CN109439790A

CN109439790A - 一种鉴定甜瓜性型InDel分子标记及其引物和应用

Info

Publication number: CN109439790A
Application number: CN201811511522.2A
Authority: CN
Inventors: 王吉明; 李娜; 尚建立; 周丹; 马双武
Original assignee: Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Current assignee: Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Priority date: 2018-12-11
Filing date: 2018-12-11
Publication date: 2019-03-08

Abstract

本发明公开了鉴定甜瓜性型的InDel分子标记及其引物和应用，属于分子检测技术领域。所述InDel分子标记InDel_msPr100位于甜瓜第2号染色体上，大小为127bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，若该序列自5’起第28碱基至第40碱基之间的GACAAATTTGAAC片段缺失，获得如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列，则会引起甜瓜的单性花向两性花的性型改变。所述Indel分子标记InDel_msPr100可直接用于甜瓜性型分子标记辅助育种体系的建立。根据Indel分子标记InDel_msPr100设计的引物扩增可以在苗期快速准确鉴定出甜瓜的性型，为甜瓜性型分子育种提供技术支持，与同类标记技术相比，本发明具有简单准确，不需要酶切等优点。

Description

一种鉴定甜瓜性型InDel分子标记及其引物和应用

技术领域

本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种鉴定甜瓜性型InDel分子标记及其引物和应用。

背景技术

甜瓜(Cucumis melo L.)属葫芦科甜瓜属,是我国重要的经济作物。甜瓜的性型分为7种：雌雄异花同株、雄全同珠、两性花株、雌全同珠、三性花株和全雌系。由于性型多样,成为研究高等植物性别表达的典型材料。甜瓜性别表达的研究对瓜类以及其他作物的育种和栽培具有重大的理论意义和应用价值。现有研究结果表明，甜瓜的性型主要有三个基因调控。Boualem等(2008)利用染色体步移技术克隆到甜瓜a基因,并发现了一个共分离的SNP位点A57V。a基因编码一个乙烯合成酶基因CmACS-7。CmACS-7通过CmACS-7体外酶活性试验验证发现，CmACS-7在雌花发育的两性期抑制雄蕊原基发育。Boualem等(2015)提出的甜瓜与黄瓜的性别决定路径模型中提出，位于路径的上游CmACS11控制雌花发育，位于路径中游的CmWIP1控制雄花发育，位于路径下游的CmACS-7控制单花发育为雌花还是两性花。

根据中国专利文献CN103866005A研究报道，栾非时等开发出了鉴定甜瓜a基因酶切分子标记和鉴定甜瓜g基因的G、g基因的双引物鉴定分子标记，但技术步骤较为繁琐，鉴定效率低且成本较高；中国专文献CN108239675A中，刘莉等开发出鉴定甜瓜单性花和两性花材料的InDel分子标记TJcM02，连锁紧密性和稳定性低。因此，亟待开发一种与甜瓜性型紧密连锁的、易于操作的、鉴定效率高的、成本较低的分子标记，以期可以对性型育种的促进具有重大意义。

发明内容

本发明主要解决现有的甜瓜性型鉴定的CAPS等分子标记技术成本高、操作繁琐等的缺点，提供一种鉴定甜瓜性型InDel分子标记和应用，以期在苗期准确快速地筛选出甜瓜单性花株或两性花株，为甜瓜分子辅助育种选择提供技术基础。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

研究筛选出鉴定甜瓜性型的InDel分子标记，命名为InDel_msPr100，大小为127bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5’-AATGAAAATTTTGGTTTAATGGGAGGAGACAAATTTGAACGACAAATTTTCT TAGTAACTTACGATATGATCACTAACTAATTTATTCTAGGTTGGGGGTTTGAACCTCTCTCAACTTTGTGCTCAT-3’(SEQ IDNO.1)

申请人通过研究，对甜瓜性型性状进行了QTL定位，筛选获得了与之紧密连锁的分子标记，记名为InDel_msPr100。通过测序发现，如果这段序列如SEQ ID NO.1所示，则相应的甜瓜性型表现为单性花株。如果SEQ ID NO.1所示序列自5’起第28碱基至第40碱基之间的GACAAATTTGAAC片段缺失(下双划线部分)，获得大小为114bp如SEQ ID NO.2所示序列，则相应的甜瓜表现为两性花株。

