CN111057785B

CN111057785B - 一种与甜瓜蔓枯病抗性相关的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN111057785B
Application number: CN202010051539.5A
Authority: CN
Inventors: 马建; 王建设; 李丛丛
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2020-01-17
Filing date: 2020-01-17
Publication date: 2022-08-02
Anticipated expiration: 2040-01-17
Also published as: CN111057785A

Abstract

本发明公开了一种与甜瓜蔓枯病抗性相关的分子标记及其应用。本发明公开的甜瓜蔓枯病抗性分子标记为序列表中序列4的第52‑58位的核苷酸，甜瓜基因组DNA中对应于序列表中序列4所示的DNA片段含有序列表中序列4的第52‑58位的核苷酸或不含有序列表中序列4的第52‑58位的核苷酸。实验证明，本发明的分子标记与甜瓜的蔓枯病抗性性状相关，利用本发明的分子标记鉴定甜瓜蔓枯病抗性的准确性可达100％，进一步可用于甜瓜分子标记辅助育种，在甜瓜生长的任意阶段进行筛选、鉴定，效率高、特异性好、准确度高，大大节约时间和成本，对加速甜瓜短蔓育种具有重要意义。

Description

一种与甜瓜蔓枯病抗性相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种与甜瓜蔓枯病抗性相关的分子标记及其应用。

背景技术

甜瓜(Cucumis melo L.)是一种深受各地人民喜爱的高档瓜果。近年来，随着农村产业结构调整和人民生活水平的日益提高，我国甜瓜的露地和保护地栽培均取得了长足发展，显著地提高了甜瓜的周年供应水平。但生产上无论是露地栽培的西北厚皮甜瓜产区，还是日光温室或大棚保护地栽培的东移厚皮甜瓜产区，都面临着由于连作重茬造成的蔓枯病危害日趋严重的问题。

蔓枯病(Gummy stem blight，GSB)又称黑斑病、黑腐病，由子囊菌亚门亚隔孢壳属的瓜类黑腐球壳菌(Didymella bryoniae(Anersw.)Rehm)引起，发病严重时植株基部萎缩，致使整个植株失水枯萎而死亡，是瓜类蔬菜生产上普遍发生的一种土传病害，它可以不同程度地危害甜瓜、黄瓜、西瓜、西葫芦等葫芦科作物，重病田块可减产80％以上，严重威胁瓜类蔬菜的生产(刘书林等，2013)。在甜瓜抗蔓枯病遗传规律及抗性基因研究方面，Frantz和Jahn(2004)及Wolukau等(2007；2009)分别对甜瓜材料PI140471、PI157082、PI511890、PI482398、PI482399和PI420145中携带的5个显性和1个隐形抗性基因进行等位性分析并重新命名为Gsb-1(Mc)、Gsb-2(Mc-3)、Gsb-3(Mc-4)、Gsb-4、gsb-5和Gsb-6。随后，针对这5个显性抗性基因分别鉴定出与其紧密连锁的分子标记，如与Gsb-1基因相聚5.2cM的SSR标记CMCT505，与Gsb-2基因相聚11.3cM的ISSR标记ISSR-57₅₆₀，与Gsb-3基因相聚8.3cM的ISSR标记ISSR-100₉₀₀，与Gsb-4基因相聚5.14cM的SSR标记CMTA170a以及与Gsb-6基因连锁的SCAR标记SGSB1800等，这些抗性基因及分子标记的鉴定，为进一步利用分子标记开展甜瓜抗蔓枯病基因辅助选择育种提供了可能。但是，这些已报导的分子标记与基因的遗传距离大多相距较远，导致实际应用中选择效率偏低。

