CN111549173B - 一种鉴定黄瓜绿美1号杂交种子纯度的Indel标记引物对及方法 - Google Patents
一种鉴定黄瓜绿美1号杂交种子纯度的Indel标记引物对及方法 Download PDFInfo
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- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Abstract
本发明公开了一种用于黄瓜绿美1号杂交种子纯度鉴定的Indel标记引物对，所述标记包括Indel 79上游引物Indel 79‑F和下游引物Indel 79‑R，所述上游引物Indel 79‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物Indel 79‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还公开一种用于黄瓜绿美1号杂交种子纯度鉴定的方法，通过本发明引物及方法，只需简单提取黄瓜叶片基因组DNA，然后进行PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳，即可有效的鉴定绿美1号黄瓜杂交种子的纯度，能够替代田间纯度鉴定的方法，大大缩短鉴定周期，节省鉴定成本，提高鉴定准确度，具有较强的商业应用价值。
Description
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种用于鉴定黄瓜绿美1号杂交种子纯度的Indel标记引物对及方法。
背景技术
黄瓜是我国种植面积最大的蔬菜之一，也是我国主要的经济作物之一。目前随着保护地及玻璃温室栽培面积的逐步扩大，黄瓜的种植也由一年一茬变成了一年三茬。黄瓜的品种也在逐渐的丰富起来，不再作为一种单一的蔬菜而存在。由于不同地区对黄瓜品种的需求不同，育种工作者就要根据区域进行不同类型黄瓜的选育。同时，种子质量也是相当的重要，种子纯度又是衡量种子质量的重要指标之一。
目前黄瓜育种的主要方法就是杂交育种。黄瓜属于雌雄同株，异花授粉作物，受环境以及外界影响特别大。在黄瓜杂交育种过程中，由于花粉混杂、昆虫传粉等原因，常会出现假杂交种，导致种子纯度下降，降低种子质量，给生产及销售上造成巨大的经济损失。传统的纯度鉴定主要是通过田间区域性试验进行形态学鉴定，虽然鉴定结果比较准确但是植株形态测定需要时间较长，难以满足在调查过程中快速测定的需要，费时费工、占地面积又比较大。因此，如何快速、准确鉴定黄瓜纯度成为黄瓜生产及销售中的重中之重。
随着分子生物学技术的成熟，分子技术在种子纯度鉴定上得到了广泛的应用。DNA分子标记技术能够从基因水平上检测种子遗传特异性的差。黄瓜全基因组测序的完成及重测序技术的发展，便于Indel标记的开发，且Indel标记具有数量丰富、准确性高、稳定性好、快捷简便等优点，不仅用于分子标记辅助育种，而且也可用于杂交种子纯度检测。
发明内容
本发明以江苏绿港现代农业发展有限公司自主选育的黄瓜绿美1号亲本为试验材料，通过全基因组测序，依据亲本间核苷酸数量的不同，设计大量插入/缺失标记，开发出一对在黄瓜多个杂交种子亲本间具有强多态性的Indel标记，可以快速鉴定黄瓜杂交种子纯度，
克服黄瓜杂交种子田间纯度鉴定周期性长及受环境影响大的缺点。本发明的目的在于提供一种用于黄瓜杂交种子纯度鉴定的Indel 标记，该标记能够用于黄瓜绿美1号、18C686、19C147、19C087杂交种子纯度的鉴定；本发明的目的还在于提供一种基于PCR的黄瓜种子纯度鉴定的方法，用该方法可以通过简单的琼脂糖凝胶电泳即可检测种子纯度。
本发明所采用的技术方案是：
一种用于鉴定黄瓜绿美1号杂交种子纯度的Indel标记引物对，所述标记引物对包括Indel 79的上游引物Indel 79-F和下游引物Indel 79-R，所述上游引物Indel 79-F 的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物Indel 79的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
上述引物的具体核苷酸序列如下：；
上游引物Indel 79-F：5′-TGCCAACAGTTACATGACTTTGTG-3′（SEQ ID NO.1）
下游引物Indel 79-R：5′-CAAGTGTTGAGGACGTTACTATGC-3′（SEQ ID NO.2）
一种用于黄瓜绿美1号杂交种子纯度鉴定的方法，包括以下步骤：
（1）提取黄瓜亲本及其杂交F1的叶片基因组DNA；
（2）利用上述标记Indel 79对提取黄瓜亲本及其杂交F1的叶片基因组DNA进行PCR扩增；
（3）对步骤(2)的PCR扩增产物进行2%的琼脂糖凝胶电泳检测；
