CN110387431A - 一种分子标记及利用其鉴定水稻耐低温基因bZIP73的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及农业生物工程技术领域，公开了一种鉴定水稻耐低温基因bZIP73的分子标记，包括基因bZIP73的四条特异性引物，四条特异性引物分别为正向外引物bZIP73‑O‑F、反向外引物bZIP73‑O‑R、正向内引物bZIP73‑I‑F和反向内引物bZIP73‑I‑R；本发明还公开了一种利用鉴定水稻耐低温基因bZIP73的分子标记进行水稻基因资源鉴定的方法。本发明能对基因bZIP73中的粳型bZIP73Jap、籼bZIP73Ind及其粳籼杂合型bZIP73Jap/bZIP73Ind进行准确鉴定，本发明的方法具有操作简便、费用低廉、鉴定效率高等优点，可广泛用于水稻基因bZIP73的资源鉴定和分子标记辅助育种，提高工作效率。

Description

一种分子标记及利用其鉴定水稻耐低温基因bZIP73的方法
技术领域
本发明涉及农业生物工程技术领域，具体涉及一种分子标记及利用其鉴定水稻耐低温基因bZIP73的方法。
背景技术
水稻是我国最主要的粮食作物之一，其种植面积约占粮食作物面积的1/3，产量可约占粮食总产量的一半，约为我国60％以上人口提供口粮。水稻起源于亚热带地区，是喜温作物，一般对低温较为敏感，低温冷害极有可能导致水稻大幅度减产，中国、朝鲜及日本等国家曾经遇到过严重的冷害问题。尽管全球气候变暖，但近年来极端气候频繁，倒春寒和寒露风等低温灾害常有发生，我国每年因冷害造成的粮食损失高达3-5亿吨。冷害问题受到了人们的极大关注，如在贵州，耐低温鉴定已成为该省水稻品种审定的一个重要指标。由此，开展水稻耐低温机理研究，培育耐低温水稻品种已是当前水稻研究工作的重要方向。
随着现代分子生物学的发展，分子标记辅助选择已广泛应用于育种，可快速实现对目标基因的准确选择，弥补了传统育种依赖于表型的鉴定、周期长、效率低等的不足。基因的挖掘及其机理的阐明，又为分子标记辅助选择育种提供了基础依据和前提条件。水稻耐低温胁迫是一个复杂的遗传性状，大都受多个基因/数量性状基因座控制。因此，与其他农艺性状相比，水稻低温耐受性的遗传研究进展较缓，在水稻的12条染色体上定位到与耐低温相关的QTL超过200余个，然而，已进行精细定位或克隆分析的并不多见。精细定位的QTL约12个，即孕穗期耐低温5个(qCTB8、qCTB7、qCT-3-2、qLTB3、qCTB10-2)、苗期耐低温5个(qCTS4、qCtss11、qSCT1、qSCT11、qLOP2/qPSR2-1)、苗期和成熟期耐低温1个(qRC10-2)、萌发期耐低温1个(qLTG-9)。克隆且开展功能研究的耐低温基因仅有8个，涉及Ctb1、GSTZ2、qLTG3-1、LTG1、COLD1、qCTS-9、CTB4a及bZIP73等。其中，bZIP73基因是一个具有多重功效转录因子，参与低温信号途径，粳型bZIP73Jap与籼型bZIP73Ind在编码区存在一个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，导致对低温耐受性产生较大的不同，前者具有更强的低温耐受性；早期的研究认为，bZIP73与苗期低温耐受性关联，粳型bZIP73Jap通过与另一个bZIP蛋白(bZIP71)互作来调节水稻体内植物激素脱落酸(ABA)和活性氧(ROS)水平，从而提高水稻对低温的耐受性；进一步的研究又发现，bZIP73Jap的对低温耐受性的调控作用还发生孕穗期，bZIP73Jap在低温情况下表达上调，尤其是在花粉发育双核期的穗中表达。bZIP73Jap与bZIP71形成异源二聚体，协同作用，不仅抑制了花药中的ABA水平，而且促进了可溶性糖从花药到花粉的运输，提高了结实率和产量。另外，bZIP73Jap:bZIP71还调控了qLTG3-1Nip的表达，qLTG3-1Nip的表达株系大大提高了水稻在生殖期对寒冷胁迫的耐受性。可见，bZIP73是一个极为重要的耐低温性基因，将粳型bZIP73Jap基因引入籼稻品种可以显著的提高籼稻的耐寒性，在籼稻的耐寒性育种中具有重要的应用价值。因此，若在耐低温基因bZIP73克隆的基础上，能够开发出与目标基因共分离的分子标记，不仅能够有效地对水稻资源bZIP73基因的籼粳型进行鉴定，也为相关目标基因的分子标记辅助育种提供便利。
发明内容
基于以上问题，本发明针对传统观察法不能对bZIP73基因的籼粳型进行区分，而测序鉴定又存在费用昂贵、操作繁琐等缺点，根据耐低温bZIP73基因在籼、粳稻编码区第511位存在的一个碱基差异，设计开发出与目标基因类型共分离的四引物分子标记，并通过引物混合同管一次PCR方法，快速、准确地鉴定水稻资源bZIP73的不同基因类型，同时还可应用于分子标记辅助育种，提高工作成效。
