CN102505013A

CN102505013A - 一个与水稻温敏不育基因tms5紧密连锁标记的开发与应用

Info

Publication number: CN102505013A
Application number: CN2011103267701A
Authority: CN
Inventors: 杨剑波; 陆徐忠; 倪金龙; 马卉; 倪大虎; 李莉; 马琳; 张小娟; 宋丰顺; 汪秀峰; 杨亚春
Original assignee: Rice Research Institute of Anhui Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Rice Research Institute of Anhui Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2011-10-25
Filing date: 2011-10-25
Publication date: 2012-06-20
Anticipated expiration: 2031-10-25
Also published as: CN102505013B

Abstract

本发明提供了一个与水稻温敏不育基因tms5紧密连锁的InDel(insertion-deletion)标记，可用于水稻温敏核不育系的辅助选育及温敏型两系水稻纯度的快速鉴定。本发明依据水稻温敏核不育系与恢复系(或具恢复能力的杂交亲本)在tms5基因所在区域的DNA序列差异，开发了一个用于水稻温敏核不育系辅助选育及温敏型两系水稻纯度快速鉴定的InDel标记，即SJ001，利用PCR技术扩增该标记位点，携有tms5基因的温敏核不育系仅扩增出一条387bp的谱带；携有tms5基因的温敏型两系杂交水稻会扩增出大小分别为463bp和387bp的两条谱带；不携有tms5基因的水稻(非温敏型水稻)仅扩增出一条463bp的谱带。依据标记SJ001在水稻温敏核不育系和恢复系(或具恢复能力的杂交亲本)中的扩增差异，实现温敏核不育系的辅助选育及温敏型两系水稻纯度的快速鉴定。

Description

一个与水稻温敏不育基因tms5紧密连锁标记的开发与应用

技术领域

本发明属于水稻分子标记辅助选育和种子纯度鉴定的技术领域，具体地说是利用一种水稻温敏不育基因tms5紧密连锁的InDel标记对水稻温敏核不育系进行辅助选育及温敏型两系水稻纯度的快速鉴定。

背景技术

水稻光、温敏不育资源(即两系不育资源)的发现及其在杂交水稻上的成功应用，为保障我国粮食安全问题发挥了重要作用。与三系不育系相比，两系不育系具有自我繁殖、恢复谱广等优点，因此，近年两系法杂交水稻在我国发展较快，种植面积和推广范围迅速扩大。据农业部统计，2009年全国种植面积超过400万亩的杂交水稻品种全部为两系水稻。

两系不育系的快速选育，是推动两系杂交水稻迅速发展的重要前提。传统的光温敏不育系的选育往往是以不育材料为母本，与可育材料杂交或回交，将F2代或回交后代正季种植，在长日高温条件下选择不育单株，然后割蔸带至海南进行冬春季隔离繁殖；繁殖收获的种子带回内地种植，正季进行不育性状鉴定，再割蔸带至海南冬春季隔离繁殖。正季不育性状鉴定和海南岛繁殖交替进行数次，以选育稳定的两系不育系。若在选育过程中，正季出现连续低温多雨天气，无法进行不育性状鉴定，必须待到下一年正季重新鉴定，大大延缓了两系不育系的选育进度。

分子标记辅助育种是指利用与特定性状相关联的分子标记作为辅助手段进行的育种。开发与水稻光、温敏不育性状关联的分子标记，并应用于两系不育系的辅助选育，将大大提高不育系的选育效率。InDel(insertion-deletion)标记即插入缺失标记，指的是两种基因型在全基因组中的差异，相对于另一个基因型而言，其中一个基因型的基因组中有一定数量的核苷酸插入或缺失。根据基因组中插入缺失位点，设计一些特异扩增识别这些插入缺失位点的PCR引物，这就是InDel标记，是一类共显性标记。

目前我国生产应用的大多数温敏核不育系的不育基因来源于安农S或其同型系及衍生系，表现为高温不育、低温可育，其育性主要由温敏核不育基因tms5(Thermo-sensitive GenicMale Sterile Gene)控制。本实验室前期研究发现，温敏核两系不育系(如安农S-1)和其恢复系(如93-11)等在tms5区域存在序列差异。依据此段序列差异开发了一个InDel标记，验证实验表明：该标记能够通过特异识别tms5位点，从而实现对温敏核不育基因的鉴定，一方面能够用于温敏核两系不育系的辅助选育，另一方面也可以用于温敏型两系水稻纯度的快速鉴定。

