CN105779622B - 一种与水稻小种专化性抗稻瘟病基因紧密连锁的分子标记及其应用 - Google Patents

一种与水稻小种专化性抗稻瘟病基因紧密连锁的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于作物分子遗传育种学领域，公开了一种与水稻小种专化性抗稻瘟病基因紧密连锁的分子标记及其应用，包括如下步骤：(1)取水稻样品，提取水稻样品基因组DNA；(2)利用RM24019和RM24048中的任意一对分子标记的引物，对水稻样品基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物进行电泳检测，如果扩增出对应大小的分子标记DNA片段，标志着Pi‑hk2(t)基因的存在。通过本发明提供的水稻小种专化性抗稻瘟病基因Pi‑hk2的分子标记可以检测水稻黑壳子粳及其杂交、回交和复交后代是否含有该基因，可预测其对稻瘟病的抗性水平，大大提高水稻抗稻瘟病材料的选择效率，加快抗病育种进程。

Description

一种与水稻小种专化性抗稻瘟病基因紧密连锁的分子标记及 其应用
技术领域
本发明属于农作物分子遗传育种学领域，涉及一种与水稻小种专化性抗稻瘟病基因紧密连锁的分子标记及其应用。
背景技术
水稻是我国最重要的粮食作物之一，对保障我国粮食安全和国民经济增长具有重要意义。稻瘟病是我国水稻生产上最严重的病害，具有传播快、发生广、危害重等特点(凌忠专等，1989，我国北方稻区稻瘟病菌生理小种研究.中国农业科学，22(3):7-13)。进一步发掘和利用我国抗稻瘟病基因资源，培育和种植抗病品种是控制稻瘟病发生和减少水稻产量损失最经济有效的途径。
迄今，各国科学家从水稻中鉴定了100多个抗稻瘟病基因，其中有24个抗病基因被成功克隆。这些抗病基因可以引入或聚合到现代品种，选育出高抗、广谱的品种。但传统育种方法费时、费力、表型鉴定困难、育种效率低，由于抗病基因多为显性、基因间往往存在上位性互作，抗病基因聚合更为困难。通过分子标记辅助育种可以有效解决这一问题。
我国太湖流域稻作历史悠久，被认为是粳稻起源地之一，蕴藏有丰富的稻种资源，李培富等(1999，两个太湖流域粳稻地方品种抗稻瘟病的遗传研究.中国水稻科学，13(1):11-14)报道我国太湖流域粳稻地方品种黑壳子粳对稻瘟病菌的抗性表现广谱和高抗的特点。从我国特有的种质资源中鉴定和克隆抗稻瘟病基因，可以获得具有自主知识产权的基因，对提高我国水稻抗稻瘟病育种水平，尤其是粳稻的抗稻瘟病育种有重大意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种一种用于检测与水稻小种专化性抗稻瘟病基因紧密连锁的分子标记的引物对或引物对组及其应用。
本发明的另一目的在于提供一种用于检测或辅助检测水稻小种专化性抗稻瘟病基因的试剂盒及其应用。
本发明的又一目的在于提供一种检测水稻小种专化性抗稻瘟病基因或选择水稻抗稻瘟病品种的分子标记方法及其应用。
本发明主要提供水稻品种黑壳子粳小种专化性抗稻瘟病基因Pi-hk2的分子标记方法。通过检测与抗病基因Pi-hk2紧密连锁的分子标记，可以确定有无抗病基因Pi-hk2，并预测水稻植株的稻瘟病抗性，加快抗稻瘟病水稻新品种的选育进度。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种用于检测与水稻小种专化性抗稻瘟病基因紧密连锁的分子标记的引物对或引物对组，所述的引物对为引物对A或引物对B；所述的引物对组由引物对A和引物对B组成；所述引物对A为由如SEQ ID NO.1所示的核苷酸片段和如SEQ ID NO.2所示的核苷酸片段组成的引物对；所述引物对B为由如SEQ ID NO.3所示的核苷酸片段和如SEQ ID NO.4所示的核苷酸片段组成的引物对。