为解决以上技术问题，本发明提供了一种鉴定水稻耐低温基因bZIP73的分子标记，包括基因bZIP73的四条特异性引物，四条特异性引物分别为正向外引物bZIP73-O-F、反向外引物bZIP73-O-R、正向内引物bZIP73-I-F和反向内引物bZIP73-I-R，四条特异性引物的引物序列如下：
为解决以上技术问题，本发明还提供了一种利用鉴定水稻耐低温基因bZIP73的分子标记进行水稻基因资源鉴定的方法，包括以下步骤：
S1：分子标记设计及合成
从NCBI网站下载水稻bZIP73基因的DNA序列，根据水稻bZIP73基因在籼稻和粳稻两个亚种间的编码序列第511位置存在的一个SNP，定位到DNA序列相应的位置，进行分析，结合四引物扩增受阻突变体系PCR方法，设计并合成四引物标记，分别为正向外引物bZIP73-O-F、反向外引物bZIP73-O-R、正向内引物bZIP73-I-F和反向内引物bZIP73-I-R；
S2：提取水稻样品的DNA
取新鲜水稻叶片0.3-0.4g，利用十六烷基三甲基溴化铵法提取DNA；
S3：用分子标记进行PCR扩增
PCR扩增体系采用20μL的反应体积，包括浓度为10～100ng/L的DNA 2μL，四引物标记混合液2μL，10×Taq Buffer 2μL，Mg2+Buffer 1.2μL，浓度为2.5mM/L的dNTP Mixture0.4μL，浓度为2.5U/μL的Taq DNA聚合酶0.4μL，ddH2O 12μL；
S4：琼脂糖凝胶电泳检测并拍照
将步骤S3中的PCR扩增产物在2％的琼脂糖凝胶中于120V电压下电泳30-40min，用核酸染料染色后在紫外凝胶成像仪上观察并拍照。
进一步的，步骤S1中设计反向内引物时，在反向内引物3'端的第3个碱基引入错配，将碱基G变为碱基T，以增强引物特异性；设计正向内引物时，相对于反向内引物，加长了正向内引物序列长度，以提高其Tm值；在正向内引物5'端第3-5位碱基进行碱基类型变换，即将碱基TTT变为碱基GCG，以提高引物序列碱基GC所占百分比的比例。
进一步的，步骤S3中PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共31个循环；最后72℃延伸10min，扩增结束，降温至10℃，保存1min，取出产物备用。
进一步的，步骤S3中的四引物标记混合液中的正向外引物、反向外引物、正向内引物和反向内引物的浓度比例为1:1:4:2。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明所提供的分子标记是根据基因本身的序列差异而设计的功能标记，直接反映植株的基因型，不需表型的进一步验证，不受环境影响。
(2)本发明所提供的分子标记的设计依据来源基因本身的序列，是与基因共分离的标记，不会发生类似连锁标记的遗传交换导致的基因型鉴定错误。
(3)本发明中的分子标记是共显性标记，可以对籼、粳杂交后代分离群体的不同基因型进行同时鉴定。
(4)本发明中的分子标记可以有效地应用于辅助育种，对籼粳杂交后代的目的基因进行早代跟踪，提高选择效率，同时降低育种的盲目性。
(5)本发明中的分子标记的扩增特征条带较小，重要特征条带大小不到400bp，对试剂、DNA模板质量及仪器设备的要求低，成本低，便于普及推广应用。
(6)本发明的分子标记能够对bZIP73基因的不同基因型进行准确鉴定，引物的特异性强，操作简便，四引物混合同管一次PCR扩增检测，且不涉及限制性内切酶的使用及DNA测序等，避免了费工费时、工序复杂及费用昂贵等弊端，非常适合应用于对大批量的水稻资源和育种材料目的基因的鉴定，实用性和推广价值极强。
附图说明
图1为本发明的实施例中的分子标记的开发策略图；
图2为本发明的实施例中的bZIP73-O-F、bZIP73-O-R、bZIP73-I-F及bZIP73-I-R的比例分别为1:1:1:1和1:1:4:2的琼脂糖凝胶电泳效果对比图；
图3为本发明的实施例中进一步验证本发明的分子标记对不同来源水稻品种鉴定的准确性的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例：
本实施例提供一种鉴定水稻耐低温基因bZIP73的分子标记，包括基因bZIP73的四条特异性引物，四条特异性引物分别为正向外引物bZIP73-O-F、反向外引物bZIP73-O-R、正向内引物bZIP73-I-F和反向内引物bZIP73-I-R，四条特异性引物的引物序列如下：
