CN109971877A - 一种与水稻抗稻瘟病基因Pi2紧密连锁的分子标记R061007及应用 - Google Patents

一种与水稻抗稻瘟病基因Pi2紧密连锁的分子标记R061007及应用 Download PDF

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Abstract

一种与水稻抗稻瘟病基因Pi2紧密连锁的分子标记R061007及应用。本发明属于分子生物学领域，涉及一种分子标记，具体的，涉及一种与水稻抗稻瘟病基因Pi2紧密连锁的分子标记，该分子标记含有Seq ID No.1所示序列。本发明还涉及扩增该分子标记的引物、该分子标记和引物在水稻抗稻瘟病基因Pi2定位或水稻遗传育种中的用途，以及一种水稻育种方法。本发明公开的与水稻抗稻瘟病基因Pi2紧密连锁的分子标记、扩增引物可以对水稻抗稻瘟病基因Pi2进行良好分型，可以用于水稻抗稻瘟病的分子标记辅助育种，为实现水稻抗稻瘟病性状的早期鉴定和筛选育种提供分子辅助技术支持，对于加快水稻品种的遗传选育和改良进程具有重要的理论和实践指导意义。

Description

一种与水稻抗稻瘟病基因Pi2紧密连锁的分子标记R061007及 应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种分子标记，特别是涉及一种水稻抗稻瘟病基因Pi2紧密连锁的分子标记。本发明还涉及扩增该分子标记的引物、该分子标记和引物在水稻抗稻瘟病基因Pi2定位或水稻遗传育种中的用途。
背景技术
水稻(Oryza sativa)是我国最重要的粮食作物之一，全国水稻种植面积约占粮食作物面积的30％，产量接近粮食总产量的一半，稻谷是我国60％以上人口的主食。
稻瘟病是水稻重要病害之一，可引起大幅度减产，严重时减产40％～50％，甚至颗粒无收。稻瘟病是真菌寄生引起，稻瘟病菌主要以分生孢子和菌丝在病稻或病谷上越冬。到第二年，当温度、湿度适宜稻瘟病菌生长时，病菌就会产生大量的分生孢子，青灰色霉即是病菌的分生孢子，病害的扩展靠分生孢子在空气中传播，当分生孢子接触寄主表皮上的机动细胞后，其尖端释放的粘胶及芽胞使孢子紧密地附着在寄主上，接着分生孢子便利用自身孢子的内源营养而萌发形成发芽管，发芽管又特异性分化产生具黑色素的附着胞，附着胞产生侵染栓穿透寄主组织的角质层和表皮细胞壁，继而在寄主细胞中生长，侵染邻近表皮细胞并深入叶肉细胞，稻瘟病菌侵染水稻5～7天后出现症状，完成侵染后，被侵染的细胞又产生新的菌丝和分生孢子梗，分生孢子梗又分化出分生孢子并从病斑中释放出来，依靠气流再次传播，形成重复侵染。稻瘟病在水稻的各个时期及各部位都有发生，四叶期至分蘖期和抽穗期最易感染稻瘟病，以叶瘟和穗瘟最为常见，危害也最大。为保证水稻高产、稳产，人们主要采用两种防治技术，一是用化学防治方法，二是培育和种植抗病品种。由于化学防治成本高且污染环境，因此培育和种植抗病品种成为水稻育种的主要目标。
传统抗病育种是根据分离群体的表现和育种者的经验进行选择，通常受环境条件、显隐性关系、基因上位等因素的影响，费时、费力、不准确，从鉴定一个植物抗病种到培育出抗病良种需花费十多年时间，而病原菌一旦侵袭，其扩散速度要比育种速度快得多。
近年来生物技术的发展，尤其是分子标记技术的应用给水稻遗传育种带来了巨大变化。分子标记辅助选择(Marker Assisted Selection，MAS)为育种者提供了对目标性状进行选择的有效手段，它大大加速了育种进程，提高了育种选择效率，同时减少了盲目选择和人力、物力的大量浪费，展示出极其广阔的应用前景。
分子标记辅助选择是借助与目标基因紧密连锁的分子标记鉴定群体中是否含有目标基因个体的技术。MAS技术可以大大缩短育种选育的周期，使育种家更快获得遗传稳定的目标单株。对于粒型性状这类的数量性状而言，利用分子标记能够在育种中对有利的基因和数量性状位点(quantitative trait locus,QTLs)进行动态跟踪，可以把这些有利的QTLs聚合到目标育种材料中，从而培育出性能更加优秀的新品种。因此，开展MAS的关键在于重要性状相关QTLs的定位及相关分子标记开发。
自1923年Sasaki首次描述水稻抗稻瘟病基因以来，目前已有近百个水稻抗稻瘟病基因被鉴定。众多抗稻瘟病基因的遗传规律已基本清楚且已被初步定位。在已定位的抗稻瘟病基因中，超过半数的基因以基因簇的形式分布于水稻的不同染色体区域。
