CN110699478A

CN110699478A - 鉴定甜瓜果实苦味性状的InDel分子标记2mBi134及其引物和应用

Info

Publication number: CN110699478A
Application number: CN201911119761.8A
Authority: CN
Inventors: 王吉明; 马双武; 尚建立; 李娜; 周丹; 孔胜楠; 李楠楠
Original assignee: Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Current assignee: Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Priority date: 2019-11-15
Filing date: 2019-11-15
Publication date: 2020-01-17
Anticipated expiration: 2039-11-15
Also published as: CN110699478B

Abstract

本发明公开了一种鉴定甜瓜果实苦味性状的InDel分子标记2mBi134及其引物和应用，旨在解决现有技术无法快速准确的对甜瓜果实苦味性状种群进行种质鉴定的技术问题。本发明筛选了一种鉴定甜瓜果实苦味性状的InDel分子标记，设计了一种所述InDel分子标记的引物，提供了一种鉴定甜瓜果实苦味性状的方法，并将所述的分子标记、所述引物或所述方法在甜瓜果实苦味性状分子标记辅助育种中应用。本发明通过简便的实验操作和分析即可快速鉴定甜瓜幼果是否具有苦味，为甜瓜果实苦味性状的分子育种提供了新的技术支持，有利于提高育种的准确性和选择效率。

Description

鉴定甜瓜果实苦味性状的InDel分子标记2mBi134及其引物和应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种鉴定甜瓜果实苦味性状的InDel分子标记2mBi134及其引物和应用。

背景技术

甜瓜（Cucumis melo L.）是葫芦科一种重要的多倍体植物，在全球范围内广泛分布，具有独特的生物学特性和经济价值。因其果实香甜，营养价值丰富以及独特的香气而倍受广大消费者的青睐。然而在甜瓜的栽培生产过程中，由于遗传、环境或栽培等因素会使果实带有苦味，严重影响甜瓜果实的品质。

目前，葫芦科作物苦味已经成为研究的热点，主要集中于对无苦味品种的筛选。随着高通量测序技术和生物信息学的发展，全基因组重测序以及对序列信息的分析，使得分子标记辅助育种技术成为农作物遗传育种工作中应用最为广泛的技术之一。如，李宗扬等（2015）的研究结果表明，黄瓜果实苦味性状由单显性基因控制，有苦味对无苦味为显性，不同环境条件对该基因的表达会造成一定的影响；李兵兵等（2019）对控制西瓜果实苦味的候选基因进行了精细定位，候选基因被缩小到116.7 kb的区间内；张圣平等（2011）通过对含有184个单株的黄瓜F₂群体分析，获得了与Bt基因连锁距离为0.8cM的Indel标记Bt-InDel-1，进一步应用于无苦味黄瓜的分子标记辅助选择（MAS）育种及Bt基因精细定位。

InDel分子标记作为近年新兴的一种分子生物技术，以PCR扩增技术为基础，具有开发成本低、分型简单、检测简单便捷、扩增产物带型简单清晰、结果准确直观以及仪器设备要求低等优点。

然而，在甜瓜品种中，相关的分子标记选育工作至今鲜有报道；因此，亟需开发研究与甜瓜果实苦味相关的分子标记，以期将相关分子标记结合传统杂交育种技术实现对无苦味果实甜瓜的高效选育。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种鉴定甜瓜果实苦味性状的InDel分子标记2mBi134及其引物，并应用于甜瓜果实苦味性状分子标记辅助育种中，以期能够快速准确的对甜瓜果实苦味性状种群进行种质鉴定和实现精准、高效的品种选育。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

筛选出鉴定甜瓜果实苦味性状的InDel分子标记，命名为2mBi134，其位于甜瓜2号染色体21653588bp处，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