本实施例提供一种利用鉴定水稻耐低温基因bZIP73的分子标记进行水稻基因资源鉴定的方法，在该方法中使用到的材料如下：籼稻材料：9311、培矮64S、南京11、贵农筒恢、莲香早、遵义大粒香、黔香B；粳稻材料：日本晴、大方五里香、南粳9108、纳雍五里香、毕粳43、毕粳45、NR210；籼粳F1材料：9311/日本晴、贵农筒恢/大方五里香、遵义大粒香/纳雍五里香。
上述方法包括以下步骤：
S1：分子标记设计及合成
从NCBI数据库下载bZIP73基因的DNA序列(AP006169↘BAD34342)，根据水稻bZIP73基因在籼稻和粳稻两个亚种间的编码序列第511位置存在的一个SNP，定位到DNA序列相应位置，进行分析，结合四引物扩增受阻突变体系PCR方法，设计并合成四引物标记，分别为正向外引物bZIP73-O-F、反向外引物bZIP73-O-R、正向内引物bZIP73-I-F和反向内引物bZIP73-I-R；
本实施例利用斯坦福大学的在线引物设计软件(https://www.yeastgenome.org/primer3)进行正向外引物和反向外引物的设计，正向内引物和反向内引物则由人工设计确定，正向内引物和反向内引物的3'端落在籼粳SNP位点，且与该位点碱基相同或互补，本实施例为增强特异性，对反向内引物3'端的第3个碱基引入错配，以将碱基G变为碱基T；由于正向内引物设计位置的碱基GC百分比含量太低，仅为20％左右，易导致PCR扩增失败，所以本实施例为了增加正向内引物的碱基GC的比例，同时也缩小正向内引物与其它引物间的GC含量差距，相对于反向内引物，设计正向内引物时，通过延长正向内引物的长度提高引物的Tm值；在正向内引物5'端第3-5位碱基进行碱基类型变换，即将碱基TTT变为碱基GCG，以提高正向内引物的GC含量，上述分子标记开发策略如附图1所示，附图1中的序列中字母下划线表示单核苷酸差异位点，省略号表示相同的碱基，箭头表示引物位置和扩增方向，方框内为引入的错配碱基；
上述正向外引物、反向外引物、正向内引物和反向内引物的引物序列如下：
依据各引物序列在DNA序列中所处的位置，预测：如果同时出现681bp和342bp两条带型，则为含粳型bZIP73Jap纯合体的水稻品种；如果同时出现681bp和387bp两条带型，则为含籼型bZIP73Ind纯合体的水稻品种；如果同时出现681bp、387bp及342bp三条带型，则为含bZIP73Jap/bZIP73Ind的杂合体；
S2：提取水稻样品的DNA
取新鲜水稻叶片0.3-0.4g，利用十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB法)提取DNA，较为具体步骤为：将水稻叶片用液氮磨成粉状，加入1.5mL的CTAB溶液(CTAB-2％(W/V)，NaCl-1.4Mol/L，EDTA-0.02Mol/L，Tris Basic-0.1Mol/L，pH＝8.0)，在65℃下水浴1h，期间摇晃数次；12000rpm/min离心10min，取上清液1mL移至2mL的EP离心管，弃去沉淀；加入苯酚:氯仿:异戊醇溶液(25:24:1)1mL，摇床水平摇动15min；12000rpm/min离心10min，小心吸取上清0.7mL至2mL的EP离心管；加入氯仿:异戊醇溶液(24:1)0.7mL，摇床水平摇动15min；12000rpm/min离心10min，取上清液0.4mL至已灭菌1.5mL的EP离心管中，加40μL的3Mol/LNaAC(PH＝5.2)，再加入0.8mL的-20℃无水乙醇，在-20℃静置1h；在-10℃下，12000rpm/min离心10min，弃上清液，加入0.5mL的75％乙醇洗涤两次；将离心管放到超净工作台风干，加入0.3mL超纯水溶解备用；
S3：用分子标记进行PCR扩增
PCR扩增体系采用20μL的反应体积，包括浓度为10～100ng/L的DNA 2μL，四引物标记混合液2μL，10×Taq Buffer 2μL，Mg2+Buffer 1.2μL，浓度为2.5mM/L的dNTP Mixture0.4μL，浓度为2.5U/μL的Taq DNA聚合酶0.4μL，ddH2O 12μL；本步骤中的四引物标记混合液中的正向外引物、反向外引物、正向内引物和反向内引物的浓度比例为1:1:4:2，本实施例中的正向外引物的浓度为2μM/L，反向外引物的浓度为2μM/L，正向内引物的浓度为8μM/L，反向内引物的浓度为4μM/L；PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共31个循环；最后72℃延伸10min，扩增结束，降温到10℃，保存1min，取出产物备用；