目前，生产上对甜瓜蔓枯病的防治主要采用化学防治，实践证明，培育和种植甜瓜抗蔓枯病品种是控制此病害最为经济、有效和安全的方法。利用常规杂交育种方法需要进行蔓枯病抗性的表型鉴定，较为费事费力，而开发与蔓枯病抗性基因相关的特异分子标记，进行分子标记辅助选择育种，可在后代选育过程中进行早期选择、提高选择效率，降低育种成本，对促进甜瓜产业化发展具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种与甜瓜蔓枯病抗性相关的分子标记及其应用。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了甜瓜蔓枯病抗性分子标记或检测所述甜瓜蔓枯病抗性分子标记的物质在鉴定或辅助鉴定甜瓜蔓枯病抗性性状中的应用；所述甜瓜蔓枯病抗性分子标记为序列表中序列4的第52-58位的核苷酸，甜瓜基因组DNA中对应于序列表中序列4所示的DNA片段含有序列表中序列4的第52-58位的核苷酸或不含有序列表中序列4的第52-58位的核苷酸。

进一步的，所述检测所述甜瓜蔓枯病抗性分子标记的物质为由名称分别为Gsb1580-F和Gsb1580-R的单链DNA组成的引物对，所述Gsb1580-F为在甜瓜基因组中与序列4的第52位上游特异结合的单链DNA，所述Gsb1580-R为在甜瓜基因组中与序列4的第58位下游特异结合的单链DNA。所述引物对满足：以甜瓜基因组DNA为模板进行PCR扩增得到的DNA片段含有所述甜瓜蔓枯病抗性分子标记。

更进一步的，所述Gsb1580-F为序列表中序列1所示的单链DNA；所述Gsb1580-R为序列表中序列2所示的的单链DNA。

为了解决上述技术问题，本发明又提供了检测甜瓜基因型的方法，所述基因型为A1A1基因型、A1A2基因型和A2A2基因型，所述方法包括：检测待测甜瓜染色体中对应于序列表中序列4的第52-58位的核苷酸，如所述待测甜瓜两条染色体均为下述g2)的染色体，所述待测甜瓜为A1A1基因型甜瓜；检测待测甜瓜染色体中对应于序列表中序列4的第52-58位的核苷酸，如所述待测甜瓜两条染色体均为下述g1)的染色体，所述待测甜瓜为A2A2基因型甜瓜；如所述待测甜瓜两条染色体中一条为下述g1)的染色体，另一条为下述g2)的染色体，所述待测甜瓜为A1A2基因型甜瓜；

g1)含有序列表中序列4的第52-58位的核苷酸；

g2)不含序列表中序列4的第52-58位的核苷酸。

进一步的，采用上述引物对(所述Gsb1580-F和所述Gsb1580-R组成的引物对)检测待测甜瓜染色体中对应于序列表中序列4的第52-58位的核苷酸，所述检测的方法包括L1)和L2)：

L1)以待测甜瓜基因组DNA为模板，采用上述引物对进行PCR扩增得到PCR产物；

L2)下述L21)或L22)：

L21)检测步骤L1)得到的PCR产物的序列，根据所述PCR产物序列确定甜瓜基因型：如所述PCR产物中含有序列表中序列3所示的DNA片段、且不含有序列表中序列4所示的DNA片段，所述待测甜瓜为A1A1基因型甜瓜；如所述PCR产物中含有序列表中序列4所示的DNA片段、且不含有序列表中序列3所示的DNA片段，所述待测甜瓜为A2A2基因型甜瓜；如所述PCR产物中含有序列表中序列3和4所示的两种DNA片段，所述待测甜瓜为A1A2基因型甜瓜；

L22)检测步骤L1)得到的PCR产物的大小，根据所述PCR产物大小确定甜瓜基因型：如所述PCR产物中含有121bp的DNA片段、且不含有128bp的DNA片段，所述待测甜瓜为A1A1基因型甜瓜；如所述PCR产物中含有128bp的DNA片段、且不含有121bp的DNA片段，所述待测甜瓜为A2A2基因型甜瓜；如所述PCR产物中含有121bp和128bp两种大小的DNA片段，所述待测甜瓜为A1A2基因型甜瓜。

