CN105176994A - 稻瘟病抗性基因Pi9功能特异性分子标记Pi9FNP及方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明是一种稻瘟病抗性基因Pi9基因特异性分子标记Pi9FNP，通过引物对SEQ？ID？NO.1和SEQ？ID？NO.2从水稻基因组DNA中扩增出的核苷酸序列I，用限制性内切酶Hae？II对前述核苷酸片段I进行酶切后，所获得的与非稻瘟病抗性基因Pi9呈特异性带型的核苷酸片段II。本发明还公开了稻瘟病抗性基因Pi9特异性分子标记Pi9FNP的检测方法与用途。本发明提供的分子标记特异性高，能明显地将Pi9与存在于该基因组区域内非Pi9基因进行区分。本发明提供的分子标记在实际应用中，只需PCR结合酶切，成本低、通量高、加上特异性高(即准确度高)，特别适用于生产实践中。

Description

稻瘟病抗性基因Pi9功能特异性分子标记Pi9FNP及方法与应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，特别涉及一种稻瘟病抗性基因Pi9功能特异性分子标记Pi9FNP及其方法与应用。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，约有一半以上的人口以稻米为主食。由稻瘟病菌(Magnapothe oryzae)引起的稻瘟病害是对水稻生产危害最严重的病害之一，几乎每年都会造成严重的粮食损失。长期的生产实践表明，选育与利用抗病品种是防治稻瘟病最为安全有效的方法。况且由于稻瘟病生理小种致病性变异频繁，导致单一抗性品种的抗性会在种植后的35年时间里逐渐丧失，因此，挖掘和合理利用广谱抗性基因是获得持久、广谱抗病品种的重要途径。常规抗性基因分析方法需要大量的接种鉴定、抗性遗传及基因等位性分析工作，并且由于不同抗性基因在抗谱上有一定的重叠性，因此常规接种鉴定方法不足以准确、真正地反映出水稻品种的基因型。近一、二十年来，随着水稻抗病分子遗传学的发展，众多的抗性基因得以被精细定位或被克隆，SSR等连锁分子标记的应用大大促进了抗性基因遗传背景的鉴定以及抗病多基因聚合育种的发展(Hittalmaniet al., 2000；Jena and Mackill, 2008)。另一方面，基因克隆的结果显示抗病基因往往是成簇存在，且不同复等位基因之间、功能型序列与非功能型之间序列高度同源，一般的连锁标记仍然难以准确甄别各种材料的功能抗病基因(Zhou et al., 2006; Ashikawa et al., 2008; Yuan et al., 2011; Zhai et al., 2011; Hua et al., 2012)。因此，直接分析功能等位基因本身的序列并开发其特异性的分子标记来对目标基因进行选择，不仅选择可靠性高，还会大大加快了育种步伐。

近年来，有关于Pi2/Pi9等位位点的抗性基因的研究有了很大进展，王倩等 (2012) 发现该位点的基因是东北各地区抗性最好、抗谱最广的抗源。张学堂等（2010）和曾凡松等（2011）在各自的研究中也证实Pi2/Pi9等位基因是当前优良的抗性基因。Zhou等（2007）和Dai等（2010）通过对Pi2/Pi9等位位点在5个栽培种及4个野生种的对比研究表明，该位点的基因组结构高度保守，其所属的NBS-LRR类LRR区受到过强正向选择。目前该抗性位点上至今已至少发现有7个不同抗谱的抗性基因（Liu et al. 2010; Zhu er al. 2012），并且有至少5个抗性基因的研究比较清楚，它们分别为Pi2、Piz-t、Pi9、Pi-gm和Pi-50(t) (Qu et al.2006; Zhou et al.2006; Deng et a1.2006; Zhu et al.2012), 其中Pi2和Piz-t在氨基酸水平上只存在着8个氨基酸残基的差异，二者与Pi9相比，氨基酸序列一致性分别都高达96% (Qu et al., 2006; Zhou et al.，2006)。Pi9来源于野生稻，能抵抗来自13个国家和地区的43个稻瘟病生理小种的侵染(Liu et al. 2002)，国际水稻所用超过100个来自菲律宾的稻瘟病生理小种对携带有抗性基因Pi9的水稻品种75-1-127进行接种鉴定，并没有发现亲和菌株(Qu et al. 2006)。已有研究开发出一些与Pi9连锁的基于Pi9基因的功能标记和基于PCR技术的分子标记 (Liu et al. 2002 ；殷得所等, 2011), 用于分子标记辅助选择(MAS)育种或品种鉴定工作。然而，前者由于为显性标记，不能鉴别分离世代材料的阳性单株基因型是否纯合; 后者与目标基因存在着一定的物理距离，因此，在减数分裂过程中存在着与目标基因发生交换的风险，在抗性育种工作中容易发生错选或漏选的情况。为了能更准确有效地将稻瘟病广谱抗性基因Pi9应用到水稻抗性育种工作中，将两者的优势结合起来，开发出准确有效的Pi9功能特异性分子标记显得尤为重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的稻瘟病抗性基因Pi9基因功能特异性分子标记Pi9FNP。

