CN101333533A - 一种温敏雄性育性基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种温敏雄性育性基因及其应用，还公开了上述温敏雄性育性基因的遗传标记，提供了上述温敏雄性育性基因所编码的蛋白质和含有上述温敏雄性育性基因的载体及重组微生物。本发明还公开了上述温敏雄性育性基因在培育温敏雄性不育系中的应用和上述遗传标记在水稻育种中的应用。本发明通过图位克隆技术安农S－1温敏不育基因座tms5获得了温敏育性基因TSSNR，通过转基因实验验证了此基因的功能，并提出了RNAi或反义RNA或过表达负显性原理的转基因技术，可使正常水稻品种中的TSSRZ基因功能丧失，培育温敏雄性不育系，具有重要的应用价值。

Description

一种温敏雄性育性基因及其应用

技术领域

本发明涉及一种温敏雄性育性基因及其应用，属于基因工程领域。

背景技术

植物通过不同品种间的杂交产生杂种。杂种在生长势、适应性、产量等方面具有优势，称为杂种优势。利用杂种优势可以提高农作物的产量、品质和抗性。水稻育种利用杂种优势的途径主要是通过杂交水稻育种，而杂交水稻育种的方式主要有两系法和三系法。三系法育种需要不育系、保持系和恢复系，而两系法只需要不育系和恢复系。两系法中的不育系具有育性转换的特点，其雄性的不育或可育受控于外界的光周期和温度条件，不育系在不同光温条件下可以作为保持系。与三系法相比，两系法具有三大优越性：一是不育系一系两用，不需要保持系，简化了种子生产程序，减少了生产环节和不育系繁殖面积，降低了种子成本；二是配组自由，绝大多数常规品种都可成为恢复系，扩大了杂种优势利用的种质范围，大大提高了选到优良组合的概率；三是不育系的不育性遗传行为简单，较容易转育到其他性状优良的水稻品种(系)中，有利于改良品质、抗性等性状，同时其不育性受细胞核控制，从而避免了细胞质不育对杂种优势的负效应，以及因细胞质单一化而导致某种毁灭性病虫害爆发的潜在威胁(袁隆平，1987)。

目前，在水稻两系法中应用的不育系主要有光敏不育系和温敏不育系。光敏不育系的花粉育性主要受日照长度的控制，在长日照的条件下，水稻花粉表现为不育，而在短日照条件下，花粉可育；温敏不育系的花粉育性主要受环境温度控制。当环境温度高于某一温度时，水稻花粉表现为不育，而当环境温度低于某一温度时，表现为可育。已发现并定位的光敏不育基因有3个，分别是pms1(Zhang等1994，Proc Natl Acad SciU S A.91：8675-9)、pms2(Zhang等1994，Proc Natl Acad Sci U S A.91：8675-9；Liu等2001，Mol Genet Genomics 266：271-5)和pms3(Mei等1999，Sci China(Ser C)42：316-322；Li等2001，Euphytica119：343-348；Li等2002，Acta Agron Sin 28：310-314；Lu等2005，MolGenet Genomics 273：507-11)。已发现并定位的温敏不育基因共有8个，分别是tms1(Wang等1995，Theor Appl Genet 91：1111-1114)，tms2(Yamaguchi等1997，Breed Sci 47：371-373)，tms3(Subudhi等1997，Genome 40：188-194)，tms4(Dong等2000，Theor Appl Genet 100：727-734)，tms5(Wang等2003，Theor Appl Genet 107：917-921；Jiang等2006，Chinese Science Bulletin 51：417-420；Yang等2007，Planta 225：321-30)，tms6(Lee等2005，Theor Appl Genet 111：1271-1277)，rtms1(Jia等2001，Theor Appl Genet 103：607-612)和Ms-h(Koh等1999，Euphytica106：57-62)。

温敏不育系安农S-1是从安农中发现的自然突变体，其温敏不育性是受一对隐性核基因所控制，其育性转换主要受温度控制，转换温度的起始点为25℃，即环境温度高于25℃时，其花粉表现为不育，而环境温度低于25℃时，表现为可育(邓华凤等，1999)。安农S-1是目前在两系法育种中广泛应用的两个温敏不育基因之一，以安农S-1为温敏不育基因的供体，已培养多个温敏不育系，广泛应用于水稻育种中。安农S-1所携带的温敏不育基因座为tms5，已定位于第二染色体(Wang等2003，Theor Appl Genet 107：917-921；Jiang等2006，Chinese ScienceBulletin 51：417-420；Jiang等2006，Chinese Science Bulletin 51：417-420；Yang等2007，Planta 225：321-30)。目前尚未有水稻温敏不育基因tms5被分离克隆的报道，安农S-1温敏不育的分子基础还不清楚，已有技术还不能明确和分离克隆温敏不育基因tms5，不能更好地选育水稻。

发明内容

本发明通过图位克隆(map-based cloning)技术安农S-1温敏不育基因座tms5获得了温敏育性基因TSSNR，通过转基因实验验证了此基因的功能，并提出了RNAi(RNAinterference，RNAi)或反义RNA(anti-senseRNA)或过表达负显性(dominant negative，DN)原理的转基因技术，可使正常水稻品种中的TSSRZ基因功能丧失，培育温敏雄性不育系。