表1为引物对及其所对应的分子标记
上述的引物对或引物对组在制备用于检测或辅助检测水稻小种专化性抗稻瘟病基因的试剂盒中的应用。
一种用于检测或辅助检测水稻小种专化性抗稻瘟病基因的试剂盒，该试剂盒包含有上述的引物对或引物对组。
上述的用于检测或辅助检测水稻小种专化性抗稻瘟病基因的试剂盒还包含有PCR技术常用的试剂。
上述的引物对、引物对组及试剂盒在检测或辅助检测水稻小种专化性抗稻瘟病基因或选择水稻抗稻瘟病品种中的应用。
一种检测水稻小种专化性抗稻瘟病基因或选择水稻抗稻瘟病品种的分子标记方法，包括以下步骤：
(1)提取待测水稻样品基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，采用上述的引物对或引物对组进行PCR扩增，获得PCR产物；
(3)检测PCR产物如果扩增出大小为84bp或/和158bp的分子标记片段，标志水稻样品中小种专化性抗稻瘟病基因Pi-hk2存在，则待测的水稻样品为抗稻瘟病品种或候选的抗稻瘟病品种。
所述PCR扩增的反应体系为：10×含Mg2+的缓冲液1.0μl，4pmol/μl的所述分子标记引物对1μl，2.5mM dNTPs 0.2μl，5U/μl的Taq酶0.1μl，10ng/μl的水稻样品基因组模板DNA1μl，加水至10μl。
所述PCR扩增的反应程序为：DNA95℃预变性5分钟后；95℃变性40秒，55℃退火40秒，72℃延伸展40秒，循环33次；最后72℃延伸10分钟。
本发明水稻黑壳子粳抗稻瘟病基因Pi-hk2的分子标记方法的具体步骤为：(1)取水稻样品，提取水稻样品基因组DNA；(2)利用与水稻黑壳子粳小种专化性抗稻瘟病基因Pi-hk2紧密连锁的分子标记引物，对所述的水稻样品基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，如果扩增出对应大小的分子标记DNA片段，标志着Pi-hk2基因的存在。
上述的方法在提高水稻抗病品种育种进程中的应用。
本发明的有益效果：
本发明所提供的水稻黑壳子粳小种专化性抗稻瘟病基因的分子标记方法，具有以下优点：
(1)黑壳子粳为太湖流域粳稻地方品种，具有广谱高抗稻瘟病的特征，其主效抗病基因Pi-hk2为一个新的抗病基因，并且具有小种专化性，筛选获得与之紧密连锁的分子标记RM24019和RM24048，为分子标记辅助选择育种和克隆Pi-hk2基因奠定了基础。利用本发明任意一对与水稻黑壳子粳抗稻瘟病基因Pi-hk2紧密连锁的分子标记引物对，进行抗稻瘟病基因Pi-hk2的鉴别，选择效率都达到98.8％以上，利用两对分子标记引物的选择效率达99.98％。
(2)通过本发明分子标记定位的基因位点精确，鉴定方便。由于这些标记与抗病基因Pi-hk2的重组率低(≤1.2％)，通过检测这些与抗病基因Pi-hk2紧密连锁的分子标记，可以确定抗稻瘟病基因Pi-hk2的存在与否，预测水稻植株的稻瘟病抗性，从而快速抗病育种进程。
(3)辅助育种选择目标明确，节约成本。在传统抗病育种方法中，对育种材料的稻瘟病抗性进行表型鉴定，一般在苗期或抽穗期，受接种环境影响较大，表型鉴定的结果可靠性低。因此抗病育种不仅费时，而且难度大，成本高。通过检测抗稻瘟病基因Pi-hk2，可以在苗期取样，提取DNA，利用上述标记就可鉴定出抗稻瘟病的单株，淘汰其它植株，不仅节约生产成本、控制育种群体规模，而且大大提高抗稻瘟病个体的选择效率。
附图说明
图1.水稻抗稻瘟病基因Pi-hk2紧密连锁SSR标记RM24019的8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
