CN111826454B

CN111826454B - 用于鉴定绿豆抗白粉病表型的分子标记VrMLO_Indel2及其引物和应用

Info

Publication number: CN111826454B
Application number: CN201910327315.XA
Authority: CN
Inventors: 薛晨晨; 塞班; 陈新; 袁星星; 陈景斌; 普拉给特宋塔; 披拉沙斯乃文; 闫强; 吴然然; 张红梅; 陈华涛; 崔晓艳; 刘晓庆; 顾和平
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-04-23
Filing date: 2019-04-23
Publication date: 2022-08-02
Anticipated expiration: 2039-04-23
Also published as: CN111826454A

Abstract

本发明公开了用于鉴定绿豆抗白粉病表型的分子标记VrMLO_Indel2及其引物和应用。用于鉴定绿豆抗白粉病表型的分子标记，所述的分子标记VrMLO12_Indel2上游引物如SEQ ID NO.1所示,下游引物如SEQ ID NO.2所示，在抗白粉病品种中能够PCR扩增出大小为279bp的特征条带，在感白粉病品种中能够PCR扩增出大小为303bp的特征条带。本发明通过定位绿豆抗白粉病位点，发现了与绿豆抗白粉病基因共分离的分子标记，该标记选择效率达100％。通过本发明分子标记引物鉴定或筛选绿豆白粉病抗性，方法快速简便，选择效率高且成本低廉。

Description

用于鉴定绿豆抗白粉病表型的分子标记VrMLO_Indel2及其引物和应用

技术领域

本发明属于分子育种领域，涉及用于鉴定绿豆抗白粉病表型的分子标记VrMLO_Indel2及其引物和应用。

背景技术

绿豆(Vigna radiata)是一种豆科、蝶形花亚科豇豆属植物，是亚洲，特别是南亚和东南亚的一种重要的社会经济作物。广泛种植于印度、中国、缅甸、泰国、孟加拉国、巴基斯坦、柬埔寨、印度尼西亚、菲律宾和澳大利亚。绿豆通常是继水稻、小麦和玉米之后单独种植的作物，或作为各种种植系统的组成部分，如与甘蔗的间作，因为绿豆生长快，成熟早，只有75天左右。据估计，绿豆的生产面积超过600万公顷。印度、缅甸和中国是主要种植国家。绿豆的平均产量不高。病害是造成低产量的主要原因之一。侵染绿豆的常见病害包括白粉病、叶斑病和病毒病等。

绿豆白粉病是由蓼白粉菌(Erysiphe polygoni D.C.)引起的。它是生长在热带和亚热带地区的绿豆的一种主要真菌病，尤其是在阴干季节。冷季是南亚和东南亚一些国家生产优质绿豆的主要季节。白粉病可导致感病品种产量损失20～40％。如果该病害发生在生长早期，且天气适宜，则可杀死绿豆幼苗，造成绝产。白粉病防治最常用的方法是喷洒杀菌剂。因此选育抗白粉病绿豆品种对我国绿豆产业有很大的益处。

大多数抗白粉病绿豆种质资源来自国外。在这些抗病种质中，RUM5和V4718表现出广谱的抗性。前人研究表明，V4718的抗性受单显性基因控制，RUM5由两个隐性基因控制。前人利用不同抗性源进行的数量性状位点(QTL)研究表明，抗性由可能由1～3个QTL控制。但是具体的与抗性密切相关分子标记并未见到报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供用于鉴定绿豆抗白粉病表型的分子标记。

本发明的另一目的是提供用于鉴定绿豆抗白粉病表型的分子标记引物。

本发明的又一目的是提供该分子标记及其引物的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

用于鉴定绿豆抗白粉病表型的分子标记，所述的分子标记VrMLO_Indel2上游引物如SEQ ID NO.1所示,下游引物如SEQ ID NO.2所示，在抗白粉病品种中能够PCR扩增出大小为279bp的特征条带，在感白粉病品种中能够PCR扩增出大小为303bp的特征条带。所述的分子标记与绿豆白粉病抗性主效基因共分离，该绿豆抗白粉病标记位于绿豆第9号染色体Chro09:9,991,656..9,991,981，上述物理位置参考已测序绿豆数据(http://plantgenomics.snu.ac.kr/mediawiki-1.21.3/index.php/Main_Page)。

