CN104630364A - 抗稻瘟病基因Pi9的特异性CAPS标记Pi9caps及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗稻瘟病基因Pi9特异性CAPS标记Pi9caps及其应用。本发明公开一种鉴定或辅助鉴定水稻是否含有抗稻瘟病基因Pi9和/或是否具有稻瘟病抗性的方法，包括如下步骤：检测待测水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40804位核苷酸，根据水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40804位核苷酸的种类进行鉴定。本发明可以准确判断所选择水稻植株是否含有抗稻瘟病基因Pi9,因而在加快抗稻瘟病水稻品种选育进度中具有重要应用。

Description

抗稻瘟病基因Pi9的特异性CAPS标记Pi9caps及其应用
技术领域
本发明涉及一种抗稻瘟病基因Pi9的特异性CAPS标记Pi9caps及其应用，属于农作物分子遗传育种学领域。
背景技术
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全世界一半以上的人口以稻米为主食。稻瘟病是影响水稻产量的主要病害，位居真菌病害之首，全球每年因稻瘟病造成的水稻减产达10％～30％，严重时减产达40％～50％，甚至颗粒无收。实践证明，利用抗稻瘟病基因是控制稻瘟病害最经济、有效、环保的方法。到目前为止，在水稻中已至少报道了68个抗稻瘟病位点共83个主效基因，这些基因成簇地分布于除第3染色体外的所有水稻染色体上，已经克隆的有24个，它们分别是Pib,Pi-ta,Pi9,Piz-t,Pi2,Pid2,Pi36,Pi37,Rbr2,Pik-m,Pi5,Pid3,pi21,Pit,Pb1,Pish,Pik-p,Pik,Pia,Pi54,Pi25,Pi 1,Pi50,Pi54rh(国家水稻数据库中心http://www.ricedata.cn/gene/gene_pi.htm)。然而，尽管已经克隆的抗稻瘟病基因数量众多，但真正具有广谱抗性的却很少，在这些已克隆的抗稻瘟病基因中，来源于小粒野生稻的Pi9被多个研究组证实对收集自世界各地的稻瘟病菌均具有广谱抗性(Qu et.al.,2006；张国民等，2010；)，因此在水稻抗稻瘟病育种中，将Pi9基因导入到水稻骨干亲本材料中就显得尤为必要。
酶切扩增多态性序列(Cleaved Amplified Polymorphism Sequences，CAPS)CAPS技术又称为PCR—RFLP，它实质上是PCR技术与限制性片段长度多态性(RestrictionFragment Length Polymorphism，RFLP)技术结合的一种方法。CAPS的基本原理是利用己知位点的DNA序列资源设计出一套特异性的PCR引物(19-27bp)，然后用这些引物扩增该位点上的某一DNA片段，接着用一种专一性的限制性内切酶切割所得扩增产物，凝胶电泳分离酶切片段，染色并进行RFLP分析。CAPS标记揭示的是特异PCR片段的限制性长度变异的信息。CAPS是一类共显性分子标记，其优点是避免了RFLP分析中膜转印这一步骤，又能保持RFLP分析的精确度。另外，由于很多限制性内切酶均可参与扩增DNA酶切，所以检测到多态性机会较大。
利用常规田间表型鉴定对抗稻瘟病基因的选择存在很大困难，选择效率很低，选择准确性很差，而利用抗稻瘟病基因连锁的分子标记或者是基因本身特异性标记选择，在生产上已经被证实是十分有效且经济的。针对Pi9基因的分子标记选择，研究者已经开发了一些标记，但它们都存在一些应用上的问题或者不便，如位于Pi9基因侧翼的此类分子标记由于和Pi9基因存在一定物理距离，在减数分裂过程中存在与Pi9基因发生交换的可能，从而使选择不够准确；针对Pi9基因本身的特异性分子标记目前有两例报道，一例是针对Pi9启动子区域的10bp插入/缺失位点(陈松彪等，2013)，另外一例是针对Pi9编码区18bp酶切片段差异的dCAPS标记(华丽霞等，2013)，但由于这两种标记差异的片段较小，通常需要非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳才能区分，因此在操作过程中有一些繁琐。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是更准确、快速的鉴定抗稻瘟病基因Pi9进而筛选以抗稻瘟病植株为亲本的后代植株。
为了解决以上技术问题，本发明提供一种鉴定或辅助鉴定水稻是否含有抗稻瘟病基因Pi9和/或是否具有稻瘟病抗性的方法，包括如下步骤：检测待测水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40804位核苷酸，根据水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40804位核苷酸的种类进行鉴定：如果待测水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40804位核苷酸含T，则待测水稻为含有抗稻瘟病基因Pi9的水稻或候选为含有抗稻瘟病基因Pi9的水稻和/或具有稻瘟病抗性的水稻，如果待测水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40804位核苷酸不含T，则待测水稻为不含有抗稻瘟病基因Pi9的水稻或候选为不含有抗稻瘟病基因Pi9的水稻。