发明内容

本发明针对温敏核不育系与恢复系(或具恢复能力的杂交亲本)在tms5区域的序列差异，开发了一个与tms5紧密连锁的InDel标记SJ001，利用PCR技术对该标记位点进行扩增，通过电泳检测扩增产物的片段数量和大小，判断被检水稻样品是否为温敏型不育材料，进而实现对温敏核不育系的辅助选育及温敏型两系水稻纯度的快速鉴定。

本发明解决技术问题采用如下方案：

一种与水稻温敏不育基因tms5紧密连锁的InDel标记SJ001，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，或含有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列。

本发明水稻温敏不育基因tms5紧密连锁的InDel标记的应用方法为，设计如下引物对水稻样品DNA进行扩增，根据扩增差异，实现水稻温敏核不育系的辅助选育及温敏型两系水稻纯度的快速鉴定，

SJ001-F：5’ATATTTGGCGCTCTATTCTT 3’

SJ001-R：5’GGCCAAGTGTTATGATCACT 3’。

所述扩增差异，指产物电泳谱带类型：携有tms5基因的温敏核不育系会扩增出一条387bp的谱带；携有tms5基因的温敏型两系杂交水稻会扩增出大小分别为463bp和387bp的两条谱带；不携有tms5基因的水稻会扩增出一条463bp的谱带。

本发明水稻样品包括但不限于水稻的种子、幼苗、叶片、根、茎、穗；所述的水稻温敏核两系不育系包括但不限于安农S-1、广占63S、1892S、Y58S、新安S、新华S、03S、新二S、绿102S、株1S、广茉S、2301S、绿敏S、63-4S或其同型系及衍生温敏型核不育系；所述的温敏型两系水稻包括水稻温敏核不育系和以水稻温敏核不育系为亲本选配的杂交组合。

其详细步骤按如下所述：

1.CTAB法提取水稻基因组DNA

1.1用于温敏核不育系的辅助选育的DNA样品提取

将温敏核不育基因供体材料(即不育系)和不育基因受体材料设为对照；剪取水稻杂交(或回交)后代成株期幼嫩叶片100-200mg，移入2.0mL离心管中，并将温敏核不育基因供体材料(即不育系)和不育基因受体材料设为对照；向离心管中加液氮用玻棒充分研磨至粉末状，再加入700μL 65℃预热的DNA提取液(81.7g NaCl和20g CTAB充分溶于适量水中，然后加入1mol/L Tris-HCl 100mL，0.5mol/L EDTA 40mL，定容至1000mL，4℃贮存。)，65℃孵育1h，每隔15min颠倒混匀一次；加入等体积氯仿/异戊醇，轻缓混匀，室温静置15min；12,000rpm离心15min，吸取上清移至另一支1.5mL离心管中，再加入等体积异丙醇混匀，置于-20℃30min，4℃、12,000rpm离心10min，弃上清，加入200μL 70％乙醇洗涤沉淀；12,000rpm离心10min后弃去乙醇，室温干燥后加入50μL灭菌水，充分溶解后备用。

1.2用于温敏型两系杂交稻纯度鉴定的DNA样品提取

每样品取50-500粒单株(对于杂交种检测，尽量将其父母本作为对照)，种子发芽后取幼苗置于2.0mL离心管中，其余过程同1.1。

2.水稻基因组DNA的PCR扩增

利用引物对水稻基因组DNA进行扩增，引物序列如下：

SJ001-F：5’ATATTTGGCGCTCTATTCTT 3’

SJ001-R：5’GGCCAAGTGTTATGATCACT 3’

扩增体系中各组分配制见表1

表1PCR反应体系

反应组分	原浓度	终浓度	推荐反应体积(20μL)
				ddH2O	-	-	12.35
10×Buffer	10×	1×	2.0
				MgCl2	25mmol/L	2.5mmol/L	2.0
dNTPs	2.5mmol/L每种	0.15mmol/L每种	1.2
				Tag酶	5.0U/μL	1.0U	0.2
SJ001-F	20μmol/L	0.25μmol/L	0.25
				SJ001-R	20μmol/L	0.25μmol/L	0.25
模板DNA			2.0

