CN109280718A - 水稻温敏不育基因tms5的功能分子标记及其检测引物与应用 - Google Patents

水稻温敏不育基因tms5的功能分子标记及其检测引物与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及水稻温敏不育基因tms5的功能分子标记及其检测引物与应用。本发明提供一种水稻温敏不育基因tms5的SNP分子标记的检测引物，所述SNP分子标记包含第71位碱基的C/A多态性，所述检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示的第一引物、第二引物、第三引物和第四引物。本发明利用ARMS‑PCR检测tms5基因携带的第71位碱基由C到A的功能突变，可以有效地避免假阳性，能够实现温敏不育性状的准确检测；并且检测结果可以直接根据琼脂糖凝胶电泳条带进行判断，检测程序简单易行，成本低廉，适于进行广泛推广应用。

Description

水稻温敏不育基因tms5的功能分子标记及其检测引物与应用
技术领域
本发明涉及分子生物学及植物分子育种领域，具体地说，涉及水稻温敏不育基因tms5的功能分子标记及其检测引物与应用。
背景技术
水稻是我国最重要的粮食作物之一，全国有超过半数的人口以稻米为主食。两系法杂交水稻不育系的育性受核基因控制，具有没有恢保关系，配组自由；种子繁育程序简单，成本低；稻种资源利用率高，选育出优良组合机率高等优点，有利于使水稻杂种优势进入一个新阶段。
两系法杂交稻使用的不育系主要是利用光温敏不育水稻材料培育的。目前生产上应用的两系不育系按不育基因的来源主要分为两类：光敏不育系(PGMS)和温敏不育系(TGMS)。PGMS来源于农垦58S，其代表不育系包括培矮64S，7001S等，其控制基因为pms3(Ding J et al.A long noncoding RNA regulates photoperiod-sensitive malesterility,an essential component of hybrid rice.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,2012:109:2654-2659.)。TGMS来源于安农S-1，代表的不育系有广占63S、株1S等，其不育控制基因为tms5(Zhou et al.RNase Z S1processes Ub L40mRNAs and controlsthermosensitive genic male sterility in rice.Nature communications,2014,5:4884.)。TMS5编码产物为RNase ZS1，RNase ZS1可以降解UbL40的mRNA；TMS5基因第71位碱基C突变为A后，导致翻译提前终止，RNase ZS1酶失活，无法降解UbL40的mRNA。低温条件下，UbL40表达量低，花粉育性正常，而高温条件下，UbL40大量表达，导致花粉不育。
现有的两系不育系选育主要根据抽穗开花期的田间表现，花粉镜鉴，套袋自交等方法；还需要利用海南冬季的低温短日照和大陆的夏季的高温长日照。这种选育方式步骤繁琐、准确性低、时间长、见效慢，限制了两系不育系的选育进程。因此开发针对不育基因的分子标记，将其应用于分子标记辅助选择，可以大大提高不育系的选育效率。
截止到2011年，我国种植的两系杂交稻中，有71个品种是利用带有tms5不育基因的两用不育系培育而成，占所有两系杂交稻品种的71％，其种植面积超过全国两系杂交稻种植面积的80％。科研工作者对tms5的定位、克隆和序列分析工作为tms5的分子标记开发奠定了基础。现有技术中针对水稻温敏不育系tms5基因的分子标记主要存在假阳性率高、检测步骤繁琐及检测成本较高等问题，在实际生产中仍不能得到广泛应用：曹晓风等的专利“一种快速检测水稻温敏不育系的方法”(CN201110292922.0)检测tms5基因的两对引物均不是功能标记，存在检测假阳性高的问题。专利申请CN201510967126.0、CN201610555993.8、CN201510547897.4检测tms5基因需要使用限制性内切酶酶切或者荧光探针，步骤繁琐或检测成本较高，在实际应用中有诸多不便。因此，亟需开发假阳性率低、准确性高、操作简便、成本低廉的水稻不育基因tms5的检测分子标记。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种水稻温敏不育基因tms5的功能分子标记及其检测引物与应用。