本发明的另一发明目的在于提供所述的稻瘟病抗性基因Pi9基因特异性分子标记Pi9FNP的检测方法。

本发明的再一发明目的在于提供所述的稻瘟病抗性基因Pi9基因特异性分子标记Pi9FNP的应用。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种稻瘟病抗性基因Pi9基因特异性分子标记Pi9FNP，其特点是：通过引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2从水稻基因组DNA中扩增出的核苷酸序列I，用限制性内切酶Hae II对前述核苷酸片段I进行酶切后，所获得的与非稻瘟病抗性基因Pi9呈特异性带型的核苷酸片段II；

SEQ ID NO.1（5’ -3’）: CGAATTGTAAATAAATGTGGTC；

SEQ ID NO.2（5’ -3’）： CATAGAATTTCTCCCATTCTGGCGC；

所述的核苷酸片段I的序列如下，其中下划线处是Pi9特异碱：基:CGAATTGTAAATAAATGTGGTCGTCTACCATTAGCAATACTTACAATAGGAGCTGTGCTTGCAACTAAACA T GTGTCAGAATGGGAGAAATTCTATG

所述的核苷酸片段II的序列如下：

CGAATTGTAAATAAATG TGGTCGTCTA CCATTAGCAA TACTTACAAT AGGAGCTGTG CTTGCAACTAAACAGGTGTC AGAATGGGAGAAATTCTATG。

以上所述的本发明稻瘟病抗性基因Pi9基因特异性分子标记Pi9FNP技术方案中，进一步优选的技术方案是：其所涉及的水稻品种为选自抗性品种IRBL9-W(Pi9)、C101A51 (Pi2)、抗性品种 IRBLzt-T(Piz-t)、抗性品种谷梅4号(Pigm)、感病品种日本晴(Nip)、感病品种LTH、感病品种9311。

以上所述的本发明稻瘟病抗性基因Pi9基因特异性分子标记Pi9FNP技术方案中，进一步优选的技术方案是：所述的与稻瘟病抗性基因Pi9呈特异性带型的核苷酸片段II具体如下：用限制性内切酶Hae II酶切核苷酸片段I后，得到分子量大小为97bp核苷酸片段；而非稻瘟病基因Pi9则被切成分别为72bp和 25bp的核苷酸片段。

本发明所要解决的另一个技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明还公开了一种如以上技术方案中任何一项所述的稻瘟病抗性基因Pi9特异性分子标记Pi9FNP的检测方法，其特点是：其步骤如下:

（1）通过常规PCR法扩增，获得多个Pi9等位位点抗性基因和非抗性基因的DNA序列；

（2）将步骤（1）所得的序列对比，筛查Pi9特异的、能区别于该位点其他稻瘟病等位抗性基因的特异性单碱基SNP差异位点；

（3）利用步骤（2）获得的SNP信息，根据dCAPS标记的设计原理，在所述SNP位点处设计带有错配碱基的基因特异性下游引物，下划线是引入的错配碱基，在该SNP位点下游50100bp处设计基因特异性上游引物，引物对碱基序列如下:

SEQ ID NO.1（5’ -3’）: CGAATTGTAAATAAATGTGGTC；

SEQ ID NO.2（5’ -3’）： CATAGAATTTCTCCCATTCTGGCGC；

（4）以携带有稻瘟病抗性基因Pi9的稻瘟病抗性品种的总DNA为模板，进行PCR扩增，所获得的PCR产物经限制性内切酶Hae II酶切后，进行电泳检测的DNA片段，未被酶切开的即为稻瘟病抗性基因Pi9基因特异性分子标记Pi9FNP。