随着分子生物学和信息生物学的发展，遗传连锁图谱的构建已成为基因定位、图位克隆以及基因组结构与功能研究的重要基础。许多研究学者试图通过正向遗传学的途径对其精细定位并分离克隆。而分子标记又是构建遗传连锁图谱的基础。因此，迫切需要发现与水稻抗稻瘟病基因紧密连锁的分子标记。
发明内容
本发明的目的是提供一种与水稻抗稻瘟病基因Pi2紧密连锁的分子标记。
本发明的另一目的是提供一种可用于PCR扩增与水稻抗稻瘟病基因Pi2紧密连锁的分子标记的引物对，以及由该引物对扩增获得的分子标记。
本发明的再一目的是提供上述分子标记在水稻抗稻瘟病基因Pi2定位、检测以及水稻辅助育种中的用途以及上述分子标记的检测方法。
本发明的目的还包括提供一种包括上述分子标记的重组载体，以及含有该重组载体的重组细胞；提供一种包括使用上述分子标记的水稻抗稻瘟病基因Pi2的定位方法，和使用所述分子标记的水稻辅助育种方法。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明公开了一种与水稻抗稻瘟病基因Pi2紧密连锁的分子标记，所述分子标记含有Seq ID No.1所示核苷酸序列；优选的，所述分子标记为Seq ID No.1所示核苷酸序列。
本发明还公开了一种扩增与水稻抗稻瘟病基因Pi2紧密连锁的分子标记的引物对，所述引物对扩增的目标序列包含Seq ID No.1所示序列；
在本发明的一个实施方案中，所述引物对的引物1含有Seq ID No.2所示核苷酸序列，引物2含有Seq ID No.3所示核苷酸序列。
在本发明的另一实施方案中，所述引物1为Seq ID No.2所示核苷酸序列，所述引物2为Seq ID No.3所示核苷酸序列。
本发明还公开了一种与水稻抗稻瘟病基因Pi2紧密连锁的分子标记，所述分子标记是由上述引物对以抗稻瘟病病的水稻基因组DNA为模板经PCR扩增得到的。
优选的由上述引物对扩增得到的分子标记含有Seq ID No.1所示核苷酸序列。
在本发明的一个实施方案中，所述分子标记(含有Seq ID No.1所示核苷酸序列的DNA片段)为水稻基因组中Seq ID No.1所示核苷酸序列的DNA片段，即所包含的Seq IDNo.1的5’端和/或3’端以外的核苷酸序列也是水稻基因组中的序列，优选的，为水稻基因组中Seq ID No.1的5’端和/或3’端的上下游序列。本领域技术人员可以理解，只要扩增或者检测抗白叶病的水稻基因组DNA中的该分子标记，必然能够检测或扩增得到含有Seq IDNo.1所示的序列。Seq ID No.1的5’端和/或3’端的上下游序列的长度为适当长度，并不特别限定，例如，满足分子标记的长度小于10,000bp、小于5,000bp、小于2,000bp、小于1,500bp、小于1,200bp、小于1,000bp、小于800bp、或者小于500bp。
在本发明的一个实施方案中，所述分子标记(含有Seq ID No.1所示核苷酸序列的DNA片段)所包含的Seq ID No.1的5’端和/或3’端可操作地连接有人工序列和/或控制序列，例如启动子、增强子、终止子、酶切位点、引物序列等等。其中，术语“可操作地”在本发明中定义为一种如下构象，在该构象中，控制序列例如启动子被适当地置于Seq ID No.1的一个位置上，以致该控制序列指导Seq ID No.1编码的多肽的产生。
本发明还公开了一种载体，其含有本发明的分子标记。所述载体可以是插入有本发明的分子标记的表达重组载体或者克隆重组载体。获得上述重组载体后，本领域技术人员可以理解，根据不同的需要，将重组载体转化到合适的细胞中，得到含有该重组载体的重组细胞。因此，本发明还公开了一种含有所述重组载体的重组细胞。
本发明还公开了本发明的分子标记的制备方法，包括下述步骤：使用抗稻瘟病病的水稻基因组DNA作为模板，以上述引物对进行PCR扩增，得到的扩增产物即含有所述分子标记；优选地，还包括将PCR扩增产物进行纯化的步骤。
对本领域技术人员而言，可以理解，也可以DNA化学合成的方法得到本发明的分子标记。
本发明还公开了本发明的分子标记的检测方法，包括步骤：根据上述分子标记的核苷酸序列设计引物，以被检测水稻基因组DNA为模板进行扩增，并判断扩增产物中是否存在该分子标记。优选的，所述引物为上述分别含有Seq ID No.2和Seq ID No.3的引物对。
