)所述导入的方法和步骤(3)所述遗传转化的方法不作特别限定，本领域常规导入方法和遗传转化方法即可。在本发明的实施例中，所述导入优选采用电击转化法进行；所述遗传转化优选在无菌环境下进行。

下面结合实施例对本发明提供的一种促进棉花纤维绿色色素合成的蛋白质及其编码基因和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

在本发明的实施例中，所用到的常规实验操作如下：

1.DNA的提取

基因组DNA采用植物基因组DNA快速提取试剂盒(Aidlab)提取，详细步骤见说明书。

2.RNA的提取

RNA采用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒(Aidlab)提取，详细步骤见说明书。

3.DNA片段的PCR扩增

扩增体系为：10×Ex PCR buffer(Mg²⁺free)2.5μL，2.5mmol/L dNTPs 2μL，25mml/L MgCl₂ 2μL，引物1(5μmol/L)1μL，引物2(5μmol/L)1μL，Ex Taq DNA聚合酶1U，基因组DNA约60ng，加入ddH2O至25μL。

扩增程序为：94℃，5min；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，1.5min，35个循环；72℃延伸10min。

4.DNA片段的回收、连接和克隆

使用BioFlux胶回收试剂盒回收DNA片段。使用T4DNA ligase进行DNA片段连接。回收的片段与pUCm-T(上海生工)载体建立如下连接体系：10×T4DNA连接缓冲液1μL，载体DNA片段1μL，外源连接产物DNA片段1μL，T4DNA连接酶1μL，用双蒸水补足体积至10μL。载体DNA片段与外源连接产物DNA片段摩尔比为1︰3，16℃连接12h。之后将连接产物转化大肠杆菌DH5a。获得的抗性克隆经液体培养过夜，用BioFlux质粒提取试剂盒提取质粒，酶切验证后，在Invitrogen公司测序。

5.GUS组织化学染色

由于实验室采用的表达载体具有GUS报告基因，一般用GUS组织化学染色检测跟踪转基因。具体方法：取少量转基因棉花叶片(有伤口)置于96孔板中，加入GUS染液[0.1mol/LK₃Fe(CN)₆，0.1mol/L K₄Fe(CN)₆，0.01mol/L Na₂EDTA，500mg/L X-Gluc，1％Triton X-100(v/v)，0.14mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.0)]，在37℃恒温条件下放置2h左右，充分染液后再用75％乙醇脱色。植株叶片可被GUS染液染成特异蓝色的植株为转基因阳性。

实施例1

绿色纤维基因的精细定位

前期，用来源于绿色纤维材料T586和白色纤维材料渝棉1号的重组近交系(RIL)群体将绿色纤维(Lg)基因定为到第21染色体(D11)上与标记C2-0120、PGML4063、HAU3033、CGR5015和NBRI0087紧密连锁。然后，用绿色纤维材料(RIL051)和白色纤维品种渝棉1号构建了1个含750个单株的F2代分离群体；利用棉花D基因组祖先种雷蒙德氏棉的基因组序列设计引物，在该区段找到另外5个SSR标记(SWU07324、SWU01713、SWU01715、SWU16607和SWU01720)。用于绿色纤维(Lg)基因精细定位的分子标记及其扩增引物间表1。

表1用于绿色纤维(Lg)基因精细定位的分子标记

棉花成熟后再田间检测各单株的纤维颜色，取叶片提取DNA并鉴定各个单株各分子标记的基因型，最后用Joinmap软件构建绿色纤维(Lg)区段的遗传连锁图。遗传连锁图如图1-A所示：Lg定位到标记SWU1713和SWU1715之间56.8kb的区段内。雷蒙德氏棉基因组中该区段只包含一个蛋白编码基因Gorai.007G362200(图1-B)，因此，将陆地棉中的对应基因命名为Gh3622(SEQ ID No.2)，并把它作为棉花绿色纤维(Lg)的候选基因。进一步分析RIL群体中绿色和白色纤维的Gh3622表达和绿色色素水平，结果如图1-C和图1-D所示：纤维中Gh3622表达和绿色色素水平高度一致，均在开花后20天的绿色纤维中有很高的转录水平，而在白色纤维中转录水平极低或检测不到，表明Gh3622在纤维中促进绿色色素合成，进而促进纤维绿色呈色。

