CN108220468A - 抗稻瘟病基因Pid3的分子标记物组合及等位基因的筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗稻瘟病基因Pid3的分子标记物组合及等位基因的筛选方法，该分子标记物包括：第一分子标记物Pid3C1，用于从水稻材料中检测并筛选出抗稻瘟病基因Pid3的2209位置出现提前终止位点的水稻材料。第二分子标记物Pid3C2，用于从第一分子标记物的筛余水稻材料中检测并筛选出抗稻瘟病基因Pid3的1766位置出现提前终止位点的水稻材料。第三分子标记物Pid3C3，用于从第二分子标记物的筛余水稻材料中检测并筛选出抗稻瘟病基因Pid3的1874位置出现变异位点的水稻材料。该方法为合理配置抗稻瘟病基因Pid3不同等位基因、有目的导入特定等位基因以及快速发掘新等位基因等都具有非常重要的作用。

Description

抗稻瘟病基因Pid3的分子标记物组合及等位基因的筛选方法

技术领域

本发明涉及抗稻瘟病基因筛选领域，特别地，涉及一种抗稻瘟病基因Pid3的分子标记物组合。此外，本发明还涉及一种抗稻瘟病基因Pid3等位基因的筛选方法。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全世界一半以上的人口以稻米为主食。稻瘟病是影响水稻产量的主要病害，位居真菌病害之首，全球每年因稻瘟病造成的水稻减产达10％～30％，严重时减产达40％～50％，甚至颗粒无收。实践证明，利用抗稻瘟病基因是控制稻瘟病害最经济、有效、环保的方法。到目前为止，在水稻中已至少报道了68个抗稻瘟病位点共83个主效基因，这些基因成簇地分布于除第3染色体外的所有水稻染色体上，已经克隆的30个左右，主要包括Pib,Pi-ta,Pi9,Piz-t,Pi2,Pid2,Pi36,Pi37,Rbr2,Pik-m,Pi5,Pid3,pi21,Pit,Pb1,Pish,Pik-p,Pik,Pia,Pi54,Pi25,Pi1,Pi50,Pi54rh，Pigm等(国家水稻数据库中心http://www.ricedata.cn/gene/gene_pi.htm)。在这些已克隆的抗稻瘟病基因中，存在一个显著的特点：许多新克隆的基因其实只是原来克隆的抗病位点中的不同等位基因，比如在Pi9位点上，存在等位基因Pi9、Pi2、Pizt、Pigm；在Pik位点上存在等位基因Pik、Pikp、Pikm、Pi1等。这些等位基因序列高度相似，却具有不同的稻瘟病菌抗谱，在水稻育种中合理利用不同的等位基因是应对稻瘟病菌小种快速变异的有效途径。为了达到该目的，急需解决的首要问题就是如何快速判断水稻材料存在哪一种等位基因。

世界上水稻种质资源繁多，目前克隆的某一等位基因可能只是该位点存在众多等位基因中的一种，要准确判断水稻材料中某一抗病基因位点的等位基因，就必须对种质资源中该位点的等位基因存在形式做系统的详细研究，从而利用不同等位基因特异的分子标记进行快速判断。随着3000份水稻基因组重测序计划的完成，使得对抗病位点的等位基因系统研究成为可能。该计划收集了世界上89个国家和地区具有代表性的3000多份水稻材料进行深度达14x的基因组重测序，通过对参考基因组日本晴的比对，提供了整个栽培稻中存在的遗传变异全景图(Alexandrov.,et al.,SNP-Seek database of SNPs derived from3000rice genomes.Nucleic Acids Research,2015(43):D1023-1027)。本方法及相关分子标记就是基于对3000份水稻材料遗传变异的深入分析，针对抗稻瘟病基因Pid3位点鉴定出所有等位基因形式，选取分布最为广泛的4类等位基因，设计特异的分子标记，从而达到区分绝大多数栽培稻中Pid3等位基因的目的。利用该方法，已经成功的对水稻微核心种质资源库中的水稻材料进行了鉴定，取得了非常好的效果。该方法为合理配置抗稻瘟病基因Pid3不同等位基因、有目的导入特定等位基因以及快速发掘新等位基因等都具有非常重要的作用。

