CN102199598A - 甜瓜抗蔓枯病基因Gsb-4的SSR标记 - Google Patents

Abstract

本发明属于作物遗传育种与生物技术领域，涉及甜瓜抗蔓枯病基因Gsb-4的SSR标记。甜瓜资源PI482398抗蔓枯病基因Gsb-4的SSR标记，用SSR标记引物CMAT170a扩增含甜瓜资源PI482398抗蔓枯病基因Gsb-4的育种材料或品种DNA，获得的120bp扩增片段即为甜瓜资源PI482398抗蔓枯病基因Gsb-4的SSR标记，该SSR标记与抗性基因的遗传距离为5.14cM。本发明在国际上首次获得1个与甜瓜抗蔓枯病因Gsb-4紧密连锁的SSR分子标记。通过检测该分子标记，可以预测甜瓜植株的蔓枯病抗性，进而快速筛选抗病品种或品系用于甜瓜育种。抗病基因位点检测方便快速，不受环境条件限制。

Description

甜瓜抗蔓枯病基因Gsb-4的SSR标记

技术领域

本发明属于作物遗传育种与生物技术领域，涉及甜瓜抗蔓枯病基因Gsb-4的SSR标记。

技术背景

甜瓜是世界十大水果之一。蔓枯病是甜瓜严重的全球性病害之一。它的发生常会导致毁灭性的后果。防治甜瓜蔓枯病成了当前甜瓜生产中的一个迫切任务。培育抗病品种是防治甜瓜蔓枯病危害的最安全、有效措施之一。

传统育种方法是通过接种鉴定，根据植株的表型特征进行筛选，该方法有时会因为接种不充分或发病条件不适宜而影响鉴定效果，难以准确、快速地筛选出具有抗病基因的个体植株。分子标记辅助选择可以将传统的表型选择转变为直接选择基因型，在早代就可以对抗病植株进行选择，从而大大提高选择效率。

目前在蔓枯病抗性遗传基础的研究及抗病育种的利用上多集中在最早发掘的抗性资源PI140471(含抗性基因Gsb-1)上，而对其他抗源的利用研究很少，据研究发现大多数的蔓枯病抗性均来自于该抗源，但在长期的研究中发现该抗源不能提供足够的持久的抗病性。源于津巴布韦的抗性资源PI482398(Gsb-4)不仅抗性高于PI140471(Gsb-1)(Frantz，2004)，而且能够在长江中下游地区正常生长、开花、结果，可直接通过常规杂交、回交来转育蔓枯病的抗性，从而为解决栽培甜瓜蔓枯病抗性普遍不足的难题做出积极贡献。

发明内容

本发明的目的是针对甜瓜蔓枯病抗蔓枯病基因Gsb-1不能提供足够持久的抗病性的缺陷，以及常规育种改良方法效率低、周期长的问题，研究筛选出甜瓜蔓枯病抗性基因Gsb-4的分子标记，为甜瓜的蔓枯病抗病育种提供基因资源和标记辅助选择的技术。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

甜瓜资源PI482398抗蔓枯病基因Gsb-4的SSR标记，用SSR标记引物CMAT170a：

上游引物：5’-AGACGAAGGACGGTTAGCTTT-3’(SEQ ID NO.1)，

下游引物：5’-TTAAATCCCAAAGACATGGCG-3’(SEQ ID NO.2)，

扩增含甜瓜资源PI482398抗蔓枯病基因Gsb-4的育种材料或品种DNA，获得的120bp扩增片段即为甜瓜资源PI482398抗蔓枯病基因Gsb-4的SSR标记，该SSR标记与抗性基因Gsb-4的遗传距离为5.14cM。

甜瓜资源PI482398抗蔓枯病基因Gsb-4的分子标记方法，用SSR标记引物CMAT170a：上游引物：5’-AGACGAAGGACGGTTAGCTTT-3’(SEQ ID NO.1)，下游引物：5’-TTAAATCCCAAAGACATGGCG-3’(SEQ ID NO.2)，通过PCR扩增甜瓜育种材料或品种DNA，如果能扩增出120bp片段，则表明甜瓜资源PI482398抗蔓枯病基因Gsb-4的存在。

其中，所述的PCR扩增反应体积为20μL，其中包括50mmol/LKCL，10mmol/L Tris-HCLpH＝9.0，2.5mmol/LMgCL₂，150μmol/LdNTPs，0.67μmol/L上游引物和下游引物，40ngDNA模板，1U Taq DNA聚合酶；PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸80s，35个循环；72℃延伸5min，最后4℃下保存。

