CN101173311B - 甜瓜抗蔓枯病基因位点的分子标记方法 - Google Patents
甜瓜抗蔓枯病基因位点的分子标记方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种甜瓜抗蔓枯病基因的分子标记方法，属于生物技术领域。有四个AFLP分子标记与抗蔓枯病基因连锁，标记EcoRI-TG/MseI-CTC200为200bp条带；标记EcoRI-AT/MseI-CTG90为90bp条带；EcoRI-TC/MseI-CAG60为60bp条带；标记EcoRI-TG/MseI-CTA70为70bp条带；连锁距离分别为2.0，6.0，5.4和6.0cM。通过本发明提供的的分子标记方法检测PI420145及其衍生品种(系)中是否含有该基因，预测其蔓枯病抗性水平，提高选择效率，有利于加速我国优良抗蔓枯病甜瓜品种的选育进程，生产上用于抗蔓枯病甜瓜品种纯度鉴定。
Description
一、技术领域
本发明公开了甜瓜抗蔓枯病基因位点的分子标记方法，属于生物技术领域。专用于甜瓜抗蔓枯病的分子标记辅助选择，开展甜瓜蔓枯病抗病品种的选育与种质资源的利用。
二、技术背景
甜瓜是世界十大水果之一。由蔓枯病菌引起的甜瓜蔓枯病是严重的全球性真菌病害之一。它的发生常会导致毁灭性的后果。除危害甜瓜外，蔓枯病菌还侵染黄瓜、西瓜、南瓜和西葫芦等其它葫芦科作物，造成不同程度的减产。因此，研究防治甜瓜蔓枯病成了当前甜瓜育种中的一个迫切任务。培育抗病品种是防治甜瓜蔓枯病危害的最安全、有效而且节约成本的措施之一。
遗传研究表明，甜瓜蔓枯病抗性主要由单基因显性控制和单基因隐性控制两种类型。但是目前对蔓枯病抗性基因位点的信息仍知之甚少，同时由于在选育抗病材料时传统方法是通过接种鉴定，根据植株的表型形态学特征进行筛选，该方法有时会因为接种不充分或发病条件不适宜而影响选择效率，难以准确、快速地筛选出具有抗病基因的个体植株。分子标记辅助选择可以将传统的表型选择转变为直接选择基因型，在早代就可以对抗病植株进行选择，从而大大提高选择效率。但迄今为止，仍未见有关甜瓜蔓枯病抗性基因分子标记的研究报道。
目前在蔓枯病抗性遗传基础的研究及抗病育种的利用上多集中在最早发掘的抗性资源PI 140471上，而对其他抗源的利用研究很少。PI 420145具有与PI 140471相近的蔓枯病抗性，且其抗性由一对显性单基因控制(Wolukau et al.2007)。
三、发明内容
技术问题
本发明涉及甜瓜蔓枯病抗性基因的分子标记方法，目的是针对传统育种方法选育稳定甜瓜蔓枯病抗病品系难度较大、周期较长的缺陷，发掘出甜瓜蔓枯病抗病基因资源，为甜瓜的蔓枯病抗病育种提供基因资源和标记辅助选择的技术，从而大大提高选择效率，加快培育优良抗蔓枯病甜瓜品系的进程。
技术方案
甜瓜PI 420145抗蔓枯病基因的分子标记方法，其特征在于，该抗性基因为完全显性基因，有四个AFLP标记与之连锁，分别为：
1)标记EcoRI-TG/MseI-CTC200，用AFLP选择性标记引物
EcoRI-TG：5′-GACTGCGTACCAATTCTG-3′和
MseI-CTC：5′-GATGAGTCCTGAGTAACTC-3′
组合扩增出长度为200bp的DNA标记片段条带；
2)标记EcoRI-AT/MseI-CTG90，用AFLP选择性标记引物
EcoRI-AT：5′-GACTGCGTACCAATTCAT-3′和
MseI-CTG：5′-GATGAGTCCTGAGTAACTG-3′
组合扩增出长度为90bp的DNA标记片段条带；
3)EcoRI-TC/MseI-CAG60，用AFLP选择性标记引物
EcoRI-TC：5′-GACTGCGTACCAATTCTC-3′和
MseI-CAG：5′-GATGAGTCCTGAGTAACAG-3′
组合扩增出长度为60bp的DNA标记片段条带；
4)标记EcoRI-TG/MseI-CTA70，用AFLP选择性标记引物
EcoRI-TG：5′-GACTGCGTACCAATTCTG-3′和
MseI-CTC：5′-GATGAGTCCTGAGTAACTC-3′
