CN105112504B - 一种水稻高氮利用效率基因的分子标记鉴定方法 - Google Patents

一种水稻高氮利用效率基因的分子标记鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种水稻高氮利用效率基因的分子标记鉴定方法，属于生物工程技术领域。NRT1.1B是一个高氮利用效率基因，根据野生型NRT1.1B基因与突变型nrt1.1b基因存在的单核苷酸差异，设计由四引物组成的分子标记，加入到同一管PCR反应体系中对不同水稻植株DNA进行PCR扩增。若同时扩增出368 bp和243 bp两条特征条带，则为含NRT1.1B基因的纯合体；若同时扩增出368 bp和177 bp两条特征条带，则为含nrt1.1b基因的纯合体；若同时扩增出368 bp、243 bp和177 bp三条特征条带，则为含NRT1.1B/ nrt1.1b基因的杂合体。本发明对NRT1.1B基因的基因型检测不仅快速、便捷、准确，而且操作简单费用低廉，非常适合大批量水稻材料的目的基因鉴定，为水稻资源基因鉴定及分子标记辅助选择育种提供了重要参考。

Description

一种水稻高氮利用效率基因的分子标记鉴定方法
技术领域
本发明涉及一种水稻高氮利用效率基因(NRT1.1B)的分子标记鉴定方法，属于生物技术工程领域，专用于水稻高氮利用效率NRT1.1B基因的水稻资源鉴定和标记辅助育种。
背景技术
水稻是我国最重要的粮食作物之一，全国水稻种植面积约占粮食作物面积的30％，产量接近粮食总产量的一半(张佳宇，吉林农业大学，2008)，约为我国60％以上的人口提供口粮。按照植物学分类划分，我国种植的水稻品种属于亚洲栽培稻。亚洲栽培稻有两个亚种，即籼亚种和粳亚种(杨有新等，科学通报，2009，(15):2212-2218)，它们在形态、发育与生理等方面都表现出较大的不同特征。从目前来看，粳稻的产量往往不及籼稻，然而前者食味品质却大都优于后者。随着人们生活水平的不断提高，粳稻凭借较优的食味品质而更受消费者的青睐，在我国的种植面积逐年扩大。但与籼稻相比，粳稻的低氮肥利用效率成为制约其种植面积扩大的重要因素。令人兴奋的是，2015年6月8日世界著名杂志《NatureGenetic》在线报道了“一个伟大的发现”，Hu等从籼稻中克隆了一个高氮利用效率NRT1.1B基因；试验表明，将NRT1.1B基因导入粳稻，大大提高粳稻的氮肥吸收率，一半施肥条件下，与对照相比增产30～33％，氮肥利用效率提高30％；在正常施氮条件下，增产8～10％，氮肥利用效率提高约10％(Hu B,et al.,NatGenet,2015,47(7):834-838)。NRT1.1B基因在粳稻氮肥利用效率改良上具有巨大应用价值，相应基因的鉴定方法值得研究探讨。
序列分析显示，籼稻野生型NRT1.1B基因与粳稻突变型nrt1.1b基因在编码序列(Coding sequence，CDS)区域第980位存在一个碱基T与C的差异。对于单碱基差异的检测，最直接的方法就是测序，但存在费用昂贵、操作工序复杂及耗时长等缺点，不利于推广应用。四引物扩增受阻突变体系PCR(tera-primer amplification refractory mutationsystem-PCR，tera-primer ARMS-PCR)是在普通PCR基础上发展起来专门用于单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)检测的衍生技术，能对SNP进行分型鉴定，呈共显性标记特性，是一种简便、快速、低廉检测SNP的方法(管峰等，生命的化学，2004,24(6):514-516)。基于籼稻野生型NRT1.1B基因与粳稻突变型nrt1.1b基因存在的单核苷酸差异，结合tera-primer ARMS-PCR引物设计原理，本发明开发出了用于鉴定水稻高氮素利用效率NRT1.1B基因的分子标记，为相应目的基因的资源鉴定和分子标记辅助选择育种中提供重要参考，有利于提高工作成效。
发明内容
本发明的技术问题：本发明针对利用测序鉴定NRT1.1B基因存在的费用昂贵、工序复杂及耗时长等缺点，根据野生型NRT1.1B基因与突变型nrt1.1b基因在编码序列CDS第980位存在的碱基T与C的差异，结合tera-primer ARMS-PCR引物设计原理，开发该基因的四条特异性引物并于同管PCR反应扩增水稻基因组DNA来准确、快速地鉴定NRT1.1B基因的类型，为相应目的基因的资源筛选鉴定和分子标记辅助选择育种提供重要参考。