5’-AATGAAAATTTTGGTTTAATGGGAGGAGACAAATTTTCTTAGTAACTTACGA TATGATCACTAACTAATTTATTCTAGGTTGGGGGTTTGAACCTCTCTCAACTTTGTGCTCAT-3’(SEQ ID NO.2)

上述InDel分子标记的筛选方法，包括以下步骤：

(1)通过SLAF-seq测序技术开发的SLAF标记构建了高密度遗传连锁图谱，并对该96株F₂群体进行性型鉴定；

(2)结合高密度遗传图谱和F₂群体性型表型鉴定结果，利用rQTL软件(http://www.rqtl.org/)进行关联分析和QTL初定位，在LG2连锁群上检测到一个与甜瓜性型相关的主效QTL，对应的LOD值为102.21，可解释70.89％的表型变异，置信区间为0-59.31cM，对应物理位置为156183bp-3508508bp(图1)。

(3)结合两个亲本的重测序，在QTL置信区间筛选出≥5bp的InDel。设计出与甜瓜性型相关的主效QTL置信区间InDel引物11对。

(4)利用对应的InDel引物在16QC43(母本)、11C02(父本)、F₁进行多态性筛选，然后利用多态性的InDel引物在F₂群体中进行基因型鉴定。

经过分析筛选出与甜瓜性型基因紧密连锁的InDel分子标记，将该分子标记命名为InDel_msPr100，序列如下：

上游引物F1:5’-AATGAAAATTTTGGTTTAATGGGA-3’，

下游引物R1:5’-AACCTCTCTCAACTTTGTGCTCAT-3’。

提供一种甜瓜性型的鉴定方法，包括以下步骤：

(1)提取甜瓜叶片DNA；

(2)PCR扩增：利用上述InDel分子标记的引物对，对待测样品进行PCR扩增；所述扩增体系为：甜瓜叶片总DNA(100ng/μL)1μL、InDel分子标记上游引物F1(10μM)1μL、InDel分子标记下游引物R1(10μM)1μL、2×Power Taq PCR MasterMix 12.5μL、ddH₂O9.5μL；

所述扩增程序为：94℃、5min；94℃、20s，55℃、1min，72℃、30s，共35个循环；72℃、5min；

(3)对PCR产物进行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳，显影、染色和带型判读。如果出现127bp大小的片段，或包含序列如SEQ ID NO.1所示的片段，则判定待测甜瓜为单性花株；如果仅出现114bp大小的单一片段，或序列如SEQ ID NO.2所示的片段，则判定待测甜瓜为两性花株。

将上述的InDel分子标记或引物对InDel_msPr100在甜瓜性型分子标记辅助选择中应用。

将上述的鉴定方法在甜瓜性型分子标记辅助选择中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：

1.本发明是根据高通量测序所得到的甜瓜基因组数据开发出与性型紧密连锁的InDel分子标记，利用该InDel标记能够在苗期准确快速的鉴定出甜瓜的性型植株。甜瓜性型鉴定的准确率达到98.95％。

经过基因组序列比对可知，该标记与A基因和栾非时等开发的鉴定A基因的CAPS酶切标记区域一致，并在F2群体验证结果(表3)中共分离，说明该标记具有准确性高、检测方便、成本低、不需要酶切等复杂步骤的优点，从而能加快甜瓜性型选择辅助育种进程，具有更高的应用价值。同时，进一步解析了A基因的功能与甜瓜单性花形成有关。

2.本发明的InDel分子标记引物对InDel_msPr100，扩增产物稳定，特异性强，在鉴定过程中灵敏度高，不需要酶切等复杂步骤，不受环境因素的影响，可广泛应用于甜瓜性型的鉴定。

附图说明

图1性型QTL定位结果。

图2为分子标记TJcM02的引物在甜瓜16QC43(母本)、11C02(父本)、F₁及部分F₂群体中的PCR扩增结果图；其中，A为母本基因型，B为父本基因型，H为F₁杂合基因型，M为marker的缩写。