以上所述的本发明稻瘟病抗性基因Pi9特异性分子标记Pi9FNP的检测方法，其进一步优选的技术方案是：步骤（3）所述引物是根据dCAPS标记原理，在SNP处设计带有错配碱基的功能特异性下游引物SEQ ID NO.2，在SNP上游50-100bp处设计功能特异性上游引物SEQ ID NO.1。

以上所述的本发明稻瘟病抗性基因Pi9特异性分子标记Pi9FNP的检测方法，其进一步优选的技术方案是：步骤（4）中所述的PCR的反应体系如下：

10 x PCR buffer( Mg²⁺Plus): 2.5μl

dNTPs(2.5mM each): 2.0μl

SEQ ID NO.1 (10 μM) :1μl

SEQ ID NO.2 (10 μM): 1μl

TaKaRa Taq^TM(5 U/μl) : 0.2μl

DNA模板（＜0.2μg/μl): 1μl

ddH₂O 补至25μl；

所述的PCR的反应条件如下：预变性94℃5分钟；94℃30秒、55℃30秒、72℃20秒，扩增35个循环；72℃7分钟；10℃保存。

本发明所述的一种稻瘟病抗性基因Pi9特异性分子标记Pi9FNP的应用，包括在水稻种质资源中快速、直接地鉴定该抗性基因，以及在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种以及转基因育种中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果主要体现在：

(1) 本发明提供的分子标记特异性高: Pi9所在的基因组区域存在着包括Pi9在内的6个具有抗性基因特征的候选基因，这些候选基因在序列上高度同源，相互之间在核苷酸水平上的序列一致性范围为71.8%98.6% (Qu et al., 2006)；此外，Pi9与该位点上非功能基因的序列也高度同源(Zhu et al., 2012)。本发明提供的Pi9特异性分子标记Pi9FNP能明显地将Pi9与存在于该基因组区域内非Pi9基因进行区分。

(2) 本发明提供的分子标记在实际应用中，低成本、高通量: 目前, 检测SNP的方法有测序法、荧光检测法、DNA芯片、质谱检测法等，而这些方法大部分成本高，效率低。本发明提供的分子标记只需PCR结合酶切，成本低、通量高、加上特异性高(即准确度高)，特别适用于生产实践中。

(3)本发明是第一个针对Pi9基因内部功能区域所开发的Pi9基因功能特异性Pi9FNP标记。本发明能通过电泳检测的方法成功地将Pi9与在该位点上的其它基因区分开。本发明所提供的Pi9特异性分子标记Pi9FNP是一个共显性标记，在实际应用过程中其可靠性及准确性优于显性标记。本发明可应用于Pi9转基因鉴定，基因聚合以及基于MAS技术的水稻抗性育种工作中。该标记存在于Pi9基因编码区，因此对Pi9的准确性筛选理论值可达100%，这样的筛选能力优于已报道的与Pi9连锁的分子标记。

因此，本发明所提供的稻瘟病抗性基因Pi9基因功能特异性分子标记具有重要的应用价值，能够得到广泛的应用，对降低劳动成本，提高育种工作效率起到积极重要的作用。

附图说明

图1是具有功能特异性SNP的水稻稻瘟病抗性基因Pi9与Pi2/9位点等位基因的序列对比图；

图2是Pi9功能特异性分子标记Pi9FNP在10个水稻品种中的验证结果图，其中:泳道M为DNA ladder,泳道I21的DNA模板依次为抗性基因供体品种IRBL9-W(Pi9) 、C101A51 (Pi2)、IRBLzt-T（Piz-t）、IR65482-4-136-2-2（Pi40）、二八占（Pi50），IRBLz-Fu（Piz）、谷梅2号（Pi26）、谷梅4号（Pigm）、感病品种9311、感病品种日本晴；

图3为抗性基因Pi9基因功能特异性分子标记在水稻品种中的检测应用结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1，一种稻瘟病抗性基因Pi9基因特异性分子标记Pi9FNP：通过引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2从水稻基因组DNA中扩增出的核苷酸序列I，用限制性内切酶Hae II对前述核苷酸片段I进行酶切后，所获得的与非稻瘟病抗性基因Pi9呈特异性带型的核苷酸片段II；