其中：M：分子量Marker；P1：黑壳子粳；P2：苏御糯；1、3、5、7、9、10：抗病重组自交系；4、6、8：感病重组自交系。
图2.水稻抗稻瘟病基因Pi-hk2紧密连锁SSR标记24048的8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
其中：M：分子量Marker；P1：黑壳子粳；P2：苏御糯；1、6、7：抗病重组自交系；2、3、4、8、9：感病重组自交系；5、10：杂合体。
具体实施方式
实施例1
(一)材料与方法：
1.李培富等利用抗稻瘟病水稻地方品种黑壳子粳(♀)与感病品种苏御糯(♂)杂交获得F1，自交获得F2分离群体，用于遗传分析，明确黑壳子粳对“2010-9(G1)”菌系的抗性是由一对主效显性基因控制的，进一步将黑壳子粳与12个日本稻瘟病鉴别品种杂交进行等位性测定，结果表明，黑壳子粳对2010-9(G1)菌系的抗性基因与12个鉴别品种所携带的已知抗病基因是不等位的，将该基因命名为Pi-hk2。用20个菌株对黑壳子粳接种，只有接种2010-9(G1)能够检测到Pi-hk2基因，说明该基因为小种专化性抗稻瘟病基因。本发明在此基础上，采用单粒传法构建F2:8重组自交系群体，即两亲本杂交获得F1，自交获得F2，F2随机选取162个单株，单株自交产生株系，连续自交7代，最终构建成包括162个株系的F2:8重组自交系群体。利用该群体进一步将Pi-hk2定位于第11条染色体RM24019和RM24048之间，并与这两个标记紧密连锁，物理距离均为520kb。
2.菌种培养和接种鉴定方法，参照李培富等(中国水稻科学,2007，21：579～584)。
3.DNA提取方法：用SDS法提取分离群体各单株的DNA。
4.紧密连锁分子标记的确定：
(1)标记多态性筛选：以亲本黑壳子粳和苏御糯的DNA为模板，用Gramene网站上公布的水稻SSR标记(http://www.gramene.org)，经PCR反应进行多态性分析。
(2)多态性标记的抗感池筛选:在重组自交系群体中，随机选择10个接种鉴定为抗病表型的家系材料(抗病重组自交系)和10个接种鉴定为感病表型的家系材料(感病重组自交系)，提取DNA后分别混合，形成抗病池和感病池，对多态性标记进行筛选分析其与抗感之间的关系，如果某一标记的抗病池电泳结果和抗病亲本一致，感病池电泳结果和感病亲本一致，则说明该标记可能与抗病基因紧密连锁。
(3)紧密连锁分子标记的验证：将可能与抗病基因紧密连锁的分子标记分别在构成抗感池的10个家系材料中进行验证，如果连锁关系确实存在时，再在所有的家系材料中进行验证，根据连锁的多态性标记与对应的抗感表型，分析标记与基因间的重组频率，计算出标记对抗性的选择效率。
PCR反应体系：体积为10μl，其中10×缓冲液(含Mg2+)1.0μl,分子标记引物对(4pmol/μl)1μl，2.5mM dNTPs 0.2μl,Taq酶(5U/μl)0.1μl,模板DNA(10ng/μl)1μl，加水至10μl。反应程序为：DNA95℃预变性5分钟后，(95℃变性40秒，55℃退火40秒，72℃延伸展40秒)循环33次，最后72℃延伸10分钟。以水稻的基因组DNA为模板，采用表2中的引物对在biometre扩增仪上进行PCR扩增，扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶(100ml聚丙烯酰胺溶液中含7.6克丙烯酰胺和0.4克甲叉双丙烯酰胺)上进行电泳分离，然后在紫外透射仪上照相，记录结果。
(二)结果与分析：
研究结果发现，SSR标记RM24019、RM24048与抗病基因Pi-hk2紧密连锁(图1，图2)，在亲本中的扩增条带大小如表2所示。在重组自交系162个家系材料中(324个配子中)，选择效率计算方法如下