本发明为克服已有技术的不足，目的在于提供一种温敏雄性育性基因。

本发明的另一个目的是提供上述温敏雄性育性基因的遗传标记。

本发明的另一个目的是提供上述温敏雄性育性基因所编码的蛋白质。

本发明的另一个目的是提供含有上述温敏雄性育性基因的载体。

本发明的另一个目的在于提供含有温敏雄性育性基因的重组微生物。

本发明的另一个目的是提供上述温敏雄性育性基因在培育温敏雄性不育系中的应用。

本发明的另一个目的是提供上述遗传标记在水稻育种中的应用。

本发明通过以下技术方案实现上述目的。

一种温敏雄性育性基因，其核苷酸序列如如SEQ ID No.1或SEQ IDNo.4。

上述温敏雄性育性基因的遗传标记，确定第71位的碱基C突变为A。

含有上述温敏雄性育性基因所编码的蛋白质，序列为SEQ ID No.2或SEQ ID No.5，或替换、减少或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。

含有上述温敏雄性育性基因的载体。所述的载体包括含有所述核苷酸序列或其片段的克隆载体或表达载体。

含有温敏雄性育性基因的重组微生物。所述的重组微生物是含有所述载体的细菌细胞、含有所述核苷酸序列或其片段的转化的植物细胞。

上述温敏雄性育性基因在培育植物温敏不育系中的应用。所述温敏不育系可以是温敏雄性不育系。

上述遗传标记在水稻育种中的应用。

本发明首先采用分子标记的方法完成安农S-1温敏不育基因的精细定位，将安农S-1温敏不育基因定位于8.4kb的区域，根据已测定的水稻基因组的序列，该区域只有3个编码蛋白的基因。根据水稻基因组测序的结果，设计引物采用PCR的方法扩增正常品种安农和温敏不育系安农S-1的这3个基因的基因组全序列(包括启动子和编码区的序列)，将扩增的序列进行测序。比较安农N和安农S-1的这3个基因的全基因组序列，发现只有一个编码核酸酶Z(nuclear ribonuclease Z，简称为RNase Z或RZ)的基因在安农N和安农S-1间有差异，即安农S-1中编码区的第71位核苷酸由C突变为A，导致第24位的密码子由TCG突变为终止密码子TAG。用PCR方法，从正常品种安农中扩增RZ基因的基因组全序列克隆到植物转化载体，将该载体用农杆菌介导的方法转化安农S-1转育的温敏不育系，T₀代时，被转化的温敏不育系即使在高温条件其花粉育性恢复正常，在T₁代中不同单株的花粉育性在高温条件下出现分离，即含有转基因的单株花粉育性正常，而不含转基因的单株花粉不育。同时，采用RNA干扰(RNAinterference，RNAi)的方法降低正常品种中RZ基因的表达，在T₀代中RZ基因的表达量下降，导致正常品种的花粉育性转变为高温(28-35℃)不育和适温(19-24℃)可育。在T₁代中不同单株在高温下出现花粉育性分离，含有转基因的单株，表现为温敏雄性不育，而不含转基因的单株表现雄性育性正常。为了检验这种机制的普遍性，同样采用RNA干扰的方法降低拟南芥中RZ同源基因NUZ(核苷酸水平同源性为67％)的表达，导致拟南芥的花粉育性在高温条件下不育，而在适温条件下花粉可育，同样表现为温敏雄性不育。这些结果说明突变的RZ基因是温敏不育基因，将该基因命名为temperature-sensitive sterile RZ，其野生型和突变型分别简称为TSSRZ(SEQ ID NO：1)和tssrz(SEQ ID NO：3)。TSSRZ及其在其它植物的同源基因如双子叶模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)的同源基因序列NUZ(SEQ ID NO：4)的表达抑制或其功能缺失突变型表达异常的蛋白，能导致植物温敏雄性不育。

与已有技术相比，本发明的具有以下有益效果：(1)阐明了安农S-1的温敏不育的分子机理，获得了安农S-1温敏不育基因tms5；(2)本发明提供的温敏育性基因具有重要的应用价值，是根据所述基因序列信息产生特异性的分子标记或其紧密连锁标记，包括但不限于SNP(单核苷酸多态)、InDel(插入缺失多态)、RFLP(限制性内切酶长度多态)、CAP(切割扩增片段多态)，用这些标记可鉴定水稻或野生稻或杂交后代植株的基因型，用于分子标记辅助选择育种，从而提高育种的选择效率；同时利用已阐明的温敏不育的分子机理培育植物温敏雄性不育系，即利用RNAi或反义RNA(anti-sense RNA)或过表达负显性(dominant negative，DN)原理的转基因技术使正常水稻品种中的TSSRZ基因和其它植物的TSSRZ同源基因的功能丧失，实现培育温敏雄性不育系的方法。

附图说明

图1是实施例1水稻温敏不育基因座tms5的染色体连锁定位图。

图2是实施例2正常水稻品种安农N的TSSRZ(RA-ANcDNA)和温敏不育系安农S-1的tssrz(RA-AScDNA)编码区的差异示意图。

图3和图4是实施例2用反转录PCR技术检测温敏不育基因TSSRZ在幼穗的表达，其中图3为TSSRZ RT-PCR扩增的结果图；图4为actinRT-PCR扩增的结果图。两图中，1为花粉母细胞时期穗，2为减数分裂时期穗，3为小孢子早期穗，4为小孢子晚期穗。

