CN105002176B - 一种水稻温敏不育基因tms5的功能标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于水稻温敏不育基因tms5的功能标记、利用该功能标记检验样品是否为含有tms5基因的方法、利用该功能标记基因判断两系温敏水稻的种子纯度的方法以及其在培育不育系中的应用。本发明根据水稻tms5基因突变位点序列，在PCR引物中引入错配碱基，使含有tms5基因(突变型)的水稻PCR扩增产物出现一个限制性内切酶Rsa I的酶切位点，而不含有tms5基因(野生型)的水稻PCR产物则没有这一酶切位点。通过Rsa I酶切PCR产物，可将含有tms5基因的水稻PCR扩增产物酶切成两个片段，而不含的却无法被切开，从而进行区分。本发明采用直接酶切tms5扩增产物的设计，与前人相比，一方面简化了检测流程，另一方面也避免了假阳性结果的出现。

Description

一种水稻温敏不育基因tms5的功能标记及其应用

技术领域

本发明属于水稻分子检测领域。具体地说，本发明公开了针对tms5功能突变位点设计的的功能标记，该功能标记可用检测水稻样品中是否含有tms5基因。

背景技术

水稻两系不育资源的发现及成功应用，为保障我国粮食安全发挥了重要作用。与三系不育系相比，两系杂交水稻不受恢复基因的限制，配组自由，资源利用率高，使得两系杂交水稻在产量和米质方面均较三系杂交水稻有较大提升。同时，两系不育系还具有能自我繁殖的优点。因此，近年两系法杂交水稻在我国发展速度快，种植面积和推广范围迅速扩大。

选育优良的两系不育系，是培育两系杂交水稻的重要前提。传统的两系不育系选育需要在海南和内地穿梭育种，利用海南冬季的低温短日照繁殖不育株，内地夏季的高温长日照鉴定育性。这种选育方式，具有诸多限制因素。因此，开发两系不育基因的分子标记，应用于标记辅助选择，将能大大提高不育系的选育效率。其次，由于两系杂交稻种子的价格和销售利润都明显高于其他水稻种子，使得种子假冒事件时有发生，严重扰乱了种子市场，给农民造成重大经济损失。另外，由于两系杂交水稻制种过程中，易受温、光条件的影响，使不育系自交结实，导致纯度降低，我国规定杂交稻的纯度需≥96％，而传统的种植鉴定费时、费工、结果滞后。还有，水稻两系不育系最早在我国境内发现，为我国的特有种质资源，且为我国的粮食安全作出重大贡献。国务院多次强调要坚决遏制我国特有种质资源向国外流失。但是，缺少有效的检测手段防止外流。

因此，根据不育基因的DNA序列信息，设计共显性的分子标记，特异性地将含有不育基因和不含有不育基因的水稻材料区分开，将对两系不育系的分子标记辅助选择、种子市场的套牌打假、纯度鉴定和种质资源流失管控都具有重要意义。

目前，生产上大规模应用的两系按其不育基因来源可分为两类。一类来源于农垦58S，一般被称为含有光敏不育基因(PGMS)的不育系，生产上使用的代表不育系如培矮64S，7001S。2012年，Ding等和Zhou等分别克隆pms3(或P/TMS12-1)基因(参见，A longnoncoding RNA regulates photoperiod-sensitive male sterility,an essentialcomponent of hybrid rice,PNAS,2012,109:2654–2659和Photoperiod-and thermo-sensitive genic male sterility in rice are caused by a point mutation in anovel noncoding RNA that produces a small RNA,Cell Research,2012:1-12.)，农垦58s中的pms3基因一个碱基G突变为C，导致RNA结构改变，产生不育。

另一类来源于安农S-1，常被称为温敏不育基因(TGMS，tms5，ptgms2-1)，代表的不育系有广占63s、Zhu1S等。2011年，Xu等的文章[Fine mapping and candidate geneanalysis of ptgms2-1,the photoperiod-thermo-sensitive genic male sterile genein rice(Oryza sativa L.),Theor Appl Genet.2011,122(2):365-372]中介绍了将其定位在第二染色体的两个Indel标记间，距离50.4Kb，该区间有10个基因，其中一个核糖核酸酶Z基因被认为是tms5的候选基因(LOC_Os02g12290)，在广占63s中，距离起始密码子71bp的C突变为A，导致密码由TCG变为终止密码子TAG，推测可能是tms5的突变位点。2014年，Zhang等[Characterization of an RNase Z nonsense mutation identifiedexclusively in environment-conditioned genic male sterile rice,Mol Breeding(2014)34:481–489]，对多份两系不育系进行了等位型测验和测序分析，发现先前报道的tms5、tms9和ptgms2-1为等位基因，且温敏不育系具有共同的序列特征，即在距离起始密码子70-71bp位置均为TA，而非温敏不育系材料为GC或TC。同年，Zhou等[RNase Z^S1processesUbL40mRNAs and controls thermosensitive genic male sterility in rice,NATURECOMMUNICATIONS,DOI:10.1038/ncomms5884]功能互补验证试验结果显示：70-71bp位置为GC(日本晴)和TC(安农N)型的Tms5基因均能使安农S-1(TA型)恢复育性，说明71位C→A的突变是导致安农S-1花粉在高温条件下不育的功能型突变位点。Tms5编码产物为RNase Z^S1，RNase Z^S1可以降解UbL40的mRNA，在tms5突变体中RNase Z^S1酶失活，无法降解UbL40的mRNA，导致UbL40的mRNA积累，高温条件下，UbL40表达量高，导致不育系不育，低温条件下UbL40表达量低，导致可育。文中还根据我国农业部的统计数据，分析了我国推广的两系杂交水稻，发现我国的两系不育系有71％含有tms5基因，且这些不育系配组的杂交稻推广面积占整个两系杂交稻推广面积的83.8％(约290万公顷)，这说明当前两系杂交水稻生产上，tms5较pms3应用更广泛。