S4：琼脂糖凝胶电泳检测并拍照
将步骤S3中的扩增产物用约2％的琼脂糖凝胶于120V电压下电泳30-40min，并用越华洋的gillgreen核酸染料染色，然后在紫外凝胶成像仪上观察及拍照。
在四引物PCR反应体系中，除引物序列本身的设计是否合理外，各引物的比例及浓度对也会对试验结果产生重大的影响，是试验成败的一个重要因素，因此，混合引物加入比例及浓度的优化至关重要；
本实施例在确定步骤S3中的bZIP73-O-F、bZIP73-O-R、bZIP73-I-F和bZIP73-I-R的比例及浓度时，首先选用bZIP73-O-F：bZIP73-O-R：bZIP73-I-F：bZIP73-I-R为1:1:1:1的比例，浓度均为2μM/L，但检测结果发现，检测结果参见附图2中的a图，含纯合粳型bZIP73Jap的日本晴扩增出了大致681bp和342bp的条带类型，含纯合籼型bZIP73Ind的9311扩增出了大致681bp和387bp的条带类型，与预测目的片段相吻合；然而粳、籼杂合子F1却没有扩增出以上的所有条带类型，粳型特征带没有在杂合子中得到体现(见附图2中的a)，呈显性标记；后来本实施例以调整各引物比例为出发点，进行了诸多的实践探索，最终按bZIP73-O-F：bZIP73-O-R：bZIP73-I-F：bZIP73-I-R为1:1:4:2的比例进行试验，浓度分别为2μM/L、2μM/L、8μM/L、2μM/L进行试验，获得成功，发现所有基因类型的特征谱带均得到有效扩增，与预测目标片段大小一致，共显性标记得以体现(见附图2中的b)，籼粳杂合子扩增出了681bp、387bp及342bp三种条带类型；附图2中的M代表Marker B(100-600bp)，1和4代表日本晴水稻，2和5代表9311水稻，3和6代表F1(日本晴/9311)水稻。
为了进一步验证本发明的分子标记对不同来源水稻品种鉴定的准确性，本实施例扩大了研究范围，又增加了6个粳稻、6个籼稻和2个粳籼杂合F1进行测试。电泳检测结果如附图3所示，结果显示，6个粳稻品种均呈现出约681bp和342bp的谱带类型，6个籼稻品种呈现出约681bp和387bp的谱带类型，粳籼杂交的F1也如预期所盼，扩增出了粳、籼两亚种类型的所有特征谱带，即681bp、342bp和387bp三种带型。本发明的分子标记的可靠性得到了进一步验证，说明bZIP73-O-F、bZIP73-O-R、bZIP73-I-F和bZIP73-I-R四引物在同一管PCR扩增能很好地用于区分水稻品种bZIP73的粳籼属性，即粳型bZIP73Jap、籼型bZIP73Ind及bZIP73Jap/bZIP73Ind杂合子，可用于水稻相关基因的资源鉴定及分子标记辅助选择育种；附图3中的M、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17分别代表Marker B(100-600bp)、日本晴水稻、大方五里香水稻、南粳9108水稻、纳雍五里香水稻、毕粳43水稻、毕粳45水稻、NR210水稻、9311水稻、培矮64S水稻、南京11水稻、贵农筒恢水稻、莲香早水稻、遵义大粒香水稻、黔香20B水稻、F1(9311/日本晴)水稻、F1(贵农筒恢/大方五里香)水稻和F1(遵义大粒香/纳雍五里香)水稻。
如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 毕节市农业科学研究所
贵州省水稻研究所
<120> 一种分子标记及利用其鉴定水稻耐低温基因bZIP73的方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccatcaaggc atcaaacaca tc 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cacagatgac gcctaccaga 20
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gagcgattat tcagtaatca aatattctc 29
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gagctcctca cagccattca 20

Claims (5)

1.一种鉴定水稻耐低温基因bZIP73的分子标记，其特征在于，包括基因bZIP73的四条特异性引物，四条特异性引物分别为正向外引物bZIP73-O-F、反向外引物bZIP73-O-R、正向内引物bZIP73-I-F和反向内引物bZIP73-I-R，四条特异性引物的引物序列如下：