图5和图6是实施例3将正常水稻品种(中化11)中的TSSRZ基因导入安农S-1，获得的T0转化体在高温(28-35℃)下的花粉恢复可育的照片。其中图5为未导入TSSRZ基因的安农S-1在高温(28-35℃)下花粉的育性照片；图6为导入TSSRZ基因的安农S-1在高温(28-35℃)下花粉的育性照片。

图7为实施例4利用RNAi技术抑制水稻品种中化11的TSSRZ表达后，在高温(28-35℃)条件下产生不育的照片。

图8为实施例4利用RNAi技术抑制水稻品种中化11的TSSRZ表达在适温(19-24℃)下表现花粉可育的照片。

图9和图10所示为实施例4利用RNAi技术抑制水稻品种中化11的TSSRZ表达。图9为用TSSRZ作为探针Northern杂交的结果图，显示RNAi转化系中TSSRZ表达水平明显下降，图10为总RNA电泳结果图。图中CK为未转化的中花11，1和2分别为RNAi转化株系，

图11和图12所示是实施例5利用RNAi技术抑制拟南芥(哥伦比亚生态型)的同源基因NUZ的表达。其中，图11为用拟南芥TSSRZ作为探针Northern杂交的结果图，图12为总RNA电泳结果图。图中CK为未转化的拟南芥(哥伦比亚生态型)，1为RNAi转化株系。

图13和图14为实施例5利用RNAi技术抑制拟南芥的同源基因NUZ的表达后，不同温度条件下花粉萌发的结果。其中，图11为适温(25℃)下花粉可以萌发的照片；图12为高温(30℃)条件下的花粉不能萌发的照片。

图15所示为实施例6用SNP标记RA1鉴定正常水稻品种安农N(AN)和温敏不育系安农S-1(AS)的温敏育性基因的基因型，图中RANR和RASR分别为TSSRZ和tssrz的特异引物。

具体实施方式

实施例1 tms5的精细定位(多态性分子标记的筛选和tms5基因的连锁定位)

根据公开的水稻基因组序列数据库的资料(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，在该区域发展了多个分子标记，如表1所示：

表1与tms5紧密连锁或共分离的多态性分子标记

表1中的AN1、PL1和NAC1为插入/缺失(InDel)标记；RA1为单核苷酸多态性(SNP)标记。SNP标记的检测方法为：第1次PCR用引物“RA1F”与“RA1R”扩增33个循环，然后取0.5μl PCR产物为第2次PCR的模板，每个样品配制2个反应，即用引物“RA1F”与“RASR”为温敏不育基因型的特异反应，用引物“RA1F”与“RANR”为野生基因型的特异反应，扩增8-10个循环，用6％聚丙烯酰胺凝胶检测PCR产物，见13和图14。

分子标记与目标恢复基因的重组事件越多，表示两者的遗传距离越远，反之其遗传距离越近。利用这种遗传作图的方法和安农S-1与粳籼89杂交的6000多株F₂植株构建了一个tms5基因的遗传连锁图，见图1。图中2个标记ANIDL76和DLNAC1与tms5之间分别只有1个重组事件和3个重组事件，而标记IDLPL与tms5基因是零重组即共分离。ANIDL76和DLNAC1之间的物理距离约为8.4kb。所述的定位区域位于已公开的水稻细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome，BAC)OJ1006_D05(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的约36-45kb处。

实施例2tms5的克隆与序列分析

根据GenBank公开的水稻(粳稻)基因组DNA序列和RiceGAAS软件(http://ricegaas.dna.affrc.go.jp)分析，在定位的8.4kb区域内只存在2个预测的基因，这2个基因分别是果胶裂解酶(Pectate lyase，简称为PL)和核酸酶Z(RNase Z，简称为RZ)。其中果胶裂解酶基因编码1个446氨基酸的蛋白质，而核酸酶Z基因编码1个302氨基酸的蛋白质。

使用引物PLf(5’-CTCCTCTCGATGCACTCATG-3’)与PLr(5’-GATAGCATGACATGGCATTG-3’)和RZf(5’-CACGTCGTCAACAACGACTAC-3’)与RZr(5’-CCTGTTAACCGGTIGAGGTG-3’)从正常品种安农N和温敏不育系安农S-1用PCR技术扩增出PL和RZ基因组全序列(包括启动子与编码区)，克隆到质粒载体pUC18。经测序分析，发现PL的DNA序列在安农N和安农S-1之间没有差异，而RZ的DNA序列在安农N和安农S-1之间只有1个核苷酸的差异。并通过测定安农S-1和正常品种间RZ基因的cDNA序列，发现此核苷酸的变异发生在安农S-1的编码区的第71位，即由C突变为A，结果导致密码子由TCG(Ser)突变为终止密码TAG，产生一个只编码23个氨基酸的截断短肽，见图2。用反转录PCR技术检测到RZ基因在花粉母细胞时期的幼穗表达，其它时期的幼穗不表达，见图3和图4。因此，此突变的RZ基因可能是产生温敏不育的基因。