pms3和tms5的定位、克隆和序列分析工作为设计pms3和tms5的分子标记奠定了基础。对于pms3基因，由于与本发明所要标记的基因不同，这里不做详细介绍。

对于tms5基因，2011年杨剑波等[一个与水稻温敏不育基因tms5紧密连锁标记的开发与应用，专利号：zl 20011 1 0326770.1]开发了一个用于tms5检测的Indel标记SJ001(SJ001-F：5’ATATTTGGCGCTCTATTCTT 3’，SJ001-R：5’GGCCAAGTGTTATGATCACT 3’)，专利中称：用PCR扩增该标记位点，携有tms5基因的温敏核不育系仅扩增出一条387bp的谱带；携有tms5基因的温敏型两系杂交水稻会扩增出大小分别为463bp和387bp的两条谱带；不携有tms5基因的水稻(非温敏型水稻)仅扩增出一条463bp的谱带。2012年，出入境检验检疫行业标准《两系水稻品种真实性与纯度鉴定DNA分析法》(SN/T 3402-2012)中设计了Indel标记tms5-S2用于检测tms5基因，尽管SJ001标记和tms5-S2标记的引物序列不同，但是扩增的多态位点是一致的，均为tms5基因起始密码子ATG上游约5Kb位置的78bp缺失位点。应用SJ001和tms5-S2过程中，我们发现部分非两系不育系如协青早A中也能扩增出阳性条带。导致这种假阳性结果的原因是这两种标记检测的位点不是导致tms5功能缺失的突变位点(后称功能位点)。

2011年，曹晓风等在申请号为201110292922.0的专利申请“一种快速便捷检测水稻温敏不育系的方法”中设计了两对引物(RMZ-11F：CCTCTGTATCCACGAAGGAT和RMZ-11R:CACTCGGAGGTCTACAATCT；RMZ-13F:GTAATGTCGTAAGGAAATGCCC和RMZ-13R:GCGATGACTTGCCGCTGT)用于检测温敏不育基因，并认为电泳结果中比野生型产物电泳速度快的为携带不育基因的温敏不育系；这两对引物均是检测tms5基因ATG上游-1至-6位6碱基的缺失。即该标记检测的也不是tms5的功能突变位点，仍然存在检测假阳性风险。根据Zhang等[Mol Breeding(2014)34:481–489]对多个品种(品系)的tms5基因测序结果，可以发现，用RMZ-11和RMZ-13标记检测tms5基因，会在不含有tms5基因的材料如08EZ01,Hua201,Hua966,L718,R287,R288,Yi R88,W6154,Zaoxian2430中出现假阳性结果。

2014年，Zhang等[参见，Mol Breeding(2014)34:481–489]开发了针对tms5功能突变位点的两个dCAPS标记RZ2F1/R和RZ2F2/R(RZ2F1:ACCGCGCCGCCACCGGGTCGG CCCAAG，RZ2F2：ACCGCGCCGCCACC GGGTCGGCCGGAG，RZ2R：TGAAGAGGAA CTCCTGCGAGACGG)。RZ2F1/R和RZ2F2/R的扩增产物均为178bp，但是RZ2F1/R产物中引入了Sty I酶切位点，能切开70-72bp位置为GCG的扩增产物(153bp和25bp)，而切不开tms5基因(70-72bp为TAG)的扩增产物，RZ2F2/R产物中引入了Hinf I酶切位点，能切开70-72bp位置为TCG的扩增产物，同样无法切开tms5基因的扩增产物。这种设计通过两次扩增、两次酶切，根据酶切结果推断是否含有tms5基因，过程繁琐，另一方面，Zhang等对部分品种测序，只发现在70-72bp位置的GCG、TCG和TAG三种单倍型，但是不排除在HinfI和StyI的6碱基酶切位点存在其他单倍型的可能，如果存在其他单倍型，HinfI和StyI也无法切开，将导致假阳性结果。

因此，综上所述，目前对于水稻温敏不育基因tms5的验证，所采用验证方式，要么在对该基因进行验证时存在假阳性，要么需要通过两次酶切验证才可以检验，而且即便通过两次酶切，对于某些特定情况，还是无法避免假阳性结果的出现。

发明内容

针对上述问题，本发明希望提供一种能够通过单次酶切过程来验证水稻温敏不育基因tms5的标记基因，并且希望所提供的标记基因在进行验证时避免假阳性的出现。

具体而言，本发明根据tms5基因的功能突变位点，设计了一种标记引物对，利用该引物对进行PCR扩增后，用限制性内切酶只能切开含有tms5基因的PCR产物，而不切不开其他单倍型的扩增产物。这样即简化了检测的程序，也可避免假阳性结果。

一方面，本发明提供一种用于水稻温敏不育基因tms5检测的功能标记，其特征在于，所述功能标记包括第一引物和第二引物，所述第一引物中包含错配碱基。

进一步地，所述第一引物的序列如SEQ ID No.1中所示，所述第一引物的最后一个碱基为错配碱基；所述第二引物的序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4中所示。

另一方面，本发明提供一种利用所述功能标记检验样品是否含有tms5基因的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：

A)提取待检测水稻样本的DNA；

B)利用所述第一引物和第二引物对所提取的DNA进行PCR扩增；

C)利用限制性内切酶RsaI酶对所述扩增产物进行酶切；

D)判断所述限制性内切酶RsaI酶是否能够将所述扩增产物切开，如果限制性内切酶RsaI酶能够将所述扩增产物切开，则判定所述待检测水稻样本含有tms5基因，否则不含有tms5基因。