SEQ ID NO.1（5’ -3’）: CGAATTGTAAATAAATGTGGTC；

SEQ ID NO.2（5’ -3’）： CATAGAATTTCTCCCATTCTGGCGC；

所述的核苷酸片段I的序列如下，其中下划线处是Pi9特异碱：基:CGAATTGTAAATAAATGTGGTCGTCTACCATTAGCAATACTTACAATAGGAGCTGTGCTTGCAACTAAACA T GTGTCAGAATGGGAGAAATTCTATG

所述的核苷酸片段II的序列如下：

CGAATTGTAAATAAATG TGGTCGTCTA CCATTAGCAA TACTTACAAT AGGAGCTGTG CTTGCAACTAAACAGGTGTC AGAATGGGAGAAATTCTATG。

所述的稻瘟病抗性基因Pi9特异性分子标记Pi9FNP，可以在水稻种质资源中快速、直接地鉴定该抗性基因，以及在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种以及转基因育种中的应用。

实施例2，实施例1所述的一种稻瘟病抗性基因Pi9基因特异性分子标记Pi9FNP中：其所涉及的水稻品种为选自抗性品种IRBL9-W(Pi9)、C101A51 (Pi2)、抗性品种 IRBLzt-T(Piz-t)、抗性品种谷梅4号(Pigm)、感病品种日本晴(Nip)、感病品种LTH、感病品种9311。

实施例3，实施例1或2所述的一种稻瘟病抗性基因Pi9基因特异性分子标记Pi9FNP中：所述的与稻瘟病抗性基因Pi9呈特异性带型的核苷酸片段II具体如下:用限制性内切酶Hae II酶切核苷酸片段I后，得到分子量大小为97bp核苷酸片段；而非稻瘟病基因Pi9则被切成分别为72bp和 25bp的核苷酸片段。

实施例4，一种如实施例1－3中任何一项所述的稻瘟病抗性基因Pi9特异性分子标记Pi9FNP的检测方法，其步骤如下:

（1）通过常规PCR法扩增，获得多个Pi9等位位点抗性基因和非抗性基因的DNA序列；

（2）将步骤（1）所得的序列对比，筛查Pi9特异的、能区别于该位点其他稻瘟病等位抗性基因的特异性单碱基SNP差异位点；

（3）利用步骤（2）获得的SNP信息，根据dCAPS标记的设计原理，在所述SNP位点处设计带有错配碱基的基因特异性下游引物，下划线是引入的错配碱基，在该SNP位点下游50100bp处设计基因特异性上游引物，引物对碱基序列如下:

SEQ ID NO.1（5’ -3’）: CGAATTGTAAATAAATGTGGTC；

SEQ ID NO.2（5’ -3’）： CATAGAATTTCTCCCATTCTGGCGC；

（4）以携带有稻瘟病抗性基因Pi9的稻瘟病抗性品种的总DNA为模板，进行PCR扩增，所获得的PCR产物经限制性内切酶Hae II酶切后，进行电泳检测的DNA片段，未被酶切开的即为稻瘟病抗性基因Pi9基因特异性分子标记Pi9FNP。

实施例5，实施例4所述的稻瘟病抗性基因Pi9特异性分子标记Pi9FNP的检测方法中：步骤（3）所述引物是根据dCAPS标记原理，在SNP处设计带有错配碱基的功能特异性下游引物SEQ ID NO.2，在SNP上游50-100bp处设计功能特异性上游引物SEQ ID NO.1。

实施例6，实施例4或5所述的稻瘟病抗性基因Pi9特异性分子标记Pi9FNP的检测方法：步骤（4）中所述的PCR的反应体系如下：

10 x PCR buffer( Mg²⁺Plus): 2.5μl

dNTPs(2.5mM each): 2.0μl

SEQ ID NO.1 (10 μM) :1μl

SEQ ID NO.2 (10 μM): 1μl

TaKaRa Taq^TM(5 U/μl) : 0.2μl

DNA模板（＜0.2μg/μl): 1μl

ddH₂O 补至25μl；

所述的PCR的反应条件如下：预变性94℃5分钟；94℃30秒、55℃30秒、72℃20秒，扩增35个循环；72℃7分钟；10℃保存。

实施例7: Pi9功能特异性分子标记及其引物设计与检测实验：

(I) Pi9特异性单碱基差异(SNP)位点的分析:

