CN104498612B - 与稻瘟病Pi9基因紧密连锁的分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了与稻瘟病Pi9基因紧密连锁的分子标记及其应用，属于分子标记辅助育种领域。本发明公开了检测与稻瘟病Pi9基因紧密连锁标记的引物对以及利用所述引物对检测水稻品种或株系中是否含有Pi9基因的方法，包括：(1)提取待检水稻样品基因组DNA；(2)利用所述的引物对进行PCR扩增；(3)内切酶酶切步骤(2)的PCR扩增产物，电泳；(4)根据酶切结果判断待检水稻样品是否含有Pi9基因。本发明方法能够准确判断被检水稻样品是否含有Pi9基因以及含有的Pi9基因为杂合或纯合，还可以鉴定亲本之一含Pi9基因的F1代杂交种纯度，在Pi9基因辅助选育等方面具有应用前景。

Description

与稻瘟病Pi9基因紧密连锁的分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及分子标记，尤其涉及与稻瘟病Pi9基因紧密连锁的分子标记，属于分子标记辅助育种领域。
背景技术
水稻(Oryaa sativa L.)是中国重要的粮食作物，常年栽培面积三千万公顷以上，产量居粮食作物首位。稻瘟病是严重危害水稻生产的主要病害之一，经常在水稻种植区域发生流行。稻瘟病是由Pyricularia Oryzae Cav.引起的真菌性病害，全国水稻种植区均有发生，流行年份一般减产10％～20％，严重的达40％～50％以上(Ou,1985)。发掘新的抗源、选育抗性品种仍然是预防稻瘟病最经济有效的方法。
到目前为止，已鉴定的稻瘟病抗性基因达70多个，其中来自小粒野生稻Oryzaminuta的Pi9基因对来自13个国家的43个稻瘟病小种都表现出抗性，显示出良好抗稻瘟病能力。2006年Qu等已成功标记并克隆了该基因。中国已有研究所利用与Pi9基因紧密连锁的标记进行育种。然而目前使用的与Pi9基因紧密锁的标记pB8在供体亲本75-1-127与H02、协青早B等亲本间没有多态性，这就给通过分子标记手段选择Pi9基因带来很大的难度。亟待开发一种与Pi9基因紧密锁的分子标记，准确判断被检水稻样品是否含有Pi9基因及含有的Pi9基因为杂合或纯合。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种与Pi9基因紧密锁的分子标记，判断被检测水稻样品是否含有Pi9基因以及含有的Pi9基因为杂合或纯合，进而实现对Pi9基因的辅助选育。
本发明所要解决的上述技术问题是通过以下技术方案实现的：
本发明针对Pi9基因功能区域设计引物，对多个品种包括供体75-1-127、Pi9基因转育后代N632S和N779S、其他材料93-11、日本晴、y80、f232、f254、f251、1892S的pi9基因功能区域进行测序，利用DNAMAN软件对获得的序列进行比较，找出Pi9基因专一性的差异。本发明根据Pi9基因功能区域的特有差异，设计了3对PCR检测引物对，分别为引物对1(Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR)、引物对2(Pi9-NheIF/Pi9-NheIR1)和引物对3(Pi9-Bsp1286IF/Pi9-Bsp1286IR)。其中，引物对1(Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR)其核苷酸序列为SEQ ID No.11和SEQID No.12所示；引物对2(Pi9-NheIF/Pi9-NheIR1)其核苷酸序列为SEQ ID No.13和SEQ IDNo.14所示；引物对3(Pi9-Bsp1286IF/Pi9-Bsp1286IR)其核苷酸序列为SEQ ID No.15和SEQID No.16所示；优选的，所述引物对为核苷酸序列为SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的引物对1。
本发明还公开了一种利用所述引物对检测水稻品种或株系中是否含有Pi9基因的方法，包括以下步骤：
(1)提取待检测水稻样品基因组DNA；(2)利用所述的引物对1进行PCR扩增；(3)用AflII内切酶酶切步骤(2)的PCR扩增产物，电泳；(4)根据酶切结果判断，如果酶切谱带含有371BP谱带，则待检测水稻样品含有Pi9基因；如果酶切谱带仅有447BP谱带，则待检测水稻样品不含有Pi9基因。