更进一步的，利用所述引物对(所述Gsb1580-F和所述Gsb1580-R组成的引物对)进行PCR扩增，所述Gsb1580-F和所述Gsb1580-R在反应体系中的浓度均可为0.5μmol/L。具体可采用如下反应体系进行PCR扩增：1μL Buffer、0.8μL dNTPs(四种dNTP每种的浓度均为2mmol/L)、所述Gsb1580-F和所述Gsb1580-R、1μL所述待测甜瓜基因组DNA(50ng/μL)、0.1μL

DNA Polymerase for PAGE，ddH₂O补至10μL。Buffer和

DNAPolymerase for PAGE均可为北京全式金生物技术有限公司产品。

利用所述引物对(所述Gsb1580-F和所述Gsb1580-R组成的引物对)进行PCR扩增时的退火温度可为59℃。利用所述引物对(所述Gsb1580-F和所述Gsb1580-R组成的引物对)进行PCR扩增具体可采用如下反应条件：94℃预变性4min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。

检测所述PCR产物的大小可通过电泳进行，也可通过测序进行。

本发明还提供了下述X1)或X2)或X3)的方法：

X1)鉴定或辅助鉴定甜瓜蔓枯病抗性性状的方法，包括：按照所述检测甜瓜基因型的方法检测待测甜瓜的基因型，A1A1基因型甜瓜的蔓枯病抗性大于或候选大于A1A2基因型或A2A2基因型甜瓜，A2A2基因型甜瓜蔓枯病抗性与A1A2基因型甜瓜蔓枯病抗性无差异或候选无差异；

X2)鉴定或辅助鉴定待测甜瓜为抗蔓枯病甜瓜还是感蔓枯病甜瓜的方法，包括：按照所述检测甜瓜基因型的方法检测待测甜瓜的基因型，A1A1基因型甜瓜为或候选为抗蔓枯病甜瓜，A1A2基因型或A2A2基因型甜瓜为或候选为感蔓枯病甜瓜；

X3)甜瓜育种方法，包括：按照所述检测甜瓜基因型的方法检测甜瓜的基因型，选择A1A1基因型甜瓜或A1A2基因型甜瓜作为亲本进行育种。

所述甜瓜蔓枯病抗性分子标记也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了具有如下Y1)-Y8)中任一用途的物质，所述物质包括所述引物对(所述Gsb1580-F和所述Gsb1580-R组成的引物对)：

