KR100919753B1

KR100919753B1 - 메론 및 참외에서 유용한 흰가루병 저항성 연관 ｓｃａｒ마커 및 이를 이용한 저항성 참외 품종 선발방법

Info

Publication number: KR100919753B1
Application number: KR1020070075640A
Authority: KR
Inventors: 남석현; 이희정; 안종문; 이민선; 허남한; 이경아; 조화진; 한지학; 양승균
Original assignee: 주식회사 농우바이오
Priority date: 2007-07-27
Filing date: 2007-07-27
Publication date: 2009-09-29
Also published as: KR20090011741A

Abstract

본 발명은 메론 및 참외에서 유용한 흰가루병 저항성 연관 SCAR 분자표지 및 이를 이용한 저항성 참외 품종 육성방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 메론의 흰가루병 저항성 계통과 이병성 계통을 이용하여 분리집단 F₂를 육성 및 병 검정하여 흰가루병 저항성과 연관된 유전자 단편을 분리하고, 상기 유전자 단편들의 염기서열을 분석하여 그 단편에 특이적인 프라이머를 합성하여 고안된 8개 조합의 흰가루병 저항성 연관 SCAR 분자표지 및 이를 이용한 흰가루병 저항성 품종 육성방법에 관한 것이다.

본 발명의 흰가루병 저항성 검출용 SCAR 분자표지는 메론 또는 참외 계통의 저항성 품종을 효과적으로 선발하는데 유용하며, 저항성 품종을 분리하여 새로운 품종을 개발하는데 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 교배가 잘되는 참외에 메론의 흰가루병 저항성 인자를 도입하여 흰가루병 저항성 참외 식물체를 개발하는데 유용하게 이용될 것으로 평가되었다.

Description

메론 및 참외에서 유용한 흰가루병 저항성 연관 ＳＣＡＲ 마커 및 이를 이용한 저항성 참외 품종 선발방법 {SCAR marker involving in powderly mildew resistance and selection method in melon thereof}

본 발명은 메론의 흰가루병 저항성과 연관된 유전자 단편 및 상기 유전자 단편의 염기서열을 이용하여 메론 또는 참외의 흰가루병 저항성을 선발하는 SCAR 분자표지에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 메론의 흰가루병 저항성 계통과 이병성 계통을 이용하여 분리집단 F₂를 육성 및 병 검정하여 흰가루병 저항성과 연관된 유전자 단편을 분리하고, 상기 유전자 단편들의 염기서열을 분석하여 그 표지에 특이적인 프라이머를 합성하여 고안된 SCAR 분자표지에 관한 것이다.

박과 작물인 메론은 1970년대 농가에 처음 보급된 이래로 연간 총 재배면적이 98년 550ha 정도에서 현재 약 1000ha로 증가 추세에 있고, 생산량은 일반적으로 3,570kg/10ha 이다. 현재 국민의 기호가 다양해지고 메론에 대한 인지도가 높아지고 있으므로 앞으로 좀 더 대중적인 소비가 이루어질 것으로 예측된다.

메론 재배에 있어, 가장 큰 병해의 하나가 흰가루병이다. 메론 흰가루병(powdery mildew)의 병원균은 스파이로테카 풀리지니아(Sphaerotheca fuliginea)이며, 자낭각 형태로 월동하며 포자는 바람이나 곤충에 의해 전염되므로 효과적인 방제가 어렵고, 일단 발병하면 20~40% 이상의 생산량 저하를 초래한다.

흰가루병의 방제를 위한 방법으로 화학적 방제법과 자연 친화적 방제법이 사용되고 있는데, 주로 이용되고 있는 화학적 방제법 즉, 살균제를 이용한 방제방법은 방제 효과가 낮고 약제에 대한 내성을 가지는 새로운 병원균의 발생 가능성을 높이는 것으로 보고되고 있다. 또한 자연친화적인 방제법으로는 천적 미생물이나 생화합물을 이용한 생물학적 방제법이 있지만 효율이 높지 않으므로 현시점에서 효과적인 방제법을 찾기가 어려운 실정이다. 이러한 상황에서 메론의 흰가루병 방제를 위한 가장 효과적인 방법은 저항성 품종을 육성하는 것으로 인식되고 있고, 그 필요성이 증대되고 있다.

메론의 흰가루병 저항성 품종을 육성하기 위해서는 저항성 검정 방법이 확립되어야 하지만, 진정활물기생균으로 증식하는 이 병원균은 발병조건이 까다롭고, 발병시키기 위해서는 포장의 자연환경 조건하에서 발병을 유도해야 하므로 실질적으로 저항성 품종을 육성하기 위해서는 막대한 노력과 시간이 소요된다. 그러나 분자표지를 이용하여 저항성 품종을 육성할 경우, 환경 요인의 영향이나 관여하는 유전자의 유전양식에 따른 제한이 없어 정확한 표현형 선발이 가능하고, 유묘기에 선발이 가능하기 때문에 흰가루병과 같은 개화기 이후에 발병하는 형질의 경우, 그 경제적인 효과가 굉장히 높다.

또한, 메론의 흰가루병 저항성과 같이 환경적인 요인에 영향을 많이 받고 유전자의 작용이 복잡한 양적형질의 경우, 분자마커의 개발과 이를 이용한 저항성 품종 육성이 필수요건으로 보고되고 있으므로, 메론의 흰가루병 저항성 품종을 육성하기 위해 저항성과 연관된 분자마커의 개발이 요구되고 있다.

