CN103184220A - 水稻抗瘟基因Pi50基因特异性分子标记Pi50N4s及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种稻瘟病抗性基因Pi50基因特异性单碱基差异（SingleNucleotidePolymorphism,SNP）分子标记Pi50N4s,为以水稻品种抗源品种28占（EBZ）总DNA为模板，通过特定的引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2进行PCR扩增得到的核苷酸片段，所得PCR产物经限制性内切酶XbaI酶切后，与Pi50呈特异性带型分子标记。利用该分子标记Pi50N4s可以提高稻瘟病抗性基因Pi50在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种，以及转基因育种中利用的效率。

Description

水稻抗瘟基因Pi50基因特异性分子标记Pi50N4s及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体地，涉及稻瘟病技术领域，尤其是，

水稻抗瘟基因Pi50基因特异性分子标记Pi50N4s及其制备方法和应用。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，约有一半以上的人口以稻米为主食。由稻瘟病菌(Magnapothe oryzae)引起的稻瘟病是对水稻生产危害最严重的病害之一，每年都造成严重的粮食损失。从环境保护与农业可持续发展的观点来看，选育与利用抗病品种是防治稻瘟病最安全有效的方法。此外，单一抗性品种的持久性（通常是2-4年）会随着病原菌的迅速变异而失去功效（郑钊等2009），因此，合理的挖掘和利用广谱抗性基因或者聚合多个抗病基因，是获得持久、广谱抗病品种的重要途径。传统的水稻抗性育种依赖于抗性表型的鉴定，不仅依赖于育种者具备的丰富经验和敏锐的观察力，鉴定结果也极易受到环境及人为因素的影响而造成误差，抗性基因的选育效率低下。随着分子标记技术的产生及发展，其便捷、直接、不受环境影响等优点使其应用价值及前景越来越受到关注。通过开发与目标基因紧密连锁的分子标记，特别是在基因内部开发其功能特异性的标记物进行分子标记辅助选择，不仅大大加快了育种步伐，也提高了选择的可靠性。

到目前为止，人们已经鉴定出80多个水稻抗瘟基因(Ballini et al.,2008;鄂志国等2009;Zhai et al.,2010)，其中至少22个水稻稻瘟病抗性基因已被克隆(Wang et al.,1999;Qu et al.2006;Hayashi et al.2010；Jiang etal.，2012；Hua et al.，2012；Das et al.，2012)。这些稻瘟病抗病基因多数具有富亮氨酸重复-核苷酸结合位点（NBS-LRR）蛋白结构，NBS中心区域的功能与ATP结合/水解相关，C-端LRR区域参与了蛋白的相互作用(Dangl&Jones,2001;Takken&Tameling,2009;Bernoux,2011)。NBS-LRR基因有成簇排列的倾向，通常簇内基因的同源性很高，与相同抗性途径的基因也维持着共遗传的规律(Michelmore&Meyers,1998;Leister,2004)。水稻第6染色体长臂的Pi2/9基因簇是科学家的研究热点，如图1所示（Yang et al.,2009），从该位点区域已报道并深入研究的抗瘟基因有：Pi2、Pi9、Pigm(t)、Pi-z及Piz-t，他们分布在2～9个NBS-LRR成员组成的基因簇内。人们已证明了Pi2、Pi9和Pi-z中单个NBS-LRR基因已具有广谱抗瘟作用(Zhou，2006，2007；Dai，2010)，其中，Pi2和Piz-t的LRR区域仅8个氨基酸残基的差异就产生了不同的产物及抗性(Qu et al.,2006;Zhou et al.,2006)。但该基因簇中，还有更多的NBS-LRR成员等待人们进一步的挖掘和利用。

发明内容

申请人通过图位克隆方法(Map-based cloning)，从华南稻区的一个优异抗源品种28占（EBZ）中分离、鉴定到了一个具有广谱、持久抗性的稻瘟病抗性基因Pi50。申请人通过长片段PCR扩增（Long Rangement PCR Amplification）以及染色体步移（Chromosome Working）的方法，获得了包含Pi50位点区域的95kb基因组序列。通过FGenesh预测，该区域包括了7个编码NBS-LRR类蛋白的基因：Pi50-Nbs1～7（申请人未发表数据）。Pi50同样位于Pi2/9基因簇，Pi2/9/50区域NBS-LRR基因簇位点的整合图谱如图2所示（Zhu et al.,2012）。