Y1)检测所述甜瓜蔓枯病抗性分子标记；

Y2)制备检测所述甜瓜蔓枯病抗性分子标记的产品；

Y3)鉴定或辅助鉴定甜瓜蔓枯病抗性性状；

Y4)制备鉴定或辅助鉴定甜瓜蔓枯病抗性性状产品；

Y5)鉴定或辅助鉴定待测甜瓜为抗蔓枯病甜瓜还是感蔓枯病甜瓜；

Y6)制备鉴定或辅助鉴定待测甜瓜为抗蔓枯病甜瓜还是感蔓枯病甜瓜的产品；

Y7)甜瓜育种；

Y8)制备甜瓜育种的产品。

本发明还提供了下述任一应用：

H1)所述甜瓜蔓枯病抗性分子标记或检测所述甜瓜蔓枯病抗性分子标记的物质在鉴定或辅助鉴定待测甜瓜为抗蔓枯病甜瓜还是感蔓枯病甜瓜中的应用；

H2)所述甜瓜蔓枯病抗性分子标记或检测所述甜瓜蔓枯病抗性分子标记的物质在甜瓜育种中的应用；

H3)所述检测甜瓜基因型的方法在鉴定或辅助鉴定甜瓜蔓枯病抗性性状中的应用；

H4)所述检测甜瓜基因型的方法在鉴定或辅助鉴定待测甜瓜为抗蔓枯病甜瓜还是感蔓枯病甜瓜中的应用；

H5)所述检测甜瓜基因型的方法在甜瓜育种中的应用。

上述应用中，检测所述甜瓜蔓枯病抗性分子标记的物质可为所述引物对(所述Gsb1580-F和所述Gsb1580-R组成的引物对)。

以上任一所述抗蔓枯病甜瓜可为蔓枯病抗性等级为1级或2级或3级的甜瓜；所述感蔓枯病甜瓜可为蔓枯病抗性等级为4级或5级的甜瓜。

以上任一所述甜瓜可为抗蔓枯病甜瓜或其后代。所述抗蔓枯病甜瓜具体可为抗蔓枯病甜瓜品种B8。所述抗蔓枯病甜瓜品种B8的后代包括以抗蔓枯病甜瓜品种B8为亲本与其他甜瓜进行杂交和/或回交得到的各世代。在本发明的具体实施例中，所述蔓枯病抗性甜瓜品种B8的后代为抗蔓枯病甜瓜品种B8与感蔓枯病甜瓜品种HP22的杂交后代。

实验证明，本发明的甜瓜蔓枯病抗性分子标记(Gsb1580)与甜瓜的蔓枯病抗性相关，两条染色体均为序列表中序列3所示核苷酸序列的A1A1基因型甜瓜为抗蔓枯病甜瓜。利用本发明的甜瓜蔓枯病抗性分子标记鉴定甜瓜蔓枯病抗性的准确性可达100％，本发明的甜瓜蔓枯病抗性分子标记进一步可用于甜瓜蔓枯病抗性分子标记辅助育种，在甜瓜生长的任意阶段进行筛选、鉴定，效率高、特异性好、准确度高，大大节约时间和成本，对加速甜瓜蔓枯病抗性育种具有重要意义。

附图说明

图1为甜瓜接种蔓枯病病原菌5天后表型。其中，A：抗蔓枯病甜瓜品种B8；B：F₁；C：感蔓枯病甜瓜品种HP22；D：CK。

图2为部分植株的电泳结果。其中，M为DNA分子量标准，100bp DNA ladder；P₁为抗蔓枯病甜瓜品种B8；P₂为感蔓枯病甜瓜品种HP22；F₂中编号为1-22的单株为抗病A1A1基因型，编号为23、24、27-30、32、34、36和37的单株为感病A1A2基因型，编号为25、26、31、33和35的单株为感病A2A2基因型。

图3为标记Gsb1580在8个甜瓜品种中的检测结果。其中，1-8分别为HP22、皇子金玉、HP1、B8、白玉脆、HP2、欣春、金钻17号；M：100bp DNA ladder。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例仅对本发明做进一步说明，并不限制本发明。实施例中如无特殊说明，所采用的实验方法，均为常规方法；所用的试剂等，均可通过商业途径得到。

下述实施例中的抗蔓枯病甜瓜品种B8记载于：马建，王建设.甜瓜全雌系调控基因g的分子标记开发与应用[J].植物遗传资源学报，2019，20(4):1080-1086中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的感蔓枯病甜瓜品种HP22记载于：马建，李丛丛，张朦，王建设.甜瓜黄色种皮的遗传分析及标记开发[J].园艺学报，2019，46(S1):2700中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的甜瓜品种HP1和HP2均记载于：马建，王建设.甜瓜全雌系调控基因g的分子标记开发与应用[J].植物遗传资源学报，2019，20(4):1080-1086中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、甜瓜蔓枯病抗性分子标记Gsb1580可以用来检测甜瓜蔓枯病抗性