其中，步骤(2)PCR反应体系为：2×PCR buffer II 25μL，2.0mmol/L dNTPs 5.0μL，10μmol/L SEQ ID No.11所示引物2.5μL，10μmol/L SEQ ID No.12所示引物2.5μL，5U/μLLA Taq酶0.5μL，模板DNA 5.0μL，ddH2O 9.5μL，总体积50μL；PCR程序为：94℃变性5min后，94℃1min，55℃1min，72℃1min，循环35次，72℃延伸10min，12℃保温；
步骤(3)酶切体系为：ddH2O 5.8μL，10×Buffer 2.0μL，10×BSA 2.0μL，10U/μL内切酶0.2μL，步骤(2)PCR产物10μL，总反应体积20μL；酶切反应温度为37℃，酶切时间为12h。
本发明进一步公开了一种检测水稻品种或株系中是否含有Pi9基因以及含有的Pi9基因为杂合或纯合的试剂盒，由彼此独立的试剂1和试剂2组成；其中，试剂1的组成包括：2×PCR缓冲液，dNTPs混合溶液，检测上下游引物对，LA Taq DNA聚合酶和双蒸水；试剂2的组成包括：双蒸水，10×Buffer缓冲液，10×BSA，内切酶；其中，所述上下游引物为引物对1；所述内切酶为AflII内切酶。
本发明所述的引物对1能够应用于Pi9基因辅助选育，包括以下步骤：
(1)利用所述的引物对1扩增待检测水稻样品基因组DNA；(2)AflII内切酶酶切扩增的产物，电泳；(3)根据酶切结果判断，如果酶切谱带只有371BP谱带，则待检测水稻样品是Pi9基因纯合体；如果酶切谱带含有447BP和371BP两条谱带，则待检测水稻样品是Pi9基因杂合体；如果酶切谱带仅有447BP谱带，则待检测水稻样品不含Pi9基因。
本发明所述的引物对1能够应用于不育系为Pi9基因纯合体且恢复系不含有Pi9基因的杂交水稻纯度鉴定中，包括以下步骤：
(1)提取待检测水稻品种或株系基因组DNA；(2)利用所述的引物对1进行PCR扩增；(3)步骤(2)的PCR扩增产物经AflII内切酶酶切，电泳；(3)根据酶切结果判断，如果酶切谱带仅含有371BP谱带，则待检测水稻样品是不育系；如果酶切谱带仅含有447BP谱带，则待检测水稻样品是恢复系；如果酶切谱带含有447BP和371BP两条谱带，则待检测水稻样品是杂交水稻。
本发明所述的引物对1还能够应用于不育系不含有Pi9基因且恢复系为Pi9基因纯合体的杂交水稻纯度鉴定中，包括以下步骤：
(1)提取待检测水稻品种或株系基因组DNA；(2)利用所述的引物对1进行PCR扩增；(3)步骤(2)的PCR扩增产物经AflII内切酶酶切，电泳；(3)根据酶切结果判断，如果酶切谱带仅含有447BP谱带，则待检测水稻样品是不育系；如果酶切谱带仅含有371BP谱带，则待检测水稻样品是恢复系；如果酶切谱带含有447BP和371BP两条谱带，则待检测水稻样品是杂交水稻。
利用引物对2(Pi9-NheIF/Pi9-NheIR1)分别对Pi9基因纯合体和不含Pi9基因品种进行扩增，利用NheI内切酶对PCR产物进行酶切，酶切产物经4％琼脂糖电泳分离，结果无法区分Pi9基因有无。
利用引物对3(Pi9-Bsp1286IF/Pi9-Bsp1286IR)分别对Pi9基因纯合体和不含Pi9基因品种进行扩增，利用Bsp1286I内切酶对PCR产物进行酶切，同样不能区分Pi9基因有无。以上实验结果说明不是所有的SNP都能用于区分Pi9基因。
为了将Pi9基因转入具有优异的性状水稻材料，用优良水稻品系与含有Pi9基因的材料杂交并回交，利用引物Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR扩增各杂交(回交)世代单株Pi9基因位点，并对扩增的PCR产物用AflII酶切，根据酶切结果，判断Pi9基因的存在与否，从而辅助选育含有Pi9基因且农艺性状优良的单株。
根据引物对Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR对自交分离群体单株的扩增产物酶切谱带的差异，判别受检单株是否含有Pi9基因，以及Pi9基因是否为纯合类型。利用Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR引物扩增，经AflII酶切，结果只有371BP谱带的为含有Pi9基因纯合体，只有447BP谱带的为不含有Pi9基因，含有447BP和371BP两条谱带的单株为含有Pi9基因的杂合株。因此，当对自交分离群体进行鉴定时，利用Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR引物扩增，经AflII酶切，结果只有371BP谱带的为含有Pi9基因纯合体。