水稻温敏不育基因tms5为编码RNase ZS1蛋白的TMS5基因的第71位碱基由C突变为A，携带tms5基因的水稻表现为花粉的表型。本发明针对第71位碱基由C突变为A的SNP位点，开发基于碱基不互补耐热DNA聚合酶不延伸原理的突变扩增系统(ARMS-PCR)检测引物和检测方法。
一方面，本发明提供一种水稻温敏不育基因tms5的SNP分子标记的检测引物，所述SNP分子标记包含第71位碱基的C/A多态性，所述检测引物包括第一引物、第二引物、第三引物和第四引物；所述第一引物和所述第二引物分别为所述第71位碱基的上下游外侧扩增引物，所述第三引物的3’末端的最后1个碱基与tms5基因非编码链的第71位碱基T互补，所述第四引物的3’末端的最后1个碱基与TMS5基因编码链的第71位碱基C互补。
其中，TMS5基因为第71位碱基未发生突变的野生型基因(即第71位碱基为C)。
优选的，所述检测引物的核苷酸序列如下：
第一引物：SEQ ID NO.1：AACCGGTAATGTCGTAAGGAAATG；
第二引物：SEQ ID NO.2：GGCGTGGGAGATGAAGAGGAA；
第三引物：SEQ ID NO.3：GCCGCCACCGGGTCGGCCGAAGTA；
第四引物：SEQ ID NO.4：CGGTGAGGGGCGGCGCCTTCG。
另一方面，本发明提供一种水稻温敏不育基因tms5的检测方法，为利用ARMS-PCR对tms5的SNP分子标记进行扩增，根据电泳检测扩增产物的条带分型，判断tms5基因的有无或杂/纯合；所述ARMS-PCR的引物为本发明所述的检测引物。
具体的，水稻温敏不育基因tms5的检测方法包括如下步骤：
(1)提取待测水稻的基因组DNA；
(2)以待测水稻的基因组DNA为模板，利用本发明所述的检测引物，采用ARMS-PCR进行扩增；
(3)电泳检测ARMS-PCR扩增产物，根据扩增产物的条带分型判断tms5基因的有无或杂/纯合。
优选的，所述判断tms5基因的有无或杂/纯合的方法如下：如果扩增产物条带为大小分别为468bp/474bp和184bp的两条带，判定所述待检测水稻样本含有纯和的tms5基因；如果扩增产物条带为大小分别为468bp/474bp、329bp/335bp及184bp的三条带，判定所述待检测水稻样品含有杂合的TMS5/tms5基因；如果扩增产物条带为大小分别为468bp/474bp和329bp/335bp的两条带，判定所述待检测水稻样本不含有tms5基因。
水稻的不同品种的TMS5基因序列存在一定差异，一部分品种的TMS5缺失了两个氨基酸(核苷酸序列缺失了6bp)，另一部分品种则没有缺失这两个氨基酸(这两个氨基酸的缺失不影响育性)，因此，采用同一外侧引物(第一、第二引物)与SNP位点特异的第三或第四引物组成的引物对进行扩增时，扩增产物的大小会产生6bp大小的差异，即出现上述468bp/474bp和329bp/335bp的情况。具体判定时，例如，扩增产物条带为大小分别为468bp和184bp的两条带或者扩增产物条带为大小分别为474bp和184bp的两条带，均判定所述待检测水稻样本含有纯和的tms5基因。
本发明中，所述ARMS-PCR的反应程序如下：94℃～98℃预变性3～10min；94℃～98℃变性30s～60s，52℃～60℃退火30s，72℃延伸45s～60s，28～35个循环；72℃延伸3～10min。
作为本发明的优选实施方式，所述ARMS-PCR的反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸5min。
本发明中，所述ARMS-PCR的20μL的反应体系包括如下组分：基因组DNA 0.5～4.0μL，DNA聚合酶Buffer 4～10μL，dNTP 0.5～2.0μL，DNA聚合酶0.1～1.0μL，第一引物0.1～0.5μL，第二引物0.1～0.5μl，第三引物0.1～0.5μl，第四引物0.1～0.5μl，ddH2O余量。