한편, 참외에는 흰가루병 저항성 유전자가 없어서 메론에 있는 저항성 인자를 교배에 의하여 도입하여야 하는데, 메론과 참외는 교배가 잘되어 메론에 있는 흰가루병 저항성 유전자를 도입하는 것에는 문제가 없지만, 바이오 어세이(bioassay)에 의한 흰가루병 저항성 검정이 어려워 분자마커로 검정하는 것이 효과적이다.

따라서 본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 메론의 흰가루병 저항성 유전자와 연관된 SCAR 분자표지를 제공하고, 이 분자표지를 이용하여 흰가루병에 저항성을 갖는 참외 품종의 육성방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 메론 및 참외 계통에서 흰가루병 저항성 계통을 선발하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 메론에서 유래한 흰가루병 저항성 검출용 SCAR 분자표지에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 SCAR 분자표지를 증폭하기 위한 특징적 염기서열을 가지는 프라이머 쌍에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 SCAR 분자표지를 이용하여 참외의 흰가루병 저항성 계통을 선발하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 SCAR 분자표지를 이용하여 흰가루병 저항성 참외 품종을 육성하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 SCAR 분자표지를 이용하여 저항성 유전자형으로 확인되는 흰가루병 저항성 참외 품종에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서는 메론의 흰가루병에 저항성을 보이는 계통과 이병성을 보이는 계통을 교배하여 얻은 F₁을 자가 수정하여 F₂를 육성하고, 분리집단 F₂에서 완전한 저항성으로 나온 16개체, 완전한 이병성으로 나온 16개체의 DNA를 풀링(pooling)하여 bulk DNA를 만든 후, DNA 지문(fingerprinting) 방법을 응용한 일괄분리분석(bulked segregant analysis, BSA) 기술을 이용하여 흰가루병 저항성과 연관된 분자마커를 탐색하였다.

본 발명은 여러 가지 저항성 유전자를 갖는 유전형을 동정하는데 있어 분자마커가 유용하며, 환경의 간섭 없이 유전형을 기반으로 선발할 수 있다는 장점이 있다. 분자마커는 또한 생물학이나 검역 때문에 병원체를 얻기 어려운 곳에서 병저항성 형질을 선발할 때 유용하게 쓰일 수 있다.

먼저 흰가루병 병원균에 대해서 저항성을 보이는 계통과 이병성을 보이는 계통을 교배하여 얻은 F₁을 자가수정하여 분리집단 F₂를 육성하였다. 이들 양친계통과 F₁, F₂ 집단에서 흰가루병 저항성을 검정하였다. 양친과 F₁, F₂ 식물체를 정식한 후, 비닐하우스 포장의 자연환경에서 흰가루병을 발병시켰고, 한 달 후 발병 정도를 다섯 단계로 나누어 검정하였다. 그 결과, 발병지수를 통해 얻은 비율이 1:2:1의 비율에 가까워 메론 흰가루병 저항성 형질은 불완전우성 효과를 가지는 하나의 주동유전자에 의해 조절되는 것으로 추정할 수 있다.

분리집단 F₂에서 완전한 저항성으로 나온 16개체, 완전한 이병성으로 나온 16개체의 DNA를 풀링(pooling)하여 bulk DNA를 만든 후, DNA 지문(fingerprinting) 방법을 응용한 일괄분리분석(bulked segregant analysis, BSA) 기술을 이용하여 흰가루병 저항성과 연관된 분자표지를 탐색하였다. 흰가루병 저항성과 연관된 분자표지를 선발하기 위해 random primer, ISSR primer, 그리고 일반적으로 식물의 병저항성 유전자에 존재하는 NBS (nucleotide binding site)-domain에 특이적인 염기서열에서 작성한 primer를 이용하여 BSA (bulked segregant analysis) 방법을 수행하면서, AFLP (amplified fragment length polymorphism) 기술을 응용한 BSA (bulked segregant analysis) 방법도 병행하여 흰가루병 저항성 연관마커를 탐색하였다. 그 결과 저항성 bulk DNA와 이병성 bulk DNA에서 차이를 보이는 8개의 프라이머 조합을 선발하였고, 이들 프라이머가 재현성 있게 차이를 나타내는지 확인하기 위해 저항성 계통, 이병성 계통, 저항성 bulk, 이병성 bulk에서 2차적으로 확인하여 재현성이 있는 것으로 확인되었으며, 이후 이들을 클로닝하여 각각 CmPMR1, CmPMR3, CmPMR6, CmPMR7, CmPMR8, CmPMR9, CmPMR10, CmPMR11로 명명하였다.

NBS(nucleotide binding site)-domain에 특이적인 염기서열에서 작성한 redundant primer와 random primer, AFLP primer 조합을 이용하여 선발한 분자표지를 품종 육종의 선발표지로 바로 이용하는 것은 효율성과 정확성 측면에서 어려움이 있기 때문에 분석이 간편한 DNA 표지로 전환하고자 저항성과 연관된 것으로 추정되는 DNA 단편을 클로닝하여 염기서열을 분석한 후, 그 표지에 특이적인 primer를 다시 합성하여 분석이 간편하고 재현성과 신뢰도가 높은 SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) 분자표지로 전환하였다.