进一步地，在所述步骤B)中，所采用的聚合酶为rTaq，缓冲液为2×GCbuffer II。

进一步地，所述步骤C)中利用限制性内切酶RsaI酶对所述扩增产物进行酶切之前，无需对PCR扩增产物进行纯化，直接加入Rsa I酶即可，Rsa I酶的终浓度为1-4U/40μL。

进一步地，在所述步骤D)中，判断所述限制性内切酶RsaI酶是否能够将所述扩增产物切开的方式为：

(1)如果所采用的第二引物为SEQ ID No.2或SEQ ID No.3中所示的引物，则在对所述扩增产物进行酶切之后，进行PAGE胶电泳，并且根据电泳结果判断酶切产物中是否缺失了预定长度的片段；

(2)如果所采用的第二引物为SEQ ID No.4中所示的引物，则在对所述扩增产物酶切之后，进行琼脂糖电泳或者PAGE胶电泳(220V)，并且根据电泳结果判断酶切产物中是否缺失了预定长度的片段。

进一步地，所述方法还包括在对样品进行检测时，以含有tms5基因的不育系和常规水稻为对照，并且分别将所述样品的检测结果与两种对照的结果进行对比：检测的样品如果带型和不育系对照一致，说明该样品含有tms5基因，且纯合；如果和常规水稻一致，说明不含有Tms5基因，且纯合，不是不育系；如果含有2个对照的条带，说明所述样品的基因型为Tms5/tms5。

另一方面，本发明提供一种利用所述功能标记判断两系温敏水稻的种子纯度的方法，其特征在于，所述方法包括：以含有温敏不育基因tms5的不育系和不含tms5基因的材料为对照，对被检测种子以及所述两种对照分别按照权利要求3中的所述的方法进行检验，如果被检测种子所检测出的目的条带的带型与含有温敏不育基因tms5的不育系一致，说明所述被检测种子含有tms5基因，为温敏不育系；如果所述被检测种子所检测出的目的条带的带型与不含tms5基因的材料一致，则所述被检测种子不含有tms5基因；如果所述被检测种子含有2个对照的条带，则所述被检测种子为杂交种子。

另一方面，本发明提供一种所述功能标记的应用，其特征在于，所述功能标记用于辅助选择培育新的不育系，所述应用包括将含有tms5基因的不育系与其他水稻品种杂交、回交或自交，利用所述功能标记基因按照权利要求3中所述的方法对杂交、回交或自交后代进行检测，筛选出与所采用的含有tms5基因的不育系的带型完全一致的纯合型单株，即为新的不育系；筛选出Tms5/tms5型可继续回交或自交。

进一步地，所述含有tms5基因的水稻是指在离起始密码子71bp处碱基为A的材料，包括：孟s、新2s、广占63s、1892s、宣69s、广茉s、Y58s、P88s、丰39s、安农s-1、N422s、H980S，新安s、深08s、C815s或其同型系及衍生温敏型核不育系，及其与其他水稻材料配置的杂交组合；

不含有tms5基因的水稻是指在Tms5基因外显子上距离起始密码子71bp处碱基为非A的材料，包括：H980S，农垦58s，7001S、培矮64s、YDs、雁农s、H4s、W6154s、8077s、R1128、R2、WH26、豪恢808、R527、黄化占、盐稻4号、y80、y59、y28、RH003、扬稻6号或其同型系及衍生系。

上面方法中概述了利用本发明进行tms5检测时的各个步骤，下面详细介绍每一步的具体含义和过程。

1 DNA提取

本发明首先需要对检测的样品提取DNA，对DNA提取方法没有特殊要求，CTAB、SDS等方法均可，只需提取的DNA 260nm/280nm比值在1.7-2.0的范围即可。

在提取DNA过程中，为保证结果准确可靠且易判读，最好加入对照。对于温敏不育基因的真实性检测，需要加入含有tms5基因的不育系和不含有tms5的材料作为对照，与需要检测的样品一起提取DNA。温敏两系杂交种纯度检测，需要加入杂交种父本和母本作为对照。分子标记辅助选择的检测，需要加入供体亲本(为含tms5的温敏不育系)和受体亲本为对照。

2 PCR扩增

从表1中选择上游引物Re-RsaI，并挑选一条下游引物(如果电泳选择琼脂糖，就挑选Re-172-R3，如果选择聚丙烯酰胺电泳，三条下游引物均可)，组成引物对，按照表2中成分和浓度进行PCR扩增，扩增体积可按比例进行调整，如也可用25μL体系扩增。需要说明的是，表1、表2中所列出的各种引物和成分的具体获得和选择过程，在具体实施方式中进行了详细描述，此处，是基于经过多次实验验证后所获得的结果进行描述的。

扩增条件为：反应程序为：95℃变性5min后，94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，循环35次，72℃延伸5min，12℃保温。PCR扩增的引物如表1所示。

表1

PCR反应体系如表2所示。

表2

注：*表示下游引物从表1中的下游引物中选择一条。

3 酶切和电泳

对扩增后的PCR产物，取10μL用2-4％琼脂糖胶电泳30分钟，并加入标准分子量Marker，判断PCR产物中是否扩增出了目的条带(上游引物Re-RsaI与下游引物Re-94-R1、Re-91-R2、Re-172-R3组合分别能扩增出94bp、91bp和172bp的片段)，如果扩增出目的条带，就进行酶切步骤。酶切时只需在剩下的PCR产物(40μL)中加入Rsa I酶(5U/μL，NewEnglandBiolabs)0.3μL，37℃酶切1-16小时。