PCR产物在9％聚丙烯酰胺凝胶上电泳，采用改良的银染方法检测。

所述的改良的银染方法为：

1)将凝胶从玻璃板上取下，置于白瓷盘中，加入200mL含乙醇100mL/L，乙酸50mL/L的 固定液a，固定20min；

2)回收固定液a，加入200mL，0.2g/LAgNO₃的染色液b，染色20min；

3)回收染色液b，先用去离子水漂洗2次，每次60s，再用含有15mg/L Na₂S₂SO₃的去离子水漂洗60-90s。

4)加入200mL的NaOH 15g/L，37％甲醛11mL/L的显色液c，显色至条带清晰为止。

本发明甜瓜抗源PI482398抗蔓枯病基因Gsb-4的分子标记的获得包括：甜瓜抗源PI482398抗蔓枯病基因Gsb-4的遗传规律的确证，抗性基因的SSR多态性筛选，以及SSR标记与抗性基因之间的连锁距离确定，具体为：

1)通过抗蔓枯病自交系PI492398作为父本与母本感蔓枯病材料‘白皮脆’进行杂交，BC₁F₁、BC₂F₁和F₂的遗传研究，验证蔓枯病抗性为Gsb-4单基因显性控制；

2)89对甜瓜的SSR随机引物在抗感亲本的基因组DNA上进行多态性筛选，其中4对引物均在抗性亲本上扩增出稳定的多态性条带。表现多态性的4对引物在抗感基因池上进行扩增，其中引物CMTA170a在抗感基因池上多态性稳定、重复性好，且多态性条带清晰，片段大小约为120bp；

3)在基因池间表现多态性的引物CMTA170a在F₂代分离群体上进行SSR扩增的多态性验证，分析发现，该引物的多态性扩增产物与抗性基因Gsb-4具有连锁关系，然后进行连锁分析，结果表明：本发明SSR标记CMTA170a与抗性基因Gsb-4的连锁距离为5.14cM。

有益效果：

本发明所提供的与甜瓜抗蔓枯病基因Gsb-4紧密连锁的SSR分子标记具有以下优点：

1)本发明在国际上首次获得1个与甜瓜抗蔓枯病因Gsb-4紧密连锁的SSR分子标记。

2)通过检测本发明筛选的与抗蔓枯病基因Gsb-4连锁的分子标记，可以预测甜瓜植株的蔓枯病抗性，进而快速筛选抗病品种或品系用于甜瓜育种。抗病基因位点检测方便快速，不受环境条件限制。

3)通过检测本发明筛选的与抗蔓枯病基因Gsb-4连锁的分子标记，可以检测蔓枯病抗性聚合的品种中是否含有该抗性基因，进而快速的筛选抗性聚合品种，为甜瓜蔓枯病的抗性聚合育种提供了依据，加速了聚合育种的进程。

附图说明

图1引物CMAT170a在双亲、F₁、抗感DNA池和F₂代单株的PCR扩增结果，表明在抗蔓枯病单株中出现一条大小大约120bp的特异带。

其中，M：Marker，1：抗病亲本，2：感病亲本，3：F₁，4：抗病DNA池，5：感病DNA池，6-14：抗蔓枯病单株，15-23：感蔓枯病单株

具体实施方式

实施例1

本发明甜瓜抗蔓枯病基因Gsb-4的分子标记的实施程序包括：

a)将抗病自交系PI482398(

由美国引进)和‘白皮脆’(♀，购自新疆农科院)进行杂交获得F₁，F₁自交产生F₂，同时分别与父母本回交产生BC₁F₁和BC₂F₁分离群体。2009年秋季在南京农业大学园艺学院实验基地获得F₂、BC₁F₁和BC₂F₁代分离群体。2010年春季对BC₁F₁、BC₂F₁分离群体和F₂分离群体进行人工接种并统计各个单株发病情况，并用卡方检测分析蔓枯病抗性的遗传规律。分析发现108株BC₁F₁除了在接种鉴定的2株表现感病外，其余的在接种中都表现抗病，109株BC₂F₁的抗病接种鉴定中抗/感株分别为58/51，抗感分离比基本符合1∶1的期望分离比例；118株F₂代群体在抗病性接种鉴定中抗/感株分别为81/37，F₂代的抗感分离情况基本符合3∶1的期望分离比例。结果表明抗源PI482398对甜瓜蔓枯病的抗性是由单个显性基因控制的。

b)利用SSR(Simple Sequence Repeats，简单重复序列)技术结合BSA(Bulked SegregantAnalysis，混合分离分析法)技术进行抗蔓枯病基因连锁标记检测分析。共筛选分析了89对选择性引物，获得4对引物(表1)在抗感亲本上表现多态性，利用抗感基因池和F₂代单株验证后，确认引物CMAT170a能在抗蔓枯病单株中扩增出特异性条带，而在感蔓枯病单株中则没有。