组合扩增出长度为70bp的DNA标记片段条带。
即用上述1)—4)组标记引物中任一对、二对、三对或四对引物扩增甜瓜PI420145抗蔓枯病材料的DNA，如果扩增出其对应大小的标记片段条带，则标志着甜瓜PI420145抗蔓枯病基因的存在。
有益效果
本发明所提供的与甜瓜抗蔓枯病基因位点紧密连锁的AFLP分子标记具有以下优点：
(1)通过本发明在国际上首次获得4个与甜瓜抗蔓枯病基因紧密连锁的AFLP分子标记；
(2)通过本发明分子标记方法定位的抗蔓枯病基因位点位置明确，鉴定方便。通过检测这些与抗蔓枯病基因位点连锁的分子标记，可以预测甜瓜植株的蔓枯病抗性，进而快速筛选抗病品种或品系用于甜瓜育种。抗病基因位点的检测方便快速，不受环境影响；
(3)辅助育种选择目标明确，节约成本。在传统育种方法中，首先要收集具有抗病基因的亲本与栽培品种进行一系列杂交，而且要对蔓枯病抗性进行单株选择。对甜瓜蔓枯病进行接种鉴定，因接种不充分或发病条件不适宜而影响选择效率。因此抗病育种不仅费时，而且难度大，成本高。通过检测抗蔓枯病基因位点，可以在苗期就鉴定出高抗蔓枯病的单株，淘汰其它植株，不仅节约生产成本而且大大提高抗蔓枯病甜瓜的选择效率。
(4)通过本发明分子标记方法，生产上通过检测这些与抗蔓枯病基因位点连锁的分子标记，可以快速鉴定抗病品种或品系的纯度。
四、附图说明
图1EcoRI-TG/MseI-CTC引物组合在F2代单株的扩增结果表明在抗蔓枯病单株出现一条200bp的特异带。1-10：感蔓枯病单株，11-23：抗蔓枯病单株；箭头示抗蔓枯病单株中出现的特异带
五、具体实施方式
本发明筛选甜瓜抗蔓枯病基因分子标记的实施程序包括：
(1)将抗病材料PI420145(♀)和PI136170(♂)进行杂交获得F1(PI420145和PI136170见参考文献：Wolukau et al.，2007，Resistance to Gummy Stem Blight in Melon(Cucumis melo L.)Germplasm and Inheritance of Resistance from Plant Introductions157076，420145，and 323498.HortScience42(2)：215-221.)，F1自交产生F2，同时进行回交产生BC1代。2006年春季于南京农业大学实验农场种植获得的F2代和BC1代分离群体。对其进行人工接种并统计各个单株的发病情况，利用卡方测验分析蔓枯病抗性的遗传规律。分析发现，63株BC1代回交群体中，29株为抗病，37株为感病，其分离比完全符合1：1的单基因分离比。同时对F2代分离群体统计表明，89株群体中，69株为抗病，20株为感病，也符合3：1的单显性基因的遗传模式。
(2)利用AFLP(Amplification Fragment Length Polymorphism，扩增片段长度多态性，Vos et al.，1995)技术结合BSA(Bulked Segregant Analysis，混合分离分析法，Michelmore et al.，1991)技术进行全雌性基因的连锁标记检测分析。共筛选分析了上海生工公司提供的64对选择性引物，获得12对引物在抗病和感病DNA池间表现多态性，利用F2代单株验证后，确证EcoRI-TG/MseI-CTC，EcoRI-AT/MseI-CTG，EcoRI-TC/MseI-CAG和EcoRI-TG/MseI-CTA引物4对组合能在抗蔓枯病单株中扩增出特异性条带，而在感蔓枯病单株中则没有，连锁分析表明这四个标记与抗蔓枯病位点的连锁距离分别在2.0，6.0，5.4和6.0cM。4对引物组合为：
1)标记EcoRI-TG/MseI-CTC200，用AFLP选择性标记引物
EcoRI-TG：5′-GACTGCGTACCAATTCTG-3′和
MseI-CTC：5′-GATGAGTCCTGAGTAACTC-3′
组合扩增出长度为200bp的DNA片段；
2)标记EcoRI-AT/MseI-CTG90，用AFLP选择性标记引物
EcoRI-AT：5′-GACTGCGTACCAATTCAT-3′和