对于不育系含有Pi9基因(纯合)、恢复系不含有Pi9基因的杂交水稻纯度鉴定，根据标记Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR在水稻不育系、恢复系和杂交种中扩增产物酶切结果的差异，判别受检杂交稻种中是否存在不育系或恢复系(或其它亲本，是指不含Pi9基因的其它水稻株系或其它品种)单株混杂。利用Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR引物扩增，PCR产物经AflII酶切，不育系酶切谱带仅含有371BP谱带，恢复系酶切谱带仅含有447BP谱带，杂交种酶切谱带含有447BP和371BP两条谱带。因此，当不育系进行纯度鉴定时，凡是未酶切出大小371bp单一谱带的单株，都判定为混杂株；当对杂交水稻进行纯度鉴定时，凡是仅酶切出大小为371bp单一谱带的，判定为不育系混杂，凡是仅酶切出大小为447bp单一谱带的，都判定为恢复系(或其它亲本，指不含Pi9基因的其它水稻株系或其它品种)混杂。
对于不育系不含有Pi9基因、恢复系含有Pi9基因(纯合)的杂交水稻纯度鉴定，根据标记Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR在水稻不育系、恢复系和杂交种中扩增产物酶切结果的差异，判别受检杂交稻种中是否存在不育系(或其它亲本，指不含Pi9基因的其它水稻株系或其它品种)或恢复系单株混杂。利用Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR引物扩增，PCR产物经AflII酶切，不育系酶切谱带仅含有447BP谱带，恢复系酶切谱带仅含有371BP谱带，杂交种酶切谱带含有447BP和371BP两条谱带。因此，当对杂交水稻进行纯度鉴定时，凡是仅酶切出大小为447bp单一谱带的，判定为不育系混杂(或其它亲本，指不含Pi9基因的其它水稻株系或其它品种)，凡是仅酶切出大小为371bp单一谱带的，都判定为恢复系混杂。
水稻样品纯度检验结果按以下公式计算：
P ( % ) = N T - N D N T × 100 %
式中：
P—样品纯度；
NT—为供检种子粒数(幼苗数、株数)；
ND—为判定为混杂株的种子粒数(幼苗数、株数)。
本发明利用Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR标记鉴别母本含Pi9基因、父本不含Pi9基因杂交种纯度，结果表明，43株杂种F1代中，5株为母本混杂，1株为父本混杂，杂交种纯度为86.04％。利用Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR标记鉴别母本不含Pi9基因、父本含Pi9基因杂交种纯度，结果表明，在45株杂种F1代中，1株为母本混杂，6株为父本混杂，杂交种纯度为84.44％。
本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明开发的Pi9基因紧密锁的分子标记能够准确判断被检水稻样品是否含有Pi9基因、快速判断Pi9基因纯合体以及鉴定亲本之一含有Pi9基因的F1代杂交种纯度，能够应用于Pi9基因辅助选育。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
“不育系”包括“三系不育系”和“两系不育系”。三系不育系意指将选择到的雄性不育单株与可育的个体杂交再经连续回交培育而成的具有雄性不育特征且整齐一致的品质。两系不育系意指光温敏不育系，其育性转换与日照长短和温度高低有密切关系，在长日高温条件下，它表现雄性不育；在短日平温条件下，恢复雄性可育。
“恢复系”意指某一品系与不育系杂交后可使子代恢复雄性可育特征。
“保持系”意指当作为父本与不育系杂交时，能使F1保持雄性不育性的植物品系。
“分子标记”有广义和狭义之分，广义的“分子标记”意指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质；狭义“分子标记”意指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。
附图说明
图1为Pi9基因序列比较、标记引物及酶切位点在序列中的位置；
图2为引物Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR在部分水稻品种中扩增酶切结果；其中，M：标准分子量；1为75-1-127；2为N779S；3为N632S；4为93-11；5为日本晴；6为f232；7为f251；8为f254；9为1892S；