实施例3遗传转化鉴定目标基因的功能

用引物RZf(5’-GTTCGGTGTGTGAAGGGGTG-3’)与RZr(5’-CCTGTTAACCGGTTGAGGTG-3’)将从安农N扩增的4kb的RZ基因片段(包含启动子区、编码区、及其下游区序列)克隆到双元转化载体pCAMBIA1300。用电激法将该表达载体导入常用的土壤根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105。通过根癌农杆菌介导法(Hiei等，Plant J.6：271-282)转化由安农S-1转育的温敏不育系，获得T₀代转基因植株。经分子检测，获得含有外源基因的转化体，这些转化体在高温条件下(28-35℃)花粉育性正常，见图5和图6。

收获T₀代种子，种植T₁代，在高温条件下(28-35℃)T1代花粉育性出现分离，即含有转基因的植株花粉可育，而不含转基因的植株花粉败育。这些结果证明了突变的RZ是温敏不育基因。本发明将此基因的野生型和突变型分别命名为TSSRZ和tssrz(temperature-sensitive sterile RZ)。

实施例4用RNAi技术抑制TSSRZ基因的表达产生温敏不育转化体

植物转化RNAi载体的构建按公开的载体和方法(胡旭霞和刘耀光，植物分子育种，4：1-6)进行，此RNAi载体由组成型的玉米泛素基因启动子控制目的双链RNA  的产生。用引物RAZif(5’-aaaaAAGCTTcatggaccagtccgagctc-3’)和RAZir(5’-aaaaGAATTCgtcacactgattcagtatctc-3’)对花粉母细胞时期的幼穗cDNA进行扩增。将扩增得到的TSSRZ的cDNA片段用BamH I和Hind III进行双酶切，连接到pRNAi-ubi载体(胡旭霞和刘耀光，植物分子育种，4：1-6)的第一克隆位点。用电激法转化大肠杆菌Top10F’，再用pRNAi-ubi载体通用引物RNAi-Mlu(5’-CACCCTGACGCGTGGTGTTACTTCTG AAGAGG-3’)和RNAi-Pst(5’-ACTAGAACTGCAGCCTCAGATCTAC CATGGTTC G-3’)对克隆的目的片段进行PCR扩增，获得末端含有Mlu I和Pst I酶切位点的目的片段。将目的片段用Mlu I和Pst I酶切，克隆到第一轮阳性载体(也用同样的酶切好)的第二克隆位点，然后将其转化大肠杆菌DH10B。将构建好的RNAi载体电击转化到农杆菌EHA105，用根癌农杆菌介导法(Hiei等，Plant J.6：271-282)转化正常可育水稻品种中花11，经筛选获得了含有转基因的24株T₀代体。将每个T₀转化体的分蘖分开种植，在生殖发育对温度敏感的花粉母细胞时期进行高温处理(28-35℃)和适温(19-24℃)处理7天。结果高温处理的产生败育花粉且花粉量很少，而经适温处理的可育花粉量达50％以上，结果见图7和图8。适温处理的T₀转化体能结实获得T₁植株。再次对T₁植株进行花粉母细胞发育时期的高温处理(28-35℃)7天。结果T₁植株的花粉育性出现分离，即含有RNAi转基因的单株花粉败育，而不含RNAi转基因的单株花粉可育。RT-PCR检测结果表明，携带RNAi转基因的T₁转化体的TSSRZ表达受到抑制，见图9和图10。这些结果说明抑制TSSRZ基因的表达产生温敏不育。

实施例5拟南芥TMS5同源基因RNAi载体构建及转化后代分析

用TSSRZ基因序列对生物数据库进行同源性搜索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，获得双子叶模式植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)的同源基因序列NUZ(SEQ ID NO：3)。利用NUZ特异引物NUZif(5’-aaaaAAGCTTcacatggatcatatcggtgg-3’)和NUZir(5’aaaaGGATCCtccttcactgtataccgagc3’)PCR扩增拟南芥花的cDNA。将扩增得到的目的片段用BamH I和Hind III进行双酶切。按实施例4相同的方法步骤构建RNAi载体。将构建好的RNAi载体电击转化到农杆菌EHA105，用花器官浸泡法(Clough and Ben t 1998，Plant J.16，735-743)转化拟南芥(哥伦比亚生态型)，收获的T₀代拟南芥种子均匀播种在含有潮霉素的培养基上，在筛选培养基上萌发并存活的植株即为T₁代阳性植株。在T₁植株生长到到抽苔后的花粉母细胞发育时期，部分植株进行高温(28-35℃)处理7天，部分植株进行适温(19-24℃)处理。结果高温处理的植株产生花粉败育，适温处理的植株花粉可育，见图11和图12。经适温处理的T₁植株获得T₂代种子。再次在T₂植株抽苔后的花粉母细胞发育时期进行高温条件处理，结果T₂植株得花粉育性出现分离，含有RNAi转基因的植株花粉败育，而不含转基因的植株花粉可育。RT-PCR检测结果表明，携带RNAi转基因的T₂转化体的NUZ表达受到抑制，见图13和图14。这些结果说明，采用基因工程方法抑制TSSRZ或其同源基因得表达，或筛选这些基因的自然突变或人工诱变突变体，可以在单子叶植物和双子叶植物培育温敏雄性不育系，用于杂交种子生产。