전환된 SCAR 분자표지는 bulk DNA를 만들 때 사용되었던 F₂ 분리개체에서 개체별로 확인하여 저항성 유전자와의 연관성을 확인하였고, 이후 흰가루병 검정에 사용되었던 F₂ 분리집단 전체 개체들에 대해 분자표지를 적용해 연관정도를 알아보기 위해 MapMaker 프로그램(V 3.0)을 이용하여 유전자연관 지도를 작성하여 QTL을 분석하였다. 그 결과, CmPMR7과 CmPMR10 표지의 유전자형이 RR인 개체를 선발할 경우 95%는 저항성 개체, 나머지 5%는 중도 저항성 개체를 선발할 수 있어 정확하게 저항성 개체를 선발할 수 있는 것으로 판단되었다.

또한 연관분석 결과, 저항성과 가장 가까이 연관된 SCAR 표지인 CmPMR7 및 CmPMR10을 이용하여 국내에서 판매되는 국내 종자회사의 주요 참외 17 품종 및 저항성계통에 대하여 본 발명의 SCAR 분자표지의 흰가루병 선발에 대한 유용성을 검정하였다. 그 결과, 본 발명에 의해 분리된 흰가루병 저항성에 연관된 마커들은 흰가루병의 저항성 유전자가 없는 참외에 도입되어 흰가루병 저항성을 가지는 품종 개발에 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 이들 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 국한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 저항성 계통과 이병성 계통을 이용한 분리집단 F₂육성 및 병 검정

메론에서 흰가루병 병원균에 대해서 저항성을 보이는 계통 'NWPMR'과 이병성을 보이는 계통 'NWPMS'를 교배하여 얻은 F₁을 자가수정하여 분리집단 F₂를 육성하였다. 이들 양친계통과 F₁, F₂ 집단에서 흰가루병 저항성을 검정하였다. 양친과 F₁, F₂ 식물체를 정식한 후, 비닐하우스 포장의 자연환경에서 흰가루병을 발병시켰고, 한달 후 발병 정도를 다섯 단계로 나누어 검정하였다(표 1).

[표 1] 포장의 자연발병 조건에서 메론 F₂ 분리집단의 흰가루병 발병 조사

발병지수(D.I)	NWPMR	NWPMS	F₁	F₂
1	2	0	0	3
2	8	0	0	72
3	0	0	6	60
4	0	2	4	55
5	0	8	0	72
Total	10	10	10	262

즉, 저항성 계통, 이병성 계통, F₁그리고 F₂분리집단에서 발병 정도는 5단계의 발병지수 (Disease Index, D.I)로 나누었는데, D.I1은 병징이 전혀 나타나지 않는 개체, D.I5는 흰가루병 포자가 75% 이상의 잎을 완전하게 뒤덮고 있는 개체, D.I2~D.I4의 값은 잎 표면의 포자 발생 정도가 적은 개체에서 많은 개체순서로 다르게 표시를 하였다.

표 1에서와 같이 F₁에서 일부 병징이 나타나는 것으로 보아 메론에서 흰가루병 저항성 유전자는 불완전 우성으로 작용하는 것으로 추정할 수 있다. F₂분리집단에서 D.I1 및 D.I2로 나타난 식물체를 저항성으로 판단하고, D.I3 및 D.I4로 나타난 개체를 불완전 저항성, D.I5로 나타난 개체를 이병성으로 판단하게 되면 저항성과 불완전 저항성, 이병성 개체 비율이 75：126：76의 비율로 나타나는데, 이 비율은 1:2:1의 비율에 가까워(Χ²=2.43) 메론 흰가루병 저항성 형질은 불완전우성 효과를 가지는 하나의 주동유전자에 의해 주요하게 조절되는 것으로 추정할 수 있다.

실시예 2. BSA 기술을 이용한 저항성 연관 분자표지 개발

분리집단 F₂에서 이병지수 1단계 내지 2단계의 완전저항 16개체, 이병지수 5단계의 완전이병으로 나온 16개체의 DNA를 풀링(pooling)한 후, DNA 지문(fingerprinting) 방법을 응용한 일괄분리분석(bulked segregant analysis, BSA) 기술을 이용하여 흰가루병 저항성과 연관된 분자표지를 탐색하였다.

전체 유전자를 분리하기 위해서 1.5㎖ 마이크로튜브(microtube)에 손톱 크기 정도의 샘플과 텅스텐 비드(tungsten bead), DNA 추출 버퍼(0.5M NaCl, 0.5% SDS, 50mM EDTA, 0.1M Tris-Cl) 400㎕와 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol) 4㎕를 넣고 퀴아젠(Qiagen)사의 분쇄기계(grinding machine)를 이용하여 곱게 갈아준 후, 10분에 한번씩 샘플을 흔들어 주면서 65℃에서 1시간동안 인큐베이션(incubation)하였다. 자석을 이용해 튜브에서 텅스텐 비드를 제거한 후, 5M 초산칼륨(KOAc) 130㎕를 넣고 가볍게 섞어준 다음 4℃에 10분간 방치하였다. 이를 13,000rpm으로 10분간 원심분리 후, 상층액 100㎕를 새로운 마이크로튜브로 옮기고, 여기에 이소프로판올(isopropanol) 100㎕를 넣고 섞어주었다. 이를 실온에 10분 정도 방치하고 13,000rpm에서 2분간 원심분리 하였다. 침전물만 남기고 상층액을 모두 버린 후 70% 에탄올(ethanol) 1㎖를 넣고 잘 흔들어준 후, 에탄올을 제거하고 침전물을 건조시켰다. 이렇게 분리한 DNA는 리보핵산분해효소(RNase)가 들어있는 3차 증류수 200㎕에 잘 녹인 후, 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)에 주형 DNA로 이용하였다.