设计一种所述InDel分子标记的引物，核苷酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

开发了基于上述InDel分子标记的甜瓜果实苦味性状的鉴定方法，包括以下步骤：

（1）利用CTAB法提取甜瓜叶片总DNA；

（2）利用上述InDel分子标记的引物对，以所述总DNA为模板进行PCR扩增；

（3）对所述PCR扩增产物进行电泳、显影、染色和带型判读，根据扩增产物的条带大小及位置关系确定所属基因型。

在所述步骤（2）中，PCR扩增的体系优选为：甜瓜叶片总DNA 1μL、所述引物各 1μL、2 ×Power Taq PCR MasterMix 12.5μL、ddH₂O 9.5μL。PCR扩增的反应程序为：94℃ 5min，35个循环的94℃ 20 s、55℃ 1 min、72℃ 30 s，72℃ 5 min。

在所述步骤（3）中：所述判读时，314bp的条带代表父本苦味特异基因型，340bp的条带代表母本不苦特异基因型。

将所述的分子标记、所述引物或所述方法在甜瓜果实苦味性状分子标记辅助育种中应用。

与现有技术相比，本发明的主要有益技术效果在于：

1.本发明首次定位了甜瓜苦味性状相关的InDel差异位点，该位点位于甜瓜2号染色体，并基于差异位点鉴定出由一个单基因控制的甜瓜幼果苦味性状，且苦相对不苦为显性，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.本发明开发了一对精准的InDel分子标记引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2和3所示；该引物具有检测方便、快速，扩增稳定，准确率高等特点，在X23群体中该标记的准确率达到95.65%。

3.本发明分子标记不需要酶切等复杂步骤且不受环境的影响，能够快速的鉴定出甜瓜群体是否含有苦味，为鉴定甜瓜苦味性状提供了高效、便捷的新手段，为甜瓜苦味基因精细定位和分子鉴定研究以及利用分子标记辅助无苦味甜瓜育种提供了高效的技术手段以及坚实的研究基础。

附图说明

图1为甜瓜果实苦味性状QTL定位结果图。

图2为2号染色体分子标记2mBi134的引物在甜瓜C68（母本）、C69（父本）及部分X23群体中的PCR扩增结果图；其中，A：母本基因型，B：父本基因型，H：F₁杂合基因型，M：marker。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂和试验材料如无特别说明，均为市售常规试剂和试验材料；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1：甜瓜果实苦味遗传性状分析及材料筛选

以中国农业科学院郑州果树研究所西甜瓜中期库挑选的C68（母本）、C69（父本）（C68是Primo X丰甜1号选系，C69是小翠瓜X广州蜜选系）为亲本，杂交获得F₁，F₁自交得到F₂，F₁与母本回交获得96株BC₁群体。

其中，C69甜瓜果实鉴定为苦，C68果实鉴定为不苦，F₁代甜瓜果实鉴定为苦，说明苦相对不苦为显性。

在96株F₂代群体中，幼果苦为92株，不苦为4株，经卡方检测，符合15：1的孟德尔遗传分离比例（χ²=0.71，p-value=0.40）；在95株BC₁群体中，存在果实苦味的有72株，不苦的有23株，经卡方检测，符合3：1的孟德尔遗传分离比例（χ²=0.98，p-value=0.32），说明甜瓜果实苦味性状是由2对核基因控制的稳定遗传的显性性状，且苦相对不苦为显性。

为了进一步得到控制甜瓜果实苦味性状的基因，将F₂群体中基因型为Aabb的苦味甜瓜个体自交，得到由单基因控制的甜瓜果实苦味性状群体X23（F₃），且苦相对不苦为显性。

实施例2：甜瓜果实苦味性状相关基因定位及InDel分子标记的开发

（1）甜瓜果实苦味性状主效QTL区间初步定位

通过2b-RAD测序方法对父母本及BC₁群体进行测序挖掘相关SNP位点，利用JoinMap4.0软件构建甜瓜遗传连锁图谱，并对该95株BC₁群体进行果实苦味品尝；结合遗传连锁图谱及苦味品尝结果，利用MapQTL6.0软件进行QTL初定位，如图1所示，在LG3上检测到一个与甜瓜果实苦味性状相关的主效QTL区间。LG3对应2号染色体，LOD峰值为6.65，可解释27.6%的表型变异，置信区间为54.335～74.628cM，对应物理位置为17238358bp～24543640bp；在LG4上检测到一个与甜瓜果实苦味性状相关的主效QTL区间。LG4对应5号染色体，LOD峰值为6.33，可解释26.4%的表型变异，置信区间为56.464～68.881cM，对应物理位置为19630521bp～21787261bp。