上游引物Re-RsaI与下游引物Re-94-R1、Re-91-R2扩增的PCR产物酶切后，需要用10％的PAGE胶电泳(220V)30-50 min，银染后，检测结果。对于Re-RsaI与Re-172-R3的引物组合扩增的PCR产物酶切后可用4％琼脂糖电泳60-90min，也可用10％PAGE胶电泳(220V)90min。

4 结果判读

在含有tms5基因的PCR扩增中，PCR产物能被RsaI酶切去一个26bp的小片段，而Tms5型的扩增产物却不能被Rsa I酶切，从而形成多态。结果判读如表3。如果用表3中的引物组合PCR扩增只扩出68bp、65bp或146bp条带就可以判断含有tms5基因，且为纯合体；如果只扩出94、91、或172bp的条带，就可以判断含有Tms5基因(野生型)；如果出现双条带，即为杂合型单株(Tms5/tms5)。

表3酶切后电泳片段大小

引物组合	tms5型(纯和体)	Tms5型(纯和体)	Tms5/tms5(杂合体)
				Re-RsaI+Re-94-R1	68bp	94bp	94bp和68bp
Re-94-R1+Re-91-R2	65bp	91bp	91bp和65bp
				Re-94-R1+Re-172-R3	146bp	172bp	172bp和146bp

对于分子标记辅助选择tms5基因，可以对杂交、回交或自交单株提取DNA，用表1中的引物和表2的体系进行PCR扩增，以含有tms5基因的不育系和受体亲本为对照，PCR产物酶切电泳后，含有tms5基因的不育系条带会小于受体亲本(少26bp)。检测的单株如果带型和不育系对照一致，说明该单株含有tms5基因，且纯合，如果和受体亲本一致，说明不含有Tms5基因，且纯合，不是不育系。如果含有2个对照的条带，说明该单株基因型为Tms5/tms5。如果需要继续回交，则需要选择Tms5/tms5带型的单株继续回交，如果是自交后代选择不育系，则选择tms5型单株。

对于两系温敏水稻的真实性判定，可用含有温敏不育基因tms5的不育系(如1892s)和不含tms5基因的材料(如93-11)为对照，如果检测样品的带型与1892s一致，说明含有tms5基因，为温敏不育系，如果带型与9311一致，则不含有tms5基因。如果含有2个对照的条带(2条带)，就是杂交种子。

同时，本标记适用于温敏不育系配组的杂交种子的纯度检测，以父母本为对照，如果带型与母本一致，说明是不育系自交的种子，如果带型与父本一致则为父本或其他不含有tms5基因的混杂种子，如果含有双亲的两条带型，则为真杂交种。纯度检验结果可按以下公式计算：

式中：

P—样品纯度；

N_T—为检测种子的总粒数；

N_G—为同时含有父母本带型的种子粒数。

有益效果

本申请的发明人在试验过程中发现，通常所设计出的引物对tms5基因突变位点周边序列的PCR扩增很困难。

通过发明人不懈努力，本发明通过引物设计配合反应体系优化，筛选出稳定的针对tms5基因的PCR扩增体系。本发明的功能标记用于tms5基因的分子标记辅助选择、tms5型两系杂交水稻及其亲本的真实性和纯度检测时，检测速度快，效果稳定，不会出现假阳性。本发明中的设计用限制性内切酶直接酶切tms5的PCR产物，一方面简化了检测流程，另一方面也可避免假阳性结果的出现。

附图说明

图1为普通PCR体系扩增的结果，

其中，泳道1-14分别对应于表4中的序号1-14，泳道15和16为空白水对照，泳道17为标准分子量Marker，DL2000(TAKARA)。

图2为Re-ScaI+Re-94-R1引物PCR产物和Sca I酶切结果，

其中，1和2泳道为Re-ScaI+Re-94-R1引物PCR扩增产物，3和4泳道为Re-ScaI+Re-94-R1引物PCR产物经酶切后结果，3和4泳道的条带，并不比1和2泳道的条带小。

图3为rTaq+2×GC buffer I体系PCR扩增的结果，

其中，泳道1-14分别对应于表4中的序号1-14，泳道15和16为空白水对照，泳道17为标准分子量Marker，DL2000(TAKARA)。泳道1、2、3、4和11扩增出较亮的单条带。

图4为rTaq+2×GC buffer II体系PCR扩增的结果

其中，泳道1-14分别对应于表4中的序号1-14，泳道15和16为空白水对照，泳道17为标准分子量Marker，DL2000(TAKARA)。泳道1、2、3、4、7和8扩增出较亮的单条带。

图5为HS STAT酶+5×Prime buffer体系PCR扩增的结果

其中，泳道1-14分别对应于表4中的序号1-14，泳道15和16为空白水对照，泳道17为标准分子量Marker，DL2000(TAKARA)。各个泳道虽然扩增出目的条带，但是非特异性扩增的杂带多。

图6为HS STAT酶+2×GC buffer体系PCR扩增的结果

其中，泳道1-14分别对应于表4中的序号1-14，泳道15和16为空白水对照，泳道17为标准分子量Marker，DL2000(TAKARA)。各个泳道虽然扩增出目的条带，但是非特异性扩增的杂带多。

图7为PCR产物酶切结果

其中，1-6为For-MaeI+For-120-R2引物对扩增结果，7-12为For-MboII+For-120-R2引物对扩增结果，13-18为Re-Rsa I+Re-94-R1引物对扩增的结果；1,2,7,8,13,14模板DNA为1892s,3,4,9,10,15,16模板DNA为扬稻6号选，5,6,11,12,17,18为F1；单数泳道(1,3,5,7,9,11,13,15,17)为PCR产物未酶切电泳结果，双数泳道(2,4,6,8,10,12,14,16,18)为PCR产物酶切后电泳结果；M1和M2为marker(标记)，分别为DL2000和20bp marker。