值得注意的是，同样位于Pi2/9基因簇的Pi50，其对应的专化性小种的抗谱却与Pi2、Pi9和Piz-t的抗谱明显不同，如表1所示。针对各等位基因的结构域测序分析表明，Pi50与Pi2,Pi9和Piz-t的LRR功能域存在明显差异。其中Pi50-Nbs2，4，6这3个NBS-LRR类蛋白基因与已报道的Pi2/9基因簇的复等位基因存在较大的核酸序列差异。此外，Pi50供体品种EBZ与参考序列品种日本晴之间具有相似的基因组结构，但与Pi2，Pi9的供体品种存在较大的序列差异。多年实践证明，Pi50具有广谱、持久的稻瘟病抗性，且遗传力较高，使之更适合广泛应用于稻瘟病抗性育种计划中。因而，为了加快Pi50在抗性育种工作中的应用，开发出Pi50基因特异性分子标记，对于准确有效的分子标记辅助育种（MAS）、基因的聚合育种，显得尤其重要。

表1Pi2/9/z-t/50基因抗谱比较

为此，本发明的首要目的是提供一种稻瘟病抗性基因Pi50基因特异性单碱基差异（Single Nucleotide Polymorphism,SNP）分子标记Pi50N4s，以提高该基因在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种，以及转基因育种中利用的效率。

本发明的另一目的在于提供所述Pi50基因特异性单碱基差异分子标记Pi50N4s的制备方法。

本发明的再一目的在于提供所述Pi50基因特异性单碱基差异分子标记Pi50N4s的应用

本发明的技术方案如下：一种稻瘟病抗性基因Pi50基因特异性单碱基差异（Single Nucleotide Polymorphism,SNP）分子标记Pi50N4s,为以水稻品种抗源品种28占（EBZ）总DNA为模板，通过下列碱基序列的引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2进行PCR扩增得到的核苷酸片段：

SEQ ID NO.1（5’-3’）：CTTTGAATGTAATTAGATCTGCC

SEQ ID NO.2（5’-3’）：CTACCCCACAATTACAATCAG

所得PCR产物经限制性内切酶Xba I酶切后，与Pi50呈特异性带型分子标记。

所述稻瘟病抗性基因Pi50包括7个编码NBS-LRR类蛋白的基因，其中，基因特异性分子标记Pi50N4s位于第4个NBS-LRR类蛋白基因中。

所述稻瘟病抗性基因Pi50为通过图位克隆方法（Map-based cloning）从水稻品种抗源品种28占（EBZ）中分离鉴定得到。

所述稻瘟病抗性基因Pi50基因特异性单碱基差异（Single NucleotidePolymorphism,SNP）分子标记Pi50N4s的制备方法，包括如下步骤：

步骤1）利用多序列比对软件工具，对比日本晴、Pi2/Pi9BAC以及Pi50区域95kb序列，比较Pi50对应区域的NBS-LRR类基因的核苷酸序列，筛查Pi50中特异的、能区别于其感病等位基因以及该位点其他稻瘟病等位抗性基因的特异性单碱基（SNP）差异位点，得知该SNP位于候选基因Pi50-Nbs4中；

步骤2）根据dCAPS(DerivedCleaved Amplified Polymorphic Sequences;Neff et al.,2002.Trends in Genetics18:613-615)标记的开发原理，利用步骤1）获得的SNP信息，在SNP上游100-200bp处设计基因特异性上游引物，在该SNP处设计带有错配碱基的基因特异性下游引物，引物对碱基序列如下：

SEQ ID NO.1（5’-3’）：CTTTGAATGTAATTAGATCTGCC

SEQ ID NO.2（5’-3’）：CTACCCCACAATTACAATCAG

利用上述引物对，以水稻品种抗源品种28占（EBZ）总DNA为模板，进行PCR扩增，得到可进行电泳检测的DNA片段，即为所述稻瘟病抗性基因Pi50基因特异性单碱基差异（Single Nucleotide Polymorphism,SNP）分子标记Pi50N4s。