实施例2

Gh3622编码序列的克隆

提取开花后20天绿色纤维的总RNA，用3’-RACE方法扩增Gh3622的cDNA序列。3’-RACE的基因特异引物为ctcttctcccataatccaattc-3’，其余操作按试剂盒说明书(TaKaRa)进行。扩增产物用常规方法进行回收、克隆、测序。

分别以陆地棉T586基因组DNA和开花后20天绿色纤维cDNA为模板，用引物5’-ggatcc gggatgaagggcaacgat-3’和5’-ggtacc ctaggagataggccatgac-3’扩增Gh3622基因的基因组和cDNA编码序列，扩增产物用常规方法进行回收、克隆、测序，进一步验证RACE结果。最终获得Gh3622基因的编码序列如SEQ IDNo.3所示。

实施例3

纤维次生壁合成期特异的Gh3622表达载体的构建

Gh3622基因的编码序列构建入植物表达载体pLGN的流程见图2。pLGN是由传统的植物表达载体pBI121改造而来的一个双元植物表达载体。其T-DNA区段(RB和LB之间区域，图2)替换为了组成型的CaMV35S启动子(CaMV35S-P)控制报告基因GUS和标记基因NptII的融合基因表达盒，以及另一个由CaMV35S-P控制的表达盒。

按前述常规操作方法用引物(pFbl2F，5’-aagcttgcagacttaggattggatg-3’和pFbl2R，5’-ggatcc ggttaaccgaaatacaaagca-3’)从棉花基因组中扩增克隆启动子pFbl2，并在启动子两端加上HindⅢ和BamHⅠ位点。用HindⅢ和BamHⅠ将pFbl2A启动子从克隆载体上切下(HindⅢ为部分酶切)，连接到用HindⅢ和BamHⅠ酶切的pLGN载体上构建pLGN-pFbl2A载体。进一步用BamHⅠ和KpnⅠ将Gh3622基因的编码序列从克隆载体上切下，插入到pLGN-pFbl2A载体的相应位点上，即获得最终的表达载体pLGN-pFbl2A-Gh3622。所有限制性内切酶购自Roche公司，按照使用说明书操作。DNA片段的回收、连接和大肠杆菌转化按前述常规操作方法进行。参考Bio-RAD MicroPulser用户说明书，将上述载体通过电激转化法导入农杆菌LBA4404。

实施例4

棉花的遗传转化

通过根癌农杆菌介导的方法进行上述表达载体的棉花遗传转化，所用培养基配方见表2。

表2根癌农杆菌介导的棉花遗传转化用培养基

MS:Murashige&Skoog,1962；B5:Gamborg,1986；Gelrite:Sigma,货号:G1910；SH:Schenk&Hildebrandt,1972。

具体步骤为：对野生型陆地棉冀棉14号饱满棉花种子进行脱壳，将少量(约20～40颗)去壳后的种子置于灭菌后的100mL三角瓶中，先用75％酒精预洗种子1min，轻轻倒出酒精再加入0.1％HgCl₂灭菌约12min(不断摇动三角瓶进行灭菌)，轻轻倒出升汞，加入无菌水充分漂洗，约漂洗10次，最后一次三角瓶中留有适量无菌水。置于摇床(30℃、100rpm)上，每隔8小时换一次无菌水，待胚根长出1cm左右(约36～48h)，将胚根轻轻插进萌发培养基中，30℃暗培养至下胚轴伸长到3cm左右(约48h)。侵染约20h前，将携带遗传转化载体的农杆菌单菌落接种于含有50mg/L Km和125mg/L Sm的液体YEB培养基中，置于28℃摇床(200rpm)，培养约20h后测量菌液的OD值(OD₆₀₀)，OD₆₀₀在0.8～1.0适宜转化。收集活化后的农杆菌液，8000rpm离1min，弃上清后用含有共培养液体培养基(含100μmo1/L AS，乙酰丁香酮)的按1:1体积比重悬菌体后收集重悬液于100mL三角瓶，置于摇床(30℃、100rpm)培养约20min。将下胚轴切成长约1cm的小段，置于重悬液中并在摇床(30℃、100rpm)上侵染50min，弃液体再取出下胚段轻轻放入固体共培养基表面，暗培养48h左右。暗培养后将下胚段转入固体筛选培养基中培养(30℃、16h光照/8h黑暗，下同)15天后再转入固体下胚段生长培养基，每隔15d左右继代一次至愈伤组织明显形成，将愈伤组织转到固体愈伤培养基上培养。将状态良好的胚性愈伤转入液体悬浮培养基中并置于摇床(30℃、100rpm)上悬浮培养10d左右，通过筛网过滤将细小体胚铺于体胚伸长培养基中至绿色体胚长出，将绿色体胚挑至体胚伸长培养基中继续培养至长约1cm左右，插入生根培养基中直至幼苗长出。以上操作必须在严格的无菌条件下完成。