发明内容

本发明提供了一种抗稻瘟病基因Pid3的分子标记物组合及等位基因的筛选方法，以解决抗稻瘟病基因Pid3等位基因筛选的技术问题。

本发明采用的技术方案如下：

本发明一方面提供了一种抗稻瘟病基因Pid3的分子标记物组合，包括：

第一分子标记物Pid3C1，第一分子标记物用于从水稻材料中检测并筛选出抗稻瘟病基因Pid3的2209位置出现提前终止位点的水稻材料。

第二分子标记物Pid3C2，第二分子标记物用于从水稻材料中检测并筛选出抗稻瘟病基因Pid3的1766位置出现提前终止位点的水稻材料。

第三分子标记物Pid3C3，第三分子标记物用于从第一分子标记物的筛余水稻材料中检测并筛选出抗稻瘟病基因Pid3的1874位置出现变异位点的水稻材料。

进一步地，

第一分子标记物Pid3C1包括引物Pid3C1F和引物Pid3C1R，其序列分别为：

引物Pid3C1F:ATGATTCATCTTACCCGTCTTGAGATC

引物Pid3C1R:GTAATCCCTCAAGATTAAGGAATGC

第二分子标记物Pid3C2包括引物Pid3C2F和引物Pid3C2R，其序列分别为：

Pid3C2F:GTCTGTTTTGGATCTAACTGATACTT

Pid3C2R:GCTTTCGAAGTTACAATAAGATGTG

第三分子标记物Pid3C3包括引物Pid3C3F和引物Pid3C3R，其序列分别为：

Pid3C3F:AAGTTGTTGTCTGTTTTGGA

Pid3C3R:TGACTACTGTCTGCCTGGAT。

一种抗稻瘟病基因Pid3的等位基因的筛选方法，利用上述抗稻瘟病基因Pid3的分子标记物组合对抗稻瘟病基因Pid3的等位基因进行筛选，包括以下步骤：

1)、利用第一分子标记物Pid3C1或第二分子标记物Pid3C2对水稻材料进行PCR扩增，PCR扩增产物进行电泳检测，将呈阳性的水稻材料进行酶切，筛选出能酶切的水稻材料，得到在抗稻瘟病基因Pid3的相应位置出现提前终止位点的水稻材料。

2)、从抗稻瘟病基因Pid3的分子标记物组合中选择不同于步骤1)中的分子标记物，对步骤1)的筛余水稻材料中进行PCR扩增，PCR扩增产物进行电泳检测，将呈阳性的水稻材料进行酶切，筛选出能酶切的水稻材料，得到抗稻瘟病基因Pid3的相应位置出现提前终止位点或变异位点的水稻材料。

3)、从抗稻瘟病基因Pid3的分子标记物组合中选择剩余的分子标记物，对步骤2)的筛余水稻材料中进行PCR扩增，PCR扩增产物进行电泳检测，将呈阳性的水稻材料进行酶切，筛选出能酶切的水稻材料，得到抗稻瘟病基因Pid3的相应位置出现提前终止位点或变异位点的水稻材料。

其中，利用第一分子标记物Pid3C1对水稻材料进行扩增的步骤在第三分子标记物Pid3C3对水稻材料扩增的步骤之前。

进一步地，在步骤3)之后还包括以下步骤：

利用第四分子标记物Pid3对步骤3)的筛余水稻材料中进行PCR扩增，PCR扩增产物进行电泳检测，将呈阳性的水稻材料利用引物C1、C2、C3、C4进行测序。

其中：第四分子标记物Pid3包括引物Pid3F和引物Pid3R，其序列分别为：

Pid3F:CCTGCGTTTTATGAAAGGGGTGAA

Pid3R:GAACGACAAGTGCGACATGATTG

引物C1、C2、C3、C4的序列分别为：

C1：AGTAACACCCAAGGATAGGATAG

C2:GTATTGAAAGTAAAATTGAAC

C3：CTCACAATGGCAACTTCGCACC

C4：CCAGCCTCATTTCTCTTCACCA。

本发明第一分子标记物Pid3C1的PCR扩增产物的酶切所用酶为限制性内切酶BglII。

第二分子标记物Pid3C1的PCR扩增产物的酶切所用酶为限制性内切酶AflII。

第三分子标记物Pid3C1的PCR扩增产物的酶切所用酶为限制性内切酶ApoI。

本发明具有以下有益效果：本发明的抗稻瘟病基因Pid3的分子标记物组合是基于对3000份水稻材料遗传变异的深入分析，针对抗稻瘟病基因Pid3位点鉴定出所有等位基因形式，选取分布最为广泛的4类等位基因，设计特异的分子标记，从而达到区分绝大多数栽培稻中Pid3等位基因的目的。利用该方法，已经成功的对水稻微核心种质资源库中的水稻材料进行了鉴定，取得了非常好的效果。该方法为合理配置抗稻瘟病基因Pid3不同等位基因、有目的导入特定等位基因以及快速发掘新等位基因等都具有非常重要的作用。

除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。

附图说明

构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是Pid3位点各单倍型间序列变异示意图；

图2是Pid3位点3种代表等位型的dCAPS标记位点序列分析图；

图3是Pid3位点各等位基因特异性dcap标记在含有该等位基因水稻材料中扩增并酶切结果；

图4是Pid3C1在检测微核心水稻材料Pid3位点等位基因型的结果；其中：泳道1为DNA ladder，泳道2-25为不同微核心水稻材料；

图5是Pid3C2在检测微核心水稻材料Pid3位点等位基因型的结果；其中：泳道1为DNA ladder，泳道2-25为不同微核心水稻材料；

图6是Pid3C3在检测微核心水稻材料Pid3位点等位基因型的结果；其中：泳道1为DNA ladder，泳道2-25为不同微核心水稻材料。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。