较佳地，还包括步骤3），利用步骤2）所述的引物对，对多个不同水稻品种的总DNA进行PCR扩增反应，获得Pi2/9基因簇多个抗源品种对应于Pi50特异SNP位点的片段，与步骤2获得的DNA片段进行比较验证，从而确定Pi50基因特异性的分子标记Pi50N4s。

所述稻瘟病抗性基因Pi50基因特异性单碱基差异（Single NucleotidePolymorphism,SNP）分子标记Pi50N4s在鉴别Pi2/9基因簇区域不同稻瘟病抗性基因的应用。

所述稻瘟病抗性基因Pi50基因特异性单碱基差异（Single NucleotidePolymorphism,SNP）分子标记Pi50N4s在鉴别普栽水稻品种中稻瘟病抗性基因的应用。

本发明的有益效果为：本发明所提供的稻瘟病抗性基因Pi50功能特异性分子标记具有重要的应用价值，利用此标记可以提高该基因在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种，以及转基因育种中利用的效率。

附图说明

图1为水稻第6染色体长臂的Pi2/9基因簇中已经报道的抗瘟基因；

图2是Pi2/9/50区域NBS-LRR基因簇位点的整合图谱；

图3是Pi50基因特异性分子标记Pi50N4s在Pi2/9基因簇区域不同稻瘟病抗性基因的验证。其中，

M:DNA ladder；

泳道1：DNA模板为抗性基因供体品种EBZ(Pi50)；

泳道2：DNA模板为抗性品种IRBLzt-T(Piz-t)；

泳道3：DNA模板为抗性品种75-1-27(Pi9)；

泳道4：DNA模板为抗性品种C101A51(Pi2)；

泳道5：DNA模板为抗性品种谷梅2(Pi26)；

泳道6：DNA模板为抗性品种谷梅4(Pigm)；

泳道7：DNA模板为感病品种日本晴（Nip）；

泳道8：DNA模板为感病品种LTH(NIL-Pi50近等基因系的轮回亲本)；

泳道9：DNA模板为NIL-e1-Pi50(Pi50近等基因系)；

泳道10：DNA模板为NIL-e2-Pi50(Pi50近等基因系)。

图4是Pi50基因特异性分子标记Pi50N4s在华南地区13种水稻材料中稻瘟病抗性基因型的验证。其中，

M:DNA ladder；

泳道1：DNA模板为抗性基因供体品种EBZ(Pi50)；

泳道2：DNA模板为NIL-e1-Pi50(Pi50近等基因系)；

泳道3：DNA模板为NIL-e2-Pi50(Pi50近等基因系)；

泳道4：DNA模板为感病品种LTH(NIL-Pi50近等基因系的轮回亲本)；

泳道5：DNA模板为感病品种日本晴(Nip)；

泳道6～18的DNA模板为依次为：华占、金恢207、五山丝苗、粤晶丝苗、天丰B、协青早B、地谷B、福伊B、五丰B、中丝2号、中丝3号、钱江1B、天B。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：稻瘟病抗性基因Pi50基因特异性分子标记及其引物设计与检测

1）特异单碱基差异（SNP）位点的分析：

利用多序列比对软件工具，对比日本晴、Pi2/Pi9BAC以及申请人实验室所获得的Pi50区域95kb序列，比较Pi50对应区域的NBS-LRR类基因的核苷酸序列，筛查Pi50中特异的、能区别于其感病等位基因以及该位点其他稻瘟病等位抗性基因的特异单碱基差异（SNP）位点。具有基因特异性SNP的水稻稻瘟病抗性基因Pi50与Pi2/9簇等位基因侧翼序列的多序列结果如下所示，

Pi50:GAGATGTACATGCGCTCTCTATATTGTAATTGTGGGGTAG

Nbs4-Nip:GAGATGTACATGCGCTCGCTATATTGTAATTGTGGGGTAG

Nbs6-Pi2:GAGATGTACATGCGCTCGCTATATTGTAATTGTGGGGTAG

其中，加黑加粗字母号T标出该SNP位点信息，由此鉴定到在Pi50-N4部分具有的功能特异性单碱基差异（SNP）；

2）设计引物：

根据dCAPS标记的设计原理，在所述SNP位点上游100-200bp处设计基因特异性上游引物，在该SNP位点处设计带有错配碱基的基因特异性下游引物，引物对碱基序列如下所示：