生长健壮的再生棉花幼苗移栽至种植钵，在温室中常规管理至棉花纤维和种子成熟。收获T0代转基因棉花种子，继续种植T1代并收获种子，播种T1代种子后对萌发的T2代幼苗进行GUS组织染色(见常规操作方法)，筛选出纯合的转基因T2代株系(全部为GUS阳性或GUS阴性植株)，移栽T2代纯合株系，并检测靶标基因Gh3622的表达水平和比较纤维颜色性状的变化。

实施例5

棉花Gh3622基因转录水平的检测

提取RIL系、转基因棉花和对照纤维的RNA，逆转录合成cDNA一链，以此为模板进行定量PCR检测。具体操作步骤为：用cDNA一链合成试剂盒(TaKaRa公司)合成各种RNA的一链cDNA，操作均按试剂盒说明书进行。定量PCR在CFX96定量PCR检测系统(Bio-Rad)上进行，在20μL的反应体系包括10μL2×SuperMix(Bio-Rad)，上下游引物各0.2μmol/L和1μL一链cDNA。温度循环参数为95℃预变性2min；95℃，10sec，60℃，20sec，扩增40循环。用棉花Actin4基因作内标。用定量PCR仪自带的分析软件Bio-Rad CFX Manager2.0计算各个基因的相对表达量。所有定量PCR引物序列见表3。

表3定量PCR引物序列

棉花纤维色泽及绿色色素水平的考察：棉花纤维色泽取成熟纤维进行观察照相。用开花后20天的纤维检测绿色色素水平。取开花后10～30天的棉铃，冰上剥取胚珠上的纤维，液氮速冻，真空冷冻干燥后，称取样品约0.1g，在液氮中迅速研磨成粉，加入3mL配制好的色素提取液(50％无水乙醇，50％二氯甲烷)，匀浆10s，60℃下超声萃取2小时；5000rpm，离心10min；取上清，即为色素粗提液，多次提取直至样品为无色，合并色素提取液，用旋转蒸发仪蒸发掉提取液后，用色素溶解液(50％甲醇；50％N,N-二甲基甲酰胺)重新溶解样品。每个样品三个重复，取溶解液50μL于96孔酶标板上，在波长332nm处检测吸光值，用吸光值估计色素含量。

棉花Gh3622基因转录水平的检测结果及棉花纤维色泽及绿色色素水平如图3所示。其中，图3-A为转基因绿色棉(FLgT1、16和19)、分离的非转基因系(Null)以及野生绿色棉(WT)的成熟籽棉照片；图3-B为开花后20天后转基因纤维中的Gh3622基因表达水平；图3-C表示转基因绿色棉(FLgT1)及分离的非转基因系(Null)在不同时期的纤维中Gh3622基因的表达水平；图3-D表示转基因绿色棉(FLgT1)及分离的非转基因系(Null)在不同时期的纤维中的绿色色素水平。图3结果表明，pFbl2A-Gh3622转基因棉花成熟纤维呈现绿色，且Gh3622表达水平和绿色色素水平均在次生壁合成期(开花20天后)显著升高，显示通过转基因方法在纤维次生壁合成期特异表达Gh3622基因可以促进纤维合成绿色色素，使成熟纤维呈绿色。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> 一种促进棉花纤维绿色色素合成的蛋白质、基因及其编码序列和应用