参照图1，本发明的优选实施例提供了一种抗稻瘟病基因Pid3的分子标记物组合，包括：

第一分子标记物Pid3C1，第一分子标记物用于从水稻材料中检测并筛选出抗稻瘟病基因Pid3的2209位置出现提前终止位点的水稻材料；

第二分子标记物Pid3C2，第二分子标记物用于从水稻材料中检测并筛选出抗稻瘟病基因Pid3的1766位置出现提前终止位点的水稻材料；

第三分子标记物Pid3C3，第三分子标记物用于从第一分子标记物的筛余水稻材料中检测并筛选出抗稻瘟病基因Pid3的1874位置出现变异位点的水稻材料。

世界上水稻种质资源繁多，目前克隆的某一等位基因可能只是该位点存在众多等位基因中的一种，要准确判断水稻材料中某一抗病基因位点的等位基因，就必须对种质资源中该位点的等位基因存在形式做系统的详细研究，从而利用不同等位基因特异的分子标记进行快速判断。随着3000份水稻基因组重测序计划的完成，使得对抗病位点的等位基因系统研究成为可能。该计划收集了世界上89个国家和地区具有代表性的3000多份水稻材料进行深度达14x的基因组重测序，通过对参考基因组日本晴的比对，提供了整个栽培稻中存在的遗传变异全景图(Alexandrov.,et al.,SNP-Seek database of SNPs derived from3000rice genomes.Nucleic Acids Research,2015(43):D1023-1027)。本方法及相关分子标记就是基于对3000份水稻材料遗传变异的深入分析，针对抗稻瘟病基因Pid3位点鉴定出所有等位基因形式，选取分布最为广泛的4类等位基因，设计特异的分子标记，从而达到区分绝大多数栽培稻中Pid3等位基因的目的。

抗稻瘟病基因Pid3各等位基因类型特异性分子标记Pid3C1,Pid3C2,Pid3C3的研究过程如下:

步骤1，从公共数据库中(http://www.rmbreeding.cn/snp3k和http://oryzasnp.org/iric-portal/index.zul)下载得到搜集自全球各地的3024份栽培稻全基因组重测序数据，针对抗稻瘟病基因Pid3(genebank登录号：FJ773286.1)编码区存在的所有遗传变异进行分析。结果发现在3024份水稻材料中，针对Pid3编码区2775bp序列共获得2621份材料中可信的序列。这2621条Pid3等位基因可划分为40个单倍型，每种单倍型数量不等，从包含1份水稻材料到多达含有1376份材料不等(表1)。对40种单倍型之间的进化关系分析可得知(图1)在含有数量最多两类单倍型Hap_6和Hap_9周围分别存在许多只相差一到两个碱基的单倍型，构成了两大类群。进一步分析发现：Hap_9周围的所有单倍型在2209位置处都存在提前终止突变，导致该类群Pid3等位基因(715份材料)均无抗病功能；Hap_6周围所有单倍型变异无明显功能缺失碱基变异，其功能与Hap_6相同；除了Hap_9及周围单倍型在2209处提前终止外，Hap_2所含的95份材料也在1766位置处提前终止而无功能；对比各单倍型与文献报道的Pid3等位基因序列确认Hap_6为水稻93-11中克隆的等位基因，并已证实具有抗稻瘟病功能。经统计，明确由于2209和1766位置提前终止导致无功能的单倍型，以及明确具有抗病功能的Hap_6及周围单倍型共含有2374份水稻材料，占总数的90.58％，说明这三类变异型在栽培稻Pid3位点上具有非常强的代表性。本研究的目的就是设计有效的分子标记区分此三类变异，并对余下的变异类型进行PCR测序，明确栽培稻中所含的Pid3基因变异类型。

表1、Pid3位点各单倍型及所含材料数量

*,#,&,$代表所对应的单倍型在2209,1766,1088,885位置处提前终止

利用步骤1中筛选到的3类代表性变异类型，利用dCAPS标记设计原理，设计出各等位变异的特异分子标记Pid3C1，Pid3C2，Pid3C3。其中Pid3C1针对2209位置处存在的提前终止位点，Pid3C2针对1766位置处存在的提前终止位点，Pid3C3针对Hap6及周围单倍型1874位置处存在的变异位点设计(图二)。

具体的，Hap_9及相邻的13种单倍型在2209位置处出现了提前终止(CAG-TAG)，可以以此位点设计该变异类型的检测标记；Hap_2在1766位置处出现了提前终止(TCA-TAA)可以以此位点设计该变异类型的检测标记；功能型等位Hap_6在1874位置与其他三种类型变异存在SNP(T-G)可以以此位点设计该等位类型的检测标记。Hap_9在该位点与Hap6碱基相同，因此利用第三分子标记物Pid3C3筛选的步骤需在利用第一分子标记物Pid3C1筛选的步骤之后，即将Hap_9筛选出来，把该单倍型在前面检测过程中剔除，再将Hap6筛选出来。针对2209、1766、1874三个位点的变异，根据dcaps标记设计原理，均可以在引入一个碱基变异的条件下成功获得相应dcaps标记。

以需要进行Pid3位点背景检测的水稻总DNA为模板，利用前述3对引物Pid3C1，Pid3C2，Pid3C3分别进行PCR扩增，所获得的PCR产物分别经限制性内切酶BglII，AflII，ApoI酶切后，进行电泳检测的DNA片段，即可以分辨抗稻瘟病基因Pid3位点等位基因存在情况。

本发明具有以下有益效果：本发明的抗稻瘟病基因Pid3的分子标记物组合是基于对3000份水稻材料遗传变异的深入分析，针对抗稻瘟病基因Pid3位点鉴定出所有等位基因形式，选取分布最为广泛的4类等位基因，设计特异的分子标记，从而达到区分绝大多数栽培稻中Pid3等位基因的目的。利用该方法，已经成功的对水稻微核心种质资源库中的水稻材料进行了鉴定，取得了非常好的效果。该方法为合理配置抗稻瘟病基因Pid3不同等位基因、有目的导入特定等位基因以及快速发掘新等位基因等都具有非常重要的作用。