本发明的技术方案：一种水稻高氮利用效率基因的分子标记鉴定方法，其特征在于:使用高氮利用效率NRT1.1B基因的特异性引物。引物包括四条，序列如下：
正向外引物NRT1.1B-O-F：5'-GATGGAGGCGATGAGGAAGA-3'；
反向外引物NRT1.1B-O-R：5'-GCTGCCAAGAAACACCACAA-3'；
正向内引物NRT1.1B-I-F：5'-TCGTGCACAGCCTCCACTTGCTCGACG-3'；
反向内引物NRT1.1B-I-R：5'-AGGTCGGCGGCGGAGTCGCCGGCTAT-3'。
使用以上所述的四条引物准确、快速鉴定区分NRT1.1B基因型的PCR分子标记方法如下：
(1)水稻植株基因组DNA的提取：取分蘖期水稻叶片适量，按CTAB方法对DNA进行提取，具体步骤为：①取约0.05g新鲜叶片，置于研钵中，加入0.5ml的CTAB溶液(CTAB-2％(W/V)，NaCl-1.4mol/L，EDTA-0.02mol/L，Tris Basic-0.1mol/L，pH＝8.0)进行研磨；②将研磨液移入1.5ml的离心管，在65℃下水浴1h，期间摇晃数次；③12000rpm离心8min，回收上清液0.3ml至灭菌1.5ml离心管，弃去沉淀；④加入苯酚:氯仿:异戊醇溶液(25:24:1)0.3ml，上下颠倒数次，静置10min；⑤12000rpm离心10min，小心吸取上清0.2ml至灭菌1.5ml离心管；⑥加入20μl的3mol/L NaAC(PH＝5.2)，再加入0.4ml的-20℃无水乙醇，-20℃静置1h；⑦12000rpm离心10min，弃上清液，加入0.3ml的70％乙醇洗涤两次；⑧将离心管放到超净工作台风干，加入0.2ml超纯水溶解备用。
(2)水稻基因组DNA的PCR扩增：将所述的四条引物NRT1.1B-O-F、NRT1.1B-O-R、NRT1.1B-I-F及NRT1.1B-I-R加入到同管PCR反应体系对水稻植株的DNA进行扩增；20μL的PCR反应体系包括：DNA 2μL(10～100ng/L)，引物NRT1.1B-O-F、NRT1.1B-O-R、NRT1.1B-I-F及NRT1.1B-I-R各0.5μL(2μM)，10×Taq Buffer 2μL(含Mg2+)，dNTP Mixture 0.4μL(2.5mM)，TaqDNA聚合酶0.4(2500U/mL)，ddH2O 13.2μL。PCR反应程序为：先在95℃下预变性5min；然后95℃下变性30s，62℃下退火复性30s，72℃下延伸1min，循环31次；然后72℃下再延伸10min，12℃下2min，可将产物取出备用。
(3)扩增产物的检测：扩增产物在质量比浓度约为3％的琼脂糖凝胶于150V电压下电泳40min，华越洋的gillgreen核酸染料染色，置于伯乐凝胶成像系统GEL DOC XR下观察、拍照及记载。若同时扩增出368bp和243bp两条特征条带，则为含野生型NRT1.1B基因的纯合体；若同时扩增出368bp和177bp两条特征条带，则为含突变型nrt1.1b基因的纯合体；若同时扩增出368bp、243bp和177bp三条特征条带，则为含NRT1.1B/nrt1.1b基因的杂合体。
本发明的有益效果：本发明提供的“一种水稻高氮利用效率基因的分子标记鉴定方法”，具有如下优点：
(1)本发明提供的分子标记并非与NRT1.1B连锁的标记，而是基于基因本身的DNA序列而设计的功能性分子标记，它能直接反映水稻植株的基因型，不会发生类似连锁标记与基因的遗传交换而导致基因型鉴定的错误。
(2)本发明提供的分子标记能准确、快速地对水稻高氮利用效率NRT1.1B基因的基因类型进行鉴定。
(3)与测序鉴定相比，本发明采用四条引物同管一步PCR扩增方法对NRT1.1B基因的基因型进行鉴定，不仅能高效地区分目的基因的纯合和杂合类型，而且还可以克服费用昂贵、工序复杂及耗时长等缺点，显得更为高效、快捷且费用低廉，非常适合对大批量水稻资源及育种材料的鉴定，具有重大的意义和推广价值。
附图说明
图1鉴定高氮利用效率NRT1.1B基因分子标记的设计策略
(nrt1.1b代表粳稻突变型基因序列；NRT1.1B代表籼稻野生型基因序列；对比序列中标示有下划线的字母表示存在差异的碱基；箭头表示引物位置及扩增方向，NRT1.1B-O-F表示正向外引物，NRT1.1B-O-R表示反向外引物，NRT1.1B-I-F表示正向内引物，NRT1.1B-I-R表示反向内引物)