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 282

<212> PRT

<213> 棉花(Gossypium spp)

<400> 1

Met Lys Gly Asn Asp Lys Asn Gly Leu Lys Lys Gly Pro Trp Thr Pro

1 5 10 15

Glu Glu Asp Arg Ile Leu Val Asp Tyr Ile Gln Lys His Gly His Ser

20 25 30

Lys Trp Lys Ser Val Pro Ala Leu Ala Gly Leu Asn Arg Cys Gly Lys

35 40 45

Ser Cys Arg Leu Arg Trp Thr Asn Tyr Leu Arg Pro Asn Ile Lys Arg

50 55 60

Gly Asn Phe Ser Ser Glu Glu Glu Gln Leu Ile Ile Asp Leu His Ala

65 70 75 80

Leu Met Gly Asn Lys Trp Ser Ala Ile Ala Arg His Leu Pro Gly Arg

85 90 95

Thr Asp Asn Glu Val Lys Asn Leu Trp Asn Ser Arg Leu Lys Arg Lys

100 105 110

Leu Ile Gln Met Gly Ile Asp Pro Ile Thr His Glu Pro Leu Thr Asp

115 120 125

Pro Arg Leu His Gln Leu Leu Ala Ala Ala Ser Phe Ser Asn Leu Ile

130 135 140

Asn Asn Pro Leu Asp Ile Val Asn Ala Leu Met Leu Gln Ser Asp Ala

145 150 155 160

Val Ala Thr Leu Ala Lys Ser Leu His Leu Ser His Asn Met Leu Gln

165 170 175

Ala Leu Ala Ser Thr Pro Thr Thr Met Ala Ser Gln Asp Pro Thr Lys

180 185 190

Ala Cys Ser Thr Ser Asn Glu Tyr Gln Phe Gly Ser Ser Ser Ser Ser

195 200 205

Leu Pro Val Asn Val Pro Asn Leu Asp Thr Thr Pro Gln Pro Ile Pro

210 215 220

Pro Met Ala Pro Arg Pro Thr Ile Val Asp Asp His His Glu Thr Asn

225 230 235 240

Asn Ile Thr Asn Pro Ser Ser Thr Thr Leu Gln Glu Trp Asp Asp Phe

245 250 255

Met Asp Gly Gly Glu Ala Ser Glu Pro Tyr Trp Arg Asp Ile Ile Asp

260 265 270

Gln Ala Ser Ser Gln Ser Trp Pro Ile Ser

275 280

<210> 2

<211> 2918

<212> DNA

<213> 棉花(Gossypium spp)