MseI-CTG：5′-GATGAGTCCTGAGTAACTG-3′
组合扩增出长度为90bp的DNA片段；
3)EcoRI-TC/Mse I-CAG60，用AFLP选择性标记引物
EcoRI-TC：5′-GACTGCGTACCAATTCTC-3′和
MseI-CAG：5′-GATGAGTCCTGAGTAACAG-3′
组合扩增出长度为60bp的DNA片段；
4)标记EcoRI-TG/MseI-CTA70，用AFLP选择性标记引物
EcoRI-TG：5′-GACTGCGTACCAATTCTG-3′和
MseI-CTC：5′-GATGAGTCCTGAGTAACTC-3′
组合扩增出长度为70bp的DNA片段。
即用上述1)—4)组标记引物中任一对、二对、三对或四对引物扩增甜瓜PI 420145抗蔓枯病材料的DNA，如果扩增出其对应大小的标记条带，则标志着甜瓜PI 420145抗蔓枯病基因的存在。这四个标记与抗蔓枯病位点的连锁距离分别在2.0，6.0，5.4和6.0cM。这一结果为蔓枯病抗性的分子标记辅助选择和定位克隆蔓枯病抗性基因奠定基础。
具体技术过程如下：
①基因组DNA的提取和DNA池的构建：基因组DNA提取采用CTAB法(Murrayet al.，1980)。利用琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭显色进行DNA浓度的定量。F2单株DNA提取后，利用BSA法各取10个抗病和感病单株DNA等量混合，构建成抗病和感病DNA池用于AFLP引物的多态性筛选。
②酶切和接头的连接：取0.5μg基因组DNA，采用EcoRI和MseI进行双酶切。酶切后与EcoRI和MseI接头连接。EcoRI和MseI接头序列为：
EcoRI接头：5‘-CTCGTAGACTGCGTACC-3’
3‘-CATCTGACGCATGGTTAA-5’
MseI接头：5‘-GACGATGAGTCCTGA-3’
3‘-TACTCAGGACTCAT-5’
③酶切连接产物的扩增取5μl酶切连接产物为模板进行预扩增。预扩增程序为：94℃1min，56℃1min，72℃1min，36个循环；72℃延伸7min。
预扩增产物1：30稀释，作为选择性扩增的模板。选择性引物组合共64对，由8个带两个选择性碱基的EcoRI-NN引物，和8个带三个选择性碱基的MseI-NNN引物组成。选择性扩增程序为：94℃预变性30s；94℃30s，65℃30s，72℃120s，然后每个循环退火温度降低0.7℃，经13个循环后，退火温度降至56℃；再进行23个循环的扩增：94℃30s，56℃30s，72℃120s。
扩增反应在PTC-100PCR仪上进行。所用预扩增和选择性扩增引物序列见表1。
表1AFLP预扩增和选择性扩增引物序列
④变性聚丙烯酰胺凝胶电泳选择性扩增产物在6％的变性聚丙烯酰胺凝胶(6％丙烯酰胺，0.32％甲叉丙烯酰胺，7mol·L-1尿素，1×TBE)中电泳分离。电泳缓冲液为1×TBE，恒功率60W预电泳30min后，将扩增产物加入等体积的上样缓冲液(98％甲酰胺，10mmol·L-1EDTA，0.25％溴酚蓝)95℃变性5min后，立即转移至冰浴中冷却，然后每个样品取8μL上样，60W电泳2～3h。
⑤银染电泳后，小心分开两块玻璃板，将附着凝胶的长玻璃板放入10％冰醋酸中固定30min；后用去离子水漂洗2次，每次5min；然后转入染色液(2g硝酸银，3mL37％甲醛溶于2L去离子水)中染色30min，后用2L去离子水快速漂洗5～6s，立即转入显影液(60g碳酸钠，3mL37％甲醛，400μL10％硫代硫酸钠溶于2L去离子水)中，轻摇至条带清晰后，加入等体积的10％冰醋酸停显，约10min后用去离子水漂洗干净。自然干燥保存。
⑥连锁性分析利用Mapmaker(Version3.0)软件对F2代分离群体单株的标记和感病类型表现数据进行连锁分析，并利用Kosambi函数将重组率转化为遗传图距(cM)。
序列表
<110>南京农业大学
<120>甜瓜抗蔓枯病基因位点的分子标记方法
<130>说明书