上述方法中，所述待测水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40804位核苷酸含T具体可为A’或B’：
A’、所述待测水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40804位核苷酸为T的纯合型；
B’、所述待测水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40804位核苷酸为T和非T的杂合型。
上述方法中，所述检测待测水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40804位核苷酸的方法如下：以待测水稻的基因组DNA为模板，以稻瘟病抗性基因Pi9的分子标记引物为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，该PCR扩增产物为所述稻瘟病抗性基因Pi9的分子标记；用限制性核酸内切酶XbaI酶切所述PCR扩增产物，如果所述PCR扩增产物能被酶切产生两个DNA片段，则待测水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40804位核苷酸含T，如果所述PCR扩增产物不能被酶切，则待测水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40804位核苷酸不含T；
所述引物为能扩增所述稻瘟病抗性基因Pi9的分子标记的引物，所述稻瘟病抗性基因Pi9的分子标记的核苷酸序列为如下A所示的序列：
A、位于水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第39933位至第41277位核苷酸所示的序列内并含有第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40802位至第40807位核苷酸的序列。
上述任一所述的方法中，所述A所示的序列为位于水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40205位至第41006位核苷酸所示的序列；
所述引物为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的DNA分子，所述两个DNA片段分别为长度为599bp的DNA片段和203bp的DNA片段；
所述599bp的DNA片段的序列如SEQ ID No.5所示；
所述203bp的DNA片段的序列如SEQ ID No.6所示。
为了解决以上技术问题，本发明还提供扩增如下A所示的序列的引物：
A、位于水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第39933位至第41277位核苷酸所示的序列内并含有第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40802位至第40807位核苷酸的序列。
上述引物中，所述A所示的序列为位于水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40205位至第41006位核苷酸所示的序列；
所述引物为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的DNA分子。
为了解决以上技术问题，本发明还提供DNA片段，选自水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第39933位至第41277位核苷酸所示的序列内并含有第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40802位至第40807位核苷酸的序列。
上述DNA片段中，所述DNA片段的核苷酸序列为水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40205位至第41006位核苷酸所示的序列。
上述任一所述的DNA片段为上述稻瘟病抗性基因Pi9的分子标记，该标记为抗稻瘟病基因Pi9的特异性CAPS标记。
上述任一所述的方法、引物或DNA片段中所述水稻或待测水稻为骨干恢复系水稻、三系不育系水稻、二系不育系水稻、高抗水稻稻瘟病水稻、含有抗稻瘟病基因Pi9的水稻的衍生系、或只转Pi9基因编码区的转基因水稻或其衍生系；
所述骨干恢复系水稻具体为辐恢838、CDR22、桂99、绵恢725、先恢207、密阳46、93-11、远恢2号和/或蜀恢498；
所述三系不育系水稻具体为珍汕97A、金23A、天丰A和/或冈46A；
所述二系不育系水稻具体为广占63-4S；
所述高抗水稻稻瘟病水稻具体为地谷B和/或特特普；
所述含有抗稻瘟病基因Pi9的水稻具体为75-1-127；