例如，可以以被检测水稻的基因组DNA为模板，以上述引物(Seq ID No.2和Seq IDNo.3)进行PCR扩增，得到扩增产物。可以将得到的扩增产物进行测序或者凝胶电泳。
本发明还公开所述分子标记或者所述分子标记引物对在水稻抗稻瘟病基因Pi2定位或检测中的用途。
本发明还公开了一种水稻抗稻瘟病基因Pi2定位的方法，所述方法包括使用本发明的分子标记或分子标记引物对的步骤。
本发明还公开了所述的分子标记或者所述分子标记引物对在水稻辅助育种中的用途。
本发明还公开了一种水稻辅助育种方法，所述方法包括检测本发明的分子标记或用本发明的分子标记引物对进行检测的步骤。
本发明的分子标记可用于今后的分子标记辅助育种中，本领域技术人员可以理解，比如通过检测是否存在本发明的分子标记来筛选水稻是否含有抗稻瘟病病基因。所述检测可以是PCR检测的方法，具体地，可以使用上述的本发明的分子标记的引物对。所述检测还可以通过测序方法进行。该水稻辅助育种方法具有简便、快速、高通量的优点。
由于采用以上技术方案，使本发明具备的有益效果在于：
本发明提供了与水稻抗稻瘟病基因Pi2紧密连锁的分子标记，该分子标记将基因组DNA序列与水稻抗稻瘟病基因Pi2联系起来，有利于水稻分子标记辅助育种体系的建立；所述分子标记与水稻抗稻瘟病基因Pi2的遗传紧密连锁距离为0.67cM。本发明的分子标记及分子标记扩增引物可以简便、快速、高通量地应用于水稻育种实践和资源及品种鉴定。
发明的有益效果
本发明提供了与水稻抗稻瘟病基因Pi2紧密连锁的分子标记，有利于水稻分子标记辅助育种体系的建立；所述的分子标记与抗稻瘟病基因Pi2的遗传紧密连锁距离为0.67cM，可以简便、快速、高通量地应用于水稻分子辅助育种。
附图说明
图1为分子标记引物SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3对父本、母本及杂交F1代扩增片段琼脂糖凝胶电泳图。
图2为分子标记引物SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3对部分杂交F2代扩增片段琼脂糖凝胶电泳图
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1、水稻遗传群体的构建
父本为籼型不育系GD-7S，抗性表现为广谱高抗稻瘟病。
母本为籼稻光温敏不育系Y58S，抗性表现为不抗稻瘟病(该品种属籼型两用核不育系)。
父本冷灌返育得到花粉，用父本花粉和母本杂交得到F1(抗性表现为广谱高抗稻瘟病)。
F1代自交产生F2代群体，共得到196个单株。将F2群体种植在自然诱发鉴定的抗性鉴定苗圃中，田间偏施氮肥，使鉴定材料保持常青状态利于病菌发生，整个生育期保持淹水状态管理。稻瘟病抗性鉴定标准，参照国家水稻区域试验的方法进行：分蘖盛期对抗性鉴定此材料逐株进行叶瘟发病病级调查，然后求加权平均值即为发病等级；水稻收获前1周进行穗瘟发病率及损失率调查并分级。然后根据稻瘟病抗性评价综合指数对其进行综合评价。记录表型调查数据。
表型数据显示：在196个F2后代中，其中155个个体植株未感染稻瘟病，具有稻瘟病抗性性状；另外41个个体植株感染了稻瘟病，不具有稻瘟病抗性。经卡方检测可知，F2稻瘟病抗性性状分离比为3:1，符合单基因控制性状的孟德尔遗传规律，可知在此群体中稻瘟病抗性是显性单基因控制质量性状。
表1水稻F2群体稻瘟病抗性分离比例
2、父母本以及F1代、F2代个体基因组DNA的提取
用改良的CTAB法分别提取父母本、F1代和上一步中获得的196个水稻F2单株的基因组DNA，具体方法如下：
(1)取样：称取1.0g幼嫩的叶片，置于2ml离心管中。
(2)样品冷冻抽干：将取好的样品加研磨珠，打开管盖，放入真空冷冻抽干机中，-50℃条件下持续冷冻抽干12小时以上(一般冷冻抽干过夜)。
(3)样品研磨：将冷冻抽干的样品置于高通量机械研磨仪中，启动程序研磨，将样品粉碎。
(4)样品研磨充分后，在管内加入65℃预热1h的CTAB提取液，混匀，65℃水浴40分钟，期间每隔5分钟颠倒混匀一次。
(5)将水浴后的样品从水浴锅内拿出，冷却至室温后，加入与CTAB等体积的氯仿(三氯甲烷/异戊醇按照24:1比例混合)，轻轻混匀10分钟，至下层液体变为深绿色。(本步骤需在通风厨内操作)