注：反应体积可选择在5-25μL之间，模板DNA原浓度在20-200ng/μL之间。

扩增条件为：反应程序为：95℃变性5min后，94℃30sec，56℃30sec，72℃30sec，循环35次，72℃延伸10min，12℃保温。扩增产物采用2％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

3.温敏核不育系辅助选育

为了将具优异的性状水稻可育品系改良成两系不育系，用优良水稻品系与温敏核不育系杂交并回交，利用引物SJ001-F、SJ001-R扩增各杂交(回交)世代单株SJ001位点，根据引物在各单株上的扩增情况，判断温敏核不育基因tms5的存在与否，从而辅助选育具优良特性的温敏核两系不育系。

其中，仅扩增出一条387bp谱带的单株为携有tms5基因的不育单株；仅扩增出463bp谱带的单株为不携有tms5基因的可育单株；扩增出大小分别为463bp和387bp的两条谱带的单株为可育杂合单株。

4.温敏型两系水稻纯度鉴定

根据标记SJ001在水稻温敏核不育系、恢复系和温敏型两系杂交稻种中扩增结果的差异，判别受检温敏核不育系中是否存在可育单株混杂；或判别受检温敏型两系杂交稻种中是否存在温敏核不育系或恢复系(或其它亲本)单株混杂。

携有tms5基因的温敏核不育系仅扩增出一条387bp的谱带；携有tms5基因的两系杂交水稻会扩增出大小分别为463bp和387bp的两条谱带；不携有tms5基因的水稻仅扩增出一条463bp的谱带。因此，当对温敏两系不育系进行纯度鉴定时，凡是未扩增出大小387bp单一谱带的单株，都判定为混杂株；当对温敏两系杂交水稻进行纯度鉴定时，凡是仅扩增出大小为387bp单一谱带的，判定为温敏核不育系混杂，凡是仅扩增出大小为463bp单一谱带的，都判定为恢复系(或其它亲本)混杂。

水稻样品纯度检验结果按以下公式计算：

P (%) = \frac{N_{T} - N_{D}}{N_{T}} \times 100 %

式中：

P-样品纯度；

N_T-为供检种子粒数(幼苗数、株数)；

N_D-为判定为混杂株的种子粒数(幼苗数、株数)。

附图说明

图1：本发明中测序引物对安农S-1中温敏核不育基因tms5区域的扩增情况

M：分子量标准；1：测序引物(tms5-P1F、tms5-P1R)的扩增结果；2：测序引物(tms5-P2F、tms5-P2R)的扩增结果

图2A、B、C：本发明携有温敏核不育基因tms5的安农S-1与日本晴、93-11(扬稻6号)在同一位点上的DNA序列比对结果

日本晴：不携有温敏核不育基因tms5水稻日本晴在此位点的DNA序列

93-11：不携有温敏核不育基因tms5水稻93-11在此位点的DNA序列

安农S-1：携有温敏核不育基因tms5水稻安农S-1在此位点的DNA序列

图3：本发明引物SJ001-F、SJ001-R在标记SJ001序列上的位置

安农S-1：标记SJ001在水稻温敏型核不育系安农S-1基因组中的DNA序列

图4：本发明中引物SJ001-F、SJ001-R在部分水稻温敏核不育系和非温敏型材料中的扩增情况

1、珍汕97A，2、明恢100，3、成恢047，4、桂99，5、明恢63，6、明恢72，7、制选，8、蜀恢527，9、93-11，10、日本晴，11、新安S，12、03S，13、新二S，14、1892S，15、绿102S，16、安农S-1，17、Y58S，18、株1S，19、新华S，20、广茉S，21、2301S，22、C815S，23、63-4S，24、绿敏S，25、N632S，26、广占63S，27、2310SA，28、2310S，29、2312S，30、78S，31、7001S