图3为引物Pi9-NheIF/Pi9-NheIR1在部分水稻品种中扩增酶切结果；其中，M：标准分子量；1为75-1-127；2为N779S；3为N632S；4为93-11；5为日本晴；6为f232；7为f251；8为f254；9为1892S；
图4为引物Pi9-Bsp1286I F/Pi9-Bsp1286I R在部分水稻品种中扩增酶切结果；其中，M为标准分子量；1为75-1-127；2为N779S；3为N632S；4为93-11；5为日本晴；6为f232；7为f251；8为f254；9为1892S；
图5为利用Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR标记区分Pi9基因杂合体；其中，M：标准分子量Marker；1：广占63S(不含Pi9基因两系不育系)；2：93-11(不含Pi9基因恢复系)；3：N632S(含Pi9基因两系不育系)；4：SE2(含Pi9基因恢复系)；5，6：广占63S/SE2F1代杂交种(Pi9基因杂合体)；7，8：N632S/93-11F1代杂交种(Pi9基因杂合体)；
图6为Pi9基因分子辅助选育流程图；
图7为引物Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR对含Pi9基因分离世代(BC2F4)的辅助选育；其中，M为标准分子量；1为Pi9基因供体75-1-127；2为广占63S；6，10，12，19为Pi9基因纯合体；4，5，7，8，11，13，15，16，18为Pi9基因杂合体；其余为不含Pi9基因单株；
图8为利用Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR标记鉴别母本含Pi9基因、父本不含Pi9基因杂交种纯度；其中，M：标准分子量Marker；1：WH26(父本，不含Pi9基因恢复系)；2：N632S(母本，含Pi9基因两系不育系)；3-45:杂种F1代(其中3，4，16，31，36为母本混杂；22为父本混杂)；
图9为利用Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR标记鉴别母本不含Pi9基因、父本含Pi9基因杂交种纯度；其中，M：标准分子量Marker；1：SE2(父本，含Pi9基因恢复系)；2：1892S(母本，不含Pi9基因两系不育系)；3-47：杂种F1代(其中4、18、21、25、27和41为父本混杂；35为母本混杂)。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
1、实验材料
水稻品种Pi9基因供体75-1-127、Pi9基因转育后代N632S和N779S、其他材料f232、f254、f251、1892S。
其中，75-1-127、N779S和N632S为Pi9基因纯合体，其余水稻品种不含Pi9基因。
75-1-127为O.minuta/IR31917回交后代(来源于国际水稻研究所IRRI)；
N632S为广占63S/6G241BC3F4代(6G241：75-1-123/CBB23F8代)；N779S为1892S/7J278BC3F5代(7J278：75-1-123/CBB23F9代)；f232、f254、f251为93-11/WH26F6代、1892S为培矮64S变异株；均为安徽省农业科学院水稻研究所选育；
WH26(中籼2707与籼粳交优质稻209512杂交育成高产中籼品种)，SE2(93-11/75-1-127回交后代选育的抗病株系)。
实施例1与Pi9基因紧密锁的分子标记的开发
1、实验方法
1.1 CTAB法提取水稻基因组DNA
剪取Pi9基因供体75-1-127、Pi9基因转育后代N632S和N779S、其他材料93-11、日本晴、f232、f251、f254、1892S材料幼嫩叶片100-200mg，移入2.0mL离心管中，向离心管中加液氮用玻棒充分研磨至粉末状，再加入700μL 65℃预热的DNA提取液(81.7g NaCl和20gCTAB充分溶于适量水中，然后加入1mol/L Tris-HCl 100mL，0.5mol/L EDTA 40mL，定容至1000mL，4℃贮存)，65℃孵育1h，每隔15min颠倒混匀一次；加入等体积氯仿/异戊醇，轻缓混匀，室温静置15min；12,000rpm离心15min，吸取上清移至另一支1.5mL离心管中，再加入等体积异丙醇混匀，置于-20℃30min，4℃、12,000rpm离心10min，弃上清，加入200μL70％乙醇洗涤沉淀；12,000rpm离心10min后弃去乙醇，室温干燥后加入50μL灭菌水，充分溶解后备用。