<140>200710025531.6
<141>2007-08-03
<160>8
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>标记引物EcoRI-TG
<222>(1)..(18)
<223>
<400>1
gactgcgtac caattctg 18
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>标记引物MseI-CTC
<222>(1)..(19)
<223>
<400>2
gatgagtcct gagtaactc 19
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>标记引物EcoRI-AT
<222>(1)..(18)
<223>
<400>3
gactgcgtac caattcat 18
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>标记引物MseI-CTG
<222>(1)..(19)
<223>
<400>4
gatgagtcct gagtaactg 19
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>标记引物EcoRI-TC
<222>(1)..(18)
<223>
<400>5
gactgcgtac caattctc 18
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>标记引物MseI-CAG
<222>(1)..(19)
<223>
<400>6
gatgagtcct gagtaacag 19
<210>7
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>标记引物EcoRI-TG
<222>(1)..(18)
<223>
<400>7
gactgcgtac caattctg 18
<210>8
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>标记引物MseI-CTC
<222>(1)..(19)
<223>
<400>8
gatgagtcct gagtaactc 19
Claims (1)
1.甜瓜PI 420145抗蔓枯病基因的分子标记方法，其特征在于，该抗性基因为完全显性，有四个AFLP标记与之连锁，分别为：
1)标记EcoRI-TG/MseI-CTC200，用AFLP选择性标记引物
EcoRI-TG：5′-GACTGCGTACCAATTCTG-3′和
MseI-CTC：5′-GATGAGTCCTGAGTAACTC-3′
组合扩增出长度为200bp的DNA标记片段条带；
2)标记EcoRI-AT/MseI-CTG90，用AFLP选择性标记引物
EcoRI-AT：5′-GACTGCGTACCAATTCAT-3′和
MseI-CTG：5′-GATGAGTCCTGAGTAACTG-3′
组合扩增出长度为90bp的DNA标记片段条带；
3)EcoRI-TC/MseI-CAG60，用AFLP选择性标记引物
EcoRI-TC：5′-GACTGCGTACCAATTCTC-3′和
MseI-CAG：5′-GATGAGTCCTGAGTAACAG-3′
组合扩增出长度为60bp的DNA标记片段条带；
4)标记EcoRI-TG/MseI-CTA70，用AFLP选择性标记引物
EcoRI-TG：5′-GACTGCGTACCAATTCTG-3′和
MseI-CTC：5′-GATGAGTCCTGAGTAACTC-3′
组合扩增出长度为70bp的DNA标记片段条带；
即用上述1)—4)组标记引物中任一对、二对、三对或四对引物扩增甜瓜PI 420145抗蔓枯病材料的DNA，如果扩增出其对应大小的标记片段条带，则标志着甜瓜PI 420145抗蔓枯病基因的存在。
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