（4）对步骤(3)电泳检测结果进行分析，真正杂交种子的标准图谱为同时具有两个亲本特异性序列的图谱，否则为假杂种，利用统计结果计算杂交种子纯度。在上述各步骤中：
所述步骤(1) 中提取黄瓜亲本及其杂交后代的叶片基因组DNA采用改良的CTAB法提取：① 取新鲜叶片30mg放入2ml的离心管中，加入一个直径4mm的钢珠，盖紧盖子，将其放入液氮中60s，然后利用组织研磨仪磨样；
② 在磨好的样中加入600µl 2%的CTAB提取液，55℃水浴20min，每隔5min摇晃一次；
③ 12000rpm离心5min，吸取350µl上清于干净的1.5ml的离心管中，加入250µl氯仿和异戊醇混合物，充分混匀；氯仿和异戊醇混合物中氯仿和异戊醇的体积比为24：1；
④ 13000rpm离心2min，取250µl上清于另一1.5ml的离心管中，加入550µl无水乙醇，放-20℃冰箱2h；无水乙醇提前在-20℃条件下预冷；
⑤ 12000rpm离心10分钟，倒掉上清液，室温放置；
⑥ 待离心管中无酒精味时，加入100µl ddH2O溶解DNA；放4℃冰箱；
所述步骤(2) 中PCR 扩增时采用的反应体系为25μL体系，其中提取黄瓜亲本及其杂交后代的叶片基因组DNA 2μL，2*Taq MasterMix (Dye) 12.5μL，正反引物各1μL，加入灭菌的超纯水至25μL；
所述步骤(2) 中PCR 扩增时反应程序为：94℃预变性2min；然后进行38个循环，每个循环包括94℃变性30s， 58℃退火30s，72℃延伸45s；最后延伸2min，置于4℃保存。
所述步骤(3)中电泳检测时，在加有溴化乙锭（EB）的2%的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳缓冲液为1 X TAE缓冲液，电压为150v。电泳结束后在凝胶成像分析仪中观察电泳条带，在365nm波长下分析DNA电泳条带大小，扫描图像并保存。
上述用于黄瓜杂交种子纯度鉴定的方法鉴定绿美1号、18C686、19C147、19C087杂交种子纯度的具体方法如下：
若在黄瓜绿美1号杂交种子中能同时扩增出151bp的母本特异性序列如SEQ IDNO.3 所示、204bp的父本特异性序列如SEQ ID NO.4所示，则为真正杂交种；
若在黄瓜18C686杂交种子中能同时扩增出151bp的母本特异性序列如SEQ IDNO.5所示、204bp的父本特异性序列如SEQ ID NO.6所示，则为真正杂交种；
若在黄瓜19C147杂交种子中能同时扩增出151bp的母本特异性序列如SEQ IDNO.7所示、204bp的父本特异性序列如SEQ ID NO.8所示，则为真正杂交种；
若在黄瓜19C087杂交种子中能同时扩增出204bp的母本特异性序列如SEQ IDNO.9所示、151bp的父本特异性序列如SEQ ID NO.10所示，则为真正杂交种。
本发明的有益效果：
1.本发明中的标记Indel 79为自主开发的Indel标记，其具有特异性强，稳定高的特点。
2.用本发明的标记Indel 79及方法，可将黄瓜绿美1号、18C686、19C147、19C087杂交种子与其对应的父母本种子、其他混杂的种子区分开来，快速检测出黄瓜杂交种子的纯度。
3.本发明的标记Indel 79，其PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳即可检测，且扩增带型清晰，区别于多数Indel标记需用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的繁琐，既可加快检测进程，又可提高育种工作者工作效率。
本发明避免了传统田间小区鉴定周期长、费时费工、占地面积大等的不足，能够替代传统杂交种子纯度鉴定的方法，大大缩短鉴定时间，节省鉴定成本，提高鉴定准确度，具有较强的商业应用价值。
附图说明
图1 表示利用标记Indel 79扩增的绿美1号亲本与F1杂交种子的部分电泳图；其中M表示2000的 Marker，P1表示母本，P2表示父本，F1表示杂交种子。
图2 表示利用标记Indel 79扩增的18C686亲本与F1杂交种子的部分电泳图；其中M表示2000的 Marker，P1表示母本，P2表示父本，F1表示杂交种子。
图3 表示利用标记Indel 79扩增的19C147亲本与F1杂交种子的部分电泳图；其中M表示2000的 Marker，P1表示母本，P2表示父本，F1表示杂交种子。
图4 表示利标记Indel 79扩增的19C087亲本与F1杂交种子的部分电泳图；其中M表示2000的 Marker，P1表示母本，P2表示父本，F1表示杂交种子。
具体实施方式
（一）材料与方法
1. 植物材料
本研究使用黄瓜杂交种子绿美1号、18C686、19C147、19C087及其对应的亲本为试验材料，由江苏绿港现代农业发展有限公司育种研究所提供。其中杂交种子F1各取样200份幼嫩叶片、亲本各取样2份幼嫩叶片。