从公共数据库中下载得到已经公开发表的Pi9及Pi2水稻供体品种的部分基因组序列(Genebank收录号分别为: DQ285630 ,DQ352453)以及测序品种日本晴(Nipponbare) 、9311相对应区域的基因组序列，针对Pi9转录区进行序列比对，筛查Pi9特异的、能区别于该位点其他稻瘟病等位抗性基因的功能特异性差异位点。具有基因特异性差异位点的水稻稻瘟病抗性基因Pi9与C101A51 (Pi2)、Nip-Pi9的 多序列比对结果如下所示:

IRBL9-W-Pi9: ；

C101A51-Pi2: ；

Nip-Pi9: ；

其中，加黑加粗(方框)的核苷酸即为鉴定到的Pi9基因特异性单碱基差异(SNP)；

(2)设计引物:

根据dCAPS标记的设计原理，在所述SNP位点处设计带有错配碱基的基因特异性下游引物，在该SNP位点上游50-100bp处设计基因特异性上游引物，引物对碱基序列如下所示:

SEQ ID NO.1（5’ -3’）: CGAATTGTAAATAAATGTGGTC；

SEQ ID NO.2（5’ -3’）： CATAGAATTTCTCCCATTCTGGCGC；

利用SEQ ID NO.1和 SEQ ID NO.2引物对对携有Pi9基因以及其他等位基因的品种DNA模板进行扩增，扩增出的核苷酸片断即为Pi9FNP。

Pi9FNP的PCR扩增反应体系如下：

10 x PCR buffer( Mg²⁺Plus): 2.5μl

dNTPs(2.5mM each): 2.0μl

SEQ ID NO.1 (10 μM) :1μl

SEQ ID NO.2 (10 μM): 1μl

TaKaRa Taq^TM(5 U/μl) : 0.2μl

DNA模板（＜0.2μg/μl): 1μl

ddH₂O 补至25μl

Pi9FNP的PCR的反应条件如下：预变性94℃5分钟；94℃30秒、55℃30秒、72℃20秒，扩增35个循环；72℃7分钟；10℃保存。

PCR反应结束后，利用限制性内切酶Hae II对所获得的PCR产物进行酶切，反应体系如下：

10 X buffer: 1μl

PCR产物：10μl

Hae II：0.5μl

ddH₂O 补至20μl

在37℃条件下酶切2小时后,取适量酶切样品在3%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测,电泳条件是80V，40分钟。

实施例8：抗性基因Pi9功能特异性分子标记在鉴别不同稻瘟病抗性基因中的应用实验：

选择携带有Pi9基因以及Pi2/9基因族等位基因的代表品种如下:

水稻品种 IRBL9-W，为 Pi9 供体品种(参见 “Tsunematsu et al.，2000. Development of monogenic lines of rice for blast resistance. Breed Sci j 50:229-234”中公开)，为阳性对照；

水稻品种 IRBLzt-T，为 Piz-t 供体品种(参见 “Zhou et al., 2006. The eight amino-acid differences within three leucine-rich repeats between Pi2 and Piz-t resistance proteins determine the resistance specificity to Magnaporthe grisea. MPMI 19:1216-1228” 中公开)；

水稻品种IR65482-4-136-2-2，为Pi40供体品种(参见“ Jeung et al.，2007. A novel gene, Pi40(t), linked to the DNA markers derived from NBS-LRR motifs confers broad spectrum of blast resistance in rice. Theor Appl Genet, 115:1167-73” 中公开)

水稻品种 C101A51，为 Pi2 供体品种 (参见“Inukai et al.，1994. Allelism of blast resistance genes in near-1sogenic lines of rice. Phytopathology, 84:1278-1283” 中公开)；

水稻品种 IRBLz-Fu,为 Piz 供体品种(参见“Kobayashi et al., 2007.Development of new sets of international standard differential varieties for blast resistance in rice (Oryza saliva L.).JARQ, 41:31-37”中公开)；