흰가루병 저항성 연관 마커를 선발하기 위해 오페론 테크놀러지(Operon Technology)사에서 구입한 10-mer 랜덤 프라이머 520 조합, 브리티시콜럼비아대학교(UBC, Canada)에서 구입한 10-mer 랜덤 프라이머 100조합, ISSR(inter-simple sequence repeat amplication) 프라이머 100조합, 그리고 일반적으로 식물의 병저항성 유전자에 존재하는 뉴클레오티드 결합부위-도메인[NBS(nucleotide binding site)-domain]에 특이적인 염기서열에서 작성한 프라이머 56조합을 이용하여 BSA-RAPD(bulked segregant analysis-randomly amplified polymorphic DNA sequence)방법으로 실험을 수행하였다. 한편, AFLP 분석을 위해서는 EcoRⅠ, XbaⅠprimer 1008조합을 이용하여 실험을 수행하였다.

RAPD분석을 위한 중합효소 연쇄반응 조건은 전체 25㎕ 반응용액에 주형 DNA 5㎕(약 30ng), 프라이머 10pmole, 0.25mM dNTP, 1x PCR 버퍼, 0.5U Taq DNA 폴리머라제(Takara Ex Taq)를 포함시켰다. 이 반응용액을 Eppendorf사의 PCR 기계를 사용하여 94℃에서 30초, 37℃에서 30초, 72℃에서 1분 30초로 35회 반응시키고, 반응이 끝난 후, 증폭된 산물을 1.2% 아가로오스 겔(agarose gel)에 전기영동하여 반응산물을 확인하였다.

ISSR 프라이머와 NBS-도메인에 특이적인 프라이머 조합을 이용한 반응의 경우, 모든 조건은 RAPD 분석 조건과 동일하지만, 중합효소 연쇄반응(PCR)의 온도 조건만 변형하여 94℃에서 30초, 50℃에서 30초, 72℃에서 2분으로 35회 반응시켰다.

AFLP 분석을 위한 실험방법은 다음과 같이, 먼저 genomic DNA를 EcoRⅠ과 XbaⅠ으로 절단하고, EcoRⅠ과 XbaⅠ 어답터(adaptor)를 부착(ligation)한 후, 이 어답터(adaptor)에 특이한 프라이머(selective primer)인 EcoRⅠ-N과 XbaⅠ-N을 이용하여 기증폭(preamplification)하고, 이를 희석하여 EcoRⅠ-NNNN과 XbaⅠ-NNNN 프라이머 조합으로 PCR을 수행하여 2% 아가로오스 겔(agarose gel)에 전기영동하여 연관표지를 탐색하였다.

그 결과 저항성 bulk DNA와 이병성 bulk DNA에서 차이를 보이는 8개의 primer 조합을 선발하였고, 이들 primer가 재현성 있게 차이를 나타내는지를 확인하기 위해 저항성 계통, 이병성 계통, 저항성 bulk, 이병성 bulk에서 2차적으로 확인하여 재현성이 있는 것으로 확인되었다 (도 1). 이후 차이를 보이는 PCR 밴드를 클로닝하여 각각 CmPMR1, CmPMR3, CmPMR6, CmPMR7, CmPMR8, CmPMR9, CmPMR10, CmPMR11로 명명하였다. 도 1의 PCR 반응에 이용한 primer의 염기 서열은 아래와 같다.

[표 2] BSA 방법으로 연관표지 탐색에 사용한 프라이머 염기서열

Markers	Forward primer (5'→ 3')	Reverse primer (5'→ 3')	Tm
CmPMR1	UBC846: CACACACACACACACAGT(서열번호1)	L08: GNNTNGGNAARACNACTCT(서열번호2)	48℃
CmPMR3	UBC846: CACACACACACACACAGT(서열번호3)	L16: GNNTNGGNAARACNACCCT(서열번호4)	48℃
CmPMR6	GL27: CCAGANGGNGANCGNGACAG(서열번호5)	MS39: AGTGTGTGTGTGTGTG(서열번호6)	48℃
CmPMR7	L18: GNNATNGGNAARTAYTAYATN(서열번호7)	MS85: VDVCTCTCTCTCTCTCT(서열번호8)	48℃
CmPMR8	x04: GACTGCGTACCAATTCATG(서열번호9)	e26: TGAGTCCTGAGCTAGATCT(서열번호10)	56℃
CmPMR9	x05: GACTGCGTACCAATTCACA(서열번호11)	e20: TGAGTCCTGAGCTAGATAG(서열번호12)	56℃
CmPMR10	x07: GACTGCGTACCAATTCACC(서열번호13)	e02: TGAGTCCTGAGCTAGAAAT(서열번호14)	56℃
CmPMR11	x18: GACTGCGTACCAATTCTCT(서열번호15)	e23: TGAGTCCTGAGCTAGATTC(서열번호16)	56℃

실시예 3. 저항성과 연관된 것으로 추정되는 DNA 단편의 SCAR 표지로 전환

무작위 프라이머(random primer)를 이용하여 선발한 분자표지를 품종 육종의 선발표지로 바로 이용하는 것은 어려움이 있기 때문에, 그 불안정성을 개선하기 위해 선발된 밴드의 특정부위를 특이적으로 증폭할 수 있는 분석이 간편한 DNA 분자표지로 전환하고자 하였다. 즉, 흰가루병 저항성과 연관된 것으로 추정되는 DNA 단편을 클로닝하여 염기서열을 분석한 후, 그 표지에 특이적인 프라이머를 다시 합성하여 분석이 간편하고 재현성과 신뢰도가 높은 SCAR(sequence characterized amplified region)표지로 전환하고자 하였다.