所述衍生系为杂交或回交或繁衍的后代群体；
所述含有抗稻瘟病基因Pi9的水稻的衍生系具体可为以水稻品种93-11为母本，以含抗稻瘟病基因Pi9的水稻品种75-1-127为父本进行杂交得到的杂交后代，如F1代和/或F2代。
为了解决以上技术问题，本发明还提供一种鉴定或辅助鉴定水稻是否含有抗稻瘟病基因Pi9和/或是否具有稻瘟病抗性的试剂盒，该试剂盒包含上述任一所述的引物；
所述试剂盒还包含记载在可读载体上的使用说明，说明中记载上述任一所述的方法；
所述水稻具体为骨干恢复系水稻、三系不育系水稻、二系不育系水稻、高抗水稻稻瘟病水稻、含有抗稻瘟病基因Pi9的水稻的衍生系、或只转Pi9基因编码区的转基因水稻或其衍生系；
所述骨干恢复系水稻具体为辐恢838、CDR22、桂99、绵恢725、先恢207、密阳46、93-11、远恢2号和/或蜀恢498；
所述三系不育系水稻具体为珍汕97A、金23A、天丰A和/或冈46A；
所述二系不育系水稻具体为广占63-4S；
所述高抗水稻稻瘟病水稻具体为地谷B和/或特特普；
所述含有抗稻瘟病基因Pi9的水稻具体为75-1-127；
所述衍生系为杂交或回交或繁衍的后代群体；
所述含有抗稻瘟病基因Pi9的水稻的衍生系具体可为以水稻品种93-11为母本，以含抗稻瘟病基因Pi9的水稻品种75-1-127为父本进行杂交得到的杂交后代，如F1代和/或F2代。
为了解决以上技术问题，本发明还提供上述任一所述的引物、上述任一所述的DNA片段或上述试剂盒在鉴定或辅助鉴定水稻是否含有抗稻瘟病基因Pi9和/或是否具有稻瘟病抗性中的应用；
所述水稻具体为骨干恢复系水稻、三系不育系水稻、二系不育系水稻、高抗水稻稻瘟病水稻、含有抗稻瘟病基因Pi9的水稻的衍生系、或只转Pi9基因编码区的转基因水稻或其衍生系；
所述骨干恢复系水稻具体为辐恢838、CDR22、桂99、绵恢725、先恢207、密阳46、93-11、远恢2号和/或蜀恢498；
所述三系不育系水稻具体为珍汕97A、金23A、天丰A和/或冈46A；
所述二系不育系水稻具体为广占63-4S；
所述高抗水稻稻瘟病水稻具体为地谷B和/或特特普；
所述含有抗稻瘟病基因Pi9的水稻具体为75-1-127；
所述衍生系为其杂交或回交或繁衍的后代群体；
所述含有抗稻瘟病基因Pi9的水稻的衍生系具体可为以水稻品种93-11为母本，以含抗稻瘟病基因Pi9的水稻品种75-1-127为父本进行杂交得到的杂交后代，如F1代和/或F2代。
为了解决以上技术问题，本发明还提供上述任一所述的方法、上述任一所述的引物、上述任一所述的DNA片段或上述试剂盒在水稻育种中的应用；
所述在水稻育种中的应用可为以上述任一所述的方法、上述任一所述的引物、上述任一所述的DNA片段或上述试剂盒鉴定得到的含有抗稻瘟病基因Pi9的水稻为亲本进行育种。
上述任一所述的方法、试剂盒或应用中，所述Pi9基因编码的氨基酸序列如GenBank Accession Number为ABB88855更新日为2006年3月29日的序列所示，Pi9基因的序列为GenBank Accession Number为DQ285630.1更新日为2010年9月28日的5’末端起第33725位至第42313位核苷酸所示的序列。
上述任一所述的方法、试剂盒或应用中，所述水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列为GenBank Accession Number为DQ285630.1更新日为2010年9月28日的序列。
本发明通过比较水稻抗稻瘟病Pi9基因和其等位基因间的DNA序列,在Pi9基因的编码区确定了一个位于限制性核酸内切酶XbaI识别序列里的SNP,并开发了基于此SNP的抗稻瘟病基因Pi9的特异性CAPS标记Pi9caps，通过该标记可以准确检测不同水稻品种的基因组中是否含有抗稻瘟病Pi9基因以及其纯合状态,可应用于筛选水稻杂交转育后代植株,提高水稻抗稻瘟病材料的选育效率,获得含抗稻瘟病Pi9基因的抗稻瘟病水稻品种。
本发明的有益效果如下:
1)本发明提供的分子标记Pi9caps位于Pi9基因的编码区,在遗传上与Pi9抗病性呈共分离,选择效率达到100％。由于其处于Pi9基因的编码区，除了在常规育种中可以辅助选择Pi9基因外，在只过表达Pi9基因编码区的转基因水稻中，也能通过此分子标记选择Pi9基因。
2)本发明提供的分子标记Pi9caps可以经过XbaI酶切进行区分，酶切后一种能产生599bp、203bp的条带，一种为不能被酶切的802bp的条带，所以可以利用1.5％的琼脂糖凝胶电泳直接检测，与已有的通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测10-20bp左右差异条带的Pi9基因分子标记相比，更方便，更适用于高通量的生产实践。
3)本发明提供的分子标记Pi9caps能广泛应用于遗传背景不同的群体中。现有的与Pi9连锁的分子标记大部分都是针对同一个群体2个不同亲本的序列多态性所开发的,这些标记在其它群体中的适用性有限。
本发明适用于我国大面积应用的水稻恢复系与不育系骨干亲本材料的转基因育种,基因聚合以及基于MAS(分子标记辅助选择)技术的抗性育种,无需重复进行亲本多态性的筛选,在加快抗稻瘟病水稻品种选育进度中具有重要应用。