<400> 2

atgaagggca acgataaaaa tggcctgaaa aaagggccat ggacacctga ggaagacagg 60

attcttgtag attacattca gaaacatggt catagcaaat ggaaatcagt accagcttta 120

gctggtttaa acaggtgtgg aaaaagttgc aggcttcgat ggactaatta tttgagacct 180

aatattaaga gaggcaattt ttctagtgaa gaagagcaac tcatcattga tcttcatgca 240

cttatgggca acaagtaacc tctctttact tattactttt ttgggtcaaa ttttattatt 300

agtctcgtat tttatgtgag ttgtgagttt agtccctaag ctccaatttg gtttagtctt 360

tgaatattta gttcttcctc aaatggtagt tgttgaattc agtaatttaa tggctaccat 420

ttgggtaagg attgaaattt taaaattaga aaagtacaag gactaaaaat gatcaaatta 480

gaatttaagg attaaattta gaaaccacac atagtataag aactaactac atagtataac 540

cttcacacct tttatactta tctatccatt atccctgcat gcgtgtataa tatggttaat 600

tgcagtacta aacattctta aattatctct acattttaaa ttgatctcta aactttaaaa 660

tattttaatt tagtccttaa aatattagta ttgtatccag gggtaaatct agaaattctt 720

ttaggggtca aattttaatt ataaattttt gagaaatcaa aacataattt tatcatttat 780

taaaggacta atgttttttc attatttatg aggggactaa acagacaata ttccattttg 840

gggctcttgc ctttcccttt aaagtcaccc ctaattgtat atttagatcc ttacacctaa 900

taataggaca ggtcactcag tccagcccga aggttcacct aaaaagtggg agagtttaag 960

caaaaaaaat agactcgttt tttaaacggg tcaggtttcg ggtaagtttt ctttggccca 1020

ggcccgaccc gacccaaatt tgcaaaaaaa aaatctgttg ctttttgttg ttgttttgtc 1080

actgttttgg tgtcgtttcg ctattatatt gttactattt tgttgttatt gtttgaatat 1140

tatataactc ttgttttatt gttaattttg gtactatttt agaagtattt gctttctaag 1200

ttgcatctat gtcggtgtta tttaagtata aataattttt ctgatttatt ttcgaattgt 1260

tgggaatcat ttatttttaa cgtatttgat atattataat ttttaaattt atttttatat 1320

aaaaataaaa atataaaaaa ttctaatatg agcgagccga acctagaaac gggacctaaa 1380

attctattga ggcttgaccc gacccaactc attattacat ctacttacag ctagccatca 1440

atttagacct taaatatgat tctaaatcta atgtgaaata tatttaaaat ataaacacat 1500

ttatagttat tacatcatat tcaaattgtt gatgcgtata tttgagttga tgttacgtct 1560

gacgcaaagt tacattaata cgatattcat attttaaata tgtttttttt tttaacattt 1620

aaaggtggtc tgcaatagca agacatctcc ctggaagaac agataacgag gttaaaaatc 1680

tatggaactc acgtttgaag aggaagctta tacaaatggg gatcgatcca ataactcacg 1740

aaccattaac tgatcccagg ttacaccagt tgcttgctgc tgctagcttt agtaacctca 1800

ttaacaatcc attagacatc gtcaatgccc ttatgttaca atcagatgct gttgcaacac 1860

ttgctaaatc actccatttg tctcataaca tgcttcaagc tctagctagt acccctacaa 1920

caatggcttc tcaagaccca acaaaagctt gttccactag caatgaatat caatttggtt 1980

cttcttcgtc atcactgcct gttaatgttc caaatttgga tactactcct cagcctattc 2040

ctccgatggc tcctagaccg actattgtag atgatcacca tgaaaccaac aacatcacta 2100

acccttcttc aactaccttg caagaatggg atgattttat ggatggtggt gaagcaagtg 2160

aaccttattg gagggatatt atagagtatg tatatacaac cttctttttg ttgtcgttgt 2220

tcttttttgg ctttaatgca caccgcttac tgtttctttc aggtgaagat ttggaagtat 2280

cgttatgagt ttagtagggt ttcaaccctt gacttatagt atataggtca ttatggggag 2340

gtatggtaca aggctagatc gggcttaagt atgatattaa tacacttcat gcttatctaa 2400

gcccggcttg accagaaata tgagtctaaa attttactat aagccaaaaa tcgtcgtgcg 2460

ccgggtaggg ttcaaacctt tgatttatag catatgctgg gtcaggttta agcatgacat 2520

taatacagtt tatacttact taagctagac tcgatatgaa atatgggccc aaaattttac 2580

ccaaacctaa cctatatttt aaaaagggca taattttttg ttcaagctca tttttcgagc 2640

ctaatgtttt tacccacaac cttttaaatt taagacgaat ctttaagctt aaacagataa 2700

tctaaccgct taaacagata atctaaccca taaacaaatc tgctattgaa ctgcgtactt 2760

ccaaaactta ccctgaaaca ttatcgagag ttcaacgaat aataattcaa agactctcga 2820

caaaaattca ttttttttcg tttatttatt tatgatccat aacatttttt ttcttgaatt 2880

gcagccaggc atcatcacag tcatggccta tctcctag 2918

<210> 3

<211> 849

<212> DNA

<213> 棉花(Gossypium spp)