저항성 유전자와 비교적 가까이 연관된 것으로 추정되는 8개의 DNA 단편을 agarose gel에서 회수하여 pGEM-T 벡터(Promega사)에 부착(ligation)하였고, 대장균 숙주세포(competent cell) (DH5α)에 형질전환을 하였다. 형질전환된 대장균을 암피실린, X-gal, IPTG가 각각 50 ㎍/mL 함유된 배지에서 12시간 배양하여 형질전환체를 선발하여 플라스미드 DNA를 분리하였다. 분리된 플라스미드를 EcoRⅠ으로 절단하고 1.4% 아가로스 젤에서 전기영동을 실시하여 예상되는 크기의 DNA 단편이 클로닝된 재조합클론을 확보하였고, 이들을 마크로젠사에 의뢰하여 염기서열을 분석하였다. 이렇게 분석한 염기서열을 기초로 하여 양 밀단에 해당하는 염기서열을 근간으로 하는 SCAR 표지의 프라이머를 합성하였다.

흰가루병 저항성과 이병성 계통에서 저항성 연관 표지들의 염기서열을 비교하여, 저항성과 이병성을 구분하기 위해 새로 합성한 SCAR 표지의 프라이머 염기서열과 다형성(polymorphism)을 나타내기 위해 사용한 제한효소는 하기와 같다.

[표 3] 새롭게 작성한 흰가루병 저항성 연관 SCAR 표지의 프라이머 염기서열

Marker	Forward primer (5'→ 3')	Reverse primer (5'→ 3')	Tm	제한효소
CmPMR1	CCTTACACGTGCAGAAAATGTC(서열번호17)	TACTTTGGTCTTTTGCCTCGAT(서열번호18)	55℃	Taq I
CmPMR3	AGCCGAYCCCTAAATGTAGTTGT(서열번호19)	ACCATCTCATCAAATGCTCCATA(서열번호20)	55℃	-
CmPMR6	GACAGATGAAGGAAGCCAGAAT(서열번호21)	TGGCTTCTGTCTGTACTCTCAA(서열번호22)	55℃	-
CmPMR7	GGTAACGCCCACGAAAACT(서열번호23)	CCAAAGTCGACCGTCTTGAT(서열번호24)	54℃	Taq I
CmPMR8	CAGTTGCTAATTGCTGCCTC(서열번호25)	GAGGATAGGCATATTGGCTTCG(서열번호26)	55℃	-
CmPMR9	GCTTGATTTATCTAAGTTGAACAGG(서열번호27)	TCGAGAGGCAGTGAAGCATTTC(서열번호28)	55℃	Alu I
CmPMR10	GTAGTTGAGTGAAGCAAAGATACG(서열번호29)	AGTTAAGCAAATGAGATTGTTTGATA(서열번호30)	55℃	Rsa I
CmPMR11	CAAATTTTTGCATCATACTTCTATG(서열번호31)	ATTCTGCAACTTGTAGAAAATTTC(서열번호32)	55℃	-

흰가루병 저항성 개체를 선발할 수 있는 SCAR 표지의 유용성을 검정하기 위해, 새롭게 작성한 프라이머를 이용하여 저항성계통, 이병성계통, 분리집단 F₂에서 분석하여 표지의 사용 가능성을 알아보았다.

전환된 SCAR 표지를 검정하기 위한 PCR 반응조건은 전체 25 ㎕ 반응용액에 주형 DNA 5 ㎕(약 30 ng), 프라이머 각 10 pmole, 0.25 mM dNTP, 1x PCR 버퍼, 0.5 U Taq DNA 폴리머라제 (Prime Taq polymerase, Genet Bio)를 포함시켰다. 이 반응용액을 Eppendorf사의 PCR 기계를 사용하여 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초로 35회 반응하였고, 반응이 끝난 후, 증폭된 산물을 2% agarose gel에 전기영동하거나, 다형성(polymorphism)을 나타내기 위해 제한효소를 처리하여 반응산물을 확인하였다 (도 2 내지 도 9).

실시예 4. 전환된 SCAR 표지의 저항성 유전자와 연관분석

저항성 유전자와 연관된 것으로 추정되는 SCAR 표지를 흰가루병을 검정한 전체 F₂ 분리집단에서 검정함으로써 실제로 이들 분자표지가 저항성 유전자와 얼마나 연관되어 있는지를 알아보았다. 흰가루병 저항성과 연관된 것으로 추정되는 8개의 SCAR 표지를 이용하여 흰가루병 발병 정도를 검정한 분리집단 F₂ 262개체에 대하여 분석하여 연관지도 작성과 QTL 분석을 하였다 (표 4 내지 표 11, 도 10). 그 결과 저항성 유전자와 가장 가까이 연관된 표지는 CmPMR7인 것으로 나타났다. 이들 SCAR 표지를 이용하여 저항성 수준을 판단할 수 있는 정확성을 계산하면, CmPMR7 SCAR 표지의 유전자형이 RR인 F₂ 64개체의 평균 발병지수(D.I)는 2.01로 나타났고, 유전자형이 Rr인 F₂ 126개체의 평균 발병지수(D.I)는 3.34, 유전자형이 rr인 F₂ 72개체의 평균 발병지수(D.I)는 4.96으로 나타났다. 이 표지의 유전자형이 RR인 개체를 선발할 경우 95%는 저항성 개체, 나머지 5%는 중도 저항성 개체를 선발할 수 있어 정확하게 저항성 개체를 선발할 수 있는 것으로 평가되었다.