一、甜瓜蔓枯病抗性分子标记Gsb1580的发现

本发明在甜瓜基因组12号染色体上发现了一个与甜瓜蔓枯病抗性相关的分子标记，将该分子标记命名为Gsb1580，Gsb1580为甜瓜基因组中对应于序列表中序列4的第52-58位的核苷酸。Gsb1580在感蔓枯病甜瓜品种HP22中为序列4的第52-58位，在抗蔓枯病甜瓜品种B8中缺失序列4的第52-58位。抗蔓枯病甜瓜品种B8和感蔓枯病甜瓜品种HP22的表型如图1所示。

二、基于标记Gsb1580设计的引物

在Gsb1580上下游设计并合成引物Gsb1580-F和Gsb1580-R，Gsb1580-F为序列表中序列1所示的单链DNA，Gsb1580-R为与序列2所示的单链DNA。引物Gsb1580-F和Gsb1580-R在抗蔓枯病甜瓜品种B8中的扩增产物序列为序列表中序列3所示的大小为121bp的序列；在感病蔓枯病甜瓜品种HP22中的扩增产物序列为序列表中序列4所示的大小为128bp的序列，与在感蔓枯病甜瓜品种HP22中的扩增产物序列相比，在抗蔓枯病甜瓜品种B8中的扩增产物序列发生大小为7bp的缺失，缺失的序列为序列表中序列4第52-58位所示的序列。

将基因组DNA中两条染色体序列均对应于序列表中序列3所示的核苷酸序列的甜瓜记为A1A1基因型甜瓜，将基因组DNA中两条染色体序列均对应于序列表中序列4所示的核苷酸序列的甜瓜记为A2A2基因型甜瓜，将基因组DNA中一条染色体对应于序列表中序列3所示的核苷酸序列、另一条染色体对应于序列表中序列4所示的核苷酸序列的甜瓜记为A1A2基因型甜瓜。

三、甜瓜蔓枯病抗性接种鉴定

将抗蔓枯病甜瓜品种B8与感蔓枯病甜瓜品种HP22杂交得到F₁代，将F₁代自交得到200株F₂代单株，将亲本、F₁代和200株F₂代单株种植于穴盘中进行抗性接种鉴定。

蔓枯病病原菌的培养：从超低温冰箱中取出甘油保存的蔓枯病病原菌STw-1(该菌株采集自国家蔬菜工程技术中心多年连作的甜瓜种植大棚，经分离纯化后的甘油菌保存于-80℃冰箱，样品备份保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.1089，具体分离鉴定方法参见授权号为“ZL200410006162.2”，发明名称为“一株甜瓜蔓枯病病原菌及其分生孢子的高效诱导方法与应用”的发明专利)接种到PDA培养基上，置于25℃培养箱中在黑暗条件下培养一周。

蔓枯病病原菌的接种方法参考：任琴琴等，分子标记辅助离体叶片接种鉴定蔓枯病极端抗感单株，中国瓜菜，2019，,3(5)：13-16一文中所述的离体叶片菌丝块接种方法。具体步骤如下：取甜瓜植株展开的第3或第4片真叶(保留叶柄)接种菌丝块，接种蔓枯病病原菌5天后对甜瓜植株叶片进行蔓枯病抗性鉴定，测量病原菌的扩展半径，分析甜瓜对病原菌侵染的抗性等级。蔓枯病抗性等级分级标准：1级高抗(HR)：扩展半径<1.8cm；2级抗(R)：1.8cm≤扩展半径<2.3cm；3级中抗(MR)：2.3cm≤扩展半径<2.8cm；4级感(S)：2.8cm≤扩展半径<3.3cm；5级高感(HS)：扩展半径≥3.3cm。

四、Gsb1580与甜瓜蔓枯病抗性相关

利用CTAB法提取各待测植株的基因组DNA，利用Gsb1580-F和Gsb1580-R进行PCR扩增检测基因型，并利用两亲本作为对照。

PCR扩增的反应体系如下：1μL Buffer(北京全式金生物技术有限公司)、0.8μLdNTPs(四种dNTP每种的浓度均为2mmol/L)、Gsb1580-F和Gsb1580-R(两种引物在反应体系中的浓度均为0.5μmol/L)、1μL基因组DNA(50ng/μL)、0.1μL