2. 叶片基因组DNA的提取与检测
利用改良的CTAB法，从新鲜植物叶片中提取黄瓜亲本及其杂交F1的基因组DNA。
① 取新鲜叶片30mg放入2ml的离心管中，加入一个直径4mm的钢珠，盖紧盖子，将其放入液氮中60s，然后利用组织研磨仪磨样；
② 在磨好的样中加入600µl 2%的CTAB提取液，55℃水浴20min，每隔5min摇晃一次；
③12000rpm离心5min，吸取350µl上清于干净的1.5ml的离心管中，加入250µl氯仿和异戊醇混合物，充分混匀；氯仿和异戊醇混合物中氯仿和异戊醇的体积比为24：1；
④ 13000rpm离心2min，取250µl上清于另一1.5ml的离心管中，加入550µl无水乙醇，放-20℃冰箱2h；无水乙醇提前在-20℃条件下预冷；
⑤ 12000rpm离心10分钟，倒掉上清液，室温放置；
⑥ 待离心管中无酒精味时，加入100µl ddH2O溶解DNA；放4℃冰箱；
琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测DNA的质量与浓度。
3. PCR扩增及检测
PCR扩增在中国华盛公司LY96G ThermocyclerTM扩增仪上进行，中PCR 扩增时采用的反应体系为25μL体系，其中提取黄瓜亲本及其杂交后代的基因组DNA 2μL，2*TaqMasterMix (Dye) 12.5μL，正反引物各1μL，加入灭菌的超纯水至25μL； 反应程序为94℃预变性2min，[94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s]，38个循环， 72℃延伸2min，然后反应保持在4℃。
在加有溴化乙锭（EB）的2%的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳缓冲液为1 X TAE缓冲液，电压为150v。电泳结束后在凝胶成像分析仪中观察电泳条带，在365nm波长下分析DNA电泳条带大小，扫描图像并保存。
4. 具有多态性的引物筛选及纯度鉴定
随机选取288对基于黄瓜绿美1号亲本全基因组测序开发的Indel标记，通过PCR扩增与电泳，利用多对黄瓜亲本材料筛选具有多态性标记。
用筛选到的具有多态性的标记，进行黄瓜杂交种子的扩增、电泳，完成纯度鉴定。
（二）结果与分析
1. 所选材料的基因组DNA的检测分析
使用超微量紫外可见分光光度计（DeNovix DS-11）对本研究所提取的黄瓜叶片基因组DNA进行浓度检测，发现提取的DNA浓度均高于100ng /μl，而且OD260/OD280基本都在1.8~2.0之间。取不同浓度DNA用2%的琼脂糖电泳检测，电泳图清晰明亮，无明显拖尾，说明提取的DNA质量较好。所以，提取到的高质量黄瓜叶片基因组DNA，适用于PCR扩增、Indel等分子标记的生物学试验。
2. PCR扩增与纯度鉴定
从黄瓜288对Indel标记中，通过PCR扩增与电泳，利用亲本筛选出一对具有多态性强、重复性好的Indel标记Indel 79。该标记对黄瓜绿美1号、18C686、19C147、19C087杂交种子对应的亲本分别具有母本特异性标记和父本特异性标记，可用于检测杂交种子纯度。
利用标记Indel 79对黄瓜绿美1号杂交种子进行PCR扩增、电泳，完成纯度鉴定，结果见图1，从图1可以清晰的看出，在绿美1号母本中扩增出151bp的特异性条带，父本中扩增出204bp的特异性条带，绿美1号标准杂交种子的电泳图谱为同时具有父母本特异性标记的条带151/204bp。被检测种子中有179个泳道图谱与绿美1号标准杂交种子图谱一致，有1个泳道的图谱与绿美1号杂交种子标准图谱不一致，说明这1株为杂株，计算得出黄瓜绿美1号杂交种子纯度为99.4%。
用同样的方法，利用标记Indel 79分别对黄瓜18C686、19C147、19C087杂交种子进行PCR扩增、电泳，完成纯度鉴定，结果见图2~4。鉴定出黄瓜18C686、19C147和19C087杂交种子纯度都达到了100%。
以上案例表明，用本发明的标记Indel 79及其方法，可以用来鉴定黄瓜绿美1号、18C686、19C147、19C087杂交种子的纯度。
SEQ ID NO.1：
5′-TGCCAACAGTTACATGACTTTGTG-3′
SEQ ID NO.2：
5′-CAAGTGTTGAGGACGTTACTATGC-3′
SEQ ID NO.3： TGCCAACAGTTACATGACTTTGTGTGAGACTTTAATCGTGTCCTAAGCTACTCGATAAGATTGTATCCGATAAAGAGTTGTCAACTGAAAGTGTTTCTTGTAATTTGATGAGTTGAAGGGTTTTAACCAAGTGTTGAGGACGTTACTATGC
SEQ ID NO.4：