[표 4] 분리집단 F₂ 262개체에 대한 분자표지 CmPMR1 검정 결과

유전자형 발병지수	RR	Rr	rr	Total
1	3	0	0	3
2	51	19	1	71
3	5	53	2	60
4	4	47	4	55
5	0	9	63	72
Total	63	128	70	261

[표 5] 분리집단 F₂ 262개체에 대한 분자표지 CmPMR3 검정 결과

유전자형 발병지수	RR	Rr	rr	Total
1	3	0	0	3
2	51	20	0	71
3	6	53	2	61
4	4	47	4	55
5	0	11	61	72
Total	64	131	67	262

[표 6] 분리집단 F₂ 262개체에 대한 분자표지 CmPMR6 검정 결과

유전자형 발병지수	RR	Rr	rr	Total
1	2	1	0	3
2	53	18	0	71
3	4	52	4	60
4	2	50	3	55
5	2	7	63	72
Total	63	128	70	261

[표 7] 분리집단 F₂ 262개체에 대한 분자표지 CmPMR7 검정 결과

유전자형 발병지수	RR	Rr	rr	Total
1	3	0	0	3
2	58	14	0	72
3	2	57	1	60
4	1	53	1	55
5	0	2	70	72
Total	64	126	72	262

[표 8] 분리집단 F₂ 262개체에 대한 분자표지 CmPMR8 검정 결과

유전자형 발병지수	RR	Rr	rr	Total
1	3	0	0	3
2	56	16	0	72
3	2	57	1	60
4	0	54	1	55
5	0	6	66	72
Total	61	133	68	262

[표 9] 분리집단 F₂ 262개체에 대한 분자표지 CmPMR9 검정 결과

유전자형 발병지수	RR	Rr	rr	Total
1	3	0	0	3
2	52	19	1	72
3	3	55	2	60
4	4	49	2	55
5	0	8	64	72
Total	62	131	69	262

[표 10] 분리집단 F₂ 262개체에 대한 분자표지 CmPMR10 검정 결과

[표 11] 분리집단 F₂ 262개체에 대한 분자표지 CmPMR11 검정 결과

유전자형 발병지수	RR	Rr or rr	Total
1	3	0	3
2	55	17	72
3	2	58	60
4	0	55	55
5	0	72	72
Total	60	202	262

실시예 5. 전환된 SCAR 표지의 저항성 유전자와 연관분석

상기 실시예 3 및 실시예 4에서 획득된 SCAR 표지의 선발에 대한 활용가능성과 유용성 평가를 위하여, 국내에서 판매되는 국내 종자회사의 주요 참외 17 품종과 저항성계통‘NWPMR’에 대하여 흰가루병을 접종한 후, 실시예 3 및 실시예 4에서 획득된 SCAR 표지로 검정하였다. 17종의 참외 품종에서는 모두 흰가루병에 대해 이병성을 나타냈고, 이들 품종을 이용하여 실시예 4에서 명시한 8개의 SCAR 표지를 이용하여 분석한 결과는 아래 표 12 및 도 11 내지 도 14와 같았다.

[표 12] 국내 시판 주요 참외 품종의 흰가루병 및 SCAR 표지 검정 결과

품 종	흰가루병	CmPMR1	CmPMR3	CmPMR6	CmPMR7	CmPMR8	CmPMR9	CmPMR10	CmPMR11
1. NWPMR	저항성	R	R	R	R	R	R	R	R
2. 금싸라기	이병성	R	R	R	S	R	R	S	S
3. 슈퍼금싸라기	이병성	R	R	R	S	R	R	S	S
4. 금노다지	이병성	R	R	R	S	R	R	S	S
5. 금황	이병성	R	R	R	S	R	R	S	S
6. 정품플러스	이병성	R	R	R	S	R	R	S	S
7. 왕대박	이병성	R	R	R	S	R	R	S	S
8. 황진이	이병성	R	R	R	S	R	R	S	S
9. 슈퍼로얄제리	이병성	R	R	R	S	R	R	S	S
10. 노랑꿀	이병성	R	R	R	S	R	R	S	S
11. 황깔꿀	이병성	R	R	R	S	R	R	S	S
12. 순금덩어리	이병성	R	R	R	S	R	R	S	S
13. 다이아몬드	이병성	R	R	R	S	R	R	S	S
14. 금도령	이병성	R	R	R	S	R	R	S	S
15. 아삭이꿀	이병성	R	R	R	S	R	R	S	S
16. 마니다라	이병성	R	R	R	S	R	R	S	S
17. 가야꿀	이병성	R	R	R	S	R	R	S	S
18. 금관	이병성	R	R	R	S	R	R	S	S

메론의 흰가루병 저항성과 가장 가까이 연관된 분자표지 CmPMR7 프라이머와 저항성계통 및 참외 17품종의 DNA를 이용하여 PCR을 수행한 후 (도 11), 제한효소 Taq I을 처리하였을 때, 모든 참외 품종들은 메론 흰가루병 저항성 계통과는 다른 밴드 양상을 보이는 것을 확인 하였다 (도 12). 또한, 메론의 흰가루병 저항성과 두 번째로 가까이 연관된 분자표지 CmPMR10 프라이머와 저항성계통 및 참외 17품종의 DNA를 이용하여 PCR을 수행한 후 (도 13), 제한효소 Rsa I을 처리하였을 때, 모든 참외 품종들은 메론 흰가루병 저항성 계통과는 다른 밴드 양상을 보이는 것을 확인 하였다 (도 14).