作为本发明的优选实施方式，所述ARMS-PCR的反应体系如下：基因组DNA 4.0μL，2×DNA聚合酶Buffer 10μL，dNTP 1.6μL，DNA聚合酶0.2μL，第一引物0.2μL，第二引物0.2μl，第三引物0.2μl，第四引物0.2μl，ddH2O 3.4μL。
本领域技术人员应该知晓，PCR的扩增体系和反应程序以及酶切反应的体系和程序可以根据所用DNA聚合酶、限制性内切酶不同或其它需要调整其中各组分的体积和/或用量以及各反应的温度和时间，因此，本发明所述的PCR扩增体系和反应程序以及酶切反应的体系和程序的选择包括但不限于上述扩增体系和反应程序。
进一步地，本发明还提供一种水稻温敏不育基因tms5检测试剂盒，包括本发明所述的检测引物。
所述试剂盒还包含dNTPs、DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、限制性内切酶和标准阳性模板中的一种或多种。
此外，本发明还提供所述的检测引物或所述的检测试剂盒在鉴定水稻温敏不育性状或杂交水稻种子纯度中的应用。
以及，所述的检测引物或所述的检测试剂盒在利用分子标记辅助选育水稻不育系中应用。
本发明的有益效果在于：本发明利用ARMS-PCR检测tms5基因携带的第71位碱基由C到A的功能突变，具有如下优点：
(1)本发明的检测方法可以有效地避免假阳性，能够实现tms5基因的准确鉴定以及温敏不育性状的准确高效筛选；
(2)本发明的检测方法的检测结果可以直接根据琼脂糖凝胶电泳条带进行判断，简化了检测流程；扩增引物无需荧光等标记，降低了检测成本。
附图说明
图1为实施例2中12个水稻品种检测的琼脂糖凝胶电泳图，其中，M：分子量标记；01-08：携带纯和tms5基因的温敏核不育系，株1S、陆18S、湘陵750S、华煜4127S、锦4128S、长早S、隆科638S、晶4155S；9～12：携带纯和TMS5基因的恢复系，华占、IRTA129、日本晴、9311。
图2为实施例3的株1S/6458-22的F2群体中筛选温敏雄性核不育基因tms5单株的琼脂糖凝胶电泳图，其中，M：分子量标记；01：携带纯和tms5基因的温敏核不育系株1S；02：携带纯和TMS5基因的水稻中间材料6458-22；03～27：部分株1S/6458-22的F2群体的单株检测。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；所用的水稻材料均为可从商业途径或国家种质库得到或为本领域技术人员广泛推广使用的材料。
实施例1水稻温敏核不育基因tms5的特异性ARMS-PCR检测方法的建立
1、生物信息学分析
TMS5基因开放阅读框第71个碱基由C突变为A(tms5)导致水稻在高温条件下产生不育表型。第70位碱基有G和T两种变异方式，经过生物信息学分析发现，tms5基因在第70位碱基的变异方式均为T。根据3000份水稻核心种植变异数据库(http://snp-seek.irri.org/index.zul)的序列分析发现，第70～71位碱基上下游20bp序列均不存在其他变异。2、ARMS-PCR检测引物设计
根据ARMS-PCR原理及水稻日本晴基因组数据，设计用于ARMS-PCR检测的四条引物：分别在第71位碱基上游308bp处和下游161bp处设计两条外引物，命名为第一引物(SEQID NO.1)和第二引物(SEQ ID NO.2)，根据tms5非编码链的第71位碱基T设计了第三引物(SEQ ID NO.3)，根据TMS5编码链的第71位碱基C设计了第四引物(SEQ ID NO.4)。
3、ARMS-PCR检测的反应体系和程序的建立
经筛选优化，确定扩增所用的PCR反应体系(20μL)：模板DNA4.0μL，2×GC Buffer10μL，dNTP1.6μL，rTaq酶0.2μL，第一引物0.2μL，第二引物0.2μl，第三引物0.2μl，第四引物0.2μl，ddH2O(灭菌)3.4μL。PCR反应程序：94℃预变性5min；然后执行以下循环：94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；循环结束后72℃补充延伸5min，结束反应，16℃保存。
实施例2 tms5基因ARMS-PCR检测方法在不育系和常规品种检测中的应用
2017年，将不育系株1S、陆18S、湘陵750S、华煜4127S、锦4128S、长早S、隆科638S、晶4155S以及常规品种华占、IRTA129、日本晴和9311种植于隆平高科三亚南繁基地，植株幼苗期取少量叶片提取基因组DNA。