图8为10％PAGE胶电泳

图9为新设计的下游引物扩增结果

图10为引物Re-Rsa I和Re-172R扩增的PCR产物RsaI酶切结果

图11为不同材料dCAPS标记酶切结果

其中，各泳道分别代表：1.孟s,2.新2s,3.广占63s,4.1892s,5.宣69s,6.广茉s,7.Y58s,8.P88s,9.丰39s,10.安农s-1,11.N422s,12.H980S,13.农垦58s,14.7001S,15.培矮64s,16.YDs,17.雁农s,18.,19为空白对照，M为DL2000marker

图12为不同材料dCAPS标记直接PAGE胶结果

其中，各泳道分别代表：1.孟s,2.新2s,3.广占63s,4.1892s,5.宣69s,6.广茉s,7.Y58s,8.P88s,9.丰39s,10.安农s-1,11.N422s,12.H980S,13.c815s,14.深08s,15.新安s16.农垦58s,17.7001S,18.培矮64s,19.YDs,20.雁农s,21.H4s,22.W6154s,23.8077s,24.R1128,25.R2,26.WH26,27.豪恢808,28.R527,29.黄化占,30.盐稻4号,31.y80,32.y59,33.y28,34.RH003,35.扬稻6号,36.绿旱1号,37.培矮64,38.II-32B,39.紫叶稻,40.轮回422,41.02428,42.HP121,43.广恢102,44.黑壳稻,45.日本晴,46.空白对照。

具体实施方式

以下叙述本发明的具体实施例。应该说明，本发明的实施例只对本发明起说明作用，而没有任何限制作用。本领域技术人员可以对本发明作出某些等同的改动和显而易见的改进。

1、tms5基因的测序验证

根据Xu等[Fine mapping and candidate gene analysis of ptgms2-1,thephotoperiod-thermo-sensitive genic male sterile gene in rice(Oryza sativaL.),Theor Appl Genet.2011,122(2):365-372]报道的tms5的候选基因(LOC_Os02g12290)的序列设计引物，对不育系1892s进行PCR扩增和测序分析，发现1892s和广占63s一样，在距离tms5起始密码子71bp处突变为A，产生终止密码子TAG。随后Zhoui等[RNase Z^S1processesUbL40 mRNAs and controls thermosensitive genic male sterility in rice,NatureCommunications,2014,DOI:10.1038/ncomms5884]对1892s的测序结果也发现1892s为tms5突变型。本实施例中以1892s为例进行描述，以上足以证明了本发明所研究的水稻品种及其中的基因tms5是得到验证的。

2、tms5基因功能突变位点的标记设计

根据tms5的功能突变位点，本申请的发明人进行针对性地引物设计。引物设计时基于两个原则：1)设计的标记需要能切开突变型(tms5型)，而切不开野生型(Tms5)；2)所用的限制性内切酶较常用，易购买。但是，本申请的发明人发现，通过常规的方式，找不到能够直接酶切PCR产物的相应的内切酶，因此，本申请的发明人给引物加上错配碱基，希望找到合适的内切酶。发明人发现，即便添加错配碱基，也并不能保证结果的稳定。

发明人分别错配1个碱基和2个碱基，并从正链和反链两个方向设计引物，选择较常用的内切酶，合成的引物见表4，表4列出了tms5基因的标记突变位点处的引物设计。

注：划线碱基为突变碱基。

表4

此外，设计下游引物，扩增片段大小控制在100bp左右，选择Tm值在60度左右，无二聚体和错配的引物，正反项各选择了2条引物，引物序列信息见表5，其中列出了标记下游引物。

标记名称	引物序列	Tm(度)	Rating	可配对的上游引物	扩增片段大小
						For-110-R1	CGGGAAGATGACGCAGGT	58.7	76	For-MaeI,For-MboII,For-XbaI	110bp
For-120-R2	CGCTCAGCGTCGGGAAGA	62.7	70	For-MaeI,For-MboII,For-XbaI	120bp
						Re-94-R1	GGCGAACAGCGGCAAGTC	62.1	100	Re-RsaI,Re-AluI,Re-ScaI,Re-SnaI	94bp
Re-91-R2	GAACAGCGGCAAGTCATCG	59.7	100	Re-RsaI,Re-AluI,Re-ScaI,Re-SnaI	91bp

表5

3、标记筛选和体系优化

在0.2mL薄壁管中依次加入表6和7成分，进行PCR反应，表6中为普通PCR扩增体系所采用的反应成分，表7中为引物组合对。扩增程序：95℃变性5min后，94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，循环35次，72℃延伸5min。4％琼脂糖凝胶电泳，拍照，结果见图1。

反应成分	加入体积(μL)
		10×PCR buffer(Takara公司)	2.5
dNTP(2.5mmol/L each)	1.6
		上游引物(10μmol/L)(见表4)	1
下游引物(10μmol/L)(见表4)	1
		rTaq酶(5U/μL)(Takara公司)	0.2
模板DNA(50ng/μl)	2.0
		ddH2O	16.7
总体积	25

表6

序列	引物(上游+下游)	序列	引物(上游+下游)
				1	For-MaeI+For-110-R1	8	Re-RsaI+Re-91-R2
2	For-MaeI+For-120-R2	9	Re-AluI+Re-94-R1
				3	For-MboII+For-110-R1	10	Re-AluI+Re-91-R2
4	For-MboII+For-120-R2	11	Re-ScaI+Re-94-R1

5	For-XbaI+For-110-R1	12	Re-ScaI+Re-91-R2
				6	For-XbaI+For-120-R2	13	Re-SnaI+Re-94-R1
7	Re-RsaI+Re-94-R1	14	Re-SnaI+Re-91-R2