SEQ ID NO.1（5’-3’）：CTTTGAATGTAATTAGATCTGCC

SEQ ID NO.2（5’-3’）：CTACCCCACAATTACAATCAG

3）选择水稻代表品种

选择携带有Pi50基因以及Pi2/9基因簇等位基因的代表品种如下：

水稻品种EBZ，为Pi50供体品种；

水稻品种C101A51，为Pi2供体品种（Chen et al.,Plant Dis.,1996,80:52–56）；

水稻品种75-1-127，为Pi9供体品种（Liu et al.,Mol Genet Genomics,2002,267:472–480）；

水稻品IRBLzt-T，为Piz-t供体品种（Zhou et al.,MPMI,2006,19:1216–1228）；

水稻品种谷梅2号，为Pi26供体品种（Wu et al.,Theor Appl Genet,2005,111:50-56）；

水稻品种谷梅4号，为Pigm供体品种(Deng et al.,Theor Appl Genet,2006,113:705–713）；

感病对照品种:日本晴；

感病对照品种：丽江新团黑谷（LTH）；

NIL-e-Pi50(Pi50近等基因系)。

4）PCR扩增，获得相应的多态性片段

利用上述引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，以上述水稻品种的总DNA为模板，进行常规PCR扩增，扩增出的片段为135bp。

扩增反应体系如下：

ddH₂O：13.3μl（补足至20μl）

10×PCR buffer(Mg²⁺Plus)：2μl

dNTPs(2.5mM each)：1.6μl

SEQ ID NO.1(10μM)：1μl

SEQ ID NO.2(10μM)：1μl

TaKaRa TaqTM(5U/μl)：0.1μl

DNA模版（20-50ng/μl）：1μl

PCR温度循环条件如下：94℃3分钟；94℃30秒、58℃30秒、72℃1分钟，35个循环；72℃5分钟；10℃保存。

PCR反应结束后，利用限制性内切酶XbaI对所获得的PCR产物进行酶切，反应体系如下：

ddH₂O：5.5μl（补足至12μl）

10×buffer1：1.2μl

BSA：1.2μl

PCR产物：5μl

XbaI：0.3μl

在37℃条件下酶切3小时后，取适量酶切样品在8%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，电泳条件为90V，2小时，电泳图谱如图3所示。其中，低带代表含有Pi50基因，高带为含Pi2/9基因。

测序检测PCR产物，以水稻品种EBZ总DNA为模板，扩增出的片段为Pi50N4s。

实施例2：抗性基因Pi50基因特异性分子标记在鉴别Pi2/9基因簇区域不同稻瘟病抗性基因的应用。

根据多态性的PCR产物条带，可以把含有目标基因Pi50与其它Pi2/9基因簇等位基因的品种区分开来。如图3所示，Pi50的供体品种及含有Pi50的近等基因系具有基因特异性分子标记的存在，使用限制性内切酶XbaI酶切时可以在特异性分子标记Pi50N4s处切断,而形成低条带；而Pi2/9基因簇其它等位基因供体品种在特异性分子标记Pi50N4s处因酶切位点不匹配，使用限制性内切酶XbaI酶切时不可以在特异性分子标记Pi50N4s处切断，只有高条带。

如附图说明的那样，试验结果与设计分析的相吻合，说明抗性基因Pi50基因特异性分子标记可在鉴别Pi50基因与其他稻瘟病抗性基因，包括Pi2/9基因簇等位基因等方面得到应用。

实施例3：抗性基因Pi50基因特异性分子标记在鉴别华南地区普栽水稻品种中稻瘟病抗性基因的应用

采集13个本研究室收集的、华南地区重要水稻品种，依次为：华占、金恢207、五山丝苗、粤晶丝苗、天丰B、协青早B、地谷B、福伊B、五丰B、中丝2号、中丝3号、钱江1B、天B，分别提取其基因组DNA,并以此为模板，利用实施例1中开发、确定的实验程序，对抗性基因Pi50基因特异性的分子标记进行PCR扩增、酶切及电泳检测。根据PCR产物（条带）的大小，可以把Pi50与其他稻瘟病抗性基因区分开来。如图4所示，在抗谱表型为Pi50型的个体中能检测到Pi50N4s基因特异性分子标记的存在，而其他抗谱表型的个体则不能检测到该分子标记。