1、基因组DNA提取
采用CTAB法提取水稻叶片DNA，具体实验方法如下：剪取新鲜水稻叶片约0.1g置于2.0ml离心管中，放入钢珠后在研磨机上研磨粉碎；向离心管中加入750μL 1.5×CTAB溶液(含1％巯基乙醇)，在65℃条件下水浴40min，每隔5min震荡1次；加入750μL三氯甲烷，将离心管至于摇床摇晃5min后，12000rpm离心10min后小心吸取上清液500μL置于另一只无菌1.5ml离心管中；加入500μL异丙醇混匀，静置20min后12000rpm离心10min；倒掉离心管中的上清液并加入500μL 70％乙醇，混匀静置20min后12000rpm离心10min，倒掉上清液加入500μL 70％乙醇，静置10min后12000rpm离心10min；弃上清，将离心管置于真空泵抽干机上，60℃条件下真空抽干20min；往离心管中加入200μL灭菌的ddH2O溶解DNA，用Nanodrop2000测定其浓度并用灭菌的ddH2O将DNA稀释至50ng/μL，经1％琼脂糖凝胶电泳检测质量合格后，用于PCR反应扩增。
2、ARMS-PCR扩增
采用如实施例1中所述的扩增反应体系和反应程序进行ARMS-PCR扩增。
配制2％的琼脂糖凝胶，向扩增产物中加入4μL 5×Loading Buffer，混匀后上样，200V电场下电泳20min，再用凝胶电泳成像仪观察并拍照记录。
3、检测结果分析
根据电泳检测结果判断获得的扩增产物的条带大小，如果扩增产物大小分别为468/474bp和184bp，判定待检测水稻样本含有纯和的tms5基因；如果扩增产物大小分别为468/474bp、329/335及184bp，判定待检测水稻样品含有杂合的tms5基因；如果扩增产物大小分别为468/474bp和329bp/335bp，判定待检测水稻样本不含有tms5基因。
根据上述分析原则，对12个水稻品种进行检测的电泳结果如图1所示，结果表明，tms5分子标记的ARMS-PCR检测方法可以准确地区分tms5和TMS5基因，根据电泳检测结果，株1S、陆18S、湘陵750S、华煜4127S、锦4128S、长早S、隆科638S、晶4155S为携带纯和tms5基因的温敏核不育系(对应电泳泳道的01-08)；华占、IRTA129、日本晴、9311为携带纯和TMS5基因的恢复系(对应电泳泳道的09-12)，通过不同表型水稻的基因型分析证实了不同品种tms5/TMS5的基因型与其对应的花粉育性相一致，证明本发明提供的tms5分子标记的ARMS-PCR检测方法能够准确鉴定tms5/TMS5基因型。
实施例3 tms5基因ARMS-PCR检测方法在温敏不育系改良F2群体检测中的应用
2017年，将水稻株1S/6458-22的F2群体种植于隆平高科三亚南繁基地。水稻叶片的基因组提取、ARMS-PCR检测、电泳分析及结果判定按照实施例2所述的方法进行。
在株1S/6458-22的F2群体中筛选温敏雄性核不育基因tms5的检测结果如图2所示，结果表明，tms5分子标记的ARMS-PCR检测方法可以较好的区分纯和的tms5、TMS5和TMS5/tms5杂合基因型。其中，泳道01为携带纯和tms5基因的温敏核不育系株1S；泳道02为携带纯和TMS5基因的水稻中间材料6458-22；泳道03～27，部分株1S/6458-22的F2群体的单株检测，其中与01带型一致的单株基因型为tms5，与02带型一致的单株基因型为TMS5，同时具有01、02带型(具有3条带)的单株基因型为TMS5/tms5杂合基因型。上述水稻植株的田间种植试验结果表明，这些检测结果与田间水稻花粉育性的表型相一致，即泳道01对应的携带tms5基因型的单株花粉表现为不育，泳道02对应的携带TMS5基因型的单株的花粉表现为可育，而泳道03～27分别对应的杂合单株的花粉均表现为可育，证明利用tms5分子标记的ARMS-PCR方法能够实现tms5基因的高效、准确检测。
虽然上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 袁隆平农业高科技股份有限公司 湖南隆平高科种业科学研究院有限公司 湖南亚华种业科学研究院
<120> 水稻温敏不育基因tms5的功能分子标记及其检测引物与应用
<130> KHP181115159.2