附图说明
图1为Pi9基因与93-11和日本晴中无功能的等位基因间7080bp处序列分析图。
图2为Pi9基因特异性CAPS标记Pi9caps在不同水稻中的验证结果图。
图3为Pi9基因特异性CAPS标记Pi9caps在75-1-127与93-11构建的F2代群体中各单株的选择结果图。
图4为Pi9基因特异性CAPS标记Pi9caps在检测转Pi9基因编码区的水稻的结果图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列为GenBank AccessionNumber为DQ285630.1更新日为2010年9月28日的序列。
下述实施例中的Pi9基因的序列为GenBank Accession Number为DQ285630.1更新日为2010年9月28日的5’末端起第33725位至第42313位核苷酸所示的序列。Pi9基因编码的氨基酸序列如GenBank Accession Number为ABB88855更新日为2006年3月29日的序列所示。
水稻75-1-127(Oryza sativa)在文献“Qu,S.H.,et al.,The broad-spectrumblast resistance gene Pi9encodes a nucleotide-binding site-leucine-richrepeat protein and is a member of a multigene family in rice.Genetics,2006.172(3):p.1901-1914.”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
水稻远恢2号(Oryza sativa)在文献“胡朝生等.强优势杂交中籼“Y两优2号”特征特性表现.安徽科技,2011(06):p.25-26.”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
水稻广占63-4S(Oryza sativa)在文献“沈其文,姜华.两系不育系广占63-4S的表现及对湖北中稻育种的启示.湖北农业科学,2014(11):p.2490-2492.”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
水稻TP309(Oryza sativa)在文献“Shang,J.J.,et al.,Identification ofa new rice blast resistance gene,Pid3,by genomewide comparison of pairednucleotide-binding site-leucine-rich repeat genes and their pseudogenealleles between the two sequenced rice genomes.Genetics,2009.182(4):p.1303-1311.”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
实施例1、抗稻瘟病基因Pi9基因特异性CAPS标记Pi9caps的引物设计与检测
一、Pi9基因序列特异性SNP位点分析
从公共数据库中下载得到已经公开发表的Pi9基因及测序水稻品种93-11、日本晴(Nipponbare)相对应区域的基因组序列,针对Pi9位点进行序列比对,筛查Pi9特异的、能区别于该位点等位基因的SNP。其中位于Pi9基因起始密码子后7080bp(即水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1的核苷酸序列自5’末端起第40804位)处的T碱基在93-11和日本晴中的等位碱基都为C,而此SNP刚好位于限制性核酸内切酶XbaI(识别序列为5’-TCTAGA-3’)识别序列内(如图1所示，图1中，Pi9为抗稻瘟病基因Pi9，Pi9-9311为Pi9在93-11中的等位基因，Pi9-Nipp为Pi9在日本晴中的等位基因)；进一步分析发现，限制性核酸内切酶XbaI在整个Pi9基因内部共存在4个酶切识别位点(分别位于Pi9基因起始密码子后3451-3456bp、6208-6213bp、7078-7083bp、7549-7554bp处，即水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1的核苷酸序列自5’末端起第37175-27180位、第39932-39937位、第40802-40807位和第41273-41278位)，除了位于Pi9基因起始密码子后7080bp(水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1的核苷酸序列自5’末端起第40804位)与其他等位基因之间有SNP存在外，其它三个酶切位点都不存在SNP，由于该SNP位点与前一个XbaI酶切识别位点(水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列自5’末端起第39932-39937位)和后一个XbaI酶切识别位点(水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列自5’末端起第41273-41278位)存在1300bp左右的序列空间，完全能够满足CAPS标记开发的条件。