2.利用权利要求1所述的一种鉴定水稻耐低温基因bZIP73的分子标记进行水稻基因资源鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：分子标记设计及合成
从NCBI网站下载水稻bZIP73基因的DNA序列，根据水稻bZIP73基因在籼稻和粳稻两个亚种间的编码序列第511位置存在的一个SNP，定位到DNA序列相应的位置，进行分析，结合四引物扩增受阻突变体系PCR方法，设计并合成四引物标记，分别为正向外引物bZIP73-O-F、反向外引物bZIP73-O-R、正向内引物bZIP73-I-F和反向内引物bZIP73-I-R；
S2：提取水稻样品的DNA
取新鲜水稻叶片0.3-0.4g，利用十六烷基三甲基溴化铵法提取DNA；
S3：用分子标记进行PCR扩增
PCR扩增体系采用20μL的反应体积，包括浓度为10～100ng/L的DNA 2μL，四引物标记混合液2μL，10×Taq Buffer 2μL，Mg2+Buffer 1.2μL，浓度为2.5mM/L的dNTP Mixture 0.4μL，浓度为2.5U/μL的Taq DNA聚合酶0.4μL，dd H2O 12μL；
S4：琼脂糖凝胶电泳检测并拍照
将步骤S3中的PCR扩增产物在2％的琼脂糖凝胶中于120V电压下电泳30-40min，用核酸染料染色后在紫外凝胶成像仪上观察并拍照。
3.根据权利要求2所述的一种利用鉴定水稻耐低温基因bZIP73的分子标记进行水稻基因资源鉴定的方法，其特征在于，步骤S1中设计反向内引物时，在反向内引物3'端的第3个碱基引入错配，将碱基G变为碱基T，以增强引物特异性；设计正向内引物时，相对于反向内引物，加长了正向内引物序列长度，以提高其Tm值；在正向内引物5'端第3-5位碱基进行碱基类型变换，即将碱基TTT变为碱基GCG，以提高引物序列碱基GC所占百分比的比例。
4.根据权利要求2所述的一种利用鉴定水稻耐低温基因bZIP73的分子标记进行水稻基因资源鉴定的方法，其特征在于，步骤S3中PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共31个循环；最后72℃延伸10min，扩增结束，降温至10℃，保存1min，取出产物备用。
5.根据权利要求2所述的一种利用鉴定水稻耐低温基因bZIP73的分子标记进行水稻基因资源鉴定的方法，其特征在于，步骤S3中的四引物标记混合液中的正向外引物、反向外引物、正向内引物和反向内引物的浓度比例为1:1:4:2。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112481411A (zh) * 2020-12-24 2021-03-12 扬州大学 一种鉴定水稻粗杆大穗位点ipa1-2D和ipa1-1D的引物及方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105112504A (zh) * 2015-07-23 2015-12-02 毕节市农业科学研究所 一种水稻高氮利用效率基因的分子标记鉴定方法
CN107475426A (zh) * 2017-09-25 2017-12-15 山东省水稻研究所 一种鉴别栽培稻品种籼粳稻类型的分子标记及应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105112504A (zh) * 2015-07-23 2015-12-02 毕节市农业科学研究所 一种水稻高氮利用效率基因的分子标记鉴定方法
CN107475426A (zh) * 2017-09-25 2017-12-15 山东省水稻研究所 一种鉴别栽培稻品种籼粳稻类型的分子标记及应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CITAO LIU等: "Early selection of bZIP73 facilitated adaptation of japonica rice to cold climates", 《NAT COMMUN》 *
刘次桃等: "bZIP73：影响粳稻耐低温的关键基因", 《遗传》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112481411A (zh) * 2020-12-24 2021-03-12 扬州大学 一种鉴定水稻粗杆大穗位点ipa1-2D和ipa1-1D的引物及方法

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