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaccggtaat gtcgtaagga aatg 24
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggcgtgggag atgaagagga a 21
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gccgccaccg ggtcggccga agta 24
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cggtgagggg cggcgccttc g 21

Claims (10)

1.一种水稻温敏不育基因tms5的SNP分子标记的检测引物，其特征在于，所述SNP分子标记包含第71位碱基的C/A多态性，所述检测引物包括第一引物、第二引物、第三引物和第四引物；所述第一引物和所述第二引物分别为所述第71位碱基的上下游外侧扩增引物，所述第三引物的3’末端的最后1个碱基与tms5基因非编码链的第71位碱基T互补，所述第四引物的3’末端的最后1个碱基与TMS5基因编码链的第71位碱基C互补。
2.根据权利要求1所述的检测引物，其特征在于，其核苷酸序列如下：
第一引物：SEQ ID NO.1：5’-AACCGGTAATGTCGTAAGGAAATG-3’；
第二引物：SEQ ID NO.2：5’-GGCGTGGGAGATGAAGAGGAA-3’；
第三引物：SEQ ID NO.3：5’-GCCGCCACCGGGTCGGCCGAAGTA-3’；
第四引物：SEQ ID NO.4：5’-CGGTGAGGGGCGGCGCCTTCG-3’。
3.一种水稻温敏不育基因tms5的检测方法，其特征在于，利用ARMS-PCR对tms5的SNP分子标记进行扩增，根据电泳检测扩增产物的条带分型，判断tms5基因的有无或杂/纯合；所述ARMS-PCR的引物采用如权利要求1或2所述的检测引物。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取待测水稻的基因组DNA；
(2)以待测水稻的基因组DNA为模板，利用如权利要求1或2所述的检测引物，采用ARMS-PCR进行扩增；
(3)电泳检测ARMS-PCR扩增产物，根据扩增产物的条带分型判断tms5基因的有无或杂/纯合。
5.根据权利要求3或4所述的检测方法，其特征在于，所述判断tms5基因的有无或杂/纯合的方法如下：如果扩增产物条带为大小分别为468bp/474bp和184bp的两条带，判定所述待检测水稻样本含有纯和的tms5基因；如果扩增产物条带为大小分别为468bp/474bp、329bp/335bp及184bp的三条带，判定所述待检测水稻样本含有杂合的TMS5/tms5基因；如果扩增产物条带为大小分别为468bp/474bp和329bp/335bp的两条带，判定所述待检测水稻样本不含有tms5基因。
6.根据权利要求3～5任一项所述的检测方法，其特征在于，所述ARMS-PCR的反应程序如下：94℃～98℃预变性3～10min；94℃～98℃变性30s～60s，52℃～60℃退火30s，72℃延伸45s～60s，28～35个循环；72℃延伸3～10min。
7.根据权利要求3～6任一项所述的检测方法，其特征在于，所述ARMS-PCR的20μL的反应体系包括如下组分：基因组DNA 0.5～4.0μL，DNA聚合酶Buffer 4～10μL，dNTP 0.5～2.0μL，DNA聚合酶0.1～1.0μL，第一引物0.1～0.5μL，第二引物0.1～0.5μl，第三引物0.1～0.5μl，第四引物0.1～0.5μl，ddH2O余量。
8.一种水稻温敏不育基因tms5检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的检测引物。
9.权利要求1或2所述的检测引物或权利要求8所述的检测试剂盒在鉴定水稻温敏不育性状或杂交水稻种子纯度中的应用。
10.权利要求1或2所述的检测引物或权利要求8所述的检测试剂盒在利用分子标记辅助选育水稻不育系中应用。
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