图2分子标记对水稻NRT1.1B基因的检测
(M:100bp DNA Ladder；1：9311；2：南京11；3：培矮64；4：胜利籼；5：特青；6：黄华占；7：明恢63；8：珍汕97B；9：日本晴；10：武运粳7；11：秀水134；12：空育131；13：龙粳29；14：秀水114；15：武运粳23号；16：牡丹江28；17：F1(9311/日本晴)；18：F1(培矮64/日本晴)；19：F1(9311/空育131)；20：F1(南京11/日本晴)。)
图3分子标记对培矮64/武运粳7的F2群体中单株不同基因型的检测
(M:100bp DNA Ladder；P1:武运粳7；P2：培矮64；1-18:F2个体植株。)
具体实施方式
下面结合实施例对本发明“一种水稻高氮利用效率基因的分子标记鉴定方法”作进一步的详细说明。
下面给出本发明的一个实施例：
1、供试材料：
(1)明确含野生型NRT1.1B基因的籼稻8份：9311、南京11、培矮64、胜利籼、特青、黄华占、明恢63、珍汕97B(Hu B,et al.,Nat Genet,2015,47(7):834-838)；
(2)明确含突变型nrt1.1b基因的粳稻8份：日本晴、武运粳7、秀水134、空育131、龙粳29、秀水114、武运粳23号、牡丹江28(Hu B,et al.,Nat Genet,2015,47(7):834-838)；
(3)明确含NRT1.1B与nrt1.1b基因的亲本杂交的后代F1材料4份：F1(9311/日本晴)，F1(培矮64/日本晴)，F1(9311/空育131)，F1(南京11/日本晴)；
(4)培矮64/武运粳7杂交的后代F2育种材料。
上述材料于2015年4月10日种于贵州省毕节市农业科学研究所水稻科研基地。
2、引物设计及合成：
根据Hu(Nat Genet.2015,47(7):834-838)等的研究结果，野生型NRT1.1B基因与突变型nrt1.1b基因CDS区域的第980位分别存在的碱基T与C的差异，从NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)下载NRT1.1B基因的DNA序列(GenBank：DP000086.1)，定位到DNA序列相应的位置，结合专用于检测SNP突变的tera-primer ARMS-PCR引物设计原理，设计用于检测鉴定NRT1.1B基因的分子标记，标记由4条引物组成，包括内外引物各2条。
正向外引物NRT1.1B-O-F：5'-GATGGAGGCGATGAGGAAGA-3'；
反向外引物NRT1.1B-O-R：5'-GCTGCCAAGAAACACCACAA-3'；
正向内引物NRT1.1B-I-F：5'-TCGTGCACAGCCTCCACTTGCTCGACG-3'；
反向内引物NRT1.1B-I-R：5'-AGGTCGGCGGCGGAGTCGCCGGCTAT-3'。
其中，为增强标记特异性，在正、反内引物的3'端倒数第3位各引入一个人工错配碱基，即正向内引物由C变A，而反向内引物由G变T(引物设计策略见图1)。
依据各引物所处的DNA序列位置，理论上，所有水稻材料均可扩增出368bp的条带，为阳性对照；而含纯合籼稻野生型NRT1.1B基因的材料特征带为243bp的条带，含纯合粳稻突变型nrt1.1b基因的材料特征带为177bp的条带，籼粳杂交NRT1.1B/nrt1.1b基因杂合材料则扩增出以上所提及的所有条带。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
3、水稻DNA提取、PCR扩增及电泳检测：
(1)水稻DNA的提取：取分蘖期水稻叶片适量，按照常规CTAB法对DNA进行提取，具体是：①取约0.05g新鲜叶片，置于研钵中，加入0.5ml的CTAB溶液(CTAB-2％(W/V)，NaCl-1.4mol/L，EDTA-0.02mol/L，Tris Basic-0.1mol/L，pH＝8.0)进行研磨；②将研磨液移入1.5ml的离心管，在65℃下水浴1h，期间摇晃数次；③12000rpm离心8min，回收上清液0.3ml至灭菌1.5ml离心管，弃去沉淀；④加入苯酚:氯仿:异戊醇溶液(25:24:1)0.3ml，上下颠倒数次，静置10min；⑤12000rpm离心10min，小心吸取上清0.2ml至灭菌1.5ml离心管；⑥加入20μl的3mol/L NaAC(PH＝5.2)，再加入0.4ml的-20℃无水乙醇，-20℃静置1h；⑦12000rpm离心10min，弃上清液，加入0.3ml的70％乙醇洗涤两次；⑧将离心管放到超净工作台风干，加入0.2ml超纯水溶解备用。