二、引物设计和合成
在Pi9基因7080bp(即水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列自5’末端起第40804位)上游600bp，下游200bp处设计配对引物，引物序列如下：
F:5’-GTCGTCTACCATTAGCAATAC-3’；(SEQ ID No.1)
R:5’-GCAATGTATGTTCTCAGCAT-3’。(SEQ ID No.2)
三、选择水稻材料
选择我国水稻杂交育种中的骨干亲本材料，包括骨干恢复系、三系不育系、二系不育系以及高抗水稻稻瘟病材料以及含有抗稻瘟病基因Pi9的水稻品系，具体名单如下(国家水稻数据库中心可以查询http://www.ricedata.cn/variety/)：
75-1-127、辐恢838、CDR22、桂99、绵恢725、先恢207、密阳46、93-11、远恢2号、蜀恢498、珍汕97A、金23A、天丰A、冈46A、广占63-4S、地谷B、特特普。
骨干恢复系：辐恢838、CDR22、桂99、绵恢725、先恢207、密阳46、93-11、远恢2号、蜀恢498；
三系不育系：珍汕97A、金23A、天丰A、冈46A；
二系不育系：广占63-4S；
高抗水稻稻瘟病水稻：地谷B、特特普；
以上骨干恢复系、三系不育系、二系不育系和高抗水稻稻瘟病水稻均不含抗稻瘟病基因Pi9。
含有纯合抗稻瘟病基因Pi9的水稻品系：75-1-127。
四、PCR扩增及酶切检测
提取步骤三的各水稻材料的基因组DNA，分别以其为模板，以步骤二的引物为引物进行PCR扩增,得到PCR扩增产物，片段大小为802bp，该片段即为Pi9caps标记，该标记为各水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列自5’末端起第40205位至第41006位，其中75-1-127的第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列自5’末端起第40802位至第40807位为XbaI酶切识别位点(5’-TCTAGA-3’)。
本发明扩增得到的Pi9caps标记的序列有两种，分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的DNA分子只存在第601位碱基的差异。
五、使用限制性核酸内切酶XbaI酶切步骤四得到的PCR扩增产物，再将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,结果如图2所示。
PCR反应体系(25μl)：10×PCR缓冲液2.5μl；dNTP Mixture(2.5mM)2.5μl；Taq酶(5U/μl)0.2μl；引物F和R(均为10mM)各0.25μl；模板(DNA)1μl；MgSO4(25mM)1.6μl；DMSO 1.6μl；ddH2O补充至25μl。
PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10分钟。
图2中，泳道1-8依次为75-1-127(含Pi9基因)、辐恢838、CDR22、桂99、绵恢725、先恢207、密阳46、93-11的酶切产物，泳道9为DNA ladder，泳道10-18依次为远恢2号、蜀恢498、珍汕97A、金23A、天丰A、冈46A、广占63-4S、地谷B、特特普的酶切产物。
图2表明,经过上述PCR扩增和限制性核酸内切酶XbaI酶切，PCR模板为含有Pi9基因的75-1-127的基因组DNA的酶切产物为两条，分别为599bp和203bp大小的条带，序列分别如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。PCR模板来自不含Pi9基因的水稻的基因组DNA的酶切产物只有一条长度为802bp的条带，表明其PCR扩增产物并未被限制性核酸内切酶XbaI酶切。
实施例2、抗稻瘟病基因Pi9特异性CAPS标记的验证及应用
一、以不含抗稻瘟病基因Pi9的水稻品种93-11为母本，以含抗稻瘟病基因Pi9的水稻品种75-1-127为父本进行杂交，得到F1代，F1代自交得到F2群体,提取F2群体中编号为4-24的单株、93-11和75-1-127的基因组DNA。
二、分别以步骤一得到的基因组DNA为模板，以实施例1的引物F和R为引物，进行PCR扩增,得到PCR扩增产物，其大小为802bp，该PCR扩增产物即为Pi9caps标记，该标记为各水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列自5’末端起第40205位至第41006位，再使用限制性核酸内切酶XbaI酶切各PCR扩增产物，得到酶切产物，将酶切产物在琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
结果如图3所示。