表7

由图1知，普通PCR体系只有少数引物组合扩增出条带，1、2泳道条带很暗，如果再用于酶切分析，很难得到清楚的结果。9和10泳道有杂带，且扩增片段的大小不正确。11泳道较清楚，且只有一条带，扩增引物为Re-ScaI+Re-94-R1。对PCR产物用乙醇沉淀的方法纯化后，Sca I酶37℃过夜进行酶切，但是电泳结果显示，ScaI无法切开扩增片段(图2)。为弄清楚酶切不开的原因，我们将扩增片段进行了测序，与tms5基因序列比对发现，扩增片段与tms5无同源性，说明Re-ScaI+Re-94-R1引物对虽然扩增出较亮条带，但是脱靶了，为假阳性结果。

上述的结果说明，用普通PCR体系直接扩增设计的tms5基因引物对，无法得到理想结果。可能是tms5功能突变位点周围有复杂的空间结构，使得PCR扩增难度大。为获得理想的扩增结果，需要对反应体系进行优化。

我们采用Takara公司的2×GC buffer I和2×GC buffer II搭配rTaq酶，以及5×Prime buffer和2×HS GC buffer搭配Hs STAR酶，来筛选适合的扩增体系(扩增体系见表8-10，扩增产物电泳结果见图3-6)。

由图3知，rTaq酶搭配2×GC buffer I扩增，部分泳道出现较亮的一条带，泳道1(引物：For-MaeI+For-110-R1)、泳道2(For-MaeI+For-120-R2)、泳道3(For-MboII+For-110-R1)、泳道4(For-MboII+For-120-R2)和泳道11(Re-ScaI+Re-94-R1)均扩出一条目标条带。泳道7(Re-RsaI+Re-94-R1)和8(Re-RsaI+Re-91-R2)虽然扩出目标条带，但是整个泳道内有杂带，其他泳道均未扩出目的条带。对泳道1、2、3、4和11泳道片段测序分析发现，1、2、3和4泳道片段序列与tms5基因一致，而泳道11和普通PCR扩增的序列一样，与tms5基因无同源性。

由图4知，rTaq酶搭配2×GC buffer II扩增，除在泳道1、2、3、4、11与2×GCbuffer I一样，能扩出单一的目的条带外，泳道7和8也能均扩出唯一的一条目的条带。测序结果显示1、2、3、4、7、8泳道序列正确，而11泳道与图3结果一样，序列不正确。

图5和图6分别为Hs STAR酶分别搭配5×Prime buffer和2×HS GC buffer扩增结果，由图知，Hs STAR酶在2种缓冲液环境下，每个泳道均能扩出目的条带(100bp左右)，说明Hs STAR酶扩增目的位点的能力很强，但是非特异性扩增也很强，每个泳道里都有很多杂带。

可见，与Hs STAR酶相比，rTaq酶在部分引物对中能扩出单一的目的条带。2×GCbuffer II和2×GC buffer I相比，2×GC buffer II能在更多的引物对中扩出单一的目的条带。所以选用rTaq酶搭配2×GC buffer II体系扩增tms5基因能获得更稳定可靠的结果。

同时，由图3-6可以看出，对于设计的引物，错配2个碱基的4条上游引物均未扩出单一的目的条带，而错配1个碱基的3条引物在rTaq酶搭配2×GC buffer II体系中，均扩出了单一的目的条带。而下游引物对扩增的结果无明显影响，如上游引物Re-RsaI分别和Re-94-R1、Re-91-R1搭配，均能扩出目的条带。

表8列出了rTaq酶搭配2×GC buffer I和2×GC buffer II的PCR扩增体系。表9列出了HS STAR酶搭配2×prime buffer的PCR扩增体系。表10列出了HS STAR酶搭配2×GCbuffer的PCR扩增体系。

表8

表9

表10

4、引物和限制性内切酶的选择

由于下游引物对扩增结果无明显影响，我们从4条下游引物中选择了For-120-R2和Re-94-R1两条下游引物，与3条单碱基错配的上游引物搭配，组成下列引物对用于PCR扩增(表11，其列出了引物组合和PCR产物酶切的限制性内切酶)。

上游引物	下游引物	内切酶
			For-MaeI	For-120-R2	Mae I
For-MboII	For-120-R2	Mbo II

Re-RsaI

Re-94-R1

Rsa I

表11

取杂交水稻徽两优6的母本1892s、扬稻6号选和F1种子在恒温箱中发苗，提取DNA，用表8中的PCR扩增体系(体积增大到50μL)和表11中的引物对进行PCR扩增，PCR产物用乙醇纯化(50μL PCR产物中加5μL醋酸钾和137.5μL无水乙醇，混匀，-80℃冰箱放置30分钟，13000rpm离心15min，200μL 70％乙醇洗涤，13000rpm离心10min，烘干，加入17.5μL超纯水溶解)，用表11中对应的限制性内切酶进行酶切(NEB酶，体系：10×cut smart buffer 2μL，限制性内切酶0.5μL，37℃，4小时)，结果如图7。