(2)PCR扩增：NRT1.1B基因的分子标记的引物序列为：
正向外引物NRT1.1B-O-F：5'-GATGGAGGCGATGAGGAAGA-3'；
反向外引物NRT1.1B-O-R：5'-GCTGCCAAGAAACACCACAA-3'；
正向内引物NRT1.1B-I-F：5'-TCGTGCACAGCCTCCACTTGCTCGACG-3'；
反向内引物NRT1.1B-I-R：5'-AGGTCGGCGGCGGAGTCGCCGGCTAT-3'。
将以上所叙述的四条引物加入到同一PCR管中，分别对供试水稻材料的DNA进行PCR扩增；20μL的PCR反应体系包括：DNA 2μL(10～100ng/L)，引物NRT1.1B-O-F、NRT1.1B-O-R、NRT1.1B-I-F及NRT1.1B-I-R各0.5μL(2μM)，10×Taq Buffer 2μL(含Mg2+)，dNTPMixture 0.4μL(2.5mM)，TaqDNA聚合酶0.4(2500U/mL)，ddH2O 13.2μL。PCR反应程序为：先在95℃下预变性5min；然后95℃下变性30s，62℃下退火复性30s，72℃下延伸1min，循环31次；然后72℃下再延伸10min，12℃下2min，可将产物取出备用。
(3)扩增产物的电泳检测：扩增产物在质量比浓度约为3％的琼脂糖凝胶于150V电压下电泳40min，华越洋的gillgreen核酸染料染色，置于伯乐凝胶成像系统GEL DOC XR下观察、拍照及记载。
4、本发明的分子标记对水稻NRT1.1B基因的检测
为使鉴定的效果具有直观性、可对比性及高可信度，本发明选用Hu等(HuB,etal.,Nat Genet,2015,47(7):834-838)已明确含NRT1.1B、nrt1.1b及NRT1.1B/nrt1.1b基因的不同水稻材料进行验证。应用所开发的分子标记对供试水稻材料的DNA进行PCR扩增，其产物经琼脂糖凝胶电泳检测。被正向外引物NRT1.1B-O-F和反向外引物NRT1.1B-O-R所扩增的阳性对照368bp条带在所有检测的材料中均呈现，表明所有DNA样本得到了有效扩增；除368bp外，9311、南京11、培矮64、胜利籼、特青、黄华占、明恢63、珍汕97B等8份含籼型NRT1.1B基因水稻品种还能扩增出一条明显的243bp条带，为正向外引物NRT1.1B-O-F和反向内引物NRT1.1B-I-R的扩增产物，特异扩增籼型NRT1.1B基因CDS第980位核苷酸为碱基T的等位位点；日本晴、武运粳7、秀水134、空育131、龙粳29、秀水114、武运粳23号、牡丹江28等8份含粳型nrt1.1b基因的品种没有出现243bp的条带，但能扩增出177bp大小的条带，为正向内引物NRT1.1B-I-F和反向外引物NRT1.1B-O-R扩增产生，特异扩增粳型nrt1.1b基因CDS第980位核苷酸为碱基C的等位位点；而含NRT1.1B/nrt1.1b基因型的F1(9311/日本晴)、F1(培矮64/日本晴)、F1(9311/空育131)及F1(南京11/日本晴)等4份籼粳杂交后代材料，则扩增出了NRT1.1B和nrt1.1b材料所能扩增出的条带类型，即扩增出368bp、243bp和177bp三种条带类型。检测情况见图2所示。本发明所开发的分子标记对NRT1.1B、nrt1.1b及NRT1.1B/nrt1.1b的水稻材料扩增出了不同的特征条带，条带类型与基因型完全一致，且片段与预测大小相吻合。以上结果表明，本发明基于tera-primer ARMS-PCR方法开发的分子标记能准确地鉴定NRT1.1B基因的类型及其纯或杂合状态，可用于水稻种质资源目的基因的鉴定和分子标记辅助选择育种，以提高工作效率。
5、本发明的分子标记对培矮64/武运粳7的F2群体植株NRT1.1B基因的鉴定