图3中，泳道1为DNA ladder，泳道2为75-1-127的酶切产物，泳道3为93-11的酶切产物，泳道4-24为F2代群体不同水稻单株(单株编号与泳道编号一致)的酶切产物。
图3表明,F2代群体内抗稻瘟病基因Pi9存在分离，75-1-127、编号为4-21、24的单株的酶切产物均为两条带(两个DNA片段)，该两条带的测序结果表明这些植株两个条带的序列均分别如SEQ ID No.5(大小为599bp)和SEQ ID No.6(大小为203bp)所示。93-11和编号为22和23的单株的酶切产物只有一条长度为802bp的条带，表明其PCR扩增产物并未被限制性核酸内切酶XbaI酶切。
检测75-1-127、93-11和F2群体中编号为4-24的单株的第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列，测序结果表明，75-1-127的第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列自5’末端起第40804位核苷酸均为T，且第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列的5’末端起第33725位至第42313位均为抗稻瘟病基因Pi9；93-11的第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列自5’末端起第40804位核苷酸均为C，不含有抗稻瘟病基因Pi9；编号为22和23的单株的第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列自5’末端起第40804位核苷酸均为C，不含有抗稻瘟病基因Pi9；编号为4、5、7、9、10的单株第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列自5’末端起第40804位核苷酸为T和C，且第6号染色体其中一条染色单体上75-1-127BAC12.1序列5’末端起第33725位至第42313位为抗稻瘟病基因Pi9；剩余编号的单株第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列自5’末端起第40804位核苷酸均为T，且第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列的5’末端起第33725位至第42313位均为抗稻瘟病基因Pi9。
以上结果表明，利用Pi9caps标记可以在群体中对含有抗稻瘟病基因Pi9的水稻品种和不含抗稻瘟病基因Pi9的水稻品种加以选择。
将上述实施例中的SEQ ID No.1和SEQ ID No.2替换为能扩增水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列自5’末端起第39933位至第41277位核苷酸所示的序列内并含有水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列自5’末端起第40802位至第40807位核苷酸的序列的引物，按照上述方法进行PCR扩增均可以得到Pi9的特异性CAPS标记，再将Pi9的特异性CAPS标记进行限制性核酸内切酶XbaI酶切，如果Pi9的特异性CAPS标记能被酶切产生两个DNA片段，则水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列自5’末端起第40804位核苷酸含T(两条染色体上该位点均为T，或其中一个染色体上的该位点为T)，含有抗稻瘟病基因Pi9(两条染色体上均含有抗稻瘟病基因Pi9，或其中一个染色体上含有抗稻瘟病基因Pi9)，具有稻瘟病抗性，如果Pi9的特异性CAPS标记不能被酶切产生两个DNA片段，则水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列自5’末端起第40804位核苷酸不含T，不含有抗稻瘟病基因Pi9。
实施例3、抗稻瘟病基因Pi9特异性CAPS标记在转Pi9基因编码区的水稻中的验证及应用
一、以不含抗稻瘟病基因Pi9的水稻品种TP309为转基因受体，将抗稻瘟病基因Pi9的CDS区域在TP309中过量表达，制备成转Pi9基因编码区的水稻。
二、提取步骤一得到的转Pi9基因编码区的水稻和TP309的基因组DNA,分别以其为模板，以实施例1的引物F和R为引物，进行PCR扩增,得到各PCR扩增产物，使用限制性核酸内切酶XbaI酶切各PCR扩增产物，得到各酶切产物，将各酶切产物在琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
结果如图4所示。
图4中，泳道1为DNA ladder，泳道2和3分别为步骤一得到的转Pi9基因编码区的水稻和TP309的酶切产物。
图4表明,转Pi9基因编码区的水稻的酶切产物具有两条分别为599bp和203bp大小的条带，而TP309的酶切产物只有一条，说明利用本标记可以检测出转Pi9基因编码区的水稻。

Claims (10)