实施例6温敏不育基因序列在分子标记辅助选择育种中的应用

利用本发明提供的序列信息可以产生水稻温敏不育基因tssrz及其紧密连锁的分子标记，用于鉴定水稻tms5位点的基因型，可在分子标记辅助选择育种中应用。例如，表1所示的标记RA1可用于鉴定水稻正常可育株和温敏不育株的基因型，结果见图15，即某个品种用“RA1F”与“RASR”引物组合可以扩增出特异的条带，而用“RA1F”与“RANR”引物组合不能扩增出特异的条带，该品种为温敏不育系；相反即某个品种用“RA1F”与“RASR”引物组合不能扩增出特异的条带，而用“RA1F”与“RANR”引物组合可以扩增出特异的条带，该品种不是温敏不育系。

序列表

<110>华南农业大学

<120>一种温敏雄性育性基因及其应用

<130>

<160>5

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>4070

<212>DNA

<213>正常水稻品种安农N(Oryza Sativa)

<220>

<221>CDS

<222>(2006)..(2485)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(2591)..(2686)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(2797)..(2910)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(3288)..(3356)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(3455)..(3529)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(3826)..(3900)

<223>

<400>1

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ctccaccacc gcgccgccac cgggtcggcc gaagtcgaag gcgccgcccc tcaccgtcga  2100

gggctacccc gtggagggca tctccatcgg cgggcaggag acctgcgtca tcttcccgac  2160

gctgagcgcc gccttcgaca tcggccggtg cccgcagcgc gccgtctcgc aggagttcct  2220

cttcatctcc cacgcccacc tcgaccacat cggcggcctc cccatgtacg tcgccacccg  2280

gggcctctac cggcagcgcc cgcccaccat cttcatcccc gcctgcctca gggaccccgt  2340

ggagcgcctc ttcgagctcc accgctccat ggaccagtcc gagctcagcc acaacctcgt  2400

ccccctcgag attggtcagg agcacgagct caggagggac ctcaaagtga aggccttcaa  2460

gacctaccac gccattccca gccaggtgaa gggttcatca gttcttggtt cttctggatg  2520

aattattctt gattgattga tttggtcgga aatgtgtggt gaatttggtt gagatgtgat  2581

gtgattgtag gggtatgtga tatacacggt gaagcaaaag ctcaagccag agtatcttgg  2640

cctccctggg agcgagatca agcagctgaa gctgtcaggt gtggaggtct gttgttgttt  2700

tttttttttt tttgatattg tggatgtctg gatgaaatgg aatacaattc acaatttagt  2760

gatgttgttg atgctgtgcg tggttctgtt tttcagatta cgaatacatt gacggtgcct  2820

gagattgctt ttaccggaga tacgatggca gatttcattc ttgatcctga taatgcggat  2880

gttttgaagg cgaaaattct tgtagtggag gtattgcttc ttatcgtcta tatggttaat  2940

ttgttgtcaa ttgtcattgt tgctattcag cctgagaaaa aaaaaagagg gaaactgttt  3000

cttcaagcac ggatatcagt atattaccaa gattaatttt atcaacagaa ggaaaagcaa  3060

cagcctttgc ttttcaggag agattgattc caactccata ttaactgata actgagtacc  3120

attttttcaa actaaaacct ttgcggaacc aattggcagc aattagtggg aactatgttg  3180

cctgaagcat gtttcagttt ccattctgaa tatttattgt ccttctcctg acgaaatttt  3240

aattatctcc aaatttaact tagtgaactg tgttctggaa attgcagagt acttttgttg  3300

atgactctgt tacaattgag catgcaagag aatatgggca cacccatctg tttgaggtta  3360

ttcccaaatt ttgcttattt catatttctg tggaagaaaa acatttcacc tagcattgct  3420

aattttgccc ttatcttttt ttttatgtat gcagatactg aatcagtgtg acaaacttga  3480

aaacaaagct attctgctaa tccacttttc tgctcgttat accgcagagg tgagctatct  3540

ctgttgtaat ccaattttac ttatatcatt ttatcctgat tcaattagta atctgtatgc  3600

tttgtttcaa ctctgtggat ttattttttg tttcaagcaa gtttcaccaa tattgttatt  3660

ttttaatgcc atcattatga gcaggcaaaa tgtgcccact tttcttgtag catcctcctt  3720

tcctcttaaa agtacacatg tttgtgtttc attctttaca aataaataca tttatcttca  3780

atttttttct caccatcatt aaacatttca tcacatcctt ttcaggaaat tgatatagca  3840

atcaataagt tgccaccctc tttcagaagt agagttcatg cattgaagga aggtttctga  3900

caaagatgaa gtgatcaatc agaaatgaag cattcaacct tactctcctc tcgatgcact  3960

catgtaccaa gaactctttt ttttttttgg gggggagggg gggggatcga atccttaact  4020

cttgagtcct gaaacatttc tgtagcaccc cttcacacac cgaacattaa             4070

<210>2

<211>302

<212>PRT

<213>正常水稻品种安农N(Oryza Sativa)