水稻品种二八占，为Pi50供体品种(参见“Zhu et al., 2012.The identification of Pi50 (t), a new member of the rice blast resistance Pi2/Pi9 multigene family. Theor Appl Genet, 124:1295 - 1304” 中公开)；

水稻品种谷梅2号，为Pi26供体品种(参见“Wu et al., 2005.Genetic control of rice blast resistance in the durably resistant cultivar Gumei2 against multiple isolates.Theor Appl Genet, 111: 50 - 56” 中公开)；

水稻品种谷梅4号，为Pigm供体品种(参见“Deng et al. 2006.Genetic characterization and fine mapping of the blast resistance locus Pigm(t) tightly linked to Pi2 and Pi9 in a broad-spectrum resistant Chinese variety. Theor Appl Genet, 113:705 - 713” 中公开)；

感病对照品种:日本晴；日本晴是日本选育的一个品种，(参见http://www.ricedata.cn/variety/varis/602979.htm)。

感病对照品种:丽江新团黑谷(LTH，参见“凌忠专等2001.水稻品种江新团黑谷普感特性的研究和利用.中国农业科学，34:1-4”中公开)。

利用实施例7中描述的Pi9FNP的PCR扩增反应体系和反应条件，对抗性基因Pi9功能特异性的分子标记进行PCR扩增、酶切及电泳检测。电泳结果如图2所示，其中，97bp的代表含有Pi9基因，72bp为不含有Pi9基因。

其中，图1的泳道I为Pi9供体品种水稻品种IRBL9-W基因组为模板PCR得到的片段再经酶切得到核酸片段，呈现的是与稻瘟病抗性基因Pi9呈特异性带型，即泳道I为Pi9基因特异性分子标记Pi9SNP。图1的结果显示，Pi9基因特异性分子标记既能区分抗感等位基因，又能区分Pi2/Pi9位点上所鉴定到的其它抗性基因。也就是说，凡是携带有Pi9的水稻品种，其PCR扩增产物不能被Hae II酶切， 电泳检测条带以97bp呈现，而在Pi2/9位点上所定位的其它稻瘟病抗性基因以及感病等位基因能被Hae II识别并酶切，电泳检测条带以72bp 呈现。

实施例9：抗性基因Pi9基因功能特异性分子标记在水稻品种中的检测应用

选择12个我国代表性的水稻品种，依次为: 02428，9311，福伊B，谷丰B，广恢128，华占，P143，连粳7号，六十早，明恢63，明恢86，汕恢316。前述品种均在国家水稻数据中心公开。

分别提取其基因组DNA，并以此为模板，按照实施例7的方法，进行PCR扩增，扩增产物进行回收，连接到T载体上后测序，结果如图3。可见，试验结果与设计分析的相吻合，说明抗性基因Pi9基因特异性分子标记可在鉴别Pi9基因与其他稻瘟病抗性基因，包括Pi2/9基因簇等位基因等方面得到应用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 连云港市农业科学院

<120> 稻瘟病抗性基因Pi9功能特异性分子标记Pi9FNP及方法与应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

〈210〉1

〈211〉22

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉引物

〈400〉1

cgaattgtaa ataaatgtgg tc 22

〈210〉2

〈211〉25

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉引物

〈400〉2

catagaattt ctcccattct ggcgc 25

〈210〉3

〈211〉97

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉核苷酸片段I

〈400〉3

cgaattgtaa ataaatgtgg tcgtctacca ttagcaatac ttacaatagg agctgtgctt 60

gcaactaaac atgtgtcaga atgggagaaa ttctatg 97

〈210〉4

〈211〉97

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉核苷酸片段II

〈400〉4

cgaattgtaa ataaatgtgg tcgtctacca ttagcaatac ttacaatagg agctgtgctt 60

gcaactaaac aggtgtcaga atgggagaaa ttctatg 97

Claims (7)

1.一种稻瘟病抗性基因Pi9基因特异性分子标记Pi9FNP，其特征在于：通过引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2从水稻基因组DNA中扩增出的核苷酸序列I，用限制性内切酶Hae II对前述核苷酸片段I进行酶切后，所获得的与非稻瘟病抗性基因Pi9呈特异性带型的核苷酸片段II；