如附图4说明的那样，试验结果与设计分析的相吻合，说明抗性基因Pi50基因特异性分子标记可在鉴别Pi50基因与其他稻瘟病抗性基因，包括Pi2/9基因簇等位基因等方面得到应用。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其架构形式能够灵活多变，可以派生系列产品。只是做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。

Claims (7)

1.一种稻瘟病抗性基因Pi50基因特异性单碱基差异（Single NucleotidePolymorphism,SNP）分子标记Pi50N4s,其特征在于，为以水稻品种抗源品种28占（EBZ）总DNA为模板，通过下列碱基序列的引物对SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2进行PCR扩增得到的核苷酸片段：

SEQ ID NO.1（5’-3’）：CTTTGAATGTAATTAGATCTGCC

SEQ ID NO.2（5’-3’）：CTACCCCACAATTACAATCAG

所得PCR产物经限制性内切酶Xba I酶切后，与Pi50呈特异性带型分子标记。

2.如权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pi50基因特异性单碱基差异（Single Nucleotide Polymorphism,SNP）分子标记Pi50N4s,其特征在于，所述稻瘟病抗性基因Pi50包括7个编码NBS-LRR类蛋白的基因，其中，基因特异性分子标记Pi50N4s位于第4个NBS-LRR类蛋白基因中。

3.如权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pi50基因特异性单碱基差异（Single Nucleotide Polymorphism,SNP）分子标记Pi50N4s,所述稻瘟病抗性基因Pi50为通过图位克隆方法（Map-based cloning）从水稻品种抗源品种28占（EBZ）中分离鉴定得到。

4.如权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pi50基因特异性单碱基差异（Single Nucleotide Polymorphism,SNP）分子标记Pi50N4s的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1）利用多序列比对软件工具，对比日本晴、Pi2/Pi9BAC以及Pi50区域95kb序列，比较Pi50对应区域的NBS-LRR类基因的核苷酸序列，筛查Pi50中特异的、能区别于其感病等位基因以及该位点其他稻瘟病等位抗性基因的特异性单碱基（SNP）差异位点，得知该SNP位于候选基因Pi50-Nbs4中；

步骤2）根据dCAPS(Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequences;Neff et al.,2002.Trends in Gene tics18:613-615)标记的开发原理，利用步骤1）获得的SNP信息，在SNP上游100-200bp处设计基因特异性上游引物，在该SNP处设计带有错配碱基的基因特异性下游引物，引物对碱基序列如下：

SEQ ID NO.1（5’-3’）：CTTTGAATGTAATTAGATCTGCC

SEQ ID NO.2（5’-3’）：CTACCCCACAATTACAATCAG

利用上述引物对，以水稻品种抗源品种28占（EBZ）总DNA为模板，进行PCR扩增，得到可进行电泳检测的DNA片段，即为所述稻瘟病抗性基因Pi50基因特异性单碱基差异（Single Nucleotide Polymorphism,SNP）分子标记Pi50N4s。

5.如权利要求4所述的稻瘟病抗性基因Pi50基因特异性单碱基差异（Single Nucleotide Polymorphism,SNP）分子标记Pi50N4s的制备方法，其特征在于，还包括步骤3），利用步骤2）所述的引物对，对多个不同水稻品种的总DNA进行PCR扩增反应，获得Pi2/9基因簇多个抗源品种对应于Pi50特异SNP位点的片段，与步骤2获得的DNA片段进行比较验证，从而确定Pi50基因特异性的分子标记Pi50N4s。

6.权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pi50基因特异性单碱基差异（SingleNucleotide Polymorphism,SNP）分子标记Pi50N4s在鉴别Pi2/9基因簇区域不同稻瘟病抗性基因的应用。

7.权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pi50基因特异性单碱基差异（SingleNucleotide Polymorphism,SNP）分子标记Pi50N4s在鉴别普栽水稻品种中稻瘟病抗性基因的应用。

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