图3为分子标记InDel_msPr100的引物在甜瓜16QC43(母本)、11C02(父本)、F₁及部分F₂群体中的PCR扩增结果图；其中，A为母本基因型，B为父本基因型，H为F₁杂合基因型，M为marker的缩写。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例一：鉴定性型InDel标记的开发

1.试验材料：

以中国农业科学院郑州果树研究所西甜瓜种质资源中期库挑选的16QC43(母本)、11C02(父本)为亲本，二亲本杂交获得F₁，F₁自交获得96个F₂群体。其中16QC43为雌雄异花同株(单性花株)；11C02为两性花株。

2.甜瓜性型主效基因QTL初步定位的具有步骤为：

(1)利用16QC43(母本)、11C02(父本)为亲本及两亲本杂交获得96个F₂群体，通过SLAF-seq测序技术开发的SLAF标记构建了高密度遗传连锁图谱，并对该96株F₂群体进行性型表型鉴定；

(2)结合高密度遗传图谱和F₂群体性型表型鉴定结果，利用rQTL软件(http://www.rqtl.org/)进行QTL初定位，在L2连锁群上检测到一个与甜瓜性型相关的主效QTL，对应的LOD值为102.21，可解释70.89％的表型变异，99％置信区间为0-59.31cM，对应物理位置为156183bp-3508508bp Mb(图1)。

3.16QC43(母本)、11C02(父本)高通量重测序。与甜瓜参考基因组(https://melonomics.net/files/Genome/Melon_genome_v3.5.1/)进行比对，两个亲本共检测到804664个InDel。

4.在QTL置信区间筛选≥5bp InDel。利用Perl自编程序提取插入缺失相应位置前后各500bp的序列，并利用Primer 5软件设计InDel引物。与甜瓜性型相关的主效QTL置信区间设计11对InDel引物。

实施例二：甜瓜F₂群体分子标记分析

1.实验材料

以实施例1中的16QC43(母本)、11C02(父本)为亲本、杂交组合F₁及96份F₂群体为实验材料。

2.F₂群体基因型鉴定：

具体步骤如下：

(1)利用CTAB法提取叶片总DNA

①取1g新鲜叶片放入研钵，加入液氮快速且用力均匀研成粉末状；

②研磨后将叶片粉末随即转入加有1mL CTAB抽取液的离心管中，充分混匀后置于65℃恒温水浴60min，其间颠倒混合2～3次；

③从水浴锅取出后，离心1min，转速为8000rpm；

④取上清液置于新的离心管中，加等体积的氯仿：异戊醇(25：1，V/V)，混匀；

⑤10000rpm，离心5min，转速为10000rpm；

⑥取上清液到新的离心管中，加入0.7倍体积的异丙醇(冰上预冷30min)，混匀后置于-20℃冷冻(不超过30min)，让DNA析出；

⑦离心5min，转速为10000rpm；

⑧弃上清液，用无水乙醇清洗沉淀数次，倒掉浸泡液，并置于超净工作台上晾干(10min左右)；

⑨加入200μL的蒸馏水溶解DNA；

⑩用紫外分光光度计测定DNA的浓度，并于-20℃冰箱中保存备用。

(2)引物设计：

①根据实施例1中QTL初定位区域并结合亲本重测序结果，在QTL峰值区域发现多个插入缺失片段大于5bp的InDel；

②利用PERL自编程序提取插入缺失相应位置前后各500bp的序列，利用Primer 5软件设计引物。

(3)PCR反应体系如表1所示：

表1反应体系

(4)PCR反应程序如表2所示：

表2反应程序

(5)配制电泳缓冲液

5×TBE电泳缓冲液：称取Tris 26.95g，EDTA 1.86g，硼酸13.75g，去离子水定容至500mL。

(6)配胶：

40％聚丙烯酰胺溶液：聚丙烯酰胺77.34g，甲叉双丙烯酰胺2.66g，去离子水定容至200mL。

①量取40％聚丙烯酰胺溶液10mL，加入5×TBE 5mL，10％TBE 200μL配制8％的胶，摇匀。

②倒入制胶板中，并安装梳子，待充分凝固后拔下梳子。

(7)上样：

将1μL PCR产物点到制备好的8％聚丙烯酰胺凝胶的点样孔中，同时另外的点样孔中加入适当的Marker。

(8)电泳：260V，35min。电泳缓冲液为1×TBE。

(9)银染和显影。

(10)观察分析条带的位置差异。

实施例三：一种实施例2所筛选InDel分子标记、中国专利文献CN103866005A中A基因标记及中国专文献CN108239675A中TJcM02分子标记在F₂群体中的基因型鉴定比较(表3)