1.2 Pi9基因功能区域序列测定
1.2.1 Pi9基因功能区域DNA测序引物序列
设计引物对多个品种的pi9基因功能区域进行测序，引物序列如下：
Pi9F1:GTATATCAAAGATGAGCTAAAAACA
Pi9R1:TTCCAATCATGTAAAATCCATAGAT
Pi9F2:AAGGAGAAGAGGTACTTTGTTATTC
Pi9R2:GACAAGTCTTAATTTTTCCTGCTAT
Pi9F3:CAAAGGTTGGGATGACGACTAAGGA
Pi9R3:ACCTTCACACCGAATGATTCAGACC
Pi9F4:TATGCCTGCCTAAAGTATTCACACC
Pi9R4:TTTGAATACTAGCTTCTCCCCAAGG
Pi9F5:AGAGATGCCTAACTGGATTGAGCAG
Pi9R5:CTATCGTTCGTCGTCAACGTGATCA
1.2.2 PCR扩增
利用测序引物对水稻基因组DNA进行扩增，扩增体系中各组分配制如下：
注：反应体积可选择在5-25L之间，模板DNA原浓度在20-200ng/L之间。
扩增条件为：95℃变性5min后，94℃1min，55℃1min，72℃1min，循环35次，72℃延伸10min，12℃保温。扩增产物采用2％琼脂糖凝胶电泳进行检测。
1.3 Pi9基因功能区域序列比较
利用DNAMAN软件对获得的序列进行比较，找出Pi9基因专一性的差异。
1.4 Pi9基因检测引物设计与验证
根据Pi9基因功能区域的特有差异，设计PCR检测引物，PCR扩增水稻品种75-1-127、N779S、N632S、93-11、日本晴、f232、f251、f254、1892S；利用相应的内切酶分别对引物扩增的PCR产物进行酶切。酶切产物经4％琼脂糖电泳分离。根据酶切结果，区分Pi9基因的有无。
2、实验结果
2.1 Pi9基因功能区域序列比较
对多个品种的pi9基因功能区域进行测序，利用DNAMAN软件对获得的序列进行比较，找出了Pi9基因专一性的差异，结果见图1。
2.2 Pi9基因检测引物设计与验证
根据Pi9基因功能区域的特有差异，设计PCR检测引物Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR、Pi9-NheIF/Pi9-NheIR1和Pi9-Bsp1286IF/Pi9-Bsp1286IR，引物序列如下：
Pi9-AflIIF：AAACTACAGGGCCTACA
Pi9-AflIIR：CAATGGCTGCATAAAGTA
Pi9-NheIF：GTCGAATAGTAATAACCACTCGGAATGTTGAGCT
Pi9-NheIR1：TTAGTTGCAAGCACAGCTCCTATTG
Pi9-Bsp1286IF：GATGGCTCTGATTTAGTT
Pi9-Bsp1286IR：CTTCATTGGGTGGTTTAG
PCR扩增水稻品种75-1-127、N779S、N632S、93-11、日本晴、f232、f251、f254、1892S基因组。
PCR反应体系如下：
扩增程序：94℃变性5min后，94℃1min，55℃1min，72℃1min，循环35次，72℃延伸10min，12℃保温。
分别利用AflII、NheI、Bsp1286I内切酶对引物Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR、Pi9-NheIF/Pi9-NheIR1、Pi9-Bsp1286IF/Pi9-Bsp1286IR扩增的PCR产物进行酶切。
AflII、NheI酶切体系中各组分配制如下：
反应温度为37℃，酶切12h，酶切产物经4％琼脂糖电泳分离。
Bsp1286I酶切体系中各组分配制如下：
反应温度为30℃，酶切12h，酶切产物经4％琼脂糖电泳分离。
结果表明，引物Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR对Pi9基因功能区域进行扩增，Pi9基因第二外显子2128BP处碱基C变为G(日本晴、9311等)，为AflII酶切位点，PCR产物经AflII酶切后可以实现对Pi9基因的有效区分(图2)，酶切谱带中含有371BP谱带的为含有Pi9基因水稻品种，只有447BP谱带的为不含有Pi9基因的水稻品种。
而利用引物Pi9-NheIF/Pi9-NheIR1扩增，经NheI酶切，无法区分Pi9基因有无(图3)；
引物Pi9-Bsp1286IF/Pi9-Bsp1286IR同样不能区分Pi9基因有无(图4)，说明不是所有的SNP都能用于区分pi9基因。