可选地，第一分子标记物Pid3C1包括引物Pid3C1F和引物Pid3C1R，其序列分别为：

引物Pid3C1F:ATGATTCATCTTACCCGTCTTGAGATC，如SEQ ID No.1所示。

引物Pid3C1R:GTAATCCCTCAAGATTAAGGAATGC，如SEQ ID No.2所示。

第二分子标记物Pid3C2包括引物Pid3C2F和引物Pid3C2R，其序列分别为：

Pid3C2F:GTCTGTTTTGGATCTAACTGATACTT，如SEQ ID No.3所示。

Pid3C2R:GCTTTCGAAGTTACAATAAGATGTG，如SEQ ID No.4所示。

第三分子标记物Pid3C3包括引物Pid3C3F和引物Pid3C3R，其序列分别为：

Pid3C3F:AAGTTGTTGTCTGTTTTGGA，如SEQ ID No.5所示。

Pid3C3R:TGACTACTGTCTGCCTGGAT，如SEQ ID No.6所示。

针对Hap_9及相邻单倍型特异的2209位置提前终止位点,在Pid3位点编码区位置2182处设计上引物，在2410处设计下引物，发明检测引物Pid3C1；针对Hap_2单倍型1766位置提前终止位点,在Pid3位点编码区位置1740处设计上引物，在1973处设计下引物，发明检测引物Pid3C2；针对Hap_6单倍型1874位置特异SNP，在Pid3位点编码区位置1730处设计上引物，在2225处设计下引物，发明检测引物Pid3C3。引物序列分别如下：

Pid3C1F:ATGATTCATCTTACCCGTCTTGAGATC

Pid3C1R:GTAATCCCTCAAGATTAAGGAATGC

Pid3C2F:GTCTGTTTTGGATCTAACTGATACTT

Pid3C2R:GCTTTCGAAGTTACAATAAGATGTG

Pid3C3F:AAGTTGTTGTCTGTTTTGGA

Pid3C3R:TGACTACTGTCTGCCTGGAT。

一种抗稻瘟病基因Pid3的等位基因的筛选方法，利用上述抗稻瘟病基因Pid3的分子标记物组合对抗稻瘟病基因Pid3的等位基因进行筛选，包括以下步骤：

S1、利用第一分子标记物Pid3C1或第二分子标记物Pid3C2对水稻材料进行PCR扩增，PCR扩增产物进行电泳检测，将呈阳性的水稻材料进行酶切，筛选出能酶切的水稻材料，得到在抗稻瘟病基因Pid3的相应位置出现提前终止位点的水稻材料。

S2、从抗稻瘟病基因Pid3的分子标记物组合中选择不同于步骤S1中的分子标记物，对步骤S1的筛余水稻材料中进行PCR扩增，PCR扩增产物进行电泳检测，将呈阳性的水稻材料进行酶切，筛选出能酶切的水稻材料，得到抗稻瘟病基因Pid3的相应位置出现提前终止位点或变异位点的水稻材料。

S3、从抗稻瘟病基因Pid3的分子标记物组合中选择剩余的分子标记物，对步骤S2的筛余水稻材料中进行PCR扩增，PCR扩增产物进行电泳检测，将呈阳性的水稻材料进行酶切，筛选出能酶切的水稻材料，得到抗稻瘟病基因Pid3的相应位置出现提前终止位点或变异位点的水稻材料。

其中，利用第一分子标记物Pid3C1对水稻材料进行扩增的步骤在第三分子标记物Pid3C3对水稻材料扩增的步骤之前。

抗稻瘟病基因Pid3的等位基因的筛选方法需满足一个原则：利用第三分子标记物Pid3C3筛选的步骤需在利用第一分子标记物Pid3C1筛选的步骤之后。即利用第三分子标记物Pid3C3筛选不能在步骤S1中，必须在第二分子标记物Pid3C2筛选之后，步骤S1中利用第一分子标记物Pid3C1或第二分子标记物Pid3C2通过PCR扩增、电泳检测、酶切。当选择第一分子标记物Pid3C1时，得到在抗稻瘟病基因Pid3的2209位置出现提前终止位点的水稻材料。当选择第二分子标记物Pid3C2时，得到在抗稻瘟病基因Pid3的1766位置出现提前终止位点的水稻材料。

步骤S2选择的分子标记物首先应满足与步骤S1中的分子标记物不同，其次还要考虑使选择第一分子标记物Pid3C1对水稻材料进行PCR扩增进而筛选的步骤在选择第三分子标记物Pid3C3对水稻材料进行PCR扩增进而筛选的步骤之前。因而，当步骤S1中的选用第二分子标记物Pid3C2进行操作时，步骤S2中应选用第一分子标记物Pid3C1进行PCR扩增进而筛选，得到在抗稻瘟病基因Pid3的2209位置出现提前终止位点的水稻材料。而当步骤S1中的选用第一分子标记物Pid3C1进行操作时，步骤S2中可选用第二分子标记物Pid3C2进行PCR扩增进而筛选，得到在抗稻瘟病基因Pid3的1766位置出现提前终止位点的水稻材料，或选用第三分子标记物Pid3C3进行PCR扩增进而筛选，得到在抗稻瘟病基因Pid3的1874位置出现变异位点的水稻材料。

步骤S3选择的分子标记物为步骤S1和步骤S2中未选择的分子标记物，为第二分子标记物Pid3C2或第三分子标记物Pid3C3，经过一系列步骤，筛选得到抗稻瘟病基因Pid3的1766位置出现提前终止位点的水稻材料或在抗稻瘟病基因Pid3的1874位置出现变异位点的水稻材料。