SEQ ID NO.1（5’ -3’）: CGAATTGTAAATAAATGTGGTC；

SEQ ID NO.2（5’ -3’）： CATAGAATTTCTCCCATTCTGGCGC；

所述的核苷酸片段I的序列如下，其中下划线处是Pi9特异碱：基:CGAATTGTAAATAAATGTGGTCGTCTACCATTAGCAATACTTACAATAGGAGCTGTGCTTGCAACTAAACA T GTGTCAGAATGGGAGAAATTCTATG

所述的核苷酸片段II的序列如下：

CGAATTGTAAATAAATG TGGTCGTCTA CCATTAGCAA TACTTACAAT AGGAGCTGTG CTTGCAACTAAACAGGTGTC AGAATGGGAGAAATTCTATG。

2.根据权利要求1所述的一种稻瘟病抗性基因Pi9基因特异性分子标记Pi9FNP，其特征在于：其所涉及的水稻品种为选自抗性品种IRBL9-W(Pi9)、C101A51 (Pi2)、抗性品种 IRBLzt-T(Piz-t)、抗性品种谷梅4号(Pigm)、感病品种日本晴(Nip)、感病品种LTH、感病品种9311。

3.根据权利要求1所述的一种稻瘟病抗性基因Pi9基因特异性分子标记Pi9FNP，其特征在于：所述的与稻瘟病抗性基因Pi9呈特异性带型的核苷酸片段II具体如下:用限制性内切酶Hae II酶切核苷酸片段I后，得到分子量大小为97bp核苷酸片段；而非稻瘟病基因Pi9则被切成分别为72bp和 25bp的核苷酸片段。

4.一种如权利要求1－3任何一项所述的稻瘟病抗性基因Pi9特异性分子标记Pi9FNP的检测方法，其特征在于：其步骤如下:

（1）通过常规PCR法扩增，获得多个Pi9等位位点抗性基因和非抗性基因的DNA序列；

（2）将步骤（1）所得的序列对比，筛查Pi9特异的、能区别于该位点其他稻瘟病等位抗性基因的特异性单碱基SNP差异位点；

（3）利用步骤（2）获得的SNP信息，根据dCAPS标记的设计原理，在所述SNP位点处设计带有错配碱基的基因特异性下游引物，下划线是引入的错配碱基，在该SNP位点下游50〜100bp处设计基因特异性上游引物，引物对碱基序列如下:

SEQ ID NO.1（5’ -3’）: CGAATTGTAAATAAATGTGGTC；

SEQ ID NO.2（5’ -3’）： CATAGAATTTCTCCCATTCTGGCGC；

（4）以携带有稻瘟病抗性基因Pi9的稻瘟病抗性品种的总DNA为模板，进行PCR扩增，所获得的PCR产物经限制性内切酶Hae II酶切后，进行电泳检测的DNA片段，未被酶切开的即为稻瘟病抗性基因Pi9基因特异性分子标记Pi9FNP。

5.根据权利要求4所述的稻瘟病抗性基因Pi9特异性分子标记Pi9FNP的检测方法，其特征在于：步骤（3）所述引物是根据dCAPS标记原理，在SNP处设计带有错配碱基的功能特异性下游引物SEQ ID NO.2，在SNP上游50-100bp处设计功能特异性上游引物SEQ ID NO.1。

6.根据权利要求4所述的稻瘟病抗性基因Pi9特异性分子标记Pi9FNP的检测方法，其特征在于：步骤（4）中所述的PCR的反应体系如下：

10 x PCR buffer( Mg²⁺Plus): 2.5μl

dNTPs(2.5mM each): 2.0μl

SEQ ID NO.1 (10 μM) :1μl

SEQ ID NO.2 (10 μM): 1μl

TaKaRa Taq^TM(5 U/μl) : 0.2μl

DNA模板（＜0.2μg/μl): 1μl

ddH₂O 补至25μl；

所述的PCR的反应条件如下：预变性94℃5分钟；94℃30秒、55℃30秒、72℃20秒，扩增35个循环；72℃7分钟；10℃保存。

7.权利要求1所述的一种稻瘟病抗性基因Pi9特异性分子标记Pi9FNP的应用，包括在水稻种质资源中快速、直接地鉴定该抗性基因，以及在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种以及转基因育种中的应用。