实验例1利用Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR标记区分Pi9基因杂合体
1、实验方法
利用PCR检测引物Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR(核苷酸序列为SEQ ID No.11和SEQ IDNo.12所示)扩增水稻品种广占63S(不含Pi9基因两系不育系)，93-11(不含Pi9基因恢复系)，N632S(含Pi9基因两系不育系)，SE2(含Pi9基因恢复系)；广占63S/SE2F1代杂交种(Pi9基因杂合体)；N632S/93-11F1代杂交种(Pi9基因杂合体)的基因组。利用AflII内切酶对扩增的PCR产物进行酶切(反应体系及程序参照实施例1)。酶切产物经4％琼脂糖电泳分离。
2、实验结果
结果见图5。经引物Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR扩增，AflII酶切，不含Pi9基因水稻品种广占63S和93-11的酶切谱带中只有447BP谱带；Pi9基因纯合品种N632S和SE2的酶切谱带中仅有371BP谱带；Pi9基因杂合体广占63S/SE2F1代杂交种、N632S/93-11F1代杂交种的酶切谱带中有447BP和371BP两条谱带。
结果表明，Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR标记能够准确区分被检水稻样品是否含有Pi9基因以及含有的Pi9基因为杂合或纯合。
实验例2利用标记Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR对Pi9基因辅助选育
1、实验方法
1.1含Pi9基因材料的选育
含Pi9基因材料的选育流程见图6。
1.2水稻基因组DNA提取
所用水稻材料：广占63S不育系为母本与抗稻瘟病材料75-1-127杂交选育的BC2F4代群体单株。
其中，广占63S不育系为不含Pi9基因的不育系，为N422S/广占63杂交后代；75-1-127为含有Pi9基因的供体材料。
剪取成株期水稻幼嫩叶片100-200mg，CTAB法提取基因组DNA。
1.3水稻基因组DNA的PCR扩增及酶切
利用引物Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR对75-1-127，广占63S及BC2F4群体单株基因组DNA进行扩增，扩增产物经AflII酶切后(反应体系及程序参照实施例1)，用4％琼脂糖凝胶电泳进行检测。
2、实验结果
从酶切结果可以看出，Pi9基因供体75-1-127，单株6、10、12、19的酶切谱带中只含有371BP谱带，为Pi9基因纯合单株；单株4、5、7、8、11、13、15、16、18的酶切谱带中含有447BP和371BP两条谱带，为Pi9基因杂合单株；广占63S及其余单株的酶切谱带中仅含有447BP谱带，为不含Pi9基因单株(图7)。
在回交后代中，选择Pi9基因杂合型单株；在自交后代中，选择Pi9基因纯合型单株。
实验例3利用Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR标记鉴别母本含Pi9基因、父本不含Pi9基因杂交种纯度
1、实验方法
以N632S作母本(含Pi9基因两系不育系)与恢复系WH26(父本，不含Pi9基因恢复系)杂交，收获杂种F1代，利用引物Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR对杂种F1代基因组DNA进行扩增，扩增产物经AflII酶切后(反应体系及程序参照实施例1)，用4％琼脂糖凝胶电泳进行检测。
2、实验结果
结果见图8，43株杂种F1代中，5株为母本混杂，1株为父本混杂。
杂交种纯度＝(检测F1植株数-混杂母本植株数-混杂父本植株数)/检测F1植株数*100％＝(43-5-1)/43*100％＝86.04％。
实验例4利用Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR标记鉴别母本不含Pi9基因、父本含Pi9基因杂交种纯度
1、实验方法
以水稻品种SE2作父本(含Pi9基因恢复系)，以1892S作母本(不含Pi9基因两系不育系)进行杂交，收获杂种F1代，利用引物Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR对杂种F1代基因组DNA进行扩增，扩增产物经AflII酶切后(反应体系及程序参照实施例1)，用4％琼脂糖凝胶电泳进行检测。