(6)混匀后将离心管转入高速离心机内离心，转速12000rpm，离心15分钟。离心后样品上层为清夜。
(7)抽取适量的上清液于1.5ml离心管中，并加等体积的异丙醇，轻轻混匀(此时可以看到有絮状沉淀析出)，然后将样品置于-20℃的冰柜30分钟，以沉淀DNA。
(8)样品冷冻30分钟后转移至高速离心机内离心，转速12000rmp，离心10分钟。
(9)弃掉清夜，DNA沉淀用75％乙醇洗涤2次，洗涤后将乙醇倒掉，敞开管口放置于通风厨内晾干。
(10)待乙醇完全挥发后，加入50微升TE缓冲液(加RNA酶)溶解DNA，并于-20℃保存。
3、遗传图谱构建和基因定位
(1)遗传图谱构建针对步骤2中获得的F2代个体的基因组DNA，基于RAD-seq的基因分型技术对F2群体的个体进行基因分型，获得F2群体的基因型数据。
用MapMaker 3.0软件(Constructing genetic maps with MAPMAKER/EXP 3.0，SLincoln，M Daly，E Lander-Cambridge，MA:Whitehead Institute,1992)进行遗传连锁图谱绘制，得到遗传连锁图。
(2)基因定位根据步骤1获得的F2群体的表型数据，结合群体基因型以及遗传连锁图，通过WinQTLCart 2.5软件进行QTL定位。结果显示，其中一个水稻抗稻瘟病基因定位在6号染色体10072720至10073657区间内，长度约937bp。
4、分子标记的开发根据RAD-seq的测序结果，利用华大自主开发的SOAP软件比对测序reads，然后用SOAPsv寻找片段差异较大的分子标记，便于用凝胶电泳区分鉴别。选择靠近抗稻瘟病Pi2基因所在区段的标记R061007作为候选。所述分子标记表现为SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的插入/缺失长度多态性。
5、分子标记的制备
针对上述确定的与水稻稻瘟病抗性基因紧密连锁的分子标记R061007设计引物，R061007的引物序列如下：
R061007-F：TTACTACCATGCACACGCAT(SEQ ID NO：2)
R061007-R：AAGGTTGGAGTGCAATGGTT(SEQ ID NO：3)
以提取的父母本、F1代、及F2代的基因组DNA为模板，以分子标记引物(SEQ ID NO:2)和(SEQ ID NO:3)进行PCR扩增。
a.PCR反应体系：
b.扩增程序：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，运行35个循环；最后72℃延伸3分钟，PCR扩增产物在4℃保存；6、与水稻抗稻瘟病紧密连锁的分子标记的验证经上述扩增过程得到分子标记，然后通过琼脂糖凝胶电泳检测，得到多态性电泳条带，结果如附图所示。
图1为分子标记引物SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3对父本、母本及杂交F1代扩增片段琼脂糖凝胶电泳图，如图1所示，父本扩增片段约为1100bp，母本扩增片段约为600bp，杂交F1代同时含有这两个扩增片段。图2为分子标记引物SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3对部分F2代替扩增片段琼脂糖凝胶电泳图，凡是扩增条带为1100bp或者同时含有两个扩增片段的个体，其植株具有稻瘟病抗性；凡扩增条带为600bp的个体，其植株不具有稻瘟病抗性。并且经测序证明该1100bp的核苷酸序列与SEQ ID NO:1相同。
1.由于父母本在稻瘟病抗性上有明显的差异(父本广谱抗病，母本低抗稻瘟病)，对F2个体进行性状分析，并根据性状和marker之间的连锁关系将源自于父本的抗病基因定位在遗传图谱上。
可见，本发明的分子标记(SEQ ID NO:1)为与水稻抗拿捕净除草剂基因紧密连锁的分子标记。由此证明该分子标记R061007(SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列)在父母本之间具有多态性，并与抗稻瘟病性状紧密连锁。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 深圳市华大农业应用研究院