在前面已经分析过，参照图1和表1，在1874位置出现变异位点的水稻材料占比最大，在2209位置出现提前终止位点的水稻材料占比次之，在1766位置出现提前终止位点的水稻材料占比则更次之。由于后续利用分子标记物进行PCR扩增进而筛选的步骤均在前一步骤的筛余物的基础上进行，因而在满足利用第三分子标记物Pid3C3筛选的步骤需在利用第一分子标记物Pid3C1筛选的步骤之后的前提下，最优的筛选顺序为：利用第一分子标记物Pid3C1对水稻材料进行PCR扩增进而筛选→利用第三分子标记物Pid3C3对水稻材料进行PCR扩增进而筛选→利用第二分子标记物Pid3C2对水稻材料进行PCR扩增进而筛选。该顺序下，步骤S2和步骤S3筛选的水稻材料量会大大降低，降低了工作量，提高了筛选效率。

当然也可采用其它的筛选顺序，只要满足利用第三分子标记物Pid3C3筛选的步骤需在利用第一分子标记物Pid3C1筛选的步骤之后的前提即可，如：

S1：利用第一分子标记物Pid3C1对水稻材料进行PCR扩增，PCR扩增产物进行电泳检测，将呈阳性的水稻材料进行酶切，筛选出能酶切的水稻材料，即为抗稻瘟病基因Pid3的2209位置出现提前终止位点的水稻材料。

S2：利用第二分子标记物Pid3C2对第一分子标记物的筛余水稻材料中进行PCR扩增，PCR扩增产物进行电泳检测，将呈阳性的水稻材料进行酶切，筛选出能酶切的水稻材料，即为抗稻瘟病基因Pid3的1766位置出现提前终止位点的水稻材料。

S3：利用第三分子标记物Pid3C3对第二分子标记物的筛余水稻材料中进行PCR扩增，PCR扩增产物进行电泳检测，将呈阳性的水稻材料进行酶切，筛选出能酶切的水稻材料，即为抗稻瘟病基因Pid3的1874位置出现变异位点的水稻材料。

S4：利用第四分子标记物Pid3对第三分子标记物的筛余水稻材料中进行PCR扩增，PCR扩增产物进行电泳检测，将呈阳性的水稻材料利用引物C1、C2、C3、C4进行测序。

可以理解的是，当S1～S3步骤完成时，抗稻瘟病基因Pid3分布最为广泛的4类等位基因已经可识别筛选得出，加上S4步骤可检验并识别其余的等位基因，因此，包含S4步骤的抗稻瘟病基因Pid3的等位基因的筛选方法为优选的方案，S4步骤并非必要的技术特征。

其中：第四分子标记物Pid3包括引物Pid3F和引物Pid3R，其序列分别为：

Pid3F:CCTGCGTTTTATGAAAGGGGTGAA，如SEQ ID No.7所示。

Pid3R:GAACGACAAGTGCGACATGATTG，如SEQ ID No.8所示。

引物C1、C2、C3、C4的序列分别为：

C1：AGTAACACCCAAGGATAGGATAG，如SEQ ID No.9所示。

C2:GTATTGAAAGTAAAATTGAAC，如SEQ ID No.10所示。

C3：CTCACAATGGCAACTTCGCACC，如SEQ ID No.11所示。

C4：CCAGCCTCATTTCTCTTCACCA，如SEQ ID No.12所示。

实施例

抗稻瘟病基因Pid3的等位基因的筛选方法的具体方案如下，取待测的水稻材料进行下面步骤:

1)取水稻材料叶片组织，提取水稻样品的基因组DNA。

2)利用第一分子标记物Pid3C1对水稻样品DNA进行PCR扩增。

3)PCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测：

①若PCR结果为阴性，则待检测的水稻材料没有携带抗稻瘟病基因Pid3；

②若PCR结果为阳性，即得到229bpPCR产物，进行下一步酶切检测。

4)酶切检测:用限制性内切酶BglII酶切PCR产物片段后，得到分子量大小23bp和206bp的核苷酸片段，则待检测的水稻材料中Pid3基因在2209处提前终止，不具有抗病功能；若PCR产物不能被BglII切开，得不到两个核苷酸片段，则进行下一步检测。

5)利用第二分子标记物Pid3C2对4)中不能切开的水稻样品DNA进行PCR扩增。

6)PCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测：

①若PCR结果为阴性,则待检测的水稻材料没有携带抗稻瘟病基因Pid3；

②若PCR结果为阳性,即得到233bpPCR产物,进行下一步酶切检测

7)酶切检测:用限制性内切酶AflII酶切PCR产物片段后,得到分子量大小23bp和210bp的核苷酸片段，则待检测的水稻材料中Pid3基因在1766处提前终止，不具有抗病功能；若PCR产物不能被AflII切开，得不到两个核苷酸片段，则该材料中Pid3位点可能具有抗病功能等位并进行下一步检测。

8)利用第三分子标记物Pid3C3对7)中不能切开的水稻样品DNA进行PCR扩增。

9)PCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测：

①若PCR结果为阴性,则待检测的水稻材料没有携带抗稻瘟病基因Pid3；

②若PCR结果为阳性,即得到494bpPCR产物，进行下一步酶切检测。

10)酶切检测:用限制性内切酶ApoI酶切PCR产物片段后，得到分子量大小140bp和354bp的核苷酸片段,则待检测的水稻材料中Pid3基因为单倍型Hap_6类型；若PCR产物不能被ApoI切开，得不到两个核苷酸片段，则进行下一步检测。