2、实验结果
结果见图9，45株杂种F1代中，1株为母本混杂，6株为父本混杂。
杂交种纯度＝(检测F1植株数-混杂母本植株数-混杂父本植株数)/检测F1植株数*100％＝(45-6-1)/45*100％＝84.44％。

Claims (10)

1.一种检测与稻瘟病Pi9基因紧密连锁标记的引物对，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的引物对。
2.一种利用权利要求1所述引物对检测水稻品种或株系中是否含有Pi9基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待检测水稻样品基因组DNA；(2)利用权利要求1所述的引物对进行PCR扩增；(3)用AflII内切酶酶切步骤(2)的PCR扩增产物，电泳；(4)根据酶切结果判断，如果酶切谱带含有371BP谱带，则待检测水稻样品含有Pi9基因；如果酶切谱带仅有447BP谱带，则待检测水稻样品不含有Pi9基因。
3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)PCR反应体系为：
2×PCR buffer II 25μL，2.0mmol/L dNTPs 5.0μL，10μmol/L SEQ ID No.11所示引物2.5μL，10μmol/L SEQ ID No.12所示引物2.5μL，5U/μL LA Taq酶0.5μL，模板DNA 5.0μL，ddH2O 9.5μL，总体积50μL；PCR程序为：94℃变性5min后，94℃1min，55℃1min，72℃1min，循环35次，72℃延伸10min，12℃保温；
步骤(3)酶切体系为：ddH2O 5.8μL，10×Buffer 2.0μL，10×BSA 2.0μL，10U/μL内切酶0.2μL，步骤(2)PCR产物10μL，总反应体积20μL；酶切反应温度为37℃，酶切时间为12h。
4.一种检测水稻品种或株系中是否含有Pi9基因以及含有的Pi9基因为杂合或纯合的试剂盒，由彼此独立的试剂1和试剂2组成；其中，试剂1的组成包括：2×PCR缓冲液，dNTPs混合溶液，检测上下游引物对，LA Taq DNA聚合酶和双蒸水；试剂2的组成包括：双蒸水，10×Buffer缓冲液，10×BSA，内切酶；其特征在于：所述检测上下游引物对为权利要求1所述的引物对；所述内切酶为AflII内切酶。
5.权利要求1所述的引物对在Pi9基因辅助选育中的应用。
6.按照权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)利用权利要求1所述的引物对扩增待检测水稻样品基因组DNA；(2)AflII内切酶酶切扩增的产物，电泳；(3)根据酶切结果判断，如果酶切谱带只有371BP谱带，则待检测水稻样品是Pi9基因纯合体；如果酶切谱带含有447BP和371BP两条谱带，则待检测水稻样品是Pi9基因杂合体；如果酶切谱带仅有447BP谱带，则待检测水稻样品不含Pi9基因。
7.权利要求1所述的引物对在不育系为Pi9基因纯合体且恢复系不含Pi9基因的杂交水稻纯度鉴定中的应用。
8.按照权利要求7所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待检测水稻品种或株系基因组DNA；(2)利用权利要求1所述的引物对进行PCR扩增；(3)步骤(2)的PCR扩增产物经AflII内切酶酶切，电泳；(3)根据酶切结果判断，如果酶切谱带仅含有371BP谱带，则待检测水稻样品是不育系；如果酶切谱带仅含有447BP谱带，则待检测水稻样品是恢复系；如果酶切谱带含有447BP和371BP两条谱带，则待检测水稻样品是杂交水稻。
9.权利要求1所述的引物对在不育系不含Pi9基因且恢复系为Pi9基因纯合体的杂交水稻纯度鉴定中的应用。
10.按照权利要求9所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待检水稻品种或株系基因组DNA；(2)利用权利要求1所述的引物对进行PCR扩增；(3)步骤(2)的PCR扩增产物经AflII内切酶酶切，电泳；(3)根据酶切结果判断，如果酶切谱带仅含有447BP谱带，则待检水稻样品是不育系；如果酶切谱带仅含有371BP谱带，则待检水稻样品是恢复系；如果酶切谱带含有447BP和371BP两条谱带，则待检水稻样品是杂交水稻。
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