<400>2

Met Ala Asn Ser Gly Lys Ser Ser Pro Ala Ala Thr Ser Thr Thr Ala

1               5                   10                  15

Pro Pro Pro Gly Arg Pro Lys Ser Lys Ala Pro Pro Leu Thr Val Glu

            20                  25                  30

Gly Tyr Pro Val Glu Gly Ile Ser Ile Gly Gly Gln Glu Thr Cys Val

        35                  40                  45

Ile Phe Pro Thr Leu Ser Ala Ala Phe Asp Ile Gly Arg Cys Pro Gln

    50                  55                  60

Arg Ala Val Ser Gln Glu Phe Leu Phe Ile Ser His Ala His Leu Asp

65                  70                  75                  80

His Ile Gly Gly Leu Pro Met Tyr Val Ala Thr Arg Gly Leu Tyr Arg

                85                  90                  95

Gln Arg Pro Pro Thr Ile Phe Ile Pro Ala Cys Leu Arg Asp Pro Val

            100                 105                 110

Glu Arg Leu Phe Glu Leu His Arg Ser Met Asp Gln Ser Glu Leu Ser

        115                 120                 125

His Asn Leu Val Pro Leu Glu Ile Gly Gln Glu His Glu Leu Arg Arg

    130                 135                 140

Asp Leu Lys Val Lys Ala Phe Lys Thr Tyr His Ala Ile Pro Ser Gln

145                 150                 155                 160

Leu Gln Phe Lys Ala Ala Leu Glu Arg Glu Gln Gln Val His Asn Val

                165                 170                 175

Asn His Glu Ile Ala Ile Ser Leu Asp Lys Tyr Thr Asn Cys Pro Leu

            180                 185                 190

Ser Gly Thr Glu Ile Ala Glu Leu Thr Gln Pro Leu Arg Ser Met Thr

        195                 200                 205

Cys Gly His Ile Phe Asp Arg Gln His Ile Met Asn Tyr Met Gly Ser

    210                 215                 220

Ser Leu Lys Gly Cys Pro Val Ile Gly Cys Pro Gly Ala Val Ser Asn

225                 230                 235                 240

Asp Leu Val Phe Glu Asp Ala Glu Leu Arg His Asp Ile Lys Tyr Cys

                245                 250                 255

Gln Cys Asp Lys Leu Glu Asn Lys Ala Ile Leu Leu Ile His Phe Ser

            260                 265                 270

Ala Arg Tyr Thr Ala Glu Glu Ile Asp Ile Ala Ile Asn Lys Leu Pro

        275                 280                 285

Pro Ser Phe Arg Ser Arg Val His Ala Leu Lys Glu Gly Phe

    290                 295                 300

<210>3

<211>4070

<212>DNA

<213>水稻温敏不育系安农S-1(Oryza Sativa)

<220>

<221>CDS

<222>(2006)..(2485)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(2591)..(2686)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(2797)..(2910)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(3288)..(3356)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(3455)..(3529)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(3826)..(3900)