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 메론의 흰가루병 저항성에 연관된 유전자 단편을 분리하고, 흰가루병 저항성 검출용 SCAR 마커를 개발하였다. 본 발명의 흰가루병 저항성 검출용 SCAR 분자표지는 메론 또는 참외 계통의 저항성 품종을 효과적으로 선발하는데 유용하며, 저항성 품종을 분리하여 새로운 품종을 개발하는데 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 교배가 잘되는 참외에 메론의 흰가루병 저항성 인자를 도입하여 흰가루병 저항성 참외 식물체를 개발하는데 유용하게 이용될 것으로 평가되었다.

도1은 메론의 흰가루병 저항성과 연관된 분자표지를 개발하기 위해 BSA(bulked segregant analysis) 방법을 이용하여 저항성계통(PR), 이병성계통(PS), 저항성 F₂ bulk DNA(BR) 및 이병성 F₂ bulk DNA (BS)에서 PCR을 수행한 결과를 나타낸 겔 사진이다.

도2는 선발된 메론의 흰가루병 저항성과 연관된 분자표지 CmPMR1의 염기서열을 분석한 후, 그 표지에 특이적인 프라이머를 다시 합성하여 분석이 간편하고 재현성과 신뢰도가 높은 SCAR 분자표지로 전환한 것으로, 이들 프라이머와 저항성계통(PR), 이병성계통(PS), 저항성 F₂ bulk DNA에 포함된 저항성 16개체 및 이병성 F₂ bulk DNA에 포함된 이병성 16개체의 DNA를 이용하여 PCR을 수행한 후, 제한효소 Taq I을 처리한 결과를 나타낸 겔 사진이다.

도3은 선발된 메론의 흰가루병 저항성과 연관된 분자표지 CmPMR3의 염기서열을 분석한 후, 그 표지에 특이적인 프라이머를 다시 합성하여 분석이 간편하고 재현성과 신뢰도가 높은 SCAR 분자표지로 전환한 것으로, 이들 프라이머와 저항성계통(PR), 이병성계통(PS), 저항성 F₂ bulk DNA에 포함된 저항성 16개체 및 이병성 F₂ bulk DNA에 포함된 이병성 16개체의 DNA를 이용하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 겔 사진이다.

도4는 선발된 메론의 흰가루병 저항성과 연관된 분자표지 CmPMR6의 염기서열을 분석한 후, 그 표지에 특이적인 프라이머를 다시 합성하여 분석이 간편하고 재현성과 신뢰도가 높은 SCAR 분자표지로 전환한 것으로, 이들 프라이머와 저항성계통(PR), 이병성계통(PS), 저항성 F₂ bulk DNA에 포함된 저항성 16개체 및 이병성 F₂ bulk DNA에 포함된 이병성 16개체의 DNA를 이용하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 겔 사진이다.

도5는 선발된 메론의 흰가루병 저항성과 연관된 분자표지 CmPMR7의 염기서열을 분석한 후, 그 표지에 특이적인 프라이머를 다시 합성하여 분석이 간편하고 재현성과 신뢰도가 높은 SCAR 분자표지로 전환한 것으로, 이들 프라이머와 저항성계통(PR), 이병성계통(PS), 저항성 F₂ bulk DNA에 포함된 저항성 16개체 및 이병성 F₂ bulk DNA에 포함된 이병성 16개체의 DNA를 이용하여 PCR을 수행한 후, 제한효소 Taq I을 처리한 결과를 나타낸 겔 사진이다.

도6은 선발된 메론의 흰가루병 저항성과 연관된 분자표지 CmPMR8의 염기서열을 분석한 후, 그 표지에 특이적인 프라이머를 다시 합성하여 분석이 간편하고 재현성과 신뢰도가 높은 SCAR 분자표지로 전환한 것으로, 이들 프라이머와 저항성계통(PR), 이병성계통(PS), 저항성 F₂ bulk DNA에 포함된 저항성 16개체 및 이병성 F₂ bulk DNA에 포함된 이병성 16개체의 DNA를 이용하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 겔 사진이다.

도7은 선발된 메론의 흰가루병 저항성과 연관된 분자표지 CmPMR9의 염기서열을 분석한 후, 그 표지에 특이적인 프라이머를 다시 합성하여 분석이 간편하고 재현성과 신뢰도가 높은 SCAR 분자표지로 전환한 것으로, 이들 프라이머와 저항성계통(PR), 이병성계통(PS), 저항성 F₂ bulk DNA에 포함된 저항성 16개체 및 이병성 F₂ bulk DNA에 포함된 이병성 16개체의 DNA를 이용하여 PCR을 수행한 후, 제한효소 Alu I을 처리한 결과를 나타낸 겔 사진이다.

도8은 선발된 메론의 흰가루병 저항성과 연관된 분자표지 CmPMR10의 염기서열을 분석한 후, 그 표지에 특이적인 프라이머를 다시 합성하여 분석이 간편하고 재현성과 신뢰도가 높은 SCAR 분자표지로 전환한 것으로, 이들 프라이머와 저항성계통(PR), 이병성계통(PS), 저항성 F₂ bulk DNA에 포함된 저항성 16개체 및 이병성 F₂ bulk DNA에 포함된 이병성 16개체의 DNA를 이용하여 PCR을 수행한 후, 제한효소 Rsa I을 처리한 결과를 나타낸 겔 사진이다.