TGCCAACAGTTACATGACTTTGTGTGAGACTTTAATCGTGTCCTAAGCTACTTGATAAGATTGTATCTGATAAAGAGTTGGACTTTAATCGTGTCCTAAGCTACTTGATAAGACTGTATCCGATAAAGAGTTGTCAACTGAAAGTGTTTCTTGTAATTTGATGGGTTGAAGGGTTTCAACCAAGTGTTGAGGACGTTACTATGC
SEQ ID NO.5：
TGCCAACAGTTACATGACTTTGTGTGAGACTTTAATCGTGTCCTAAGCTACTCGATAAGATTGTATCCGATAAAGAGTTGTCAACTGAAAGTGTTTCTTGTAATTTGATGAGTTGAAGGGTTTTAACCAAGTGTTGAGGACGTTACTATGC
SEQ ID NO.6：
TGCCAACAGTTACATGACTTTGTGTGAGACTTTAATCGTGTCCTAAGCTACTTGATAAGATTGTATCTGATAAAGAGTTGGACTTTAATCGTGTCCTAAGCTACTTGATAAGACTGTATCCGATAAAGAGTTGTCAACTGAAAGTGTTTCTTGTAATTTGATGGGTTGAAGGGTTTCAACCAAGTGTTGAGGACGTTACTATGC
SEQ ID NO.7：TGCCAACAGTTACATGACTTTGTGTGAGACTTTAATCGTGTCCTAAGCTACTCGATAAGATTGTATCCGATAAAGAGTTGTCAACTGAAAGTGTTTCTTGTAATTTGATGAGTTGAAGGGTTTTAACCAAGTGTTGAGGACGTTACTATGC
SEQ ID NO.8：
TGCCAACAGTTACATGACTTTGTGTGAGACTTTAATCGTGTCCTAAGCTACTTGATAAGATTGTATCTGATAAAGAGTTGGACTTTAATCGTGTCCTAAGCTACTTGATAAGACTGTATCCGATAAAGAGTTGTCAACTGAAAGTGTTTCTTGTAATTTGATGGGTTGAAGGGTTTCAACCAAGTGTTGAGGACGTTACTATGC
SEQ ID NO.9：
TGCCAACAGTTACATGACTTTGTGTGAGACTTTAATCGTGTCCTAAGCTACTTGATAAGATTGTATCTGATAAAGAGTTGGACTTTAATCGTGTCCTAAGCTACTTGATAAGACTGTATCCGATAAAGAGTTGTCAACTGAAAGTGTTTCTTGTAATTTGATGGGTTGAAGGGTTTCAACCAAGTGTTGAGGACGTTACTATGC
SEQ ID NO.10：
TGCCAACAGTTACATGACTTTGTGTGAGACTTTAATCGTGTCCTAAGCTACTCGATAAGATTGTATCCGATAAAGAGTTGTCAACTGAAAGTGTTTCTTGTAATTTGATGAGTTGAAGGGTTTTAACCAAGTGTTGAGGACGTTACTATGC
序列表
<110> 江苏绿港现代农业发展有限公司
<120> 一种用于黄瓜杂交种子纯度鉴定的Indel标记及方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
<400> 1
tgccaacagt tacatgactt tgtg 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
<400> 2
caagtgttga ggacgttact atgc 24
<210> 3
<211> 151
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
<400> 3
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ttgtatccga taaagagttg tcaactgaaa gtgtttcttg taatttgatg agttgaaggg 120
ttttaaccaa gtgttgagga cgttactatg c 151
<210> 4
<211> 204
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
<400> 4
tgccaacagt tacatgactt tgtgtgagac tttaatcgtg tcctaagcta cttgataaga 60
ttgtatctga taaagagttg gactttaatc gtgtcctaag ctacttgata agactgtatc 120
cgataaagag ttgtcaactg aaagtgtttc ttgtaatttg atgggttgaa gggtttcaac 180