由图7知，For-MaeI+For-120-R2引物对扩增1892s、扬稻6号选和F1DNA时，在以扬稻6号选为模板的反应中无目的条带(泳道3)，而且PCR产物酶切不彻底，酶切后条带无明显的位置变化(泳道2，6)，即Mae I没能切开PCR产物。For-MboII+For-120-R2引物对扩增3个DNA，能扩出目的条带，但是Mbo II酶切后，产物全部消失(泳道8、10、12)，说明Mbo II酶有严重的星号酶切特性，不适合作为标记使用。Re-RsaI+Re-94-R1引物对扩增3个DNA，也能扩出目的条带，且用Rsa I酶切后，1892s扩增条带明显变小，扬稻6号选的扩增条带没有发生变化，而杂合体F1呈现双带，这符合共显性标记的特征，和当初的标记设计初衷一致。但是Rsa I酶切条带在琼脂糖胶上不清楚，可能是条带太小，易弥散的原因。因此，同样的产物，我们采用10％的PAGE胶电泳，30分钟，结果如图8，由图8可以看出：1)酶切后条带清晰，结果容易判读；2)tms5型的1892s的扩增产物能被彻底酶切，而Tms5型的扬稻6号选却没有任何酶切痕迹；3)杂合体F1(tms5/Tms5)呈现双亲互补带型。

由于Re-RsaI+Re-94-R1引物对扩增产物在琼脂糖胶上不太清楚，需用PAGE电泳，但是，有的检测者习惯用琼脂糖检测，所以我们重新设计下游引物，以增大PCR产物大小，拟使扩增产物在琼脂糖胶上能跑出理想结果。我们又设计了3条下游引物(表12，其中列出了与Re-RsaI搭配的下游引物)，分别与Re-RsaI搭配，采用表8的体系进行PCR扩增，DNA模板包括1892s、扬稻6号选和F1共3个，扩增的产物直接电泳后，结果如图9，由图9知：新设计的引物Re-172-R3与Re-RsaI搭配可以清楚的一条目的条带(172bp)，而Re-107-R和Re-140-R扩增的条带有较多杂带，不能使用。进一步用Rsa I酶切Re-RsaI与Re-172-R3扩增的172bp产物，琼脂糖电泳结果显示，Rsa I酶可将1892s的扩增产物切开，而扬稻6号选的扩增产物无法切开，F1呈现杂合双带(图10)。

引物名称	序列	产物大小
			Re-107-R	GCGGCGGCGCCATGGCGAACA	107bp
Re-140-R	GTGCCGGAACAACCCCCCACCACGG	140bp
			Re-172-R3	CCGGCCCATCGTGCTTCGTGCCAAA	172

表12

5、酶切体系的简化

通常情况下，PCR产物在酶切之前，均经过乙醇沉淀的步骤，不仅步骤繁琐，而且消耗时间，且由于沉淀过程有片段损失，所以要求扩增的体积大(50μL)。为此，我们尝试PCR产物不纯化，直接加入Rsa I酶，且不加酶切buffer，体系为25μL PCR产物，加入0.2μL Rsa I酶(10U/μL)，37℃酶切1小时和过夜酶切16小时，电泳发现，Rsa I酶均能切开含有tms5基因的PCR产物，且酶切条带稳定，不随酶切时间的延长而改变。因此，采用本发明的方式进行tms5检测，不需要可以省去PCR扩增之后的纯化过程，这是本领域技术人员无法预料得到的。

6、标记可行性验证

此外，本发明用母本为1892s，父本为扬稻6号选的一个F2群体验证标记的检测能力。2013年正季，合肥，发明人观察了F2群体中的192株，通过观察花药饱满程度和包颈状况，并结合花粉观察，共发现43株不育株，149可育株，提取这192个单株的DNA，采用Re-RsaI与Re-172-R3引物进行扩增，扩增产物用Rsa I酶切，结果43株不育株的带型与1892s一致，能被RsaI切开，对于149可育株，一部分带型与扬稻6号选一致，一部分呈双亲的杂合带型。说明设计的dCAP标记检测与实际的育性观察结果完全一致，标记检测结果准确可靠。

7、dCAPS-172标记对不同材料的检测

进一步用Re-RsaI与Re-172-R3引物对以下几类材料进行了标记检测：

两系不育系类：孟s、新2s、广占63s、1892s、宣69s、广茉s、Y58s、P88s、丰39s、安农s-1、N422s、H980S，农垦58s，7001S、培矮64s、YDs、雁农s、H4s、W6154s、8077s、新安s、深08s、C815s。

两系恢复系：R1128、R2、WH26、豪恢808、R527、黄化占、盐稻4号、y80、y59、y28、RH003、扬稻6号。

其他材料：绿旱1号、培矮64、II-32B、紫叶稻、轮回422、02428、HP121、广恢102、黑壳稻、日本晴。

结果发现：孟s、新2s、广占63s、1892s、宣69s、广茉s、Y58s、P88s、丰39s、安农s-1、N422s、H980S，新安s、深08s、C815s，均为含有tms5基因的两系不育系，扩增带型能被Rsa I切开，其他材料均不能被切开(图11)。

8、dCAPS-172标记直接检测品种多态性

由图10知，含有tms5基因的两系不育系扩增条带，均被Rsa I切开，条带位置一致，但是在不能被切开的材料中，似乎存在多态，如图10中，农垦58s(13)、7001S(14)、YDs(16)，条带较培矮64s(15)、雁农s(17)、H4s(18)大。

为此，我们采用分辨率更高的10％PAGE胶检测了45份材料的Re-RsaI与Re-172-R3引物扩增产物(没有酶切)，这些材料涵盖了两系不育系、两系恢复系和常规材料，结果见图11。由图11知，12份两系恢复系材料(24-35)只有R2(25)扩增的条带与有tms5基因的两系不育系扩增条带一致，而其他11份材料均与含有tms5的两系不育系一致。

9、标记用于两系杂交稻纯度检测

为了验证设计的标记是否可以用来检测两系不育系的纯度，我们用皖稻153和徽两优6号两份杂交种来验证，皖稻153和徽两优6号分别在田间栽植约200株，分蘖盛期取叶片，提取DNA，每份样品提取192个DNA(共2个96孔板)，用dCAPS-172扩增这些DNA，取2ul用于10％PAGE胶直接电泳，剩下样品用Rsa I酶切，4％琼脂糖胶电泳，结果酶切和不酶切两种方法鉴定的杂株完全一致。在皖稻153样品中，dCAPS-172标记扩增产物直接电泳共找到4株带型与其母本一致的单株(纯合型)，田间育性观察这些单株均为不育株，证明本发明的分子标记鉴定结果准确可靠。徽两优6号的鉴定结果同皖稻153，结果见表13。