其中，1-10为非两系不育系材料，11-26为温敏核不育系材料，27-31为光敏核不育系材料

图5A、B、C、D：本发明中引物SJ001-F、SJ001-R在部分温敏型两系杂交水稻及亲本中的扩增情况

1、Y58S(♀)，2、Y两优1号，3、93-11

4、广占63-4S(♀)，5、扬两优6号，6、93-11

7、新安S(♀)，8、新两优6号，9、安选6号

13、新华S(♀)，14、两优华6，15、安选6号

16、广茉S(♀)，17、广两优100，18、紫恢100

19、广茉S(♀)，20、两优100，21、紫恢100选

22、2301S(♀)，23、皖稻199，24、3401

28、广占63S(♀)，29、丰两优1号，30、93-11

31、1892S(♀)，32、徽两优6号，33、93-11

34、1892S(♀)，35、皖稻153，36、RH003

图6：本发明温敏核不育系选育流程

图7：本发明引物SJ001-F、SJ001-R对温敏核不育系的辅助选育

M：分子量标准；G：广占63S；S：1892S；X：Xa21/Xa23；1-19：广占63S与Xa21/Xa23所配BC3F3单株；20-38：1892S与Xa21/Xa23所配BC1F3单株。

箭头所示不育单株，星号所示仅有父本带型的可育单株，其余为可育杂交单株。

图8：本发明广占63S、1892S杂交(回交)后代花粉碘染情况

A：广占63S杂交(回交)后代不育单株花粉；B：广占63S杂交(回交)后代可育单株花粉；C：1892S杂交(回交)后代不育单株花粉；D：1892S杂交(回交)后代可育单株花粉。

图9A、B、C、D：本发明中引物SJ001-F、SJ001-R对温敏型两系杂交水稻皖稻153(1892S×RH003)纯度鉴定情况(部分单株电泳结果)

M：分子量标准；母：母本(1892S)对照；父：父本(RH003)对照；48、63、141：检出的母本(1892S)混杂；67：检出的父本(RH003)混杂

图10A、B：本发明图9中皖稻153各单株经SSR引物RM7120检测验证情况(部分单株电泳结果)

母：母本(1892S)对照；父：父本(RH003)对照；48、63、141：检出的母本(1892S)混杂；67：检出的父本(RH003)混杂

具体实施方式

以下叙述本发明的实施事例。应该说明，本发明的实施事例只对本发明起说明作用，而没有任何限制作用。本领域技术人员可以对本发明作出某些等同的改动和显而易见的改进。

1、CTAB法提取温敏核不育系安农S-1基因组DNA：

1)取安农S-1种子100粒左右，28℃发苗约1周；

2)单株幼苗置于2.0mL离心管中，加入液氮，用玻棒充分研磨至粉末状，处理6个单株；

3)向离心管中加入700μL 65℃预热的DNA提取液(81.7g NaCl和20g CTAB充分溶于适量水中，然后加入1mol/L Tris-HCl 100mL，0.5mol/L EDTA40mL，定容至1000mL，4℃贮存。)；

4)65℃孵育1h，每隔15min颠倒混匀一次；

5)加入等体积氯仿/异戊醇，轻缓混匀，室温静置15min；

6)12,000rpm离心15min，吸取上清移至另一支1.5mL离心管中，再加入等体积异丙醇混匀，置于-20℃冷冻30min，4℃、12,000rpm离心10min；

7)弃上清，加入200μL 70％乙醇洗涤沉淀；

8)12,000rpm离心10min后弃去乙醇；

9)室温干燥后加入50μL灭菌水，充分溶解后备用。

2、温敏核不育基因tms5区域序列测定

1)测序引物设计

根据我们先前的研究，认为温敏型核不育系(如安农S-1等)与恢复系(如93-11等)在温敏型核不育基因tms5区域上存在序列差异，我们依据NCBI公布的日本晴、93-11相关位点的核酸序列，设计了2对针对安农S-1中tms5区域的测序引物：

tms5-P1F：5’TTCTCTGAAGCTGAAAGATAAAG 3’

tms5-P1R：5’CAGTACAAATGTAGACGCTCATA 3’

tms5-P2F：5’GAACTCGTTGGTGACATTGTAG 3’

tms5-P2R：5’TTTAATTTGGTTCATCGGTTTC 3’

2)PCR扩增与电泳检测

在0.2mL薄壁管中依次加入，反应体系为：

扩增程序：94℃变性5min后，94℃40sec，59℃40sec，72℃45sec，循环35次，72℃延伸10min，12℃保温。

引物(tms5-P1F、tms5-P1R)和(tms5-P2F、tms5-P2R)各扩增2管，分别取5μL经1％琼脂糖凝胶电泳检测(见图1)，剩余扩增产物送生工生物工程(上海)有限公司进行序列测定。