深圳华大生命科学研究院
中国农业科学院深圳生物育种创新研究院
<120> 与水稻稻瘟病抗性基因Pi2紧密连锁的分子标记R061007
<130> P2018-1-0115.CN
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 518
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 1
atcggcaatc tacaagatag caggaacaat tctatccaaa aggttttctc cctaggttca 60
catatttaga gattggggca aaaacatgat gaaccaaaag agaagatcaa aagagctacc 120
ttgatagagg aaatcgcaaa tcaatcgcgg gatgaacctc ctagccacca atgtggttga 180
ttccatgtag aggaatcaaa attccatgga tgaaacaaga aatcgccgag atgatcactg 240
tagcggcggc tagggtttgg aatcggggtg gggaagaagt gtggagagag gtgtttgatg 300
aaaataaaat aacgaacaca cagaaaatag ggaaatactg tattttatta atcatgattc 360
attaacatga atgtttacaa aatacaagat aggcttccac aggagtttgc cttttgtctt 420
cgtggggaat gcttaataga aaggtatgct gactggagat tgcgtgcagt ccgctgattc 480
ccggtgccta gcaatgaggc taccggttaa ttacattc 518
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 2
ttactaccat gcacacgcat 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 3
aaggttggag tgcaatggtt 20

Claims (10)

1.一种与水稻抗稻瘟病基因Pi2紧密连锁的分子标记，其特征在于：所述分子标记含有Seq ID No.1所示核苷酸序列；优选的，所述分子标记为Seq ID No.1所示核苷酸序列。
2.一种可用于扩增与水稻抗稻瘟病基因Pi2紧密连锁的分子标记的引物对，其特征在于扩增的目标序列包含Seq ID No.1所示序列；优选的，所述引物对的引物1包含Seq IDNo.2所示序列，引物2包含Seq ID No.3所示序列；更优选的，引物1为Seq ID No.2所示序列，引物2为Seq ID No.3所示序列。
3.一种与水稻抗稻瘟病基因Pi2紧密连锁的分子标记，其特征在于：所述分子标记是由权利要求2所述的引物对以抗稻瘟病病的水稻基因组DNA为模板经PCR扩增得到的。
4.根据权利要求3所述的分子标记，其特征在于：所述分子标记含有Seq ID No.1所示核苷酸序列；优选的，所述分子标记为Seq ID No.1所示核苷酸序列。
5.一种载体，其特征在于：含有权利要求1、3、4中任一项所述的分子标记。
6.一种重组细胞，其特征在于：含有权利要求5所述的载体。
7.权利要求1所述的分子标记的检测方法，包括步骤：根据权利要求1的分子标记的核苷酸序列设计引物，以被检测水稻基因组DNA为模板进行扩增，并判断扩增产物中是否存在该分子标记；优选的，所述引物为权利要求2所述的引物对。
8.权利要求1、3、4中任一项所述的分子标记或权利要求2的分子标记引物对在水稻辅助育种或者水稻抗稻瘟病基因Pi2定位或检测中的用途。
9.一种水稻抗稻瘟病基因Pi2定位的方法，其特征在于：所述方法包括使用权利要求1、3、4中任一项所述的分子标记或权利要求2的分子标记引物对的步骤。
10.一种水稻辅助育种方法，其特征在于：所述方法包括检测权利要求1、3、4中任一项所述的分子标记或用权利要求2的分子标记引物对进行检测的步骤。
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