表13

10、用于分子标记辅助选择培育新的不育系

为验证设计的标记在分子标记辅助选择中的作用，我们用1892s与绿旱1号杂交，以绿旱1号为轮回亲本，回交3代，在BC1F1、BC2F1、BC3F1和BC3F2代进行分子标记辅助选择，其中BC1F1、BC2F1、BC3F1选择杂合型单株，在BC3F2代选择带型与1892s完全一致的纯合型单株，正季高温长日条件对BC3F2代抽穗期用I2-KI染色方法观察花粉染色情况，结果分子标记选择出的单株，I2-KI染色观察花粉全部败育，说明本发明的标记可以用于两系不育系选育过程中的分子标记辅助选择。

虽然上面结合本发明的优选实施例对本发明的原理进行了详细的描述，本领域技术人员应该理解，上述实施例仅仅是对本发明的示意性实现方式的解释，并非对本发明包含范围的限定。实施例中的细节并不构成对本发明范围的限制，在不背离本发明的精神和范围的情况下，任何基于本发明技术方案的等效变换、简单替换等显而易见的改变，均落在本发明保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用于水稻温敏不育基因tms5检测的引物组，其特征在于，所述引物组由第一引物和第二引物构成，所述第一引物中包含错配碱基，所述第一引物的序列如SEQ ID No.1中所示，所述第一引物的最后一个碱基为错配碱基；所述第二引物的序列如SEQ ID No.2、SEQID No.3或SEQ ID No.4中所示，所述引物组能够通过单次酶切过程来验证水稻温敏不育基因tms5。

2.一种利用权利要求1所述的引物组检验样品是否含有tms5基因的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：

A)提取待检测水稻样本的DNA；

B)利用所述第一引物和第二引物对所提取的DNA进行PCR扩增；

C)利用限制性内切酶RsaI酶对所述扩增产物进行酶切；

D)判断所述限制性内切酶RsaI酶是否能够将所述扩增产物切开，如果限制性内切酶RsaI酶能够将所述扩增产物切开，则判定所述待检测水稻样本含有tms5基因，否则不含有tms5基因。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述步骤B)中，所采用的聚合酶为rTaq，缓冲液为2×GC buffer II。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤C)中利用限制性内切酶RsaI酶对所述扩增产物进行酶切之前，无需对PCR扩增产物进行纯化，直接加入Rsa I酶即可，Rsa I酶的终浓度为1-4U/40μL。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述步骤D)中，判断所述限制性内切酶RsaI酶是否能够将所述扩增产物切开的方式为：

(1)如果所采用的第二引物为SEQ ID No.2或SEQ ID No.3中所示的引物，则在对所述扩增产物进行酶切之后，进行PAGE胶电泳，并且根据电泳结果判断酶切产物中是否缺失了预定长度的片段；

(2)如果所采用的第二引物为SEQ ID No.4中所示的引物，则在对所述扩增产物酶切之后，进行琼脂糖电泳或者PAGE胶电泳，并且根据电泳结果判断酶切产物中是否缺失了预定长度的片段。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在对样品进行检测时，以含有tms5基因的不育系和常规水稻为对照，并且分别将所述样品的检测结果与两种对照的结果进行对比：检测的样品如果带型和不育系对照一致，说明该样品含有tms5基因，且纯合；如果和常规水稻一致，说明不含有Tms5基因，且纯合，不是不育系；如果含有2个对照的条带，说明所述样品的基因型为Tms5/tms5。

7.一种利用权利要求1所述的引物组判断两系温敏水稻的种子纯度的方法，其特征在于，所述方法包括：以含有温敏不育基因tms5的不育系和不含tms5基因的材料为对照，对被检测种子以及所述两种对照分别按照权利要求3中的所述的方法进行检验，如果被检测种子所检测出的目的条带的带型与含有温敏不育基因tms5的不育系一致，说明所述被检测种子含有tms5基因，为温敏不育系；如果所述被检测种子所检测出的目的条带的带型与不含tms5基因的材料一致，则所述被检测种子不含有tms5基因；如果所述被检测种子含有2个对照的条带，则所述被检测种子为杂交种子。

8.一种权利要求1中所述的引物组的应用，其特征在于，所述引物组用于辅助选择培育新的不育系，所述应用包括将含有tms5基因的不育系与其他水稻品种杂交、回交或自交，利用所述引物组基因按照权利要求2中所述的方法对杂交、回交或自交后代进行检测，筛选出与所采用的含有tms5基因的不育系的带型完全一致的纯合型单株，即为新的不育系；筛选出Tms5/tms5型可继续回交或自交。

9.根据权利要求8所述的应用，所述含有tms5基因的水稻是指在离起始密码子71bp处碱基为A的材料，包括：孟s、新2s、广占63s、1892s、宣69s、广茉s、Y58s、P88s、丰39s、安农s-1、N422s、H980S、新安s、深08s、C815s或其同型系及衍生温敏型核不育系；

不含有tms5基因的水稻是指在Tms5基因外显子上距离起始密码子71bp处碱基为非A的材料，包括：农垦58s、7001S、培矮64s、YDs、雁农s、H4s、W6154s、8077s、R1128、R2、WH26、豪恢808、R527、黄化占、盐稻4号、y80、y59、y28、RH003、扬稻6号或其同型系及衍生系。