도9는 선발된 메론의 흰가루병 저항성과 연관된 분자표지 CmPMR11의 염기서열을 분석한 후, 그 표지에 특이적인 프라이머를 다시 합성하여 분석이 간편하고 재현성과 신뢰도가 높은 SCAR 분자표지로 전환한 것으로, 이들 프라이머와 저항성계통(PR), 이병성계통(PS), 저항성 F₂ bulk DNA에 포함된 저항성 16개체 및 이병성 F₂ bulk DNA에 포함된 이병성 16개체의 DNA를 이용하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 겔 사진이다.

도10은 선발된 메론의 흰가루병 저항성과 연관된 분자표지들을 이용하여 양적형질 연관지도(QTL mapping)를 작성한 결과를 나타낸 그림이다.

도11은 저항성과 가까이 연관된 분자표지 CmPMR7을 이용하여 'NWPMR’ 저항성계통(샘플 No.1)과 국내 종자회사의 주요 참외 17품종(샘플 No.2∼18)에서 PCR을 수행한 결과를 나타낸 겔 사진이다.

도12는 저항성과 가까이 연관된 분자표지 CmPMR7을 이용하여 'NWPMR’ 저항성계통(샘플 No.1)과 국내 종자회사의 주요 참외 17품종(샘플 No.2∼18)에서 PCR을 수행한 후, 제한효소 Taq I을 처리한 결과를 나타낸 겔 사진이다.

도13은 저항성과 가까이 연관된 분자표지 CmPMR10을 이용하여 'NWPMR’ 저항성계통(샘플 No.1)과 국내 종자회사의 주요 참외 17품종(샘플 No.2∼18)에서 PCR을 수행한 결과를 나타낸 겔 사진이다.

도14는 저항성과 가까이 연관된 분자표지 CmPMR10을 이용하여 'NWPMR’ 저항성계통(샘플 No.1)과 국내 종자회사의 주요 참외 17품종(샘플 No.2∼18)에서 PCR을 수행한 후, 제한효소 Rsa I을 처리한 결과를 나타낸 겔 사진이다.

<110> NONG WOO BIO CO., LTD <120> SCAR marker involving in powderly mildew resistance and selection method in melon thereof <160> 32 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 cacacacaca cacacagt 18 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gnntnggnaa racnactct 19 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cacacacaca cacacagt 18 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gnntnggnaa racnaccct 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ccaganggng ancgngacag 20 <210> 6 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 agtgtgtgtg tgtgtg 16 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gnnatnggna artaytayat n 21 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 vdvctctctc tctctct 17 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gactgcgtac caattcatg 19 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 tgagtcctga gctagatct 19 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gactgcgtac caattcaca 19 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 tgagtcctga gctagatag 19 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gactgcgtac caattcacc 19 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 tgagtcctga gctagaaat 19 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 gactgcgtac caattctct 19 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 tgagtcctga gctagattc 19 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 ccttacacgt gcagaaaatg tc 22 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 tactttggtc ttttgcctcg at 22 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 agccgayccc taaatgtagt tgt 23 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 accatctcat caaatgctcc ata 23 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 gacagatgaa ggaagccaga at 22 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 tggcttctgt ctgtactctc aa 22 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 ggtaacgccc acgaaaact 19 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 ccaaagtcga ccgtcttgat 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 cagttgctaa ttgctgcctc 20 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 gaggataggc atattggctt cg 22 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 gcttgattta tctaagttga acagg 25 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 tcgagaggca gtgaagcatt tc 22 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 gtagttgagt gaagcaaaga tacg 24 <210> 30 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 agttaagcaa atgagattgt ttgata 26 <210> 31 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 caaatttttg catcatactt ctatg 25 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 attctgcaac ttgtagaaaa tttc 24

Claims

서열번호 1 내지 16의 염기서열을 가지는 16개의 프라이머로 이루어진 것을 특징으로 하는 메론 및 참외의 흰가루병 저항성 연관 SCAR 분자표지.
삭제
서열번호 17 및 18, 서열번호 19 및 20, 서열번호 21 및 22, 서열번호 23 및 24, 서열번호 25 및 26, 서열번호 27 및 28, 서열번호 29 및 30, 서열번호 31 및 32에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 조합으로 이루어진 것을 특징으로 하는 메론의 흰가루병 저항성 검출용 프라이머 쌍.
삭제
삭제
서열번호 23 및 24, 서열번호 29 및 30, 서열번호 31 및 32에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 조합으로 이루어진 것을 특징으로 하는 참외의 흰가루병 저항성 검출용 프라이머 쌍.
삭제
삭제
삭제
삭제
제3항 또는 제6항의 흰가루병 저항성 검출용 프라이머 쌍을 이용하여 메론 또는 참외의 흰가루병 저항성 계통을 선발하는 방법.
제3항 또는 제6항의 흰가루병 저항성 검출용 프라이머 쌍을 이용하여 흰가루병 저항성 메론 또는 참외 품종을 육성하는 방법.
메론 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 23 및 24, 서열번호 29 및 30, 서열번호 31 및 32 중에서 선택되는 어느 하나의 프라이머 조합에 의해 증폭되는 핵산을 함유하는 흰가루병 저항성 참외 품종.