DNA Polymerasefor PAGE(北京全式金生物技术有限公司)，ddH₂O补至10μL。

PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，运行35个循环；72℃延伸5min。

采用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物，并利用测序检测PCR扩增产物的序列，确定各待测甜瓜的基因型：PCR扩增产物含有序列表中序列3所示的DNA片段、且不含有序列表中序列4所示的DNA片段的甜瓜为A1A1基因型甜瓜；PCR扩增产物含有序列表中序列4所示的DNA片段、且不含有序列表中序列3所示的DNA片段的甜瓜为A2A2基因型甜瓜；PCR扩增产物含有序列表中序列3和4所示的两种DNA片段的甜瓜为A1A2基因型甜瓜。抗蔓枯病品种B8与感蔓枯病品种HP22分别为A1A1基因型和A2A2基因型，F₁代为A1A2基因型，F₂代中共有40株A1A1基因型单株，50株A2A2基因型单株和110株A1A2基因型单株。部分植株的电泳结果如图2所示。

在甜瓜叶片离体接种5天后，通过测量病斑的扩展半径，分析甜瓜对病原菌侵染的抗性等级。

结果表明：抗蔓枯病甜瓜品种B8的抗性等级为1级，感蔓枯病甜瓜品种HP22的抗性等级为5级，F₁代的抗性等级均为5级。说明抗蔓枯病甜瓜品种B8的蔓枯病抗性基因为隐性基因控制。

F₂代中A1A1基因型植株的抗性等级为1～2级，A2A2基因型植株的抗性等级为4～5级，A1A2基因型植株的抗性等级为4～5级。

F₂代中A1A1基因型植株的病斑长度显著低于A2A2和A1A2基因型植株，与抗蔓枯病甜瓜品种B8的病斑长度无显著差异；F₂代中A2A2和A1A2基因型植株的病斑长度无显著性差异，且与感蔓枯病甜瓜品种HP22的病斑长度无显著差异。

以上实验结果表明，本发明的Gsb1580与甜瓜蔓枯病抗性相关，可以用来鉴定或辅助鉴定甜瓜蔓枯病抗性。

实施例2、Gsb1580在鉴定或辅助鉴定甜瓜蔓枯病抗性中的应用

利用实施例1中的Gsb1580分子标记及引物Gsb1580-F和Gsb1580-R对感蔓枯病甜瓜品种HP22、皇子金玉(德州市德蔬种业有限公司)、HP1、抗蔓枯病甜瓜品种B8、白玉脆(北京沃瑞亨种业科技有限公司)、HP2、欣春(廊坊市农林科学院)、金钻17号(新疆乌鲁木齐市金大道种子有限公司)共8份甜瓜材料的基因组DNA进行PCR扩增，检测基因型，检测方法同实施例1步骤四。

结果发现皇子金玉和HP1材料基因型均为A2A2基因型，白玉脆基因型为A1A1基因型，HP2、欣春和金钻17号材料基因型均为A1A2基因型，PCR产物的电泳结果如图3所示。

采用实施例1步骤三所述方法对8份材料进行蔓枯病抗性接种鉴定，鉴定结果表明：白玉脆的抗性等级为1级，与抗蔓枯病甜瓜品种B8一致；其余材料的抗性等级均为5级，与感蔓枯病甜瓜品种HP22一致。

上述数据表明，利用本发明的Gsb1580分子标记及引物Gsb1580-F和Gsb1580-R检测蔓枯病抗性的准确率为100％。本发明的Gsb1580分子标记及引物Gsb1580-F和Gsb1580-R可用于甜瓜育种的分子标记辅助选择，在甜瓜生长早期鉴定其蔓枯病抗性，快速培育出抗蔓枯病甜瓜新品种，大大提高育种效率。