本发明所述的用于鉴定绿豆抗白粉病表型的分子标记VrMLO_Indel2的引物，上游引物如SEQ ID NO.1所示,下游引物如SEQ ID NO.2所示。

本发明所述的分子标记在鉴定白粉病抗感品种中的应用。

本发明所述的分子标记引物在鉴定白粉病抗感品种中的应用。

本发明所述分子标记引物在鉴定绿豆抗白粉病基因VrMOL中的应用。

所述的应用优选：绿豆抗白粉病基因VrMOL位于绿豆第9号染色体Vr9gSSR50和Vr9gSSR55标记区域内，所述的分子标记VrMLO_Indel2与基因VrMOL共分离；利用所述分子标记引物扩增出大小为279bp的特征条带为含抗白粉病基因VrMOL品种，扩增出大小为303bp的特征条带为不含抗白粉病基因VrMOL的品种。

用于筛选或鉴定绿豆抗白粉病资源的PCR检测试剂盒，所述试剂盒包含本发明所述的分子标记引物。

一种筛选或鉴定绿豆抗白粉病品种的方法，包含以下步骤：

1)提取待测植株的基因组DNA；

2)以待测植株的基因组DNA为模板，利用所述的分子标记的引物进行PCR扩增反应；

3)检测PCR扩增产物，能够扩增出大小为279bp的特征条带为绿豆抗白粉病品种，扩增出大小为303bp的特征条带为绿豆易感白粉病品种。

有益效果：

本发明通过定位绿豆抗白粉病位点，发现了与绿豆抗白粉病基因共分离的分子标记VrMLO_Indel2，该标记选择效率达100％。通过本发明分子标记引物鉴定或筛选绿豆白粉病抗性，方法快速简便，选择效率高且成本低廉。只需要检测该标记的扩增条带特征，就可以判断抗白粉病基因VrMOL是否存在，从而预测绿豆品种的白粉病抗性，可以快速、有目的性的筛选绿豆康白粉病品种，高通量地应用于绿豆育种实践和资源及品种鉴定。

附图说明

图1为本发明与抗白粉病共分离的分子标记VrMLO_Indel2在抗白粉病品种RUM5和V4718，感白粉病品种CN60和KPS1的PAGE电泳检测结果。

图2为VrMOL在第9号染色体上的精细定位图

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sam brook等分子克隆实验手册(Sam brook J&R ussell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1 CN60X RUM5 F2群体190株，CN60XRUM5的BC1F1群体74株，群体构建及表型鉴定

以抗白粉病绿豆野生资源RUM5为父本，以感白粉病绿豆资源CN60为母本，配制杂种，构建了包含190个单株的F2分离群体，每个F2单株通过自交获得相应的F2:3家系，进行抗白粉病鉴定。此外以抗白粉病绿豆野生资源RUM5为父本，以感白粉病绿豆资源CN60为母本，配制杂种，构建了包含74个单株的BC1F1分离群体，每个单株自交获得BC1F1：2家系，进行抗白粉病鉴定，两个群体同步试验，具体方法如下：

每份材料随机选取30粒健康种子，包括2份感白粉病CN60、抗白粉病RUM5对照，种于田间，行距50cm，株距12cm，出苗后20d，25d和30d分别对叶片进行白粉病接种，待出苗后50d时统计，每株叶片上的侵染按1～9(1＝无病害侵染，3＝1～25％叶面积受侵染，5＝26～50％叶面积受侵染，7＝51-75％叶面积受侵染，9＝76-100％叶面积受感染)评分。