1.一种鉴定或辅助鉴定水稻是否含有抗稻瘟病基因Pi9和/或是否具有稻瘟病抗性的方法，包括如下步骤：检测待测水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40804位核苷酸，根据水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40804位核苷酸的种类进行鉴定：如果待测水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40804位核苷酸含T，则待测水稻为含有抗稻瘟病基因Pi9的水稻或候选为含有抗稻瘟病基因Pi9的水稻和/或具有稻瘟病抗性的水稻，如果待测水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40804位核苷酸不含T，则待测水稻为不含有抗稻瘟病基因Pi9的水稻或候选为不含有抗稻瘟病基因Pi9的水稻。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述检测待测水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40804位核苷酸的方法如下：以待测水稻的基因组DNA为模板，以稻瘟病抗性基因Pi9的分子标记引物为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，该PCR扩增产物为所述稻瘟病抗性基因Pi9的分子标记；用限制性核酸内切酶XbaI酶切所述PCR扩增产物，如果所述PCR扩增产物能被酶切产生两个DNA片段，则待测水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40804位核苷酸含T，如果所述PCR扩增产物不能被酶切，则待测水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40804位核苷酸不含T；
所述引物为能扩增所述稻瘟病抗性基因Pi9的分子标记的引物，所述稻瘟病抗性基因Pi9的分子标记的核苷酸序列为如下A所示的序列：
A、位于水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第39933位至第41277位核苷酸所示的序列内并含有第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40802位至第40807位核苷酸的序列。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述A所示的序列为位于水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40205位至第41006位核苷酸所示的序列；
所述引物为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的DNA分子，所述两个DNA片段分别为长度为599bp的DNA片段和203bp的DNA片段。
4.扩增如下A所示的序列的引物：
A、位于水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第39933位至第41277位核苷酸所示的序列内并含有第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40802位至第40807位核苷酸的序列。
5.根据权利要求4所述的引物，其特征在于：所述A所示的序列为位于水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40205位至第41006位核苷酸所示的序列；
所述引物为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的DNA分子。
6.DNA片段，选自水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第39933位至第41277位核苷酸所示的序列内并含有第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40802位至第40807位核苷酸的序列。
7.根据权利要求6所述的DNA片段，其特征在于：所述DNA片段的核苷酸序列为水稻第6号染色体中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40205位至第41006位核苷酸所示的序列。
8.一种鉴定或辅助鉴定水稻是否含有抗稻瘟病基因Pi9和/或是否具有稻瘟病抗性的试剂盒，该试剂盒包含权利要求4或5所述的引物。
9.权利要求4或5所述的引物、权利要求6或7所述的DNA片段或权利要求8所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定水稻是否含有抗稻瘟病基因Pi9和/或是否具有稻瘟病抗性中的应用。
10.权利要求1-3任一所述的方法、权利要求4或5所述的引物、权利要求6或7所述的DNA片段或权利要求8所述的试剂盒在水稻育种中的应用。
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