11)利用引物组合Pid3F/R对水稻样品DNA进行PCR扩增

9)PCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测：

①若PCR结果为阴性,则待检测的水稻材料没有携带抗稻瘟病基因Pid3；

②若PCR结果为阳性,即得到约3200bp长的PCR产物,利用引物C1、C2、C3、C4进行测序，即可得到待检测材料中Pid3基因等位基因类型。

更为详尽的检测步骤如下：

分子标记Pid3C1检测主要包括以下步骤：通过引物对F1和R1从水稻材料总DNA中扩增出来得到核苷酸片段1；用限制性内切酶BglII对前述核苷酸片段进行酶切,所获得的与抗稻瘟病基因Pid3位点2209位置提前终止等位基因类型呈特异性带型的核苷酸片段2和3。

F1:ATGATTCATCTTACCCGTCTTGAGATC

R1:GTAATCCCTCAAGATTAAGGAATGC

所述的核苷酸片段1(229bp)的序列如下

atgattcatcttaccCgtcttgggatcTaGgcagaCagtagtcaagaagtgctgcatcttgaatcacttaaacctcctcctctacttcagaaacttttcttgcaaggtacattatctcatgaatcattacctcatttCgtgtctgtaagcaatctgaataacctcacgTttctacgtcttgctgggtcaagaattgacgaaaatgcattccttaAtcttgagggattac

所述的与抗稻瘟病基因Pid3位点2209位置提前终止等位基因型呈特异性带型的核苷酸片段2和3具体如下：用限制性内切酶BglII酶切核苷酸片段1后，得到的分子量大小分别为23bp和206bp的核苷酸片段2与3，其序列分别为：

片段2：23bp

ATGATTCATCTTACCCGTCTTG

片段3：206bp

agatcTaGgcagaCagtagtcaagaagtgctgcatcttgaatcacttaaacctcctcctctacttcagaaacttttcttgcaaggtacattatctcatgaatcattacctcatttCgtgtctgtaagcaatctgaataacctcacgTttctacgtcttgctgggtcaagaattgacgaaaatgcattccttaAtcttgagggattac

分子标记Pid3C2检测主要包括以下步骤：通过引物对F2和R2从水稻材料总DNA中扩增出来得到核苷酸片段4；用限制性内切酶AflII对前述核苷酸片段进行酶切，所获得的与抗稻瘟病基因Pid3位点1766位置提前终止等位基因型呈特异性带型的核苷酸片段5和6

F2:GTCTGTTTTGGATCTAACTGATACTT

R2:GCTTTCGAAGTTACAATAAGATGTG

所述的核苷酸片段4(233bp)的序列如下

gtctgttttggatctaactgatacttaagttgataggctgccaaaggaagtgtttggcttgttcaacttgcGttttctgggtCtcaggcgtaCtaaaatctcCaagcttccaagctccattggaaggctaaaaaTtctgctggtgttggacgcttggaagtgtaaaattgtaaagcttccattggcgattacaaaacttcaaaagctaacacatcttattgtaacttcGaaagc

所述的与抗稻瘟病基因Pid3位点1766位置提前终止等位基因型呈特异性带型的核苷酸片段5和6具体如下：用限制性内切酶AflII酶切核苷酸片段4后，得到的分子量大小分别为22bp和206bp的核苷酸片段5与6，其序列分别为：

片段5：23bp

GTCTGTTTTGGATCTAACTGATA

片段6：210bp

cttaagttgataggctgccaaaggaagtgtttggcttgttcaacttgcGttttctgggtCtcaggcgtaCtaaaatctcCaagcttccaagctccattggaaggctaaaaaTtctgctggtgttggacgcttggaagtgtaaaattgtaaagcttccattggcgattacaaaacttcaaaagctaacacatcttattgtaacttcGaaagc

分子标记Pid3C3检测主要包括以下步骤：通过引物对F3和R3从水稻材料总DNA中扩增出来得到核苷酸片段7；用限制性内切酶ApoI对前述核苷酸片段进行酶切，所获得的与抗稻瘟病基因Pid3位点功能型等位Hap_6类型中1874位置呈特异性带型的核苷酸片段8和9

F3:AAGTTGTTGTCTGTTTTGGA

R3:TGACTACTGTCTGCCTGGAT

所述的核苷酸片段1(494bp)的序列如下

aagttgttgtctgttttggatctaactgatagttCagttgataggctgccaaaggaagtgtttggcttgttcaacttgcGttttctgggtCtcaggcgtaCtaaaatctcCaagcttccaagctccattggaaggctaaaaaTtctgctggtgttggacgcttggaagtgtaaaattgtaaagcttccattggcgattacaaaacttcaaaagctaacacatcttattgtaacttcGaaagcagtcgttgtttctaagcaatttgttccttctGttgGtgtgccagcacctttgcgtatctgctccatgacaacccttcagacattactactcatggaagcTagttctcaaatggttcatcacctaggctctcttgtggagttaagaacctttcgtatcaGCaaggtgcgaagttgccattgtgagcagttgTtcatggccatcactaatatgattcatcttaccCgtcttgggatcCaGgcagaCagtagtca

所述的与抗稻瘟病基因Pid3位点功能型等位Hap_6中1874位置呈特异性带型的核苷酸片段8和9具体如下：用限制性内切酶ApoI酶切核苷酸片段7后，得到的分子量大小分别为140bp和354bp的核苷酸片段8与9，其序列分别为：