caagtgttga ggacgttact atgc 204
<210> 5
<211> 151
<212> DNA/RNA
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Claims (6)
1.一种用于鉴定黄瓜绿美1号杂交种子纯度的Indel标记引物对，其特征在于，所述标记引物对包括Indel 79上游引物Indel 79-F和下游引物Indel 79-R，所述上游引物Indel79-F的核苷酸序列为：5′-TGCCAACAGTTACATGACTTTGTG-3′，所述下游引物Indel 79-R的核苷酸序列为：5′-CAAGTGTTGAGGACGTTACTATGC-3′。
2.一种采用权利要求1所述Indel标记引物对鉴定黄瓜绿美1号杂交种子纯度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提取黄瓜亲本及其杂交F1的叶片基因组DNA；
（2）利用标记Indel 79对提取黄瓜亲本及其杂交F1的叶片基因组DNA进行PCR扩增；
（3）对步骤(2)的PCR扩增产物进行2%的琼脂糖凝胶电泳检测；
（4）对步骤(3)电泳检测结果进行分析，真正杂交种子的标准图谱为同时具有两个亲本特异性序列的图谱，利用统计结果计算杂交种子纯度。
3.根据权利要求2所述的鉴定黄瓜绿美1号杂交种子纯度的方法，其特征在于，所述步骤(1) 中提取黄瓜亲本及其杂交后代的叶片基因组DNA采用改良的CTAB法提取：① 取新鲜叶片30mg放入2ml的离心管中，加入一个直径4mm的钢珠，盖紧盖子，将其放入液氮中60s，然后利用组织研磨仪磨样；
② 在磨好的样中加入600µl 2%的CTAB提取液，55℃水浴20min，每隔5min摇晃一次；
③ 12000rpm离心5min，吸取350µl上清于干净的1.5ml的离心管中，加入250µl氯仿和异戊醇混合物，充分混匀；氯仿和异戊醇混合物中氯仿和异戊醇的体积比为24：1；
④ 13000rpm离心2min，取250µl上清于另一1.5ml的离心管中，加入550µl无水乙醇，放-20℃冰箱2h；无水乙醇提前在-20℃条件下预冷；
⑤ 12000rpm离心10分钟，倒掉上清液，室温放置；
⑥ 待离心管中无酒精味时，加入100µl ddH2O溶解DNA；放4℃冰箱。
4.根据权利要求2所述的鉴定黄瓜绿美1号杂交种子纯度的方法，其特征在于，所述步骤(2) 中PCR 扩增时采用的反应体系为25μL体系，其中提取黄瓜亲本及其杂交后代的叶片基因组DNA 2μL，2*Taq MasterMix (Dye) 12.5μL，正反引物各1μL，加入灭菌的超纯水至25μL；所述步骤(2) 中PCR 扩增时反应程序为：94℃预变性2min；然后进行38个循环，每个循环包括94℃变性30s， 58℃退火30s，72℃延伸45s；最后延伸2min，置于4℃保存。
5.根据权利要求2所述的鉴定黄瓜绿美1号杂交种子纯度的方法，其特征在于，所述步骤(3)中电泳检测时，在加有溴化乙锭（EB）的2%的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳缓冲液为1 XTAE缓冲液，电压为150v,电泳结束后在凝胶成像分析仪中观察电泳条带，在365nm波长下分析DNA电泳条带大小，扫描图像并保存。
6.根据权利要求2-5之一所述的鉴定黄瓜绿美1号杂交种子纯度的方法，其特征在于，其特征在于，所述步骤（4）中，
当在黄瓜绿美1号杂交种子中能同时扩增出151bp的母本特异性序列SEQ ID NO.3、204bp的父本特异性序列SEQ ID NO.4，则为真正杂交种。
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2020
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Denomination of invention: A kind of Indel marker primer pair and method for identifying the purity of Cucumber Lvmei No. 1 hybrid seed Effective date of registration: 20220901 Granted publication date: 20220315 Pledgee: Jiangsu SINOSURE technology microfinance Co.,Ltd. Pledgor: JIANGSU GREENPORT MODERN AGRICULTURAL DEVELOPMENT Co.,Ltd. Registration number: Y2022980014217 |