<223>

<400>3

cctgttaacc ggttgaggtg gtggtgggac agccacgcgc gcgcgcgccg ggctgggccg      60

aggccttggc aaggtaggca ggcggctgct ctctctctct cgttttcatt ttgtaacaga     120

cggagattga ttcagtaatc aatttggttt taacgagagc gaattcattc gatgttaatc     180

atgtgattaa ttacgcagat tgaatccaag tgttatcctt gcgctacaat tcctcccagc     240

aacagacaga ggagtaacat ctctctatgt cctagcggac tgtctacttc ctcctcgatt     300

ccccttcctt ttcctgagct gcttctggct tccccggttc tgttcacttg cgcgcacggg     360

tgatcaggat gagcaggcct ccggaactcc gtccagttgc gtacctgcat gggtaggcgg     420

gcgatcaagt ttttggggag cgctcttggg cgcgactgct cctgttcgac aacggttcta     480

cactgctaca tcttcgccaa catgtcgacg gacaacacca acactcgcac tggcactgga     540

aagcctcaac tagtacatga gcgttctcag ggtatatgtc cattccctta ccgttaatta     600

tgctgctaga agatttttct gttaatgctt atcgcaatgt tacaattgcg ttactatgtg     660

aatgttatac ttattttatg aaaagcatgc tcatgctgag caccatcact agatcaattc     720

tcattgcaaa tgtcatgttt attatcttgt tggtggacct gcagccaatt ttgggtcaag     780

aagagaacga ggtagcggag aggtttgagg tgatgttgtg tggtggagaa atgcgtgaga     840

tgaggattgt gtccgatatt tcacttcgca ccggatgctc gatctgaagc attttcggat     900

ttgtgattct attttgaaca tttgtgttgt ggtactgaaa tttccgagat ttcagaaaaa     960

ctttttaaaa taattcgaac taattttagc caaatctaaa caaatttgga ccaaattcaa    1020

aaaaagagaa aaaatttgaa aattatgacg aaatattttg gtgtccggtg agggtccgaa    1080

atttcgggaa ttccgaacga aaattataaa cattgtgcat gggagtttaa ttacggggat    1140

gggaatttat cctcatgact ccctgccttt caatacgctg ggggaattgg gaggaaattc    1200

atcttcactt aaaatctaat ttccttctat actacgtaag actatcggat tgaatccaat    1260

aaacttctaa actgcctaag atatctgtcc aaaattagag ataaattagc aacaccatac    1320

caaaccaacc aaaatgacaa attaattctc agtccaaaat tacatgcatg gacagtgcag    1380

caacaaccgg catccatgaa tccataaacc gagagtggcc aaacagctgc tacttcacct    1440

gcactgcaac ttcttgcgaa tccttaaccc tctgaatctg ataggttgtc aagataatct    1500

tgcatttgtg gctttgacac gacgacgatg acgaacaccg cctgattctg atggagcaga    1560

agctgccatt tcccgatggg cacagcaagc tattcgaccg aggaatctct accttcgctg    1620

ccgatgcaac ctcttgcacc ggcagcaagc tggttatcgg tgccgaggag aagcccttct    1680

caatgttgat gttattccaa tacactccta taatcgataa tattgtaagc taatatattg    1740

acgtgcaatt cttttacgtc ttcgcgaaaa accggtaatg tcgtaaggaa atgcccccaa    1800

aagctcccac gtgttcaccc ttccaacctc ttacaggcta gatgttgaag aagcatcctg    1860

ggccgttgga tatcaatcca acgccagcag tagtcgaccg agtagacatt gacttgggcc    1920

gtgcccggcc cggcccatcg tgcttcgtgc caaaacgggc cgtgccggaa caacccccca    1980

ccacggcggc ggcggcggcg gcgccatggc gaacagcggc aagtcatcgc cggcggcgac    2040

ctccaccacc gcgccgccac cgggtcggcc gaagtagaag gcgccgcccc tcaccgtcga    2100

gggctacccc gtggagggca tctccatcgg cgggcaggag acctgcgtca tcttcccgac    2160

gctgagcgcc gccttcgaca tcggccggtg cccgcagcgc gccgtctcgc aggagttcct    2220

cttcatctcc cacgcccacc tcgaccacat cggcggcctc cccatgtacg tcgccacccg    2280

gggcctctac cggcagcgcc cgcccaccat cttcatcccc gcctgcctca gggaccccgt    2340

ggagcgcctc ttcgagctcc accgctccat ggaccagtcc gagctcagcc acaacctcgt    2400

ccccctcgag attggtcagg agcacgagct caggagggac ctcaaagtga aggccttcaa    2460

gacctaccac gccattccca gccaggtgaa gggttcatca gttcttggtt cttctggatg    2520

aattattctt gattgattga tttggtcgga aatgtgtggt gaatttggtt gagatgtgat    2581

gtgattgtag gggtatgtga tatacacggt gaagcaaaag ctcaagccag agtatcttgg    2640

cctccctggg agcgagatca agcagctgaa gctgtcaggt gtggaggtct gttgttgttt    2700

tttttttttt tttgatattg tggatgtctg gatgaaatgg aatacaattc acaatttagt    2760

gatgttgttg atgctgtgcg tggttctgtt tttcagatta cgaatacatt gacggtgcct    2820

gagattgctt ttaccggaga tacgatggca gatttcattc ttgatcctga taatgcggat    2880

gttttgaagg cgaaaattct tgtagtggag gtattgcttc ttatcgtcta tatggttaat    2940

ttgttgtcaa ttgtcattgt tgctattcag cctgagaaaa aaaaaagagg gaaactgttt    3000

cttcaagcac ggatatcagt atattaccaa gattaatttt atcaacagaa ggaaaagcaa    3060

cagcctttgc ttttcaggag agattgattc caactccata ttaactgata actgagtacc    3120

attttttcaa actaaaacct ttgcggaacc aattggcagc aattagtggg aactatgttg    3180

cctgaagcat gtttcagttt ccattctgaa tatttattgt ccttctcctg acgaaatttt    3240

aattatctcc aaatttaact tagtgaactg tgttctggaa attgcagagt acttttgttg    3300

atgactctgt tacaattgag catgcaagag aatatgggca cacccatctg tttgaggtta  3360

ttcccaaatt ttgcttattt catatttctg tggaagaaaa acatttcacc tagcattgct  3420

aattttgccc ttatcttttt ttttatgtat gcagatactg aatcagtgtg acaaacttga  3480

aaacaaagct attctgctaa tccacttttc tgctcgttat accgcagagg tgagctatct  3540

ctgttgtaat ccaattttac ttatatcatt ttatcctgat tcaattagta atctgtatgc  3600

tttgtttcaa ctctgtggat ttattttttg tttcaagcaa gtttcaccaa tattgttatt  3660

ttttaatgcc atcattatga gcaggcaaaa tgtgcccact tttcttgtag catcctcctt  3720

tcctcttaaa agtacacatg tttgtgtttc attctttaca aataaataca tttatcttca  3780

atttttttct caccatcatt aaacatttca tcacatcctt ttcaggaaat tgatatagca  3840

atcaataagt tgccaccctc tttcagaagt agagttcatg cattgaagga aggtttctga  3900

caaagatgaa gtgatcaatc agaaatgaag cattcaacct tactctcctc tcgatgcact  3960

catgtaccaa gaactctttt ttttttttgg gggggagggg gggggatcga atccttaact  4020

cttgagtcct gaaacatttc tgtagcaccc cttcacacac cgaacattaa             4070

<210>4

<211>1009

<212>DNA

<213>拟南芥(哥伦比亚生态型)(Arabidopsis Thaliana)