片段8：140bp

AagttgttgtctgttttggatctaactgatagttCagttgataggctgccaaaggaagtgtttggcttgttcaacttgcGttttctgggtCtcaggcgtaCtaaaatctcCaagcttccaagctccattggaaggctaaa

片段9：354bp

aaTtctgctggtgttggacgcttggaagtgtaaaattgtaaagcttccattggcgattacaaaacttcaaaagctaacacatcttattgtaacttcGaaagcagtcgttgtttctaagcaatttgttccttctGttgGtgtgccagcacctttgcgtatctgctccatgacaacccttcagacattactactcatggaagcTagttctcaaatggttcatcacctaggctctcttgtggagttaagaacctttcgtatcaGCaaggtgcgaagttgccattgtgagcagttgTtcatggccatcactaatatgattcatcttaccCgtcttgggatcCaGgcagaCagtagtca

对分子标记Pid3C1,Pid3C2,Pid3C3检测余下的材料进行Pid3基因编码区扩增测序主要包含以下步骤：通过引物对Pid3F和Pid3R从水稻材料总DNA中扩增出来得到约3200bp长的核苷酸片段，后利用引物C1、C2、C3、C4进行测序，最终获得Pid3基因序列。

所述的引物分别如下：

Pid3F:CCTGCGTTTTATGAAAGGGGTGAA

Pid3R:GAACGACAAGTGCGACATGATTG

C1：AGTAACACCCAAGGATAGGATAG

C2:GTATTGAAAGTAAAATTGAAC

C3：CTCACAATGGCAACTTCGCACC

C4：CCAGCCTCATTTCTCTTCACCA

验证试验

(1)选择水稻材料

选择分别含有Pid3位点3类代表性变异类型的水稻材料和水稻微核心种质资源(Agrama.,et al.,Genetic assessment of a mini-core subset developed from theUSDA rice genebank.Crop science,2009(49):1336-1346),名单如下：

含Hap_9等单倍型在2209位置提前终止的水稻材料为日本晴；含Hap_2单倍型在1766位置提前终止的水稻材料为4021；含Hap_6等单倍型在1874位置有特异SNP的水稻材料为93-11；195份水稻微核心种质资源，其包含了栽培稻中大多数遗传变异。

(2)PCR扩增及酶切检测

利用常规方法提取上述水稻材料总DNA。利用Pid3C1标记引物扩增日本晴和上述水稻微核心种质资源；利用限制性内切酶BglII酶切，区分2209位置提前终止的等位基因；利用Pid3C2标记引物扩增水稻微核心种质资源中2209位置未提前终止的水稻材料，利用限制性内切酶AflII酶切，区分1766位置提前终止的等位基因；利用Pid3C3标记引物扩增水稻微核心种质资源中2209和1766位置均未提前终止的水稻材料，利用限制性内切酶ApoI酶切，区分Hap_6相关的单倍型；最后利用Pid3F/R引物对三种标记检测后余下的水稻微核心种质资源材料进行扩增，利用引物C1、C2、C3、C4进行测序。

PCR反应体系(25μl)：10×PCR缓冲液2.5μl；dNTP Mixture(2.5mM)2.5μl；Taq酶(5U/μl)0.2μl；引物F和R(均10mM)各0.25μl；模板(DNA)1μl；MgSO4(25mM)1.6μl；DMSO1.6μl；ddH₂O补充至25μl。PCR反应条件：先94℃预变性5min；然后94℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸10分钟。

限制性内切酶反应体系(15ul)：10×缓冲液1.5μl；PCR产物10μl；内切酶0.2μl，ddH2O补充至15μl。37℃酶切2小时后在3％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，电泳电压120V，时间为40分钟。

如图3所示，利用水稻材料日本晴、水稻材料4021、水稻材料93-11、其它类型的水稻材料对该套分子标记进行验证。图3a为利用Pid3C1标记引物对上述四种水稻材料进行PCR扩增及酶切的电泳结果图。图3b为利用Pid3C2标记引物对上述四种水稻材料进行PCR扩增及酶切的电泳结果图。图3c为利用Pid3C3标记引物对上述四种水稻材料进行PCR扩增酶切及酶切的电泳结果图。

实施例结果(图4-6)：利用该套分子标记对195份水稻微核心种质资源进行检测，Pid3C1筛选到2209位置提前终止的材料77份；Pid3C2筛选到1766位置提前终止的材料3份；Pid3C3筛选到的Hap_6大类的材料81份。该三种Pid3等位基因类型在微核心种质资源中的比例与3000份水稻材料中的类似。限于篇幅，仅提供了部分核心种质资源的电泳结果图。

图4泳道：1、marker，2-25分别是核心种质材料4001，4000，4003，4002，4005，4004，4006，4010，4014，4007，4016，4019，4008，4009，4023，4025，4026，4011，4028，4035，4012，4034，4039，4041。

图5泳道：1、marker，2-25分别是核心种质材料4001，4021，4002，4004，4010，4014，4016，4019，4023，4025，4026，4028，4035，4034，4169，4039，4041，4042，4057，4036，4037，4040，4044，4045。

图6泳道：1、marker，2-25分别是核心种质材料4001，4002，4004，4010，4034，4039，4019，4023，4041，4026，4028，4042，4035，4036，4037，4040，4057，4069，4044，4045，4047，4048，4049，4070。