3)序列测定结果

安农S-1中温敏核不育基因tms5区域的序列测定拼接后的碱基长度为1579bp，与日本晴和93-11相应位点的碱基序列进行比对，结果表明，安农S-1的tms5基因位点有一段75bp的缺失(见图2)。

3、温敏核因不育基tms5区域检测引物设计

根据序列测定结果设计了温敏核不育基因tms5区域检测引物(SJ001-F、SJ001-R，见图3)，在日本晴或93-11上预期扩增片段大小为463bp，在安农S-1上预期扩增片段大小为387bp。

4、利用引物SJ001-F、SJ001-R对部分水稻亲本材料扩增验证

1)水稻基因组DNA提取

所用水稻材料：

1、珍汕97A，2、明恢100，3、成恢047，4、桂99，5、明恢63，6、明恢72，7、制选，8、蜀恢527，9、93-11，10、日本晴，11、新安S，12、03S，13、新二S，14、1892S，15、绿102S，16、安农S-1，17、Y58S，18、株1S，19、新华S，20、广茉S，21、2301S，22、矮占43S，23、矮紫-1S，24、绿敏S，25、GD-7S，26、广占63S，27、2310SA，28、2310S，29、2312S，30、78S，31、7001S。

取各水稻材料种子100粒左右，28℃发苗1周后，CTAB法提取水稻基因组DNA，每个材料提取5个单株。

2)PCR扩增及电泳检测

利用引物SJ001-F、SJ001-R对上述水稻材料基因组DNA进行扩增，反应体系为：

反应组分	原浓度	终浓度	反应体积(20μL)
				ddH2O	-	-	12.35
10×Buffer	10×	1×	2.0
				MgCl2	25mmol/L	2.5mmol/L	2.0
dNTPs	2.5mmol/L每种	0.15mmol/L每种	1.2
				Tag酶	5.0U/μL	1.0U	0.2
SJ001-F	20μmol/L	0.25μmol/L	0.25
				SJ001-R	20μmol/L	0.25μmol/L	0.25
模板DNA			2.0

扩增条件为：反应程序为：95℃变性5min后，94℃30sec，56℃30sec，72℃30sec，循环35次，72℃延伸10min，12℃保温。扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测。

结果显示，所有温敏核不育系材料(11-26)都扩增出一条387bp的谱带，所有非两系不育系材料(1-10)和光敏核不育系材料(27-31)都扩增出一条463bp的谱带(见图4)。

5、对部分温敏型两系杂交水稻及其亲本的检测验证

1)水稻基因组DNA提取

所用水稻材料：

1、Y58S(♀)，2、Y两优1号，3、93-11

4、广占63-4S(♀)，5、扬两优6号，6、93-11

7、新安S(♀)，8、新两优6号，9、安选6号

13、新华S(♀)，14、两优华6，15、安选6号

16、广茉S(♀)，17、广两优100，18、紫恢100

19、广茉S(♀)，20、两优100，21、紫恢100选

22、2301S(♀)，23、皖稻199，24、3401

28、广占63S(♀)，29、丰两优1号，30、93-11

31、1892S(♀)，32、徽两优6号，33、93-1134、1892S(♀)，35、皖稻153，36、RH003

取各水稻材料种子100粒左右，28℃发苗1周后，CTAB法提取基因组DNA，每个材料提取5个单株。

2)PCR扩增及电泳检测

利用引物SJ001-F、SJ001-R对上述水稻材料基因组DNA进行扩增，产物经2％琼脂糖凝胶电泳。在所有检测的温敏型两系杂交水稻中，不育系(母本)都扩增出一条387bp的谱带，恢复系(父本)都扩增出一条463bp的谱带，杂交种都扩增出大小分别为463bp和387bp的两条谱带(见图5)。

6、利用标记SJ001辅助选育优良温敏核不育系

1)优良温敏核不育系选育流程(见图6)

2)水稻基因组DNA提取

所用水稻材料：广占63S、1892S及以其为母本与抗病材料(Xa21/Xa23)杂交选育的BC3F3单株。剪取成株期水稻幼嫩叶片100-200mg，CTAB法提取基因组DNA；

3)水稻基因组DNA的PCR扩增电泳检测

利用引物SJ001-F、SJ001-R对广占63S、1892S、Xa21/Xa23及BC3F3单株基因组DNA进行扩增，扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