利用本发明所设计的分子标记对来自培矮64/武运粳7的杂交后代F2育种材料248株植株的DNA进行PCR扩增，所有F2的个体DNA得到了有效扩增，没有出现非特异扩增带，65株扩增出了368bp和243bp两条带型，70株扩增出了368bp和177bp两条带型，其余的113株则扩增出了368bp、243bp及177bp三条带型。表明筛选到了含NRT1.1B纯合基因型65株，杂合NRT1.1B/nrt1.1b基因型113株，剩余的70株为含突变基因nrt1.1b植株，为下一步我们对该群体的个体取舍提供了重要参考。值得注意的是，在对这F2群体检测中，三种基因型NRT1.1B:(NRT1.1B/nrt1.1b):nrt1.1b的比例接近1:2:1(χ2＝2.15)，没有发生偏分离现象，这说明在达到鉴定目的基因的同时，也进一步充分证实了所设计的分子标记具有广泛的应用价值。部分F2植株检测情况见图3所示。
当然，以上只是本发明的具体应用范例，本发明还有其他的实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 毕节市农业科学研究所
<120> 一种水稻高氮利用效率基因的分子标记鉴定方法
<130> 2015
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> NRT1.1B-O-F
<222> (1)...(20)
<223>
<400> 1
gatggaggcg atgaggaaga 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> NRT1.1B-O-R
<222> (1)...(20)
<223>
<400> 2
gctgccaaga aacaccacaa 20
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> NRT1.1B-I-F
<222> (1)...(27)
<223>
<400> 3
tcgtgcacag cctccacttg ctcgacg 27
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> NRT1.1B-I-R
<222> (1)...(26)
<223>
<400> 4
aggtcggcgg cggagtcgcc ggctat 26

Claims (1)

1.一种水稻高氮利用效率基因的分子标记鉴定方法，其特征在于：水稻NRT1.1B是一个高氮利用效率基因；利用高氮利用效率NRT1.1B基因的特异性引物标记，该标记由4条引物组成，包括内外引物各2条，序列如下：
正向外引物NRT1.1B-O-F：5'-GATGGAGGCGATGAGGAAGA-3'；
反向外引物NRT1.1B-O-R：5'-GCTGCCAAGAAACACCACAA-3'；
正向内引物NRT1.1B-I-F：5'-TCGTGCACAGCCTCCACTTGCTCGACG-3'；
反向内引物NRT1.1B-I-R：5'-AGGTCGGCGGCGGAGTCGCCGGCTAT-3'；
以上四引物PCR扩增水稻的基因组DNA，若同时扩增出368 bp和243 bp两条特征条带，则为含野生型NRT1.1B基因的纯合体；若同时扩增出368 bp和 177 bp两条特征条带，则为含突变型nrt1.1b纯合基因的纯合体；若同时扩增出368 bp、243 bp和177 bp三条特征条带，则为含NRT1.1B/nrt1.1b基因的杂合体；步骤如下：
（1）水稻植株的基因组DNA的提取；
（2）将所述的四条引物NRT1.1B-O-F、NRT1.1B-O-R、NRT1.1B-I-F及NRT1.1B-I-R加入到同管PCR反应体系对水稻植株的DNA进行扩增；20μL的PCR反应体系包括：DNA 2 μL，引物NRT1.1B-O-F、NRT1.1B-O-R、NRT1.1B-I-F及NRT1.1B-I-R各0.5 μL，10×Taq Buffer 2 μL，dNTP Mixture 0.4 μL，Taq DNA聚合酶0.4，ddH2O 13.2 μL；
PCR反应程序为：先在95℃下预变性5min；然后95℃下变性30s，62℃下退火复性30s，72℃下延伸1min，循环31次；然后72℃下再延伸10min，12℃下2min，可将产物取出备用；
（3）扩增产物在质量比浓度为3%的琼脂糖凝胶于150V电压下电泳40min，华越洋的gillgreen核酸染料染色，置于伯乐凝胶成像系统GEL DOC XR下观察、拍照及记载。
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