(3)剩余单倍型克隆测序验证

对利用三个分子标记检测余下的34份水稻微核心种质资源中的Pid3等位基因进行克隆测序，共发现7种单倍型，其中6种均属于3000份水稻材料中鉴定出的单倍型(Hap_5十个材料；Hap_10四个材料；Hap_13两个材料；Hap_14九个材料；Hap_19四个材料；Hap_20两个材料；)，只在三个材料中发现了一种新的Pid3单倍型。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 湖南杂交水稻研究中心

<120> 抗稻瘟病基因Pid3的分子标记物组合及等位基因的筛选方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgattcatc ttacccgtct tgagatc 27

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtaatccctc aagattaagg aatgc 25

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtctgttttg gatctaactg atactt 26

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctttcgaag ttacaataag atgtg 25

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aagttgttgt ctgttttgga 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgactactgt ctgcctggat 20

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cctgcgtttt atgaaagggg tgaa 24

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gaacgacaag tgcgacatga ttg 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agtaacaccc aaggatagga tag 23

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtattgaaag taaaattgaa c 21

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctcacaatgg caacttcgca cc 22

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccagcctcat ttctcttcac ca 22

Claims (5)

1.一种抗稻瘟病基因Pid3的分子标记物组合，其特征在于，包括：

第一分子标记物Pid3C1，所述第一分子标记物用于从水稻材料中检测并筛选出抗稻瘟病基因Pid3的2209位置出现提前终止位点的水稻材料；

第二分子标记物Pid3C2，所述第二分子标记物用于从水稻材料中检测并筛选出抗稻瘟病基因Pid3的1766位置出现提前终止位点的水稻材料；

第三分子标记物Pid3C3，所述第三分子标记物用于从第一分子标记物的筛余水稻材料中检测并筛选出抗稻瘟病基因Pid3的1874位置出现变异位点的水稻材料。

2.根据权利要求1所述的抗稻瘟病基因Pid3的分子标记物组合，其特征在于，

所述第一分子标记物Pid3C1包括引物Pid3C1F和引物Pid3C1R，其序列分别为：

引物Pid3C1F:ATGATTCATCTTACCCGTCTTGAGATC

引物Pid3C1R:GTAATCCCTCAAGATTAAGGAATGC

所述第二分子标记物Pid3C2包括引物Pid3C2F和引物Pid3C2R，其序列分别为：

Pid3C2F:GTCTGTTTTGGATCTAACTGATACTT

Pid3C2R:GCTTTCGAAGTTACAATAAGATGTG

所述第三分子标记物Pid3C3包括引物Pid3C3F和引物Pid3C3R，其序列分别为：

Pid3C3F:AAGTTGTTGTCTGTTTTGGA

Pid3C3R:TGACTACTGTCTGCCTGGAT。

3.一种抗稻瘟病基因Pid3的等位基因的筛选方法，其特征在于，利用权利要求1或2所述抗稻瘟病基因Pid3的分子标记物组合对抗稻瘟病基因Pid3的等位基因进行筛选，包括以下步骤：

1)、利用第一分子标记物Pid3C1或第二分子标记物Pid3C2对水稻材料进行PCR扩增，PCR扩增产物进行电泳检测，将呈阳性的水稻材料进行酶切，筛选出能酶切的水稻材料，得到在抗稻瘟病基因Pid3的相应位置出现提前终止位点的水稻材料；

2)、从抗稻瘟病基因Pid3的分子标记物组合中选择不同于步骤1)中的分子标记物，对步骤1)的筛余水稻材料中进行PCR扩增，PCR扩增产物进行电泳检测，将呈阳性的水稻材料进行酶切，筛选出能酶切的水稻材料，得到抗稻瘟病基因Pid3的相应位置出现提前终止位点或变异位点的水稻材料；

3)、从抗稻瘟病基因Pid3的分子标记物组合中选择剩余的分子标记物，对步骤2)的筛余水稻材料中进行PCR扩增，PCR扩增产物进行电泳检测，将呈阳性的水稻材料进行酶切，筛选出能酶切的水稻材料，得到抗稻瘟病基因Pid3的相应位置出现提前终止位点或变异位点的水稻材料；

其中，利用第一分子标记物Pid3C1对水稻材料进行扩增的步骤在第三分子标记物Pid3C3对水稻材料扩增的步骤之前。

4.根据权利要求3所述的抗稻瘟病基因Pid3的等位基因的筛选方法，其特征在于，在所述步骤3)之后还包括以下步骤：

利用第四分子标记物Pid3对步骤3)的筛余水稻材料中进行PCR扩增，PCR扩增产物进行电泳检测，将呈阳性的水稻材料利用引物C1、C2、C3、C4进行测序。

其中：所述第四分子标记物Pid3包括引物Pid3F和引物Pid3R，其序列分别为：

Pid3F:CCTGCGTTTTATGAAAGGGGTGAA

Pid3R:GAACGACAAGTGCGACATGATTG

所述引物C1、C2、C3、C4的序列分别为：

C1：AGTAACACCCAAGGATAGGATAG

C2:GTATTGAAAGTAAAATTGAAC

C3：CTCACAATGGCAACTTCGCACC

C4：CCAGCCTCATTTCTCTTCACCA。

5.根据权利要求4所述的抗稻瘟病基因Pid3的等位基因的筛选方法，其特征在于，

第一分子标记物Pid3C1的PCR扩增产物的酶切所用酶为限制性内切酶BglII；

第二分子标记物Pid3C2的PCR扩增产物的酶切所用酶为限制性内切酶AflII；

第三分子标记物Pid3C3的PCR扩增产物的酶切所用酶为限制性内切酶ApoI。