（2）鉴定甜瓜果实苦味性状的InDel标记引物的设计

利用C68（母本）、C69（父本）高通量重测序结果，结合甜瓜参考基因组（https://melonomics.net/files/Genome/Melon_genome_v3 .5 .1/）进行比对，最终在两个亲本共检测到739454个InDel。

在QTL置信区间内筛选≥5bp的InDel。利用Perl自编脚本提取插入缺失相应位置前后各500bp的序列，并利用Primer 5软件在甜瓜苦味相关QTL主效区间内设计了13对InDel引物。

实施例3：甜瓜X23群体Indel标记分析验证试验

（1）试验材料

以实施例1中的C68（母本）、C69（父本）及70份X23群体为试验材料。

（2）X23群体基因型鉴定

以C68（母本）、C69（父本）和F₁单株为实验材料，分别利用实施例2中设计的InDel引物对其进行多态性筛选，然后利用多态性的InDel引物在X23群体中进行基因型鉴定，最终得到位于2号染色体21653588bp处的甜瓜苦味性状紧密相关Indel标记，命名为2mBi134，其核苷酸序列为5’-AGTGCCTAACTAGAAATTAAAATATA-3’，其PCR引物如下表1所示。

表1 特异性引物信息

。

筛选的具体步骤如下：

（1）利用CTAB法提取叶片总DNA

1）取1g新鲜的甜瓜叶片放入研钵中，立刻加入液氮充分碾磨成粉状，随即转入加有1mL65℃预热好的CTAB抽取液的离心管中，上下颠倒使二者充分混匀，置于65℃恒温水浴60min，期间颠倒混合多次，以防止沉淀；

2）将样品从水浴锅取出后，8000rpm离心1min；

3）取上清液置于另一离心管中，加入与上清液等体积的氯仿和异戊醇混合液(氯仿与异戊醇体积比为24：1)，轻轻颠倒使其充分混匀；

4）10000rpm离心5min，取上清液，置于另一新的离心管中；

5）加入0.7倍体积的提前预冷30min的异丙醇，混匀后置于-20℃冰箱（不超过30min），使DNA析出；

6）取出后，10000rpm离心5min，小心弃去上清液，确保沉淀；

7）用无水乙醇清洗沉淀数次，倒掉浸泡液，打开盖子并置于超净工作台上晾干(10min左右)；

8）加入200μL的蒸馏水溶解DNA；

9）用紫外分光光度计测定DNA的浓度，并于-20℃冰箱中保存备用。

（2）PCR反应

利用实施例2的引物进行PCR。

PCR反应体系如下：甜瓜叶片总DNA (100ng/μL) 1μL、上游引物 (10μM) 1μL、下游引物 (10μM) 1μL、2× Power Taq PCR MasterMix 12.5μL、ddH₂O 9.5μL。

PCR反应程序如下：94℃、5min；94℃、20s，55℃、1min，72℃、30s，共35个循环；72℃、5min。

（3）试剂配制

1）5× TBE电泳缓冲液：称取Tris 26 .95g，EDTA 1 .86g，硼酸13 .75g，去离子水定容至500mL；

2）40％聚丙烯酰胺溶液：聚丙烯酰胺77 .34g，甲叉双丙烯酰胺2.66g，去离子水定容至200mL；

3）8％聚丙烯酰胺凝胶：40％聚丙烯酰胺溶液10ml；5×TBE 5mL；10％过硫酸铵(APS)200μL；四甲基乙二胺(TEMED)80μL；蒸馏水22mL；