4)含tms5基因后代选择

携有tms5基因的两系不育单株仅扩增出一条387bp的谱带(见图7)；不携有tms5基因不育基因的单株仅扩增出一条463bp的谱带(箭头所示)；携有tms5基因的杂交株扩增出大小分别为463bp和387bp的两条谱带(星号所示)。在回交后代中选择SJ001位点上的杂合单株，在自交后代中选择SJ001位点上的纯合单株。

5)杂交(回交)后代花粉镜检

取充分成熟将要开花的稻穗，取花药置载玻片上，用镊子充分捣碎后，再加1-2滴I-KI溶液，盖上盖玻片，置低倍显微镜下观察；其中，广占63S及杂交(回交)后代的不育单株基本无花粉，可育单株花粉粒大多呈黑色或深蓝色；1892S及杂交(回交)后代的不育单株花粉粒为黄褐色，且呈皱缩状，可育单株花粉粒呈黑色或深蓝色(见图8)。

(I-KI溶液：取KI 2g溶于5-10mL蒸馏水中，然后加入1gI₂，待全部溶解后，再加蒸馏水至300mL，贮于棕色瓶中备用。)

7、温敏型两系杂交水稻皖稻153(1892S×RH003)的纯度检测

1)皖稻153样品及其父母本基因组DNA提取

取皖稻153种子300粒左右，1892S、RH003种子各100粒左右，28℃发苗1周；取皖稻153幼苗200株，1892S、RH003幼苗各10株；CTAB法提取基因组DNA。

2)水稻基因组DNA的PCR扩增及电泳检测

利用引物SJ001-F、SJ001-R对皖稻153样品及其父母本基因组DNA进行扩增，其中皖稻153检测186个单株，1892S、RH003各检测3个单株；

扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

3)皖稻153样品纯度判定

引物SJ001-F、SJ001-R对186株皖稻153样品单株的扩增结果如下：

有3株扩增出一条387bp的谱带(为母本混杂)，有1株扩增出一条463bp的谱带(为父本混杂)，其余182株扩增出大小分别为463bp和387bp的两条谱带(见图9)，样品检测纯度为：

P(％)＝(186-3-1)/186＝97.9％

4)皖稻153样品纯度SSR检测验证

利用水稻SSR引物RM7120对上述皖稻153样品的186个单株及父母本各3个单株进行SSR分析，检测出的母本混杂和父本混杂单株编号与引物SJ001-F、SJ001-R检测出的完全一致(见图10)，说明利用标记SJ001检测温敏型两系水稻样品纯度的结果是可靠的。

Claims

1.一种与水稻温敏不育基因tms5紧密连锁的InDel标记SJ001，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，或含有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列。

2.一种如权利要求1所述的一种与水稻温敏不育基因tms5紧密连锁的InDel标记的应用，其特征在于，设计如下引物对水稻样品DNA进行扩增，根据扩增差异，实现水稻温敏核不育系的辅助选育及温敏型两系水稻纯度的快速鉴定，

SJ001-F：5’ATATTTGGCGCTCTATTCTT 3’

SJ001-R：5’GGCCAAGTGTTATGATCACT 3’。

3.一种如权利要求2所述的一种与水稻温敏不育基因tms5紧密连锁的InDel标记的应用，其特征在于，所述扩增差异，指产物电泳谱带类型：携有tms5基因的温敏核不育系会扩增出一条387bp的谱带；携有tms5基因的温敏型两系杂交水稻会扩增出大小分别为463bp和387bp的两条谱带；不携有tms5基因的水稻会扩增出一条463bp的谱带。

4.根据权利要求2所述的一种与水稻温敏不育基因tms5紧密连锁的InDel标记的应用，其特征在于，所述水稻样品包括但不限于水稻的种子、幼苗、叶片、根、茎、穗。

5.根据权利要求2所述的一种与水稻温敏不育基因tms5紧密连锁的InDel标记的应用，其特征在于，所述的水稻温敏核两系不育系包括但不限于安农S-1、广占63S、1892S、Y58S、新安S、新华S、03S、新二S、绿102S、株1S、广茉S、2301S、绿敏S、63-4S或其同型系及衍生温敏型核不育系。

6.根据权利要求2所述的一种与水稻温敏不育基因tms5紧密连锁的InDel标记的应用，其特征在于，所述的温敏型两系水稻包括水稻温敏核不育系和以水稻温敏核不育系为亲本选配的杂交组合。