<220>

<221>ORF

<222>(80)..(922)

<223>

<400>4

atttcatcga acacttggtg atcaatattt gaaaacgaag agcacagcca aaattcgata   60

aaccctaagg aacagtgaga tggagaagaa gaaagcaatg caaattgaag gttacccgat  120

cgagggattg tcgattggtg ggcacgagac gtgcatcata tttccatctc ttcggatagc  180

tttcgacatt ggtcgttgcc cacatcgcgc aatttctcaa gacttcctct tcatctctca  240

ctctcacatg gatcatatcg gtggattacc aatgtatgtt gctactagag gcttgtacaa  300

aatgaagcct ccaacgatta tagtacccgc atccattaaa gaaactgttg agagtttatt  360

cgaagttcac agaaagttag attcttcaga gctaaagcac aatcttgttg gcttggacat  420

aggggaggag tttattataa ggaaagatct caaagtcaaa gcctttaaga cattccatgt  480

catccaaagc cagggttatg tagtgtattc aactaaatat aaactcaaga aggaatatat  540

tggcctatct ggaaatgaaa ttaagaactt gaaggtttca ggtgttgaga ttacagacag  600

cataataact cctgaagttg cttttacggg agatacaacg tcggattttg tagttgatga  660

aactaatgct gatgctctca aggcaaaggt tctcgtcatg gagagcacat ttcttgatga  720

ttcggtatcg gtagagcatg cgagagatta tggacatatc catatatctg agatagtaaa  780

tcatgctgaa aagtttgaaa acaaagcaat cctgctaatc cacttttcgg ctcggtatac  840

agtgaaggaa atcgaagatg cggtttctgc attgcctcca cctttagagg gacgtgtgtt  900

tgcactaaca caaggattct aaacattata acactcttat aggttttaca tacttttgtt  960

tttgtattcc acatgtaaac attgtattct gttgttaatt ttaagattt             1009

<210>5

<211>280

<212>PRT

<213>拟南芥(哥伦比亚生态型)(Arabidopsis Thaliana)

<400>5

Met Glu Lys Lys Lys Ala Met Gln Ile Glu Gly Tyr Pro Ile Glu Gly

1               5                   10                  15

Leu Ser Ile Gly Gly His Glu Thr Cys Ile Ile Phe Pro Ser Leu Arg

            20                  25                  30

Ile Ala Phe Asp Ile Gly Arg Cys Pro His Arg Ala Ile Ser Gln Asp

        35                  40                  45

Phe Leu Phe Ile Ser His Ser His Met Asp His Ile Gly Gly Leu Pro

    50                  55                  60

Met Tyr Val Ala Thr Arg Gly Leu Tyr Lys Met Lys Pro Pro Thr Ile

65                  70                  75                  80

Ile Val Pro Ala Ser Ile Lys Glu Thr Val Glu Ser Leu Phe Glu Val

                85                  90                  95

His Arg Lys Leu Asp Ser Ser Glu Leu Lys His Asn Leu Val Gly Leu

            100                 105                 110

Asp Ile Gly Glu Glu Phe Ile Ile Arg Lys Asp Leu Lys Val Lys Ala

        115                 120                 125

Phe Lys Thr Phe His Val Ile Gln Ser Gln Gly Tyr Val Val Tyr Ser

    130                 135                 140

Thr Lys Tyr Lys Leu Lys Lys Glu Tyr Ile Gly Leu Ser Gly Asn Glu

145                 150                 155                 160

Ile Lys Asn Leu Lys Val Ser Gly Val Glu Ile Thr Asp Ser Ile Ile

                165                 170                 175

Thr Pro Glu Val Ala Phe Thr Gly Asp Thr Thr Ser Asp Phe Val Val

            180                 185                 190

Asp Glu Thr Asn Ala Asp Ala Leu Lys Ala Lys Val Leu Val Met Glu

        195                 200                 205

Ser Thr Phe Leu Asp Asp Ser Val Ser Val Glu His Ala Arg Asp Tyr

    210                 215                 220

Gly His Ile His Ile Ser Glu Ile Val Asn His Ala Glu Lys Phe Glu

225                 230                 235                 240

Asn Lys Ala Ile Leu Leu Ile His Phe Ser Ala Arg Tyr Thr Val Lys

                245                 250                 255

Glu Ile Glu Asp Ala Val Ser Ala Leu Pro Pro Pro Leu Glu Gly Arg

            260                 265                 270

Val Phe Ala Leu Thr Gln Gly Phe

        275                 280

Claims (8)

1.一种温敏雄性育性基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1或SEQID NO：4。

2.含有权利要求1所述温敏雄性育性基因的遗传标记，其特征在于第71位的碱基C突变为A。

3.权利要求1所述温敏雄性育性基因所编码的蛋白质，其特征在于编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5。

4.含有权利要求1所述温敏雄性育性基因的载体。

5.含有权利要求1所述温敏雄性育性基因的重组微生物。

6.权利要求1所述温敏雄性育性基因在培育植物温敏不育系中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的温敏不育系是温敏雄性不育系。

8.权利要求2所述遗传标记在水稻育种中的应用。

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