4）银染液：硝酸银1g；冰醋酸5mL；无水乙醇50mL；加去离子水定容至500mL；

5）显影液：氢氧化钠15g；甲醛(37％)2.5mL；加去离子水定容至500mL。

（4）凝胶板准备

凝胶玻璃板用蒸馏水洗净、晾干后，用浸泡过无水乙醇的脱脂棉球擦拭，晾干。将凹板和平板叠合紧密后放入制胶器中压紧并扣好其两边的夹子，凹形玻璃向内侧。在洗瓶内配制8％聚丙烯酰胺凝胶溶液，混匀后快速注入两板中间的缝隙内，并注意防止有气泡产生，注满后迅速插入有齿的梳子，梳子底部与胶面刚好接触为宜，等待溶液充分凝固。

（5）电泳

将制胶器支架从底座上取下，直接放入配套的电泳槽中，在电泳槽底部及支架上两块玻璃板中间倒入适量的1× TBE缓冲液。在PCR产物中加入0.2倍体积的6× DNA LoadingBuffer，混匀后取0.8μL加入点样孔内，260V电泳35min。

（6）染色和显影：

电泳完成后，从电泳槽中取出玻璃板，撬去凹板，凝胶会贴附于平板上，凝胶面向上将平板放入银染液中，置于脱色摇床上轻摇15min，凝胶会自动脱落下来；银染完毕后，将凝胶取出放入去离子水中清洗10s；清洗完毕后将凝胶转入显影液中，轻摇摇床，待条带清晰后取出凝胶，放置在阅片器上观察并拍照保存。

（7）带型判读

将显影后自然干燥好的玻璃板置于阅片台上，观察父母本以及X23群体条带的位置差异。

结果如图2所示，观察分析条带的差异，可以看出对应甜瓜2号染色体的引物对2mBi134，在340bp有条带，表现为母本基因型（记为A），无苦味；在314bp有条带，表现为父本基因型（记为B），有苦味；314bp+340bp双带型（记为H），有苦味。

（8）InDel分子标记2mBi134的引物在X23群体中的基因型鉴定统计结果如表2所示。表中，母本基因型为A，父本基因型记为B，杂合基因型为H；苦为k，不苦为b。

表2 2mBi134分子标记在X23群体中的鉴定和验证

。

通过将基因型结果与表型测量结果进行对应，可知X23群体基因型鉴定的准确率达到95.65％。

综上所述，本发明所筛选得到的位于2号染色体上的InDel分子标记2mBi134以及对应设计的引物可有效鉴定甜瓜果实苦味这一性状。

上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院郑州果树研究所

<120> 鉴定甜瓜果实苦味性状的InDel分子标记2mBi134及其引物和应用

<130> 2019

<160> 3

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> Cucumis melo

<400> 1

agtgcctaac tagaaattaa aatata 26

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ttatctaagt ttcctcggtc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

cttcaacttg gatgttttct 20

Claims

1.一种鉴定甜瓜果实苦味性状的InDel分子标记2mBi134，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种权利要求1所述InDel分子标记的引物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：3所示。

3.一种甜瓜果实苦味性状的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）利用CTAB法提取甜瓜叶片总DNA；

（2）利用权利要求2所述的引物对，以所述总DNA为模板进行PCR扩增；

4.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，在所述步骤（2）中，PCR扩增体系为：

甜瓜叶片总DNA 1μL、权利要求2所述引物各 1μL、2 ×Power Taq PCR MasterMix12.5μL、ddH₂O 9.5μL。

5.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，在所述步骤（2）中，PCR扩增的反应程序为：

94℃ 5 min，35个循环的94℃ 20 s、55℃ 1 min、72℃ 30 s，72℃ 5 min。

6.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，在所述步骤（3）中，判读时，314bp的条带代表父本苦味特异基因型，340bp的条带代表母本不苦特异基因型。

7.权利要求1所述的分子标记、权利要求2所述引物或权利要求3所述鉴定方法在甜瓜果实苦味性状分子标记辅助育种中的应用。