上述实施例仅为本发明示例性的描述，但本发明的实施方式并不受上述实施例中品种或材料的限制，其他的任何未违背本发明精神实质及原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，均落入本发明的保护范围之内。

序列表

<110>北京市农林科学院

<120>一种与甜瓜蔓枯病抗性相关的分子标记及其应用

<160>4

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<400>1

gcgggggcta tccaataaaa 20

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<400>2

cccattgctc atttgtatat tctct 25

<210>3

<211>121

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<400>3

gcgggggcta tccaataaaa accgccaaat gacaattttc cctttttttt tctttataca 60

taatatacac cttttcttta tttaaaaaaa gaaacgagag aatatacaaa tgagcaatgg 120

g 121

<210>4

<211>128

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<400>4

gcgggggcta tccaataaaa accgccaaat gacaattttc cttttttttt tttttttcct 60

ttatacataa tatacacctt ttctttattt aaaaaaagaa acgagagaat atacaaatga 120

gcaatggg 128

Claims

1.鉴定或辅助鉴定待测甜瓜为抗蔓枯病甜瓜还是感蔓枯病甜瓜的方法，所述方法包括检测待测甜瓜基因型的步骤；所述检测待测甜瓜基因型的步骤包括如下L1）和L2）：

L1）以待测甜瓜基因组DNA为模板，采用由序列表中序列1所示的单链DNA和序列表中序列2所示的单链DNA组成的引物对进行PCR扩增得到PCR产物；

L2）下述L21）或L22）：

L21）检测步骤L1）得到的PCR产物的序列，根据所述PCR产物序列确定甜瓜基因型：如所述PCR产物中含有序列表中序列3所示的DNA片段、且不含有序列表中序列4所示的DNA片段，所述待测甜瓜为A1A1基因型甜瓜；如所述PCR产物中含有序列表中序列4所示的DNA片段、且不含有序列表中序列3所示的DNA片段，所述待测甜瓜为A2A2基因型甜瓜；如所述PCR产物中含有序列表中序列3和4所示的两种DNA片段，所述待测甜瓜为A1A2基因型甜瓜；

L22）检测步骤L1）得到的PCR产物的大小，根据所述PCR产物大小确定甜瓜基因型：如所述PCR产物中含有121 bp的DNA片段、且不含有128 bp的DNA片段，所述待测甜瓜为A1A1基因型甜瓜；如所述PCR产物中含有128 bp的DNA片段、且不含有121 bp的DNA片段，所述待测甜瓜为A2A2基因型甜瓜；如所述PCR产物中含有121 bp和128 bp两种大小的DNA片段，所述待测甜瓜为A1A2基因型甜瓜；

所述A1A1基因型甜瓜为或候选为抗蔓枯病甜瓜，所述A1A2基因型或所述A2A2基因型甜瓜为或候选为感蔓枯病甜瓜。

2.抗蔓枯病甜瓜育种方法，包括如下步骤：按照权利要求1中所述检测待测甜瓜基因型的步骤检测待测甜瓜的基因型，选择A1A1基因型甜瓜作为亲本进行育种。

3.由序列表中序列1所示的单链DNA和序列表中序列2所示的单链DNA组成的引物对在如下Y1）或Y2）中的应用：

Y1）制备鉴定或辅助鉴定甜瓜蔓枯病抗性性状的产品，所述产品按照权利要求1中所述检测待测甜瓜基因型的步骤检测待测甜瓜的基因型，A1A1基因型甜瓜为或候选为抗蔓枯病甜瓜，A1A2基因型或A2A2基因型甜瓜为或候选为感蔓枯病甜瓜；

Y2）制备辅助抗蔓枯病甜瓜育种的产品，所述产品按照权利要求1中所述检测待测甜瓜基因型的步骤检测待测甜瓜的基因型，选择A1A1基因型甜瓜作为亲本进行育种。