SSR标记RM24019与抗病基因Pi-hk2之间出现2个交换型配子，重组率仅为1.2％，该标记对抗性的选择效率达98.8％；
SSR标记RM24048与抗病基因Pi-hk2之间出现2个交换型配子，重组率仅为1.2％，该标记对抗性的选择效率达98.8％；
SSR标记RM24019和RM24048双标记筛选的选择效率为1-1.2％*1.2％＝99.98％；
通过上述2个分子标记可以高效鉴定抗稻瘟病基因Pi-hk2存在与否，单标记选择效率均达到98.8％，双标记组合的选择效率达99.98％。可用于分子标记辅助选择有效提高水稻抗病品种的育种进程，控制育种群体规模。
表2扩增分子标记的引物对及扩增条带大小
标记 上游引物序列L 下游引物序列R 黑壳子粳片段(bp) 苏御糯片段(bp) 选择效率(％)
RM24019 SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.2 84 87 98.8
RM24048 SEQ ID NO.3 SEQ ID NO.4 158 161 98.8

Claims (9)

1.一种用于检测与水稻小种专化性抗稻瘟病基因紧密连锁的分子标记的引物对或引物对组，其特征在于所述的引物对为引物对A或引物对B；所述的引物对组由引物对A和引物对B组成；所述引物对A为由如SEQ ID NO.1所示的核苷酸片段和如SEQ ID NO.2所示的核苷酸片段组成的引物对；所述引物对B为由如SEQ ID NO.3所示的核苷酸片段和如SEQ IDNO.4所示的核苷酸片段组成的引物对。
2.权利要求1所述的引物对或引物对组在制备用于检测或辅助检测水稻小种专化性抗稻瘟病基因的试剂盒中的应用。
3.一种用于检测或辅助检测水稻小种专化性抗稻瘟病基因的试剂盒，其特征在于该试剂盒包含有权利要求1所述的引物对或引物对组。
4.根据权利要求3所述的用于检测或辅助检测水稻小种专化性抗稻瘟病基因的试剂盒，其特征在于该试剂盒还包含有PCR技术常用的试剂。
5.权利要求1中所述的引物对或引物对组、权利要求3或4中所述的试剂盒在检测或辅助检测水稻小种专化性抗稻瘟病基因或选择水稻抗稻瘟病品种中的应用。
6.一种检测水稻小种专化性抗稻瘟病基因或选择水稻抗稻瘟病品种的分子标记方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)提取待测水稻样品基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的引物对或引物对组进行PCR扩增，获得PCR产物；
(3)检测PCR产物如果扩增出大小为84bp或/和158bp的分子标记片段，标志水稻样品中小种专化性抗稻瘟病基因Pi-hk2存在，则待测的水稻样品为抗稻瘟病品种或候选的抗稻瘟病品种。
7.根据权利要求6所述的检测水稻小种专化性抗稻瘟病基因或选择水稻抗稻瘟病品种的分子标记方法，其特征在于所述PCR扩增的反应体系为：10×含Mg2+的缓冲液1.0μl，4pmol/μl的所述分子标记引物对1μl，2.5mM dNTPs 0.2μl，5U/μl的Taq酶0.1μl，10ng/μl的水稻样品基因组模板DNA 1μl，加水至10μl。
8.根据权利要求6所述的检测水稻小种专化性抗稻瘟病基因或选择水稻抗稻瘟病品种的分子标记方法，其特征在于所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5分钟后；95℃变性40秒，55℃退火40秒，72℃延伸40秒，循环33次；最后72℃延伸10分钟。
9.权利要求6所述的方法在提高水稻抗病品种育种进程中的应用。
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