抗白粉病鉴定结果显示，RUM5以及CN60/RUM5杂交获得的F1种子全抗，表明RUM5抗白粉病特性由显性基因控制。190个CN60/RUM5F2:3家系对白粉病的抗性级别频率分布呈连续分布。

已有研究表明，绿豆白粉病抗性位点qPMRUM5-3位于连锁群9上，SSR标记CEDG070和CEDG259之间(Chankaew等2013)。我们根据绿豆参考序列对这两个标记的引物序列进行了BLAST搜索(http://plantgenomics.snu.ac.kr/sequenceserver)。该序列在第9染色体9,097,007bp到19,388,902bp之间，大小为10.292Mb，下载了该标记间序列，设计了55对SSR引物(表1)，在CN60和RUM5之间筛选多态性，以绿豆基因组DNA为模板，进行PCR反应。10μlPCR反应体系包括：2ng DNA，1×Taq酶缓冲液；2mmol L-1MgCl2，0.2mmol L-1dNTPs，上、下游引物共5pmol L-1和1U Taq DNA聚合酶，ddH2O补至10μl。反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，50-60℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环；最后72℃延伸10min。整个反应在东胜EDC-810PCR扩增仪上进行。用5％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR产物，银染法染色。扩增的DNA条带在荧光灯箱内观察。

绿豆抗白粉病标记的获得：利用两个白粉病分离群体和抗、感池筛选出11对多态性SSR标记，该绿豆白粉病抗性主效QTL精细定位图见图2。

表1

根据NCBI已公布的绿豆基因组序列，搜索出Vr9gSSR50和Vr9gSSR55之间0.046Mb大小的序列，用软件Primer5.0进行引物设计，通过上述两组分离群体反复验证，确定设计出五个分子标记的引物可用于指示绿豆白粉病抗性，VrMLO_Indel2为其中一个分子标记，其上、下游引物如CTTTGTGGTCATCTTCTTGTTGC(SEQ ID NO.1)和TGTGCCAACCTGGAAAACA(SEQID NO.2)所示。利用VrMLO_Indel2在抗白粉病绿豆品种RUM5和V4718中可扩增出大小为279bp的特征条带，在绿豆感白粉病品种CN60和KPS1中可扩增出大小为303bp的特征条带(图1)。

实施例2分子标记引物的验证

提取绿豆感白粉病材料KPS1、苏绿1号、苏绿3号和抗白粉病材料V4718、苏绿2号、V2802和V2709，国外绿豆野生种TC1966基因组DNA，每个品种10株利用该分子标记的引物(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)进行PCR扩增进行抗白粉病鉴定，结果见表2，结果表明该标记的鉴定效率为100％。

表2

通过上述分子标记鉴定绿豆抗白粉病来预测绿豆植株抗病性，可提高我国绿豆抗白粉病品种的育种进程。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 用于鉴定绿豆抗白粉病表型的分子标记VrMLO_Indel2及其引物和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctttgtggtc atcttcttgt tgc 23

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgtgccaacc tggaaaaca 19

Claims

1.分子标记的引物在鉴定绿豆白粉病抗感品种中的应用，其特征在于，所述的分子标记的上游引物如SEQ ID NO.1所示，下游引物如SEQ ID NO.2所示，在抗白粉病品种中利用所述的分子标记的引物能够PCR扩增出大小为279bp的特征条带，在感白粉病品种中能够PCR扩增出大小为303bp的特征条带。

2.一种筛选或鉴定绿豆抗白粉病品种的方法，其特征在于，包含以下步骤：

1 )提取待测植株的基因组DNA；

2 )以待测植株的基因组DNA为模板，利用权利要求1中所述的分子标记的引物进行PCR扩增反应；

3 )检测PCR扩增产物，能够扩增出大小为279bp的特征条带为绿豆抗白粉病品种，扩增出大小为303bp的特征条带为绿豆易感白粉病品种。