具体技术过程如下：

i.基因组DNA的提取和DNA池的构建

基因组DNA提取采用改良的CTAB法。利用琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭显色进行DNA浓度的定量。F₂单株DNA提取后，利用BSA法各取10个抗病和10个感病单株、DNA等量混合，构建成抗病和感病DNA池用于SSR引物的多态性筛选。

ii SSR扩增

SSR-PCR程序按照Katzir等(1996)的方法进行优化，总反应体积为20μL，其中包括50mmol/LKCL，10mmol/L Tris-HCL pH＝9.0，2.5mmol/L MgCL₂，150μmol/L dNTPs(上海生工)，0.67μmol/L 3’和5’引物，40ngDNA，1U Taq DNA聚合酶(上海上工)。扩增反应在PTC-100PCR仪中进行(MJ Research，MJ Resarch Inc.，Chatham，New Jersey)，反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸80s，35个循环；72℃延伸5min，最后4℃下保存。

在亲本上表现多态性的SSR引物序列见表1

iii.SSR产物检测

PCR产物在9％聚丙烯酰胺凝胶上电泳，采用改良的银染方法检测：

1)将凝胶从玻璃板上取下，置于白瓷盘中，加入200mL固定液a(乙醇100mL/L，乙酸50mL/L)，固定20min；

2)回收固定液a(可连续使用5-6次)，加入200mL染色液b(AgNO₃，0.2g/L)染色20min；

3)回收染色液b(可连续使用3-4次)，先用去离子水漂洗2次，每次60s，再用含有15mg/LNa₂S₂SO₃的去离子水漂洗60-90s。

4)加入200mL的显色液c(NaOH15g/L，37％甲醛11mL/L)，显色至条带清晰为止；加入200mL的保存d(NaHCO₃15g/L)进行保存。

c)连锁分析利用Mapmaker(Version 3.0)软件对F₂代分离群体单株的标记和感病类型表现数据进行连锁分析，并利用Kosambi函数将重组率转化为遗传图距(cM)，结果表明该标记与抗蔓枯病位点连锁距离为5.14cM。

Claims (5)

1.甜瓜资源PI482398抗蔓枯病基因Gsb-4的SSR标记，其特征在于用SSR标记引物CMAT170a：

上游引物：5’-AGACGAAGGACGGTTAGCTTT-3’，

下游引物：5’-TTAAATCCCAAAGACATGGCG-3’，

扩增含甜瓜资源PI482398抗蔓枯病基因Gsb-4的育种材料或品种DNA，获得的120bp扩增片段即为甜瓜资源PI482398抗蔓枯病基因Gsb-4的SSR标记，该SSR标记与抗性基因Gsb-4的遗传距离为5.14cM。

2.甜瓜资源PI482398抗蔓枯病基因Gsb-4的分子标记方法，其特征在于用权利要求1所述的SSR标记引物CMAT170a：

上游引物：5’-AGACGAAGGACGGTTAGCTTT-3’，

下游引物：5’-TTAAATCCCAAAGACATGGCG-3’，

通过PCR扩增甜瓜育种材料或品种DNA，如果能扩增出120bp片段，则表明甜瓜资源PI482398抗蔓枯病基因Gsb-4的存在。

3.根据权利要求2所述的甜瓜资源PI482398抗蔓枯病基因Gsb-4的分子标记方法，其特征在于所述的PCR扩增反应体积为20μL，其中包括50mmol/LKCL，10mmol/L Tris-HCL pH＝9.0，2.5mmol/LMgCL₂，150μmol/LdNTPs，0.67μmol/L上游引物和下游引物，40ngDNA模板，1U TaqDNA聚合酶；PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸80s，35个循环；72℃延伸5min，最后4℃下保存。

4.根据权利要求2所述的甜瓜资源PI482398抗蔓枯病基因Gsb-4的分子标记方法，其特征在于PCR产物在9％聚丙烯酰胺凝胶上电泳，采用改良的银染方法检测。

5.根据权利要求4所述的甜瓜资源PI482398抗蔓枯病基因Gsb-4的分子标记方法，其特征在于所述的改良的银染方法为：

1)将凝胶从玻璃板上取下，置于白瓷盘中，加入200mL含乙醇100mL/L，乙酸50mL/L的固定液a，固定20min；

2)回收固定液a，加入200mL，0.2g/LAgNO₃的染色液b，染色20min；

3)回收染色液b，先用去离子水漂洗2次，每次60s，再用含有15mg/L Na₂S₂SO₃的去离子水漂洗60-90s。

4)加入200mL的NaOH 15g/L，37％甲醛11mL·L^-1的显色液c，显色至条带清晰为止。

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