①分别利用设计的11对InDel引物对16QC43(母本)、11C02(父本)和F₁单株为实验材料进行多态性筛选，然后利用多态性的InDel引物在F₂群体中进行基因型分析，检测该分子标记的两种基因型在96份F₂群体中的分布情况。

②检测InDel_msPr100、A基因标记在96个F₂(编号为C70-009至C70-128)群体中的的基因型分布情况(母本基因型为A，父本基因型记为B，杂合基因型为H)(表3)。

表3结果表明分子标记InDel_msPr100在96份F₂中，17份为A,29份为B,50份为H，其基因型鉴定的准确率达到98.95％。TJcM02标记在16QC43(母本)、11C02(父本)及F1中，在母本中出现249bp单带型，在父本中出现228bp单条带，而在F1中只出现一条228bp的条带，未出现249bp条带；TJcM02标记在母本及母本基因型个体中出现249bp单带型，在父本及父本基因型个体中出现228bp单条带，在F1及杂合基因型个体中只出现一条228bp的条带而未出现249bp条带，在F2群体中TJcM02标记无法区分父本基因型和杂合基因型(图2)，而在母本基因型中表现出与InDel_msPr100标记共分离(表3)。A基因标记在该96个F2群体同样表现出与InDel_msPr100标记共分离。以上结果表明通过分子标记InDel_msPr100可以更加简单高效稳定的鉴定出甜瓜的性型，不需要酶切等繁琐步骤。InDel_msPr100分子标记上游引物序列为：F1(上游引物):5’-AATGAAAATTTTGGTTTAATGGGA-3’，R1(下游引物):5’-AACCTCTCTCAACTTTGTGCTCAT-3’。在127bp有条带，即为母本基因型，表现为单性花株；如仅在114bp有条带，即为父本基因型，表现为两性花株(图3)。

表3 InDel_msPr100、A基因分子标记在F2群体中的鉴定和验证。

上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。

Claims

1.一种鉴定甜瓜性型的InDel分子标记，其特征在于，所述InDel分子标记InDel_msPr100位于甜瓜第2号染色体上，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，在SEQ ID NO.1所示序列自5’起第28碱基至第40碱基之间的GACAAATTTGAAC片段缺失，获得核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

2.用于扩增权利要求1所述的InDel分子标记InDel_msPr100的引物对。

3.根据权利要求2所述的引物对，其特征在于，

上游引物F1:5’-AATGAAAATTTTGGTTTAATGGGA-3’，

下游引物R1:5’-AACCTCTCTCAACTTTGTGCTCAT-3’。

4.权利要求1所述的鉴定甜瓜性型的InDel分子标记InDel_msPr100在甜瓜性型分子标记辅助育种中的应用。

5.权利要求2或3所述的引物对在甜瓜性型分子标记辅助育种中的应用。

6.一种甜瓜性型基因型的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)采用CTAB法提取甜瓜叶片DNA；

(2)PCR扩增：利用权利要求3所述的引物对，对待测样品利用如下扩增体系进行PCR扩增：甜瓜叶片总DNA 1μL、权利要求3所述的上游引物F1 1μL、权利要求3所述的下游引物R11μL、2×Power Taq PCR MasterMix 12.5μL、ddH₂O 9.5μL；

扩增程序为：94℃、5min；94℃、20s，55℃、1min，72℃、30s，共35个循环；72℃、5min；

(3)对PCR产物进行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳，显影、染色和带型判读，如果出现127bp大小的片段，或包含序列如SEQ ID NO.1所示的片段，则判定待测甜瓜为单性花株；如果仅出现114bp大小的单一片段，或序列如SEQ ID NO.2所示的片段，则判定待测甜瓜为两性花株。

7.权利要求6所述的甜瓜性型的鉴定方法在甜瓜性型分子标记辅助育种中的应用。