<400> 3

atgaagggca acgataaaaa tggcctgaaa aaagggccat ggacacctga ggaagacagg 60

attcttgtag attacattca gaaacatggt catagcaaat ggaaatcagt accagcttta 120

gctggtttaa acaggtgtgg aaaaagttgc aggcttcgat ggactaatta tttgagacct 180

aatattaaga gaggcaattt ttctagtgaa gaagagcaac tcatcattga tcttcatgca 240

cttatgggca acaagtggtc tgcaatagca agacatctcc ctggaagaac agataacgag 300

gttaaaaatc tatggaactc acgtttgaag aggaagctta tacaaatggg gatcgatcca 360

ataactcacg aaccattaac tgatcccagg ttacaccagt tgcttgctgc tgctagcttt 420

agtaacctca ttaacaatcc attagacatc gtcaatgccc ttatgttaca atcagatgct 480

gttgcaacac ttgctaaatc actccatttg tctcataaca tgcttcaagc tctagctagt 540

acccctacaa caatggcttc tcaagaccca acaaaagctt gttccactag caatgaatat 600

caatttggtt cttcttcgtc atcactgcct gttaatgttc caaatttgga tactactcct 660

cagcctattc ctccgatggc tcctagaccg actattgtag atgatcacca tgaaaccaac 720

aacatcacta acccttcttc aactaccttg caagaatggg atgattttat ggatggtggt 780

gaagcaagtg aaccttattg gagggatatt atagaccagg catcatcaca gtcatggcct 840

atctcctag 849

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggatccggga tgaagggcaa cgat 24

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggtaccctag gagataggcc atgac 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aagcttgcag acttaggatt ggatg 25

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggatccggtt aaccgaaata caaagca 27

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cttgatttgg cgtgcttgc 19

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcaaccgaag ggtctgatct c 21

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tttgtccctt aagatatcca ttaatct 27

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tcagagcgac gtagttggaa 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agccaaaatg gaaagtcagg 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cccctctact tcccaactca 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cgtggattat cattgcatcc 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tgaaattgtg agaaaccgca 20

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aacaaattta gcccacaatg c 21

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tctccaatca aagccaaacc 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gcagccatcc gacaactgga 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

aagttcctac gcgggggagt 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

agtgatggtg gagggacaaa 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ctctcctatc ccaacctcca 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gggggatggt gctactttat 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

cggtcaccaa actatcttcc 20

<210> 24

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tgaatgaaac agtagagata ggtgttc 27

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cgacccttga acatgaactg 20

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

aagcggctaa tttgaaagag aa 22

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ccccgtcgtc atcatcatc 19

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

tcctcagcct attcctccga 20

<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ctaggagata ggccatgac 19

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ttgcagaccg tatgagcaag 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

atcctccgat ccagacactg 20

<210> 32

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ctcttctccc ataatccaat tc 22

Claims

1.一种促进棉花纤维绿色色素合成的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。

2.一种编码权利要求1所述蛋白质的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种权利要求1所述蛋白质的编码序列，所述编码序列的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

4.一种用于扩增权利要求2所述基因或权利要求3所述编码序列的引物对，所述引物对的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述引物对的反向引物的核苷酸序列如SEQID No.5所示。

5.一种含有权利要求2所述基因或权利要求3所述编码序列的重组载体，其特征在于，所述重组载体还包括棉花纤维次生壁合成期特异表达启动子。

6.一种重组菌，其特征在于，包括宿主细菌和权利要求5所述重组载体。

7.权利要求1所述蛋白质、权利要求2所述基因、权利要求3所述编码序列、权利要求4所述引物对、权利要求5所述重组载体和权利要求6所述重组菌中的任一项或几项在促进棉花纤维绿色色素合成中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述促进棉花纤维绿色色素合成的方法，包括如下步骤：

(1)将编码序列、棉花纤维次生壁合成期特异表达启动子和植物表达载体重组，得到重组载体；

(2)将所述重组载体导入宿主细菌中，得到重组菌；

(3)利用所述重组菌对棉花进行遗传转化。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中棉花纤维次生壁合成期特异表达启动子由扩增得到，扩增所述棉花纤维次生壁合成期特异表达启动子用